Phát hiện khuyết đoạn gen dystrophin ở những bệnh nhân phương pháp multiplex PCR bằng phương pháp multiplex PCR

Bộ y tế




Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ


Tên đề tài:
Phát hiện khuyết đoạn gen
ở những bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne
bằng phơng pháp Multiplex PCR



Chủ nhiệm đề tài : TS.BS Nguyễn Thị Trang
Cơ quan chủ trì đề tài : Trờng Đại học y Hà nộ
i











6426
17/7/2007

Hà nội - 2006

Bộ y tế




Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ


Tên đề tài:
Phát hiện khuyết đoạn gen
ở những bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne
bằng phơng pháp Multiplex PCR





Chủ nhiệm đề tài:
TS.BS Nguyễn Thị Trang
Cơ quan chủ trì đề tài
: Trờng Đại học y Hà nội
Cấp quản lý đề tài
: Bộ y tế
Thời gian thực hiện: từ tháng 1/2004 đến tháng 12/2006
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 200 triệu đồng
Trong đó: Kinh phí SNKH 200 triệu đồng

Nguồn khác không có














1.Tên đề tài:
Phát hiện khuyết đoạn gen ở những bệnh nhân loạn dỡng cơ
Duchenne bằng phơng pháp Multiplex PCR

2.Chủ nhiệm đề tài: TS.BS Nguyễn Thị Trang
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học y Hà nội
4.Cơ quan quản lý đề tài: Bộ y tế
5. Th ký đề tài: Thạc sĩ. Bác sĩ Lơng Thị Lan Anh
6. Những ngời thực hiện chính:
TS.BS Nguyễn Thị Trang Bộ môn Y sinh học-Di truyền ĐHY Hà nội
Thạc sĩ. BS Vũ Chí Dũng Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền BV Nhi TW
Cử nhân Nguyễn Thị Phơng Mai La bô Di truyền BV Nhi TW
TS.BS Hoàng Hạnh Phúc Khoa Sinh hoá Bệnh viện Nhi trung ơng
Thạc sĩ. BS Lơng Thị Lan Anh Bộ môn Y sinh học - Di truyền ĐHY Hà nội
PGS. TS Lê Văn Phủng La bô Trung tâm Y sinh họcĐH Y Hà nội

7. Thời gian thực hiện: từ tháng 1/2004-12/2006









Danh mục chữ viết tắt


ADN Acid deoxyribonucleic
ARN Acid ribonucleic
BMD Becker muscular dystrophy (loạn dỡng cơ Becker)
bp Base pair (cặp base trong phân tử ADN kép)
CK Creatine kinase
Carrier Ngời lành mang gen bệnh
CMC
Chemical mismatch cleavage (Phơng pháp cắt liên kết không
tơng xứng hóa học)
DMD Duchenne muscular dystrophy (Bệnh loạn dỡng cơ Duchenne)
DGGE
Denaturing gradient gel electrophoresis (Điện di gel dựa trên
gradient)
FISH

Fluorescent in situ hybridisation (Lai tại chỗ phát hiện bằng

chất mầu huỳnh quang)
FIGE Field inversion gel electrophoresis (Điện di đảo ngợc)
HDA Heteroduplex analysis (Phân tích dị hợp tử kép )
NST Nhiễm sắc thể
KN-KT Kháng nguyên- Kháng thể
kb kilo base
PCR
Polymerase chain reaction (kỹ thuật khuyếch đại một đoạn
ADN đích xác định nhờ enzym Taq ADN polymerase )
PTT Protein truncation test (Xét nghiệm kiểm tra Protein bị cắt)
RFLP Restriction fragment length polymorphism (Phơng pháp
phân đoạn giới hạn đa độ dài)
RT-PCR Reverse transcription PCR (Phơng pháp phiên mã ngợc)
SSCP
Single strand conformation polymorphism (Phơng pháp cấu
trúc đa hình sợi đơn)
TSDT Tiền sử di truyền



Mục lục

Đặt vấn đề
1
Chơng 1 : Tổng quan

1.1. Đặc điểm di truyền của bệnh DMD 3
1.2. Tần số của bệnh loạn dỡng cơ Duchenne 5
1.3. Cơ sở di truyền phân tử của bệnh DMD 5
1.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen DMD 5

1.3.2. Cấu trúc và chức năng của Dystrophy 8
1.4. Cơ chế bệnh sinh của DMD 9
1.5. Cơ chế di truyền của bệnh DMD 10
1.5.1. Gen đột biến có sẵn trên NSTX của mẹ 10
1.5.2. Đột biến mới 10
1.5.3. Dạng khảm Soma tại vùng gen Dystrophy 11
1.5.4. Dạng khảm dòng tế bào mầm trong bệnh DMD 12
1.6. Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophy 13
1.6.1. Đột biến khuyết đoạn gen dystrophy (DMD) 13
1.6.2. Đột biến nhân đoạn trong gen dystrophy (DMD) 15
1.6.3. Đột biến điểm xẩy ra trong gen dystrophy (DMD) 15
1.6.4. Đột biến kiểu chuyển đoạn gây bệnh DMD ở trẻ gái 16
1.7. Các phơng pháp xét nghiệm trong chẩn đoán bệnh DMD 16
1.7.1. Phơng pháp đo hoạt độ creatine kinase trong huyết thanh 16
1.7.2. Phơng pháp thăm dò điện sinh lý cơ(ghi điện cơ) 18
1.7.3. Phơng pháp sinh thiết cơ, chẩn đoán giải phẫu bệnh vi thể
trong xác định tổn thơng cơ ở bệnh nhân
18
1.7.4. Phơng pháp miễn dịch huỳnh quang 19
1.7.5. Xét nghiệm ADN 20
1.8. Các phơng pháp phát hiện đột biến gen dystrophy 21
1.8.1. Phát hiện những tổn thơng lớn của gen dystrophy
21
1.8.2. Phát hiện những tổn thơng nhỏ của gen dystrophy ở những
bệnh nhân
23
1.8.3. Phát hiện những tổn thơng nhỏ ở những ngời nữ mang gen 26
1.9. Phòng bệnh DMD 26
1.9.1. Phát hiện những trờng hợp DMD 27
1.9.2. Phát hiện đột biến gen ở những bệnh nhân DMD/BMD 27

1.9.3. Phát hiện những ngời lành mang gen bệnh DMD (carriers) 28
1.9.4. Cho lời khuyên di truyền 30
1.9.5. Phơng pháp chẩn đoán trớc sinh và chẩn đoán ADN của
phôi trớc khi cấy phôi vào cơ thể
33
1.10. Khả năng điều trị bệnh DMD 35
1.11. Tình hình nghiên cứu bệnh DMD ở trong nớc 37
Chơng 2: Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu


2.1. Đối tợng nghiên cứu 39
2.1.1. Nhóm chứng 39
2.1.2. Nhóm bệnh 39
2.2. Nơi thực hiện
41
2.3. Phơng pháp nghiên cứu 41
2.3.1.Phơng pháp thu thập thông tin từ bệnh nhân và gia đình bệnh
nhân
41
2.3.2. Phơng pháp xét nghiệm CK toàn phần trong huyết thanh 42
2.3.3. Phơng pháp lập và phân tích phả hệ 42

2.3.4. Phơng pháp chiết tách ADN từ máu ngoại vi bằng phơng
pháp perchlorat sodium
43
2.3.5. Kỹ thuật chiết tách ADN từ máu ngoại vi theo Qiagen kit 46
2.3.6. Phơng pháp multiplex PCR 46
2.3.7. Xử lý số liệu theo phơng pháp thống kê y sinh học
53
Chơng 3. Kết quả

3.1. Kiểm tra kết quả chiết tách ADN ở 10 ngời nam bình thờng
theo phơng pháp perchlorat sodium
54
3.1.1. Kiểm tra kết quả tinh khiết của ADN
54
3.1.2. Đo hàm lợng ADN 54
3.2. Nhóm bệnh nhân DMD 56
3.2.1. Giới của bệnh nhân 56
3.2.2. Tiền sử di truyền trong gia đình 56
3.2.3. Tỉ lệ bệnh nhân DMD có đột biến mất đoạn 57
3.2.4. 35 bệnh nhân đợc khảo sát thêm exon 46 63
3.2.5. 30 bệnh nhân đợc khảo sát thêm exon 16, 32, 34, 41, 42, và
vùng promotor não(Pb)
63
3.3. Nhóm mẹ, và chị em gái của mẹ bệnh nhân DMD đợc xét
nghiệm CK cho t vấn di truyền
64
3.4. Minh hoạ một số hình ảnh kết quả PCR khảo sát những exon
trong vùng hay xẩy ra mất đoạn của gen dystrophin ở bệnh nhân
DMD
66
3.5. Minh hoạ một số phả hệ phối hợp với xét nghiệm CK và phân
tích ADN của một số bệnh nhân
76
3.6.
ả
nh minh hoạ bệnh nhân DMD
80

Chơng 4 : Bàn luận


4.1. DMD là bệnh phát sinh do cơ chế di truyền và đột biến mới 81
4.2. So sánh các phơng pháp di truyền phân tử phát hiện đột biến
mất đoạn gen và tình hình phát hiện đột biến mất đoạn gen ở các
nớc
87
4.2.1. So sánh các phơng pháp di truyền phân tử phát hiện đột biến
mất đoạn gen

87
4.2.2. So sánh về nghiên cứu mất đoạn gen ở một số nớc trên thế
giới
90
4.3. Những bệnh nhân đợc chẩn đoán là DMD nhng cha phát
hiện đợc đột biến gen
94
Kết Luận
95
Kiến nghị
96
Tài liệu tham khảo
95
Phụ lục

Bản tự đánh giá
Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới
của đề tài khoa học và công nghệ cấp Bộ

1.Tên đề tài:
Phát hiện khuyết đoạn gen dystrophin ở những bệnh nhân
loạn dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp Multiplex PCR

2.Chủ nhiệm đề tài:
TS. BS. Nguyễn Thị Trang

3.Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại Học Y Hà Nội
4.Thời gian thực hiện đề tài: Tháng 1 năm 2004 đến tháng 12 năm 2006

5. Tổng kinh phí thực hiện đề tài:
200 triệu đồng
Trong đó kinh phí từ NSNN: 200 triệu đồng
6.Tình hình thực hiện đề tài so với đề cơng:
Đề tài đ hoàn thành 2 mục tiêu của đề cơng:
- Sử dụng phơng pháp Multiplex PCR với 19 cặp mồi để phát hiện
khuyết đoạn gen dystrophin ở bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne.
- Bớc đầu tìm hiểu exon nào của gen DMD thờng xẩy ra khuyết đoạn

6.1. Về mức độ hoàn thành khối lợng công việc:
-Về
số
lợng mẫu: theo đề cơng đề ra là chiết tách ADN tổng số của ngời
nam bình thờng làm chứng(+) và chiết tách ADN của 60 bệnh nhân DMD
và thực hiện phản ứng Multiplex PCR với 18 cặp mồi để phát hiện đột biến
mất đoạn gen ở những bệnh nhân DMD.
- Đề tài đã thực hiện chiết tách ADN của ngời nam bình thờng làm
chứng(+) và 62 bệnh nhân DMD, đã thực hiện phản ứng Multiplex PCR với
19 cặp mồi để khảo sát 18 exon của gen dystrophin và vùng promotor cơ, đã
điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, chụp gel và đọc kết quả PCR cho
từng bệnh nhân.
- Xử lý số liệu và phân tích kết quả.

-Viết báo cáo nghiệm thu đề tài.
6.2. Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm khoa
học công nghệ
6.2.1. Yêu cầu khoa học trong chọn đối tợng nghiên cứu là những bệnh
nhân DMD
-Các bệnh nhân DMD đợc chẩn đoán lâm sàng theo tiêu chuẩn của
Duchenne mô tả và đợc thực hiện tại khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền

Bệnh viện Nhi trung ơng.
-Xét nghiệm đo hoạt độ enzym creatine kinase huyết thanh để chẩn đoán
bệnh DMD đợc thực hiện trên máy phân tích sinh hoá tự động với kit thuốc
thử đợc tiêu chuẩn hoá quốc tế(điều kiện nhiệt độ 37
0
C). Các kết quả xét
nghiệm của bệnh nhân đều tăng cao trên 20 lần đến 100 lần so với CK nhóm
chứng là các trẻ em bình thờng(115

32 IU/l) với cùng một điều kiện.
6.2.2. Về yêu cầu khoa học và các chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm đề tài:
-Các mẫu chiết tách ADN, phản ứng Multiplex PCR đợc thực hiện tại La bô
trung tâm Y Sinh học, Bộ môn Y Sinh học-Di truyền Đại học Y Hà Nội và La
bô di truyền Bệnh viện Nhi trung ơng là những nơi đợc trang bị máy móc
đảm bảo, với các dụng cụ và hoá chất đã đợc tiêu chuẩn hoá quốc tế.
- Các mẫu ADN đợc chiết tách từ mẫu máu ngời nam bình thờng và 62
bệnh nhân nam DMD đều đợc kiểm tra độ tinh sạch bằng máy quang phổ kế
và kiểm tra chất lợng ADN bằng điện di ADN: Các mẫu đều đạt độ tinh
sạch(1.6 <OD
260nm
/OD
280nm
<1,8) và điện di ADN thể hiện các băng gọn.
-Về sản phẩm PCR của các nhóm cặp mồi, mỗi cặp mồi đặc hiệu với từng
exon tơng ứng của gen dystrophin, kết quả điện di sản phẩm PCR của các
bệnh nhân đọc rõ so với Marker thang chuẩn 100bp(base pair) và so với
chứng(+) là ngời nam bình thờng, đã chỉ rõ mất đoạn exon trên hình ảnh
điện di sản phẩm PCR của bệnh nhân DMD.
-Qua đọc kết quả PCR của những bệnh nhân DMD chúng tôi đã phân tích xử
lý số liệu và thu đợc những kết quả sau:

+ Thực hiện phản ứng PCR với 19 cặp mồi để khảo sát 18 exon và vùng
promotor cơ của gen dystrophin ở 62 bệnh nhân DMD và đã phát hiện tỉ
lệ đột biến mất đoạn gen là 51,6%.
+ Trong 62 bệnh nhân DMD của 60 gia đình có 44 gia đình có TSDT
không rõ(73,3%), 16 gia đình có TSDT rõ(26,7%).
+ Tỉ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin ở nhóm TSDT rõ và không rõ là
tơng đơng nhau: Nhóm TSDT rõ là 52,9% và TSDT không rõ là 51,1%.
+ Đã nêu ra đợc phân bố mất đoạn gen dystrophin ở 62 bệnh nhân DMD:
Mất đoạn tập trung ở vùng giữa gen từ exon 44-52 là chủ yếu chiếm 89,3%;
Mất đoạn ở vùng từ exon 3-19 và vùng promotor cơ(Pm) hiếm gặp hơn chỉ
chiếm 10,7%.
+ Đề tài đã khảo sát thêm exon 46 ở 35 bệnh nhân(đã phát hiện đột biến
mất đoạn exon 46 ở 7 trờng hợp(20%).
6.3. Về tiến độ thực hiện:
Đề tài thực hiện hơi chậm một chút so với dự kiến
ban đầu do số mẫu bệnh nhân thiếu, vì cơ quan hợp tác đề tài phải gửi mẫu
sang Nhật theo hợp tác quốc tế.
7. Về những đóng góp mới của đề tài:

Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã đợc công bố trên các ấn
phẩm trong và ngoài nớc đến thời điểm kết thúc đề tài, đề tài có những điểm
mới sau đây:
7.1. Về giải pháp khoa học công nghệ:
- Đột biến mất đoạn gen gây bệnh DMD là đa số chiếm tỉ lệ 50-70% trong
các loại đột biến gen. Đề tài đã u tiên phát triển phơng pháp phát hiện đột
biến mất đoạn gen và lựa chọn phơng pháp Multiplex PCR là phơng pháp
có nhiều u điểm hơn các phơng pháp khác nh phơng pháp Southern blot,
FISH, RT-PCR, phơng pháp này cũng đợc nhiều nớc tiên tiến trên thế
giới và trong khu vực lựa chọn. Vì vậy đề tài đã lựa chọn giải pháp công nghệ
đúng để giải quyết phát hiện đột biến mất đoạn gen là loại đột biến phổ cập

nhất gây bệnh DMD.
7.2. Về phơng pháp nghiên cứu
Kỹ thuật Multiplex PCR đã hoàn toàn thực hiện đợc trong điều kiện
Việt Nam để phục vụ phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin cho bệnh
nhân DMD.
7.3. Những đóng góp mới khác
Đã phát hiện tỉ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin ở những bệnh nhân
DMD là 51,6% để thông tin t vấn cho gia đình bệnh nhân.
Đã nêu ra đợc tỉ lệ đột biến mất đoạn ở nhóm bệnh nhân DMD TSDT
rõ là 52,9% và nhóm TSDT không rõ là 51,1%.
Đã nêu ra đợc phân bố đột biến mất đoạn ở 62 bệnh nhân DMD: Mất
đoạn ở vùng trung tâm của gen từ exon 44-52 là chủ yếu(89,3%); vùng
tận cùng 5 của gen từ exon 3-19 và vùng Pm hiếm xẩy ra hơn(10,7%).
Đề tài đã đóng góp đặt cơ sở cho chẩn đoán trớc sinh ở những gia
đình với những đột biến đã biết.
7.4. Hiệu quả đào tạo:
Đào tạo đợc một cử nhân kỹ thuật y học đã bảo vệ thành công khoá
luận tốt nghiệp năm 2005 đạt loại giỏi với đề tài Hoàn chỉnh kỹ thuật
multiplex PCR với exon 12 và 48 của gen dystrophin ở nhóm ngời
nam bình thờng
Tên cử nhân: Nguyễn Thị Hoàng Lan Quỳnh
Đào tạo 1 thạc sĩ y học:
- Cử nhân Sinh học: Mai Kiên Định chuyên nghành Hoá sinh- Đại học
quốc gia Hà nội. Niên khoá 2005-2007.
Tên đề tài: Phân tích đột biến mất đoạn gen dystrophin ở một số bệnh
nhân loạn dỡng cơ Duchenne đề tài sẽ bảo vệ vào tháng 10 năm 2007.
Đào tạo một Bác sĩ: Nguyễn Huyền Anh khoá học 2001-2007, sẽ tốt
nghiệp vào tháng 6 với khoá luận Phát hiện đột biến mất đoạn exon
46, 51 của gen dystrophin ở một số bệnh nhân loạn dỡng cơ
Duchenne đề tài đã bảo vệ vào tháng 5 năm 2007, đạt loại xuất sắc.

7.5. Hiệu quả về kinh tế xã hội

Bệnh loạn dỡng cơ Duchenne(DMD) là bệnh di truyền hay gặp trên lâm
sàng, tiên lợng nặng, cha có biện pháp chữa trị, có thể dẫn đến tàn phế,
mất khả năng đi lại và chết trớc tuổi trởng thành. Hiện nay bệnh đã có thể
chẩn đoán sớm dựa trên xét nghiệm enzym creatine kinase, tuy nhiên phuơng
pháp này không thể phát hiện đột biến gen và chẩn đoán trớc sinh để phòng
ngừa bệnh. Phơng pháp multiplex PCR thực hiện đợc trong điều kiện Việt
nam, với những bệnh nhân DMD Việt nam sẽ góp phần cho biết:
- Những exon nào hay xẩy ra đột biến mất đoạn gen từ đó lựa chọn một số
cặp mồi phù hợp hay xẩy ra mất đoạn(20 exon), để sàng lọc đột biến mất
đoạn gen cho bệnh nhân nhanh nhằm tăng khả năng phát hiện đột biến (vì
gen dystrophin lớn nhất của ngời chứa 79 exon nếu dò tìm sẽ rất tốn kém và
mất thời gian không phù hợp với điều kiện kinh tế của Việt nam).
- Phát hiện đột biến ở những bệnh nhân DMD Việt nam sẽ giúp thông
tin t vấn di truyền cho gia đình và đặt cơ sở cho chẩn đoán trớc sinh ở
những gia đình với những đột biến đã biết khi mẹ bệnh nhân muốn sinh con
tiếp theo hoặc chị em gái của bệnh nhân là dị hợp tử lành mang gen
bệnh(carrier) xây dựng gia đình muốn sinh con thì mẫu đột biến của bệnh
nhân thuộc gia đình này chính là đối chứng bệnh để chẩn đoán trớc sinh,
nếu thai mang đột biến nh vậy cần huỷ thai, nếu thai lành có thể sinh bình
thờng. Điều này có ý nghĩa quan trọng đáp ứng nguyện vọng sinh con khoẻ
mạnh ở những gia đình với những đột biến đã biết nhằm hạn chế tới mức thấp
sự ra đời của những trẻ bị bệnh DMD.
7.6. áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội:
Hoàn chỉnh và triển khai kỹ thuật multiplex PCR trong điều kiện Việt
nam để phát hiện đột biến mất đoạn gen cho các gia đình bệnh nhân DMD sẽ
giúp thông tin giải thích, t vấn cho gia đình về nguyên nhân và tác hại của
di truyền đột biến qua nhiều thế hệ để gia đình tự nguyện áp dụng biện pháp
phòng bệnh.

Triển vọng của kỹ thuật multiplex PCR đợc thực hiện với mẫu tế bào
bào thai nh: Tế bào dịch ối hoặc gai rau sẽ cung cấp thông tin cho chẩn
đoán trớc sinh ở những gia đình với đột biến đã biết cho những phụ nữ có
nguy cơ trong gia đình muốn sinh con nhằm tránh cho ra đời những trẻ bị
bệnh.
7.7. Thực hiện mục tiêu nghiên cứu:
Đề tài đã thực hiện đủ 2 mục tiêu nghiên cứu của đề tài đã đợc Bộ
phê duyệt và còn khảo sát thêm một số exon khác ở bệnh nhân và xét nghiệm
CK cho những ngời nữ liên quan đến bệnh nhân để t vấn di truyền.
7.8. Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cơng:
- Sản phẩm đạt yêu cầu so với dự kiến của bản đề cơng với mức độ tốt
và tin cậy(kết quả trong đề tài và kết quả bài báo đã công bố)
- Đã công bố 3 bài báo:
+ Phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin ở một số bệnh nhân loạn
dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp multiplex PCR- Báo cáo khoa học hội
nghị toàn quốc, đăng trong tuyển tập những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong
khoa học sự sống. 3/11/2005, tr 1435-1437.
+ Phát hiện đột biến mất đoạn exon 46 và 51 gen dystrophin ở một số
bệnh nhân DMD bằng kỹ thuật PCR. Tạp chí nghiên cứu y học, volume 45
(N
0
5)tháng 12/2006; tr 22-26.
+ Phát hiện đột biến mất đoạn exon 12và 48 của gen dystrophin ở một
số bệnh nhân DMD bằng kỹ thuật PCR. Tạp chí nghiên cứu y học, volume 46
(N
0
6) tháng 12/2006, tr 52-55.
7.9. Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
Tổng kinh phí của đề tài là 200.000 triệu đồng
Kinh phí còn lại: 6.000.000đ

Lý do là để nghiệm thu đề tài cấp cơ sở và cấp Bộ
Ngày tháng năm 2007
Chủ nhiệm đề tài
Phần A
Tóm tắt các kết quả Nổi Bật của đề tài
1. Tóm tắt các kết quả nổi Bật của đề tài
a. Đóng góp mới của đề tài:
Đã hoàn toàn thực hiện kỹ thuật multiplex PCR trong điều kiện Việt
nam để phục vụ phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin cho bệnh
nhân DMD.
Đã phát hiện tỉ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophy ở những bệnh nhân
DMD Việt nam là 51,6% để thông tin t vấn cho gia đình bệnh nhân.
Đã nêu ra đợc tỉ lệ đột biến mất đoạn ở nhóm bệnh nhân DMD TSDT
rõ là 52,9% và nhóm TSDT không rõ là 51%.
Đã nêu ra đợc phân bố đột biến mất đoạn ở 62 bệnh nhân DMD: Mất
đoạn ở vùng trung tâm của gen từ exon 44-52 là chủ yếu (89,3%);
vùng tận cùng 5 của gen từ exon 3-19 và vùng Pm hiếm xẩy ra hơn
(10,7%).

Đề tài đã đóng góp đặt cơ sở cho chẩn đoán trớc sinh ở những gia
đình với những đột biến đã biết
b. Kết quả cụ thể:
- Chiết tách ADN của 10 ngời nam bình thờng và 62 bệnh nhân DMD đã
kiểm tra độ tinh sạch và chất lợng ADN.
-Thực hiện phản ứng PCR với 19 cặp mồi cho 18 exon và vùng promotor cơ
của gen dystrophy ở 62 bệnh nhân nam DMD Việt nam và đã tìm ra tỉ lệ đột
biến mất đoạn gen dystrophy là 51,6%.
-Trong 62 bệnh nhân DMD của 60 gia đình có 44 gia đình TSDT không rõ
(73,3%), 16 gia đình TSDT rõ (26,7%); Tỉ lệ đột biến mất đoạn gen ở nhóm
bệnh nhân TSDT không rõ (51,1%) và rõ (52,9%).

-Phân bố đột biến mất đoạn gen tập trung ở vùng từ exon 44-52 là chủ yếu
chiếm tỉ lệ (89,3%); vùng tận cùng 5 từ exon 3-19 và vùng promotor cơ
hiếm gặp hơn (10,7%).
- Lập bảng tổng kết so sánh về chẩn đoán lâm sàng, tơng ứng với xét
nghiệm CK, TSDT trong gia đình và phân tích đột biến mất đoạn gen của 18
exon và vùng promotor cơ (Pm) của 62 bệnh nhân DMD.
- Đề tài cũng đã khảo sát thêm exon 46 cho 35 bệnh nhân (đã phát hiện đột
biến mất đoạn exon 46 ở 7 trờng hợp DMD).
- Đã xét nghiệm CK cho 20 bà mẹ bệnh nhân DMD và đã phát hiện 8 trờng
hợp có trị số CK tăng rõ rệt là ngời DHT lành mang gen bệnh đợc t vấn di
truyền.
- Đã xét nghiệm CK cho 8 chị em gái của bệnh nhân DMD và đã phát hiện 2
trờng hợp có CK tăng rõ là DHT lành mang gen bệnh, những trờng hợp
này đợc báo cho bố mẹ biết để gia đình biết có hớng phòng bệnh.
c. Hiệu quả đào tạo

Đào tạo đợc một cử nhân kỹ thuật y học đã bảo vệ thành công khoá
luận tốt nghiệp năm 2005 đạt loại giỏi với đề tài Hoàn chỉnh kỹ thuật
multiplex PCR với exon 12 và 48 của gen dystrophin ở nhóm ngời
nam bình thờng
Tên cử nhân: Nguyễn Thị Hoàng Lan Quỳnh
Đào tạo 1 thạc sĩ y học:
- Cử nhân Sinh học: Mai Kiên Định chuyên ngành Hoá sinh- Đại học quốc
gia Hà nội. Niên khóa 2005-2007.
Tên đề tài: Phân tích đột biến gen dystrophin ở một số bệnh nhân
loạn dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp PCR đề tài sẽ bảo vệ vào tháng
10 năm 2007.
Đào tạo một Bác sĩ: Nguyễn Huyền Anh khoá học 2001-2007, sẽ tốt
nghiệp vào tháng 6 với khoá luận Phát hiện đột biến mất đoạn exon
46, 51 của gen dystrophin ở một số bệnh nhân loạn dỡng cơ

Duchenne đề tài đã bảo vệ đạt loại xuất sắc.
d. Hiệu quả về kinh tế x hội
Bệnh loạn dỡng cơ Duchenne(DMD) là bệnh di truyền hay gặp trên lâm
sàng, tiên lợng nặng, cha có biện pháp chữa trị, có thể dẫn đến tàn phế,
mất khả năng đi lại và chết trớc tuổi trởng thành. Hiện nay bệnh đã có thể
chẩn đoán sớm dựa trên xét nghiệm enzym creatine kinase, tuy nhiên phuơng
pháp này không thể phát hiện đột biến gen và chẩn đoán trớc sinh để phòng
ngừa bệnh. Phơng pháp multiplex PCR thực hiện đợc trong điều kiện Việt
nam, với những bệnh nhân DMD Việt nam sẽ góp phần cho biết:
- Những exon nào hay xẩy ra đột biến mất đoạn gen từ đó lựa chọn một số
cặp mồi phù hợp hay xẩy ra mất đoạn(20 exon), để sàng lọc đột biến mất
đoạn gen cho bệnh nhân nhanh nhằm tăng khả năng phát hiện đột biến (vì
gen dystrophin lớn nhất của ngời chứa 79 exon nếu dò tìm sẽ rất tốn kém và
mất thời gian không phù hợp với điều kiện kinh tế của Việt nam).
- Phát hiện đột biến ở những bệnh nhân DMD Việt nam sẽ giúp thông tin cho
t vấn di truyền cho gia đình và đặt cơ sở cho chẩn đoán trớc sinh ở những
gia đình với những đột biến đã biết khi mẹ bệnh nhân muốn sinh con tiếp
theo hoặc chị em gái của bệnh nhân là dị hợp tử lành mang gen bệnh (carrier)
xây dựng gia đình muốn sinh con thì mẫu đột biến của bệnh nhân thuộc gia
đình này chính là đối chứng bệnh để chẩn đoán trớc sinh, nếu thai mang đột
biến nh vậy cần huỷ thai, nếu thai lành có thể sinh bình thờng. Điều này có
ý nghĩa quan trọng đáp ứng nguyện vọng sinh con khoẻ mạnh ở những gia
đình với những đột biến đã biết nhằm hạn chế tới mức thấp sự ra đời của
những trẻ bị bệnh DMD.
2. áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống x hội:
Hoàn chỉnh và triển khai kỹ thuật multiplex PCR trong điều kiện Việt
nam để phát hiện đột biến mất đoạn gen cho các gia đình bệnh nhân DMD sẽ
giúp thông tin giải thích, t vấn cho gia đình về nguyên nhân và tác hại của
di truyền đột biến qua nhiều thế hệ để gia đình tự nguyện áp dụng biện pháp
phòng bệnh.

Triển vọng của kỹ thuật multiplex PCR đợc thực hiện với mẫu tế bào
bào thai nh: Tế bào dịch ối hoặc gai rau sẽ cung cấp thông tin cho chẩn
đoán trớc sinh ở những gia đình với đột biến đã biết cho những phụ nữ có
nguy cơ trong gia đình muốn sinh con nhằm tránh cho ra đời những trẻ bị
bệnh.
3. Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cơng
nghiên cứu đ đợc phê duyệt
a. Tiến độ thực hiện
Đề tài thực hiện hơi chậm so với dự kiến ban đầu do số mẫu bệnh
nhân thiếu, vì cơ quan hợp tác đề tài phải gửi mẫu sang Nhật phân tích .
b. Thực hiện mục tiêu nghiên cứu:
Đề tài đã thực hiện đủ 2 mục tiêu nghiên cứu của đề tài đã đợc phê
Bộ duyệt và còn khảo sát thêm một số exon khác ở bệnh nhân và xét nghiệm
CK cho mẹ bệnh nhân và chị em gái của bệnh nhân để t vấn di truyền.
c. Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cơng:
- Sản phẩm đạt yêu cầu so với dự kiến của bản đề cơng với mức độ tốt
và tin cậy (kết quả trong đề tài và kết quả bài báo đã công bố)
- Đã công bố 3 bài báo:
+ Phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin ở một số bệnh nhân loạn
dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp multiplex PCR- Báo cáo khoa học hội
nghị toàn quốc, đăng trong tuyển tập những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong
khoa học sự sống. 3/11/2005, tr 1435-1437.
+ Phát hiện đột biến mất đoạn exon 46 và 51 gen dystrophin ở một số
bệnh nhân DMD bằng kỹ thuật PCR. Tạp chí nghiên cứu y học, vol 45 số 5 )
tháng 12/2006; tr 22-26.
+ Phát hiện đột biến mất đoạn exon 12và 48 của gen dystrophin ở một
số bệnh nhân DMD bằng kỹ thuật PCR. Tạp chí nghiên cứu y học, vol 46 (số
6),tháng 12/2006; tr 52-55.
d. Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
Tổng kinh phí của đề tài là 200.000 triệu đồng

Kinh phí còn: 6.000.000đ
Lý do là để nghiệm thu đề tài cấp cơ sở và cấp Bộ.
1
Phần b
nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên
cứu đề tài cấp bộ
Đặt vấn đề

Loạn dỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy (DMD)) là
bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X
và là bệnh di truyền phổ biến có
tần số cao nhất trong các bệnh cơ di truyền. Tiên lợng của bệnh nặng, có thể
dẫn đến tàn phế mất khả năng đi lại vào lúc 12-15 tuổi và chết ở lứa tuổi 18-
20 vì tổn thơng cơ tim và suy hô hấp [156].
Bệnh gây nên do di truyền hoặc đột biến mới phát sinh trong quá trình
tạo giao tử ở bố hoặc mẹ. Vì vậy bệnh liên tục xẩy ra ở Việt Nam cũng nh
các nớc trên thế giới.
Nguyên nhân của bệnh là do đột biến gen dystrophy (DMD) dẫn tới
không tổng hợp đợc dystrophin, protein này tham gia vào cấu trúc và chức
năng bảo vệ màng tế bào cơ, trong bệnh DMD vắng mặt hoàn toàn sản phẩm
dystrophin làm màng tế bào cơ bị huỷ hoại giải phóng enzym đặc hiệu của cơ
là creatine kinase (CK) vào máu và biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của
trẻ [59].
Gen dystrophy nằm trên nhiễm sắc thể X, nhánh ngắn vùng 2 băng 1
(Xp2.1), chiều dài 3000 Kb, chứa 79 exon với ít nhất 8 promotor đặc hiệu
mô và là gen lớn nhất của ngời đợc biết cho tới nay. Gen này mã hoá ra
mARN 14 Kb và tổng hợp sản phẩm protein tơng ứng là dystrophin có mặt
ở màng tế bào cơ [74] [120].
Tổn thơng đột biến gen dystrophy có thể rải rác khắp 79 exon và vùng
promotor của gen, nhiều nớc đã nghiên cứu về đột biến gen bệnh DMD cho

thấy mất đoạn gen là dạng đột biến phổ biến nhất chiếm tỉ lệ 50-70% và
2
nhân đoạn chiếm tỉ lệ 2-7%, còn lại là những đột biến điểm, thêm đoạn,
chuyển đoạn [27][29] [32] [38] [50] [53] [61] [63] [64].

ở
Việt nam, bệnh DMD đã đợc nghiên cứu về lâm sàng và giá trị của
phơng pháp đo hoạt độ creatine kinase(CK) trong chẩn đoán sớm và phát
hiện nữ dị hợp tử để t vấn di truyền [11] [13] [14] [18]. Phơng pháp CK
cho phép sàng lọc chẩn đoán nhanh, khá chính xác bệnh DMD nhng không
thể phát hiện đột biến gen bệnh và ứng dụng chẩn đoán trớc sinh.
Đối với những bệnh di truyền tiên lợng nặng nh bệnh DMD xu hớng
chung của thế giới là phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân, phát hiện những
ngời nữ dị hợp tử, t vấn di truyền và chẩn đoán trớc sinh nhằm mục đích
phòng bệnh.
Mất đoạn gen là dạng đột biến phổ cập nhất, để tiết kiệm thời gian và đỡ
tốn kém dò tìm 79 exon, các nớc thờng sử dụng phơng pháp Multiplex
PCR để khảo sát 18 exon, tập trung vào 2 vùng hot spots hay xẩy ra mất
đoạn của gen dystrophy.
Trong điều kiện Việt Nam, thật cần thiết u tiên phát triển kỹ thuật
Multiplex PCR phát hiện đột biến mất đoạn gen, để biết đột biến mất đoạn
hay xẩy ra ở những exon nào, từ đó lựa chọn những cặp mồi nào phù hợp để
tăng khả năng phát hiện đột biến mất đoạn gen, giúp cho t vấn di truyền và
đặt cơ sở cho chẩn đoán trớc sinh ở những gia đình với những đột biến đã
biết.
Xuất phát từ thực tế trên đề tài này nhằm 2 mục tiêu:
1. Sử dụng phơng pháp Multiplex PCR với 19 cặp mồi để phát hiện
khuyết đoạn gen dystrophy ở bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne.
2. Bớc đầu tìm hiểu xem exon nào của gen dystrophy thờng xảy ra mất
đoạn gen.

3
Chơng I
Tổng quan Tài Liệu
1.1.Đặc điểm di truyền của bệnh DMD
DMD là bệnh di truyền đơn gen, tuân theo qui luật di truyền lặn liên kết
nhiễm sắc thể X không có alen tơng ứng trên NST Y. Nguồn gốc của bệnh
do một gen đột biến duy nhất dẫn đến sự bất thờng của một loại phân tử
Protêin tơng ứng và biểu hiện thành các triệu chứng trên lâm sàng của bệnh.
Về mặt lý thuyết : Sáu khả năng có thể xẩy ra trong quần thể đối
với bệnh di truyền gen lặn liên kết NST X không có alen tơng ứng trên
NST Y.
- Khả năng 1: Bố X
D
Y lành x Mẹ lành X
D
X
D

- Khả năng 2: Bố X
D
Y lành x Mẹ lành mang gen bệnh(DHT) X
D
X
d

-Khả năng 3: Bố X
D

Y lành x Mẹ bệnh X
d
X
d
- Khả năng 4: Bố X
D
Y lành x Mẹ lành mang gen bệnh (DHT) X
D
X
d

-Khả năng 5: Bố X
d
Y bệnh x Mẹ lành mang gen bệnh (DHT) X
D
X
d

-Khả năng 6: Bố X
d
Y bệnh x Mẹ bệnh X
d
X
d

Trong quần thể ngời đối với bệnh DMD khả năng thứ 2 là hay gặp
nhất. Trong bệnh DMD trẻ trai bị bệnh thờng dẫn đến tàn phế và chết ở lứa
tuổi 18-20 tuổi, cho nên thờng không có khả năng xây dựng gia đình. Trong
bệnh BMD (Berker muscular dystrophy) cũng là bệnh di truyền lặn liên kết
nhiễm sắc thể X do đột biến gen dystrophy gây nên, nhng biểu hiện bệnh

nhẹ, tuổi thọ của bệnh nhân có thể tới 40 hoặc 50 tuổi cho nên bệnh nhân
BMD ngoài khả năng 2 hay gặp, còn có thể gặp khả năng thứ 4, thứ 5
[2][35][79].
Bệnh di truyền lặn liên kết NST X mang đặc điểm sau:
- Bệnh chủ yếu gặp ở con trai, ít gặp ở con gái.
4
- Ngời nữ có biểu hiện bình thờng nhng là dị hợp tử mang gen bệnh
(carrier) có khả năng truyền bệnh cho 50% số con trai và truyền gen
bệnh cho 50% số con gái của họ.
- Gen đột biến không bao giờ truyền trực tiếp từ bố sang con trai.
- Gen đột biến có thể truyền qua nhiều thế hệ trong dòng họ qua ngời mang
là nữ.
- Kết hôn cận huyết không làm tăng tỉ lệ bệnh DMD [2] .
Nguyên nhân của bệnh DMD có thể do di truyền gen bệnh từ mẹ
hoặc do đột biến mới nẩy sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ.
- Đột biến gen lặn liên kết NST X gây bệnh DMD xẩy ra trong quá
trình tạo giao tử ở nam qua thụ tinh tạo thành hợp tử sẽ đi vào thế hệ
con rồi đến cháu thuộc giới nữ, truyền bệnh cho cháu thuộc giới nam.
Gen bệnh sẽ đợc lu truyền, lan rộng dần trong dòng họ và quần thể
mà cha chịu áp lực của chọn lọc tự nhiên vì gen bệnh tồn tại ở dạng
dị hợp tử không biểu hiện thành bệnh. Tuỳ theo mức độ thích ứng mà
bệnh đợc đào thải một phần hoặc ngay thế hệ đó.
- Đột biến gen DMD xẩy ra trong quá trình tạo giao tử ở ngời nữ thì
qua thụ tinh đi vào hợp tử XY sẽ biểu hiện ngay thành bệnh ở giới
nam và chịu ngay áp lực chọn lọc ở chính thế hệ mang đột biến mới
nẩy sinh đó. Nếu đột biến đi vào hợp tử XX, qua các con cháu thuộc
giới nữ, những ngời nữ này sẽ truyền bệnh DMD cho con trai, và
truyền gen bệnh DMD cho con gái thuộc các thế hệ tiếp theo làm gen
bệnh càng lan rộng và tồn tại thời gian dài trong quần thể [2].
- Nữ mang gen biểu hiện bệnh: Biểu hiện bệnh ở giới nữ biến thiên rất

rộng, có thể bình thờng, nhng cũng có thể biểu hiện bệnh ở các mức
độ nhẹ, trung bình, thậm chí nặng tuỳ tỉ lệ NST X mang gen lành hay
bệnh bị bất hoạt [2] [138][147].
5
1.2. Tần số bệnh loạn dỡng cơ Duchenne
DMD là bệnh có tần số cao trong nhóm bệnh loạn dỡng cơ tuần tiến.
Nhiều nớc tiên tiến trên thế giới đã nghiên cứu tần suất bệnh DMD: Theo
Engel AG, Banker BQ ở Mỹ năm 1986 tần số bệnh DMD là 1/3500 trẻ trai
mới sinh[56]. Theo Jerry R. Mendell và Robert c. Griggs (1991) tần suất của
bệnh là 13-33/ 100.000 trẻ trai mới sinh sống [105]. Theo Fauci năm 1998
tần số là 30/100.000 trẻ trai mới đẻ sống [59]. Theo Behrman năm 1998 tần
số là 1/3600 trẻ trai đẻ sống [35].
ở
Hà Lan theo Van-essen(1992) tần số
bệnh DMD là 1/4215 trẻ trai mới đẻ sống [143]. Theo Zoltal papp, tần số là
1/2600- 1/2700 trẻ nam mới sinh [151].
ở Việt Nam, cha có công trình nào nghiên cứu về tần số bệnh DMD.
Theo công bố của Nguyễn Thu Nhạn và cộng sự năm 1991, thì từ năm
1981đến 1990 có 131 bệnh nhân vào điều trị tại khoa Nội tiết Chuyển hoá-
Di truyền Bệnh viện nhi quốc gia Hà Nội, chiếm 0,6% trong tổng số bệnh
nhân vào điều trị tại viện [11]. Theo Nguyễn Thị Phợng và cộng sự, từ năm
1981 - 1993 có 176 bệnh nhân DMD vào điều trị tại khoa Nội tiết-Chuyển
hoá- Di truyền Bệnh viện nhi quốc gia Hà Nội [13]. Theo Nguyễn Thị Trang
từ năm 1994-1999 có 112 bệnh nhân DMD điều trị tại khoa Nội tiết- Chuyển
hoá- Di truyền [18].
1.3. Cơ sở di truyền phân tử của bệnh DMD
1.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen dystrophy (DMD)
1. 3.1.1. Vị trí của gen dystrophy
Định khu của gen dystrophy nằm trên NST X, nhánh ngắn vùng 2,
băng 1, băng phụ 2 (Xp21.2) [59].

6

Hình 1.1 Bản đồ NST X và gen Dystrophy nằm ở vị trí không tơng
ứng với NST Y
(Trích dẫn bởi Fauci năm 1998 [59]
1.3.1.2.Cấu trúc của gen dystrophy
Gen Dystrophy là một trong những gen lớn nhất của ngời đã đợc
biết, lớn hơn 1000 lần gen

Glôbin, kích thớc khoảng hơn 2000 Kb
[35] [59].
Theo Den Dunnen năm 1989 kích thớc của gen dystrophy là trên
2300 kb [49]. Năm 1987-1988 các nhà nghiên cứu mới chỉ biết gen gồm
60 exons [156]. Năm 1993 gen DMD đã đợc biết gồm 79 exons và kích
thớc của gen đã đợc xác định là 2400 Kb [48][108]. Theo Roberts RG
năm 1993 gen dystrophy có chiều dài 3000 Kb là gen dài nhất của ngời
đã đợc biết tới nay, với 79 exon [120]. Những exon có chiều dài rất nhỏ,
trung bình khoảng 100 bp cho tới vài trăm bp, intron có chiều dài rất thay
đổi từ vài chục đến 300 kb[120]. Cấu trúc của gen DMD nh hình 1.2
(Theo Jean Kaplan năm 1993).