NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI VÔ TÍNH CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa L. Harms)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI VÔ TÍNH CÂY ĐINH LĂNG
(Polyscias fruticosa L. Harms)

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

NGÔ THỊ TÚ TRINH

Niên khóa:

2006 – 2010

Tháng 07/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI VÔ TÍNH CÂY ĐINH LĂNG

(Polyscias fruticosa L. Harms)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN VŨ PHONG

NGÔ THỊ TÚ TRINH

Tháng 07/2010


LỜI CẢM ƠN

Con xin thành kính ghi ơn Ba Má và hai em đã luôn tạo mọi điều kiện, ủng hộ và
động viên con hoàn thành tốt công việc học tập của mình.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Phong đã tận tình hướng dẫn, truyền
đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa
luận. Thầy là người thầy, người anh đáng kính của chúng em.
Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:
− Thầy Lê Đình Đôn, Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện
và nhiệt tình giúp đỡ cho chúng em trong suốt thời gian chúng em thực hiện đề tài tại
Bộ môn.
− Cô Tô Thị Nhã Trầm đã truyền đạt những kiến thức về chuyên môn cho em
trong thời gian thực tập.
− Các Thầy Cô thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học, Thầy Trần Ngọc Hùng đã tận
tình giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
− Anh Đinh Văn Cương đã giúp em rất nhiều trong thời gian thực hiện khóa
luận.

Mình xin gửi lời cảm đến các bạn lớp DH06SH cùng làm khóa luận tại phòng thí
nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học đã giúp giúp mình rất nhiều trong thời gian qua.
Đồng thời mình cũng xin cảm ơn đến các bạn sinh viên lớp DH07SH, các bạn sinh
viên ở phòng 513 cư xá E đã luôn động viên mình rất nhiều.
Chân thành cảm ơn.
Tháng 07 năm 2010
Ngô Thị Tú Trinh

i


TÓM TẮT

Cây Đinh lăng có hai hợp chất chính quan trọng là polyacetylen và saponin có
tác dụng chống stress, các triệu chứng trầm cảm, chống ung thư, chống oxy hóa, kháng
khuẩn và kháng nấm, được sử dụng rất nhiều trong y học. Ngoài ra, hai hợp chất
polyacetylen pannaxynol và hepadeca 1,8 (E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol trong cây Đinh
lăng cũng có chủ yếu trong Nhân sâm, cho thấy Đinh lăng có thể được sử dụng thay
thế cho Nhân sâm. Do đó việc nhân giống và làm tăng hàm lượng hợp chất thứ cấp
trong cây Đinh lăng cần được quan tâm. Nghiên cứu phát sinh phôi soma từ cây Đinh
lăng là một giai đoạn quan trọng trong nhân giống. Ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa có
nhiều kết quả về phát sinh phôi soma trên cây Đinh lăng được công bố. Xuất phát từ
tình hình nghiên cứu trên, đề tài “Nghiên cứu tạo phôi vô tính cây Đinh lăng
Polyscias fruticosa L. Harms” được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật
của Bộ môn Công nghệ Sinh học từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2010.
Nội dung nghiên cứu gồm nuôi cấy mô sẹo từ lá và thân cây Đinh lăng, và phát
sinh phôi soma từ tế bào mô sẹo được tạo thành.
Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã thu được một số kết quả sau: tế bào mô
sẹo được tạo thành từ lá của cây Đinh lăng trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L 2,4D và 0,2 mg/L TDZ; tế bào mô sẹo từ thân của cây Đinh lăng được tạo trên môi
trường MS có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,2 mg/L TDZ; quan sát có sự hình thành

phôi vô tính từ mô sẹo phát sinh từ tế bào lớp mỏng thân phát sinh trên các môi trường
MS có bổ sung 40% nước dừa và 0,5 mg/L 2,4-D, MS bổ sung 1 mg/L IAA và 0,5
mg/L BA và môi trường MS bổ sung 1 mg/L IAA và 0,2 mg/L TDZ.

ii


SUMMARY
Polyscias fruticosa L. Harms contains two important metabolites: polyacetylen
and saponin, which have many effects, such as: anti-stress, anti-cancer, antioxidant,
antibacterial, etc. It is usually used in medicine. Therefore, propagation and
enhancement secondary metabolites in Polyscias tree are essential issues. Studying
formation somatic embryo from Polyscias fruticosa is an important stage of
propagation. In Vietnam, there are only few studies on Polyscias fruticosa formation
somatic embryo declared. Since these research situations, the thesis “Study somatic
embryogenesis of Poyscias fruticosa L. Harms” was carried out.
The thesis contents two experiments: culture leave explant and thin cell layer of
Polyscias fruticosa L. Harms to collect calli, and formation somatic embryo from calli.
These results were achieved: calli-derived from leave explant in MS medium
supplemented with 1 mg/L 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 0,2 mg/L
thidiazuron (TDZ), collecting calli from thin cell layer in MS medium supplemented
with 0,5 mg/L 2,4-D and 0,2 mg/L TDZ, the media formulars suitble for somatic
embryogenesis were MS supplemented with 40% coconut water and 0,5 mg/L 2,4-D,
MS supplemented with 1 mg/L IAA and 0,5 mg/L BA, and MS supplemented with
1mg/L IAA and 0,2 mg/L TDZ.
Key words: Polyscias fruticosa L. Harms, calli, somatic embryo.

iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................i
TÓM TẮT ...........................................................................................................................ii
SUMMARY ....................................................................................................................... iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..............................................................................................vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................. viii
Chương 1 MỞ ĐẦU............................................................................................................ 9
1.1.

Đặt vấn đề ................................................................................................................... 9

1.2.

Yêu cầu của đề tài ...................................................................................................... 9

1.3.

Nội dung thực hiện ..................................................................................................... 9

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 2
2.1. Giới thiệu về Cây đinh lăng........................................................................................... 2
2.2. Các hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng ................................................................... 2
2.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................................................................................... 3
2.3.1.

Sự tạo mô sẹo .......................................................................................................... 3

2.3.1.1.

Khái niệm về mô sẹo ........................................................................................... 3

2.3.1.2.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo ........................................... 3

2.3.1.3.

Hình thái tế bào trong sự phát sinh mô sẹo ......................................................... 4

2.3.2.

Sự tạo phôi soma từ mô sẹo tế bào ......................................................................... 5

2.3.2.1.

Khái niệm phôi soma ........................................................................................... 5

2.3.2.2.

Đặc điểm của tế bào sinh phôi ............................................................................. 6

2.3.2.3.

Các giai đoạn phát triển của phôi soma ............................................................... 6

2.3.2.4.

Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự sinh phôi soma ......... 7

a. Ảnh hưởng của auxin trong sự cảm ứng tạo phôi soma ................................................ 8
b. Ảnh hưởng của cytokinin trong môi trường có auxin lên sự tạo phôi ........................... 9
2.4.

Một số nghiên cứu trên cây Đinh lăng ....................................................................... 9

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 11
3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 11
iv


3.2.

Vật liệu ..................................................................................................................... 11

3.2.1.

Đối tượng thí nghiệm ............................................................................................ 11

3.2.2.

Môi trường nuôi cấy.............................................................................................. 11

3.3.

Phương pháp ............................................................................................................. 12

3.3.1.

Nuôi cấy chồi Đinh lăng ....................................................................................... 12

3.3.2.

Nuôi cấy mô sẹo.................................................................................................... 12

3.3.2.1.

Tạo mô sẹo từ lá ................................................................................................ 12

3.3.2.2.

Tạo mô sẹo từ thân ............................................................................................ 13

3.3.3.

Phát sinh phôi soma từ mô sẹo ............................................................................. 13

3.3.3.1.

Phát sinh phôi từ mô sẹo lá ................................................................................ 13

3.3.3.2.

Phát sinh phôi từ mô sẹo thân............................................................................ 13

3.4.

Quan sát hình thái giải phẫu của quá trình tạo mô sẹo............................................. 13

3.5.

Xử lý số liệu ............................................................................................................. 14

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 15
4.1.

Sự nuôi cấy chồi ....................................................................................................... 15

4.2.

Nuôi cấy mô sẹo ....................................................................................................... 15

4.2.1.

Sự tạo mô sẹo từ lá ................................................................................................ 15

4.2.2.

Sự tạo mô sẹo từ thân ............................................................................................ 20

4.3.

Quan sát hình thái giải phẫu của quá trình tạo mô sẹo............................................. 26

4.4.

Sự phát sinh phôi từ mô sẹo thân ............................................................................. 26

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 29
5.1.

Kết luận .................................................................................................................... 29

5.2.

Đề nghị ..................................................................................................................... 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 30
PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D

2,4- dichlorophenoxyacetic acid

CW

Coconut water

Ctv

Cộng tác viên

NAA

α – Naphthalene acetic acid

MS

Murashige và Skoog

TDZ

Thidiazuron

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Sự đáp ứng của mẫu lá trên các môi trường theo thời gian ................................ 16
Bảng 4.2 Tỷ lệ phát sinh sẹo của lá theo thời gian ............................................................ 17
Bảng 4.3 Sự đáp ứng của mẫu cấy trên các môi trường theo thời gian ............................. 20
Bảng 4.3 (tt) Sự đáp ứng của mẫu cấy trên các môi trường theo thời gian ...................... 21
Bảng 4.4 Tỷ lệ phát sinh sẹo trên bề mặt lát cắt theo thời gian ......................................... 21
Bảng 4.5 Trọng lượng tươi của mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy.............................................. 27

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây Đinh lăng ....................................................................................................... 2

Hình 2.2 Hai con đường phát sinh phôi soma. .................................................................... 6
Hình 2.2 Các giai đoạn phát sinh hình thái trong sự............................................................ 7
Hình 4.1 Chồi cây Đinh lăng sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS0. .......................... 15
Hình 4.2 Sự phát sinh mô sẹo từ vết cắt lá Đinh lăng ở nghiệm thức MS2 sau 4 tuần. ..... 19
Hình 4.3 Sự phát sinh mô sẹo từ vết cắt lá Đinh lăng ở nghiệm thức MS3 sau 4 tuần. ..... 19
Hình 4.4 Sự phát sinh mô sẹo từ vết cắt lá Đinh lăng ở nghiệm thức MS6 sau 4 tuần. ..... 20
Hình 4.5 Sự phát sinh mô sẹo trên bề mặt lát cắt thân Đinh lăng . ................................... 23
Hình 4.6 Sự phát sinh mô sẹo trên bề mặt lát cắt thân Đinh lăng ..................................... 23
Hình 4.7 Sự phát sinh mô sẹo trên bề mặt lát cắt thân Đinh lăng . ................................... 24
Hình 4.8 Sự phát sinh mô sẹo trên bề mặt lát cắt thân Đinh lăng .................................... 24
Hình 4.9 Sự phát sinh mô sẹo trên bề mặt lát cắt thân Đinh lăng. .................................... 25
Hình 4.10 Sự phát sinh mô sẹo trên bề mặt lát cắt thân Đinh lăng . ................................. 25
Hình 4.11 Mô sẹo trên nghiệm thức MS2 (a.) và MS7 (b.) sau 10 tuần. ............................ 25
Hình 4.12 Giải phẫu mô sẹo phát sinh trên các môi trường sau 8 tuần nuôi cấy .............. 26
Hình 4.13 Mô sẹo trên nghiệm thức MS11 sau 4 tuần phát sinh phôi. ............................... 27
Hình 4.14 Mô sẹo phát sinh phôi trên nghiệm thức MS13. ................................................ 28
Hình 4.15 Mô sẹo phát sinh phôi trên nghiệm thức MS14. ................................................ 28

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa) thuộc họ Ngũ gia bì Araliaceae cùng họ với

cây Nhân sâm, được sử dụng nhiều trong y học dân gian Việt Nam và Trung Quốc
( />1.BB.83m). Cây Đinh lăng có nhiều tác dụng dược lý giống Nhân sâm, đặc biệt là tác
dụng làm tăng cường thể lực, tăng sức đề kháng và tăng cường khả năng thích nghi.

Trong cây Đinh lăng có hai hợp chất chính quan trọng là polyacetylen và saponin. Hợp
chất saponin, đặc biệt là triterpen, có tác dụng ức chế sự tạo thành malonyl dialdehyd
trong quá trình peroxyd hóa, chống stress và các triệu chứng trầm cảm. Hợp chất
polyacetylen có vai trò chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm
(trích dẫn bởi Lê Thiên Thư, 2006). Trong đó, hai hợp chất polyacetylen pannaxynol
và hepadeca 1,8 (E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol trong cây Đinh lăng cũng có chủ yếu
trong Nhân sâm, cho thấy Đinh lăng có thể được sử dụng thay thế cho Nhân sâm.
Nghiên cứu tạo phôi soma từ cây Đinh lăng là một giai đoạn quan trọng phục vụ
nhân giống và thu nhận các hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy rễ tóc biến đổi gene bởi vi
khuẩn Agrobacterium .
Ở Việt Nam, hiện nay vẫn chưa có kết quả nghiên cứu về phát sinh phôi soma
cây Đinh lăng được công bố. Do đó, đề tài "Nghiên cứu tạo phôi soma cây Đinh lăng
(Polyscias fruticosa L. Harms)” được thực hiện.
1.2.

Yêu cầu của đề tài
Xác định phương pháp khử trùng đoạn thân hiệu quả.
Theo dõi và ghi nhận thời gian xuất hiện mô sẹo, trọng lượng tươi mô sẹo.
Theo dõi và ghi nhận số mẫu phát sinh phôi.
Thuần thục thao tác giải phẫu mô.

1.3.

Nội dung thực hiện
Nuôi cấy chồi cây Đinh lăng để tạo vật liệu nghiên cứu.
Khảo sát sự cảm ứng hình thành mô sẹo từ mẫu lá và lát mỏng đoạn thân.
Nghiên cứu sự hình thành phôi soma từ mô sẹo
ix

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về Cây đinh lăng
Phân loại khoa học:
Giới (regnum): Plantae
(Không phân hạng): Angiosperma
(Không phân hạng): Eudicots
(Không phân hạng): Asterids
Bộ (order): Alpiales
Họ (familia): Araliaceae
Phân họ (subfamilia): Arialioideae
Chi (genus): Polyscias
Loài (species): P. fruticosa
Tên hai phần: Polyscias fruticosa L. Harms
( />83ng)

Hình 2.1 Cây Đinh lăng
Đinh lăng hay cây gỏi cá, nam dương sâm (danh pháp khoa học: Polyscias

fruticosa, đồng nghĩa: Panax fruticosum, Panax fruticosus) là một loài cây nhỏ thuộc
chi Đinh lăng (Polyscias) của họ Cam tùng (Araliaceae). Đa số Đinh lăng hiện nay
được trồng làm cây cảnh, chỉ có vài loài được trồng làm thuốc, loài Đinh lăng được
trồng làm thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa. Cây Đinh lăng có nhiều tác dụng
dược lý giống Nhân sâm, đặc biệt dược liệu từ cây Đinh lăng có tác dụng tăng cường
thể lực, tăng sức đề kháng và tăng khả năng thích nghi (Nguyễn Ngọc Dung, 1998)
Cây Đinh lăng là cây bụi cao 0,5 – 2 m, không lông, rễ cây phù như củ. Lá có mùi
thơm, hoa nhỏ 5 cánh, trái tròn, hơi dẹp có màu trắng bạc (Phạm Hoàng Hộ, 2000).

2.2. Các hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng
Cây Đinh lăng có chứa alkaloid, glycosid, saponin, các vitamin tan trong nước
như: B1, B2, B6, C và các phytosterin. Rễ Đinh lăng có tới 20 loại acid amin. Vỏ rễ và

lá Đinh lăng có chứa saponin (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004).

2


Lá Đinh lăng chứa saponin triterpen chiếm 1,65%, đây là một genin dạng acid
oleanolic.
Trung tâm Sâm và dược liệu thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được 5 hợp
chất polyacetylen từ lá Đinh lăng là: Panaxynol, Panaxydol, Heptedeca-1,8(E)-dien4,6-diyn-3,10-diol,

Heptedeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on,

Heptedeca-1,8(Z)-

dien-4,6-diyn-3-ol-10-on. Đặc biệt, hai chất Heptedeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3-ol-10on và Heptedeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on chỉ có trong lá Đinh lăng mà chưa
thấy trong các cây khác thuộc chi Panax và họ Araliaceae.
Trong rễ Đinh lăng cũng chỉ tìm thấy 5 hợp chất polyacetylen, trong đó có
Panaxynol, Panaxydol, Heptedeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 3 chất giống trong
lá. Ba chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư. Ngoài
ra, rễ Đinh lăng cũng chứa saponin triterpen.
2.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3.1. Sự tạo mô sẹo
2.3.1.1. Khái niệm về mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan
đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật…). Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của
mô phân sinh, phải chịu một sự phản phân hóa trước sự phân chia đầu tiên. Sự phản
phân hóa có vai trò rất quan trọng, nó cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại
trạng thái trẻ (trẻ hóa). Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi
soma trong điều kiện thích hợp.

Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan đã phân hóa của các cây song
tử diệp thường phản phân hóa dưới tác động của auxin (riêng rẽ hay kết hợp
với cytokinin) để cho ra mô sẹo. Mô sẹo tạo ra ngoài nguyên nhân do các tế
bào nhu mô chịu sự phản phân hóa còn do sự phân chia các tế bào tượng tầng,
sự xáo trộn trong các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo
cơ quan (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
2.3.1.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo
Sự tạo mô sẹo từ mẫu cấy ban đầu có thể chịu ảnh hưởng của các yếu tố bên
trong như: loại mẫu, tuổi mẫu,… hay các yếu tố bên ngoài như: điều kiện chiếu sáng,
nhiệt độ, vết thương, chất điều hòa sinh trưởng...
3


Chất điều hòa tăng trưởng có vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát sinh
mô sẹo, đặc biệt là auxin và cytokinin. Auxin cần thiết cho quá trình cảm ứng mô sẹo
từ mẫu cấy ban đầu. Việc sử dụng auxin có thể làm thay đổi đặc điểm sinh lý đã được
chương trình hóa của toàn bộ mô thực vật. Để đáp ứng lại việc cảm ứng với auxin, tế
bào chuyển sang trạng thái phản phân hóa và bắt đầu hình thành khối mô không tổ
chức. Khối mô này dưới điều kiện của môi trường nuôi cấy sẽ tạo thành khối tế bào có
khả năng phát sinh thành phôi hoặc không phát sinh thành phôi.
Đối với nhân sâm Triều Tiên, thực hiện việc nuôi cấy trên môi trường MS có bổ
sung 2,4-D có nồng độ cao hơn 0,5 mg/L đã có sự hình thành sẹo. Các mẫu nuôi cấy
trên môi trường 3 mg/L 2,4-D hình thành sẹo sau 10 ngày nuôi cấy, còn các mẫu nuôi
cấy trên môi trường không có 2,4-D lại không có sự hình thành sẹo. Các mô sẹo hình
thành trên môi trường có bổ sung 3 mg/L 2,4-D sinh trưởng mạnh, khối sẹo lớn lên rất
nhanh, có màu trắng, mềm, xốp, sau 2 tháng nuôi cấy có sự xuất hiện rễ bất định.
Trong khi đó, các mẫu nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ 2,4-D cao hơn 3 mg/L
thì sự sinh trưởng của khối sẹo càng giảm, không xuất hiện rễ bất định và sẹo già đi
nhanh chóng (Nguyễn Thành Sum và ctv, 2009). Như vậy, có thể thấy rằng sự có mặt
của 2,4-D có vai trò rất lớn trong sự hình thành mô sẹo của Sâm Triều Tiên. Nồng độ

của 2,4-D quá cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của khối sẹo tạo thành.
Cytokinin có vai trò quan trọng cho sự phân chia tế bào. Tác động của cytokinin
lên sự tăng trưởng của tế bào trong môi trường nuôi cấy mô lệ thuộc vào sự hiện diện
đồng thời của auxin. Những mô sẹo có thể hình thành trên môi trường không có sự
hiện diện của cytokinin thường được cho là do yếu tố cytokinin nội sinh.
Việc kết hợp auxin và cytokinin trong môi trường tạo sẹo thường áp dụng đối với
các cây song tử diệp.
2.3.1.3. Hình thái tế bào trong sự phát sinh mô sẹo từ các mảnh mô hay cơ quan
song tử diệp khi nuôi cấy in vitro
Ở các cây song tử diệp, auxin gây ra tình trạng rối loạn tổ chức của sinh mô ngọn
rễ, làm chậm sự kéo dài rễ, kích thích hoạt động của chu luân và nội bì ở vùng dưới
ngọn. Những tế bào sinh ra từ sự phân chia tế bào của chu luân và nội bì, dưới ảnh
hưởng của auxin, sẽ tạo một vùng tế bào phân sinh, giống như một vùng mô phân sinh
thứ cấp, và sau đó người ta thấy xuất hiện nhiều vùng mô phân sinh rễ. Ở thân, auxin
kích thích hoạt động của tượng tầng và có thể cảm ứng sự phản phân hóa của các tế
4


bào nhu mô vỏ trong, libe 1 và libe 2, các tia tủy và tủy để tạo nên những vùng mô
phân sinh rộng lớn. Các tế bào vỏ ngoài và các tế bào biểu bì thường chỉ phù ra mà
không phân chia. Sự biến đổi của các mô phân sinh mới được tạo ra thường không
theo kiểu phân hóa bình thường để cho ra hệ thống dẫn truyền bình thường.
Dựa vào các đặc điểm trên có thể xác định được hình thái mô sẹo phát triển theo
thời gian dưới kính hiển vi quang học.
2.3.2. Sự tạo phôi soma từ mô sẹo tế bào
2.3.2.1. Khái niệm phôi soma
Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là cùng một khái
niệm để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới
những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn
chỉnh (Dương Tấn Nhựt, 2007).

Một số tác giả phân biệt sự khác nhau của các loại phôi dựa vào nguồn gốc ban
đầu. Nguồn gốc phôi vôi tính khá đa dạng; phôi vô tính có thể có nguồn gốc từ mô mẹ
hoặc tiểu bào tử và hạt phấn, trái lại phôi soma bắt nguồn từ tế bào soma.
Phát sinh phôi soma là quá trình mà tế bào soma trải qua các điều kiện cảm ứng
để hình thành những tế bào sinh phôi và xảy ra một loạt những biến đổi về sinh hóa,
hình thái dẫn đến hình thành phôi soma. Tính toàn năng của tế bào là nền tảng trong
phát sinh phôi soma.
Có hai con đường phát sinh phôi soma: phát sinh phôi trực tiếp và phát sinh phôi
gián tiếp
™ Phát sinh phôi trực tiếp (direct somatic embryogenesis): phôi soma được
hình thành trực tiếp trên bề mặt của mẫu cấy ban đầu không qua giai đoạn trung
gian mô sẹo. Trong trường hợp này vẫn có sự hình thành mô sẹo trên bề mặt mẫu
cấy nhưng mô sẹo tăng sinh không đáng kể và mô sẹo xuất hiện trước sự hình
thành phôi.
™ Phát sinh phôi gián tiếp (indirect somatic embryogenesis): phôi soma
được phát sinh thông qua mô sẹo và thông thường mô sẹo sẽ được tăng sinh dồi
dào trước khi được cảm ứng hình thành phôi.
Trong sự phát sinh phôi trực tiếp, các tế bào có khả năng phát sinh luôn luôn hiện
diện và sự biểu hiện của chương trình phát sinh phôi phụ thuộc vào những điều kiện
thuận lợi. Trong khi sự phát sinh phôi gián tiếp cần phải có sự tái lập chương trình tế
5


bào, chủ yếu là cần thiết cho sự phản biệt hóa để thu được những tế bào có khả năng
phát sinh phôi ( Fracisco R. và ctv, 2006).

Hình 2.2 Hai con đường phát sinh phôi soma (Francisco R. và ctv, 2006).
2.3.2.2. Đặc điểm của tế bào sinh phôi
Trong hầu hết hệ thống sinh phôi được mô tả cho đến bây giờ, tế bào sinh phôi
chỉ ra những đặc điểm thông thường như của tế bào mô phân sinh như: tế bào có kích

thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến dưỡng mạnh mẽ, tốc độ phân chia cao, tế bào
chất đậm đặc với những hạt tinh bột, nhân lớn, hạch nhân giãn nở, không bào nhỏ,
vách tế bào mỏng.
Dựa vào những đặc điểm trên để phân biệt các tế bào có khả năng sinh phôi với
các tế bào không có khả năng sinh phôi.
2.3.2.3. Các giai đoạn phát triển của phôi soma
Nhìn chung, các giai đoạn phát triển của phôi soma cũng gần giống với của phôi
hữu tính. Phôi soma trải qua các giai đoạn như: phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình
cá đuối, phôi trưởng thành.
6


Hình 2.2 Các giai đoạn phát sinh hình thái trong sự
phát triển của phôi vô tính ở cây alfalfa
( />Ở thực vật, sự tái sinh thông qua phôi soma gồm có 5 bước, đó là:
™ Nuôi cấy lát cắt trên môi trường có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng
thực vật (auxin, cytokinin).
™ Tăng sinh khối tế bào mô sẹo được tạo thành trên môi trường đặc hoặc
lỏng có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng.
™ Chuyển khối tế bào có khả năng phát sinh phôi soma sang môi trường
loại bỏ dần hoặc không có chất điều hòa tăng trưởng để trải phôi soma trải qua
bước tiền trưởng thành. Trong giai đoạn này, sự tăng sinh của khối tế bào có khả
năng sinh phôi sẽ bị ức chế và kích thích sự hình thành và phát triển của phôi
soma.
™ Phôi soma trưởng thành trên môi trường bổ sung cytokinin hoặc giảm áp
suất thẩm thấu.
™ Tái sinh cây trên môi trường loại bỏ chất điều hòa tăng trưởng.
Trong mỗi giai đoạn, các tế bào sẽ chịu tác động của các tác nhân khác nhau.
Trong đó, giai đoạn cảm ứng được xem là quan trọng nhất cho sự phát sinh phôi soma.
Đó được xem như là sự khởi đầu nhằm khơi mào cho các đặc tính phản phân hóa để tế

bào có khả năng sinh phôi (Francisco R. và ctv, 2006).
2.3.2.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự sinh phôi soma

7


a. Ảnh hưởng của auxin trong sự cảm ứng tạo phôi soma
Auxin là yếu tố cần thiết cho sự phát triển của phôi, nó có ảnh hưởng khác nhau
trong từng giai đoạn của quá trình phát sinh phôi. Sự hiện diện của auxin riêng rẽ hay
kết hợp với một cytokinin là cần thiết cho sự thành lập các tế bào hay nhóm các tế bào
có khả năng sinh phôi, tuy nhiên auxin lại cản sự sinh phôi ở các pha tiếp theo. Nhu
cầu về loại auxin cũng như nồng độ auxin cho sự cảm ứng phôi thay đổi tùy thuộc vào
kiểu gene thực vật và loại mô sử dụng trong nuôi cấy. Tuy nhiên, 2,4-D và NAA được
sử dụng nhiều nhất, 2,4-D chiếm 50% và NAA chiếm 25% trong tổng số các trường
hợp phát sinh phôi (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Auxin liên quan đến sự khơi mào khả năng sinh phôi, chủ yếu trong giai đoạn
sớm của phôi, sau đó sẽ quay lại ức chế sự phát triển của phôi. Khi loại bỏ auxin ra
khỏi môi trường nuôi cấy, các khối tế bào sinh phôi sẽ trải qua quá trình biệt hóa từ
dạng hình cầu sang dạng hình tim, dạng cá đuối và thành cây con. Ở giai đoạn phôi
hình tim, người ta cho rằng, hàm lượng auxin là lớn nhất (Yin Hua Su và Xian Sheng
Zhang). Vai trò của auxin trong sự cảm ứng tạo phôi thông qua sự acid hóa vách tế bào
và tế bào chất.
Ở cà rốt, khi cảm ứng phát sinh phôi soma cần có sự có mặt của auxin sau đó
chuyển sang môi trường nuôi cấy không có hoặc có auxin ở nồng độ thấp. Trong
nghiên cứu tạo dịch treo tế bào cây Đinh lăng, Phạm Thị Tố Liên và Võ Thị Bạch Mai
(2006) đã nhận thấy rằng, sau khi phát sinh mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2
mg/L 2,4-D và 20% nước dừa, khối sẹo được chuyển sang môi trường có nồng độ 2,4D giảm đi một nửa kết hợp với BA và nước dừa là môi trường rất tốt cho quá trình
phát sinh phôi soma.
Tác dụng của auxin lên sự phát sinh phôi soma có thể là do ảnh hưởng của
auxin lên sự biểu hiện gene, từ đó nó làm xuất hiện nhiều thay đổi khiến tế bào

có thể được tái lập sang trạng thái có thể sinh phôi. Có nhiều cách để làm ngừng
lại các kiểu biểu hiện gene tại thời điểm đó của mô cấy để thay thế sự biểu hiện
đó bằng một chương trình sinh phôi. Một trong những cơ chế có thể làm ngưng
các biểu hiện của gene là methyl hóa DNA. Theo LoSchiavo (1989), sự methyl
hóa DNA đã thực sự xảy ra khi có sự tồn tại một lượng auxin ngoại sinh. Ngoài
ra, auxin còn có vai trò trong sự thành lập các tế bào có khả năng sinh phôi là do

8


chúng ảnh hưởng lên tính lưỡng cực của tế bào và kích thích các phân chia
không cân xứng sau đó (trích dẫn bởi Dương Tấn Nhựt, 2007).
b. Ảnh hưởng của cytokinin trong môi trường có auxin lên sự tạo phôi
Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng thực vật cần thiết cho sự sinh phôi soma ở
một số loài thực vật. Cytokinin có tác dụng kích thích sự tăng trưởng tế bào với điều
kiện có mặt auxin trong môi trường. Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân
chia tế bào: phân nhân và phân bào. Trong sự nuôi cấy các mô nghèo cytokinin, auxin
kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự
phân vách. Sự phân vách chỉ xảy ra khi có cytokinin ngoại sinh (Bùi Trang Việt, 2000
trích dẫn bởi Lê Thiên Thư, 2006).
Cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, nhưng đồng thời cũng có sự đối
kháng giữa auxin (giúp tạo rễ) và cytokinin (kích thích tạo chồi), sự cân bằng giữa hai
hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển.
Nhiều tác giả ghi nhận rằng, việc kết hợp cytokinin và auxin được cảm ứng tạo
phôi ở nhiều loài thực vật. Sự thêm cytokinin vào môi trường đã tăng cảm ứng tạo
phôi ở Dưa đỏ. Loại cytokinin rất thích hợp đối với cây thân gỗ là TDZ. Chỉ với hàm
lượng TDZ rất nhỏ cũng đủ kích thích quá trình phát sinh phôi. Ở Tiêu, phôi soma
được tạo ra trên môi trường có 2,4-D và TDZ nhưng nếu môi trường chỉ có chứa 2,4-D
thì quá trình tạo phôi không xảy ra.
Ở American gingseng, 2,4-D (9 µM) và BAP (2,2µM) đã được dùng cho môi

trường cảm ứng tạo phôi soma từ mẫu cấy của phôi hợp tử (Li và Guo, 1990); dicamba
(9 µM) và kinetin (5 µM) cảm ứng sự tạo phôi soma từ trụ thượng diệp và mô rễ
(Tirajo và Punja, 1995),2,4-D (9 µM) và kinetin (4,6 µM) được dùng để cảm ứng tạo
mô sẹo từ rễ, sau đó nuôi cấy trên môi trường bổ sung dicamba (9 µM) để hình thành
phôi (Wang, 1990 trích dẫn bởi Lê Thiên Thư, 2006).
2.4. Một số nghiên cứu trên cây Đinh lăng
Trên thế giới hiện nay hầu như chưa có nghiên cứu nào thực hiện trên cây Đinh
lăng. Hiện nay những nghiên cứu về cây Đinh lăng ở nước ta vẫn chưa có nhiều. Phạm
Thị Tố Liên, Võ Thị Bạch Mai (2006) đã nghiên cứu sự tạo dịch treo tế bào cây Đinh
lăng Polyscias fruticosa L. Harms và nhận thấy rằng ở nồng độ 2 mg/L 2,4-D thì thích
hợp cho phát sinh mô sẹo từ cây Đinh lăng; dịch treo tế bào được thu hoạch sau 8 tuần
khi nuôi cấy mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/L 2,4-D và 20% (w/w)
9


nước dừa. Lê Thiên Thư, Võ Thị Bạch Mai đã nghiên cứu những ảnh hưởng của các
chất kích thích sinh trưởng lên sự phát sinh và phát triển của mô sẹo từ lá và đốt thân
cây Đinh lăng, đồng thời khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố bên trong và bên ngoài lên
sự phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo và xác định 2,4-D là auxin ngoại sinh thích hợp
cho sự cảm ứng tạo mô sẹo ở mẫu cấy lá và thân của Đinh lăng, mô sẹo có sự sinh
phôi vô tính trong điều kiện không có auxin ngoại sinh sau 8 tuần. Để đánh giá tác
dụng dược lý của Đinh lăng từ phương pháp cấy mô so với Đinh lăng từ phương pháp
nuôi trồng tự nhiên, Nguyễn Trần Châu Đỗ Mai Anh và Nguyễn Phương Dung nhận
thấy rằng rễ Đinh lăng nuôi trồng nhân tạo trong 6 tháng thể hiện tác dụng tăng lực dài
ngày, chống stress nóng và kháng viêm thực nghiệm tương tự như rễ cây Đinh lăng 5
năm tuổi trồng trong điều kiện tự nhiên.

10

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 2 năm 2010 đến hết tháng 6 năm 2010 tại Phòng
thí nghiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm,
thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Đối tượng thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành trên cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L.
Harms. Chồi ngủ từ các cây Đinh lăng được trồng tại vườn ươm của Bộ môn
Công nghệ Sinh học.
3.2.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường dùng để nuôi cấy mầm ngủ cây Đinh lăng là môi trường MS
(Murashige và Skoog, 1962)
Khoáng đa lượng

Khoáng vi lượng

Sắt EDTA
Vitamin

Thành phần

Nồng độ (mg/L)

NH4NO3

1650

KNO3

1900

CaCl2.2H2O

440

MgSO4.7H2O

370

KH2PO4

170

MnSO4.4H2O

23,3

ZnSO4.7H2O

8,6

H3BO3

6,2

KI

0,83

Na2MoO4.2H2O

0,25

CuSO4.5H2O

0,025

CoCl2.6H2O

0,025

Na2.EDTA

37,3

FeSO4.7H2O

27,8

Myo- Inositol

100

11


Thiamin (B1)

0,1

Nicotinic acid

0,5

Pyridoxine HCl

0,5

Glycine

2

Bổ sung 30 g đường và 8 g agar/L môi trường, chỉnh pH = 5,8 ± 0,1. Hấp khử
trùng bằng autoclave ở 121oC, 1 atm trong 25 phút.
3.3. Phương pháp
3.3.1. Nuôi cấy chồi Đinh lăng
Phần thân non cây Đinh lăng có mang chồi ngủ được rửa sạch bằng xà phòng
loãng và được rửa lại bằng nước máy. Trong tủ cấy vô trùng, mẫu được lắc trong cồn
70o trong thời gian 30 giây, sau đó được rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng. Cho mẫu
vào trong dung dịch Javel (Super Sodium Hypochloride và Sodium Hydroxide) với tỷ
lệ javel: nước là 1:3, có thêm vài giọt Tween 20, lắc nhẹ trong thời gian 15 phút. Sau
đó mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần. Mẫu được cắt thành từng đoạn
khoảng 1 cm có mang chồi ngủ và cắm vào môi trường MS0. Các mẫu cấy được nuôi ở
phòng tăng trưởng với chu kỳ chiếu sáng 16 h/ ngày, nhiệt độ 24 ± 2 oC.
3.3.2. Nuôi cấy mô sẹo
3.3.2.1. Tạo mô sẹo từ lá
Lá Đinh lăng từ cây in vitro được tạo những vết thương và đặt úp trên môi trường
có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như dưới đây:

MS0: MS
MS1: MS0 + 0,2 mg/L TDZ
MS2: MS0 + 0,2 mg/L TDZ + 0,5 mg/L 2,4-D
MS3: MS0 + 0,2 mg/L TDZ + 1 mg/L 2,4-D
MS4: MS0 + 0,2 mg/L TDZ + 2 mg/L 2,4-D
MS5: MS0 + 20% CW
MS6: MS0 + 20% CW + 0,5 mg/L 2,4-D
MS7: MS0 + 20% CW + 1 mg/L 2,4-D
MS8: MS0 + 20% CW + 2 mg/L 2,4-D
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 5 mẫu.

12


Việc nuôi cấy được thực hiện trong tối ở nhiệt độ 24 ± 2oC. Theo dõi thời gian
phát sinh mô sẹo, quan sát hình thái mô sẹo, tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo. Số liệu
được ghi nhận mỗi 10 ngày, trong thời gian 50 ngày.
3.3.2.2. Tạo mô sẹo từ thân
Thân của cây Đinh lăng in vitro được cắt thành những lát mỏng và cấy vào
các môi trường MS 0 , MS1 , MS2 , MS 3 , MS 4 , MS 5 , MS6 , MS 7 , MS8 để tạo sẹo. Sự
nuôi cấy được thực hiện trong tối ở nhiệt độ 24 ± 2o C. Theo dõi thời gian phát
sinh và hình thái mô sẹo.
3.3.3. Phát sinh phôi soma từ mô sẹo
3.3.3.1. Phát sinh phôi từ mô sẹo lá
Mô sẹo từ các mẫu cấy của lá Đinh lăng trên môi trường tạo sẹo được cấy chuyền
sang môi trường cảm ứng sinh phôi. Các môi trường cảm ứng tạo phôi với nồng độ các
chất điều hòa sinh trưởng thay đổi như sau:
MS9: MS0 + 40% CW + 0,5 mg/L 2,4-D
MS10: MS0 + 40% CW + 1 mg/L 2,4-D
MS11: MS0 + 1 mg/L TDZ + 0,5 mg/L 2,4-D

MS12: MS0 + 1 mg/L TDZ + 1 mg/L 2,4-D
MS13: MS0 + 1 mg /L IAA + 0,5 mg/L BA
MS14: MS0 + 1 mg/L IAA + 0,2 mg/L TDZ
Quan sát biểu hiện của mẫu cấy và theo dõi thời gian cảm ứng tạo phôi của các khối sẹo.
3.3.3.2. Phát sinh phôi từ mô sẹo thân
Các khối sẹo tạo ra từ mẫu cấy thân của cây Đinh lăng sau khi phát sinh 8 tuần
được chuyển sang môi trường cảm ứng tạo phôi MS9, MS10, MS11, MS12, MS13, MS14.
Theo dõi thời gian các mẫu sẹo cảm ứng với môi trường.
3.4.

Quan sát hình thái giải phẫu của quá trình tạo mô sẹo
Những biến đổi của mẫu lá và lát cắt thân trong quá trình tạo mô sẹo, biến đổi

của mô sẹo được quan sát dưới kính hiển vi sau khi nhuộm mẫu bằng thuốc nhuộm 2
màu đỏ carmin và xanh iod.
Nhân tế bào được nhuộm bằng aceto carmin.
Phương pháp nhuộm tế bào:
− Ngâm lát cắt vào dung dịch javel khoảng 10 – 15 phút, rửa bằng nước cất nhiều lần.

13


− Ngâm lát cắt trong dung dịch acid acetic 1% trong 2 phút để tẩy sạch javel còn
sót lại. Rửa lại nhiều lần bằng nước cất.
− Ngâm lát cắt trong dung dịch xanh iod từ 5 – 10 giây. Rửa nhiều lần bằng nước cất.
− Ngâm tiếp vào dung dịch đỏ carmin khoảng 15 – 30 phút. Rửa bằng nước cất
cho đến khi dung dịch rửa hết màu.
Vi phẫu nhuộm xong được quan sát dưới kính hiển vi với các vật kính 4X, 10X, 40X.
3.5.

Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm MSTATC, kết quả được đọc dựa trên bảng

ANOVA và bảng trắc nghiệm phân hạng.

14


Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Sự nuôi cấy chồi
Các đoạn thân có mang chồi ngủ của cây Đinh lăng sau 1 tuần nuôi cấy trên môi
trường MS0 bắt đầu tăng trưởng, sau 3 tuần các chồi tăng trưởng tốt với 2 lá.

Hình 4.1 Chồi cây Đinh lăng sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS0.
4.2.

Nuôi cấy mô sẹo

4.2.1. Sự tạo mô sẹo từ lá
Sau 10 ngày nuôi cấy, các mẫu lá bắt đầu có hiện tượng cảm ứng với các
môi trường khác nhau. Tế bào mô sẹo xuất hiện xung quanh vết cắt trên
nghiệm thức MS 2 , MS 3 , MS 4 , MS 6 , MS 7 , MS 8 và gia tăng kích thước theo thời
gian. Ở các nghiệm thức MS 1 , MS 5 không thấy hiện tượng cảm ứng hình
thành mô sẹo. Ở nghiệm thức MS 1 mẫu có hiện tượng phù lên, nhưng sau đó
mẫu cấy bị hóa nâu và chết.

15