KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ LÂY NHIỄM Agrobacterium tumefaciens VÀO PHÔI HỮU TÍNH THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) VÀ SỰ THỂ HIỆN GEN uidA

 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ
LÂY NHIỄM Agrobacterium tumefaciens VÀO PHÔI
HỮU TÍNH THÔNG NHỰA (Pinus merkusii)
VÀ SỰ THỂ HIỆN GEN uidA

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN CAO LÊ HIỀN

Niên khóa

: 2006 - 2010

Tháng 07/2010

 


 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ
LÂY NHIỄM Agrobacterium tumefaciens VÀO PHÔI
HỮU TÍNH THÔNG NHỰA (Pinus merkusii)
VÀ SỰ THỂ HIỆN GEN uidA

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. VƯƠNG ĐÌNH TUẤN

NGUYỄN CAO LÊ HIỀN

Tháng 07/ 2010

 


 

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

− Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh
− Quý Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học, Quý Thầy Cô trực tiếp giảng dạy
đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập ở trường.
− TS. Vương Đình Tuấn luôn tận tình hướng dẫn con trong nghiên cứu khoa học.
Những lời thầy nói, thầy dạy sẽ là những bài học quí giá cho chặng đường phía trước
của con.
− TS. Lê Đình Đôn, Trưởng khoa Công nghệ sinh học, đã trau dồi cho con những bài
học quí giá, luôn tận tình quan tâm, giúp đỡ, thuyết phục và dẫn dắt con đến với đề tài
vô cùng lý thú này.
− Chị Lâm Ngọc Vân Thanh, người đồng hành cùng em trong suốt sáu tháng làm đề
tài. Với những kiến thức, kĩ năng chị truyền đạt cùng những lời động viên, chia sẻ
những vui buồn cùng em, chị tạo cho em thêm nhiều nghị lực và niềm vui để vượt qua
các giai đoạn khó khăn giúp em hoàn thành tốt đề tài. Trong thời gian thực hiện đề tài
chị còn dạy em rất nhiều bài học quí giá trong cuộc sống.
− Anh Nguyễn Xuân Cường - Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam bộ
luôn tận tình giúp đỡ khi em gặp khó khăn trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
− Các bạn lớp CNSH khóa 06 động viên tôi rất nhiều trong thời gian làm đề tài.
− Người bạn thân thiết của tôi - Lý Sơn Tùng vì sự nhiệt tình và những nổ lực không
mệt mỏi của bạn, bạn luôn bên cạnh ủng hộ, động viên giúp tôi lấy lại niềm tin và
thăng bằng những lúc tôi gặp khó khăn nhất.
− Cảm ơn hai chị và em trai của tôi vì mọi người rất tin tưởng vào tôi.
− Cuối cùng, con xin gửi tới ba má, Nguyễn Thông và Lê Thị Sen lòng biết ơn… vì
tất cả những gì ba má đã giành cho con.
Tp. Hồ Chí Minh ngày 14 tháng 07 năm 2010
Nguyễn Cao Lê Hiền

i

 

 

TÓM TẮT
Pinus merkusii là một loài thông cung cấp sản lượng nhựa cao nhất thế giới, nhựa
thông có giá trị kinh tế trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Tuy nhiên, những năm
gần đây hàng ngàn hecta thông nhựa tại một số vùng ở nước ta như Hoàng Mai (Nghệ
An), Sơn Viện (Thanh Hóa), Yên Lập (Quảng Ninh)… bị tàn phá nghiêm trọng do
dịch sâu róm gây hại. Vì vậy, việc tạo ra giống thông nhựa kháng sâu róm là hết sức
cần thiết trong sản xuất. Phương pháp lai tạo truyền thống tốn nhiều thời gian và công
sức. Những tiến bộ ứng dụng khoa học công nghệ gen trong hơn một thập kỉ qua đã
cho thấy tiềm năng ứng dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen
kháng sâu (Bt) và tạo được cây kháng sâu trên một số loại cây nông và lâm nghiệp.
Vì thế, trong định hướng tạo giống cây thông kháng sâu róm bằng
Agrobacterium tumefaciens chúng tôi thực hiện bước khảo sát một số yếu tố ảnh
hưởng đến sự lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens vào phôi hữu tính thông nhựa
(pinus merkusii) và sự thể hiện gen uidA.
Kết quả đã thực hiện được việc chuyển gen chỉ thị uidA vào phôi chín của thông
nhựa dòng 2 ở các nồng độ OD600nm = 0,5; 0,7; 0,9 với thời gian lây nhiễm là 60 phút
và 90 phút. Gen chỉ thị uidA ở nồng độ OD600nm = 0,9, thời gian lây nhiễm 90 phút, có
gây vết thương cơ giới cho biểu hiện cao nhất trong các yếu tố khảo sát. Nồng độ
timentin 600 mg.l-1 cho hiệu quả cao nhất trong việc loại vi khuẩn dư sau lây nhiễm.
Các phôi đã biến nạp đang được nuôi cấy trên môi trường có chứa 40 mg.l-1
kanamycin phục vụ cho chọn lọc chuyển thành gen bền vững. Việc theo dõi các phôi
đã biến nạp trên môi trường chọn lọc đang được tiếp tục theo dõi.

ii

 

 

SUMMARY
The title of graduation thesis is “Investigation of some factors affecting
transformation of Bt gen in zygotic embryos of Pinus merkusii mediated by
Agrobacterium tumefaciens”. This thesis was supervised by Dr. VUONG DINH
TUAN. The work was carried out from January to June 2010 at Nong Lam university.
Pinus merkusii (Jungh et de Vriese) is one of the few truly tropical pine species
of the world with great ecological and economic importances. Especially, this species
give high content of resin with a high economic value in many different industries. Our
country has the potential to grow, exploitation and processing of resin. However,
recently years, thousand hectare P.merkusii were severely demaged by an epidemic of
Dendrolimus Punctatus insect in several provines such as Nghe An, Thanh Hoa,
Quang Ninh…
It is therefore, development of Pinus variety resistant to Dendrolimus insect is a
very critical requirement for improving this highly economic value species. Traditional
breeding programe can help to develop such a variety. However, the method is
required time and labour. Recent successful results in application of gene
transformation technique in several agriculture and forestry species imply that this
technique can be applied to improve resistance of Pinus merkusii using Agrobacterium
tumefaciens. This study aims at finding out some factors affecting transformation of Bt
gene in zygotic embryos of Pinus merkusii mediated by Agrobacterium tumefaciens
Our result showed that kanamycin at 40 mg.l-1 can be used as a lethal threshold
level for selection of stable transformation. Concentration of Agrobacterium
tumefaciens at OD600nm = 0,9 gave the highest ratio of GUS expression on the
transformed embryos. Timentin at 600mg.l-1 could be used to eliminate excess
Agrobacterium tumefaciens after transformation. Transformants are under selection
process on kanamycin containing medium.

iii

 


 

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ....................................................................................................................... i
Tóm tắt .............................................................................................................................ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................vii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục đích và yêu cầu ................................................................................................. 2
1.2.1. Mục đích ................................................................................................................ 2
1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................................. 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung về thông nhựa ............................................................................... 3
2.1.1. Phân loại ................................................................................................................ 3
2.1.2. Phân bố ................................................................................................................. 3
2.1.3. Đặc điểm sinh thái ................................................................................................. 4
2.1.4. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của thông nhựa .................................................. 4
2.1.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trong nước và trên thế giới ................................... 5
2.1.5.1. Trên thế giới ....................................................................................................... 5

2.1.5.2. Ở Việt Nam......................................................................................................... 5
2.1.6. Tình hình nghiên cứu chuyển gen trên Pinus trong nước và thế giới ................... 5
2.1.6.1. Trên thế giới ....................................................................................................... 5
2.1.6.2. Ở Việt Nam......................................................................................................... 7
2.2. Giới thiệu chung về chuyển gen thực vật ................................................................. 7
2.2.1. Định nghĩa chuyển gen .......................................................................................... 7
2.2.2. Thực vật chuyển gene ............................................................................................ 7
iv

 


 

2.2.3. Tóm tắt lịch sử phát triển của công nghệ chuyển gen thực vật ............................. 9
2.2.4. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật ......................................................... 10
2.3. Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens............................................................. 11
2.3.1. Giới thiệu đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ................ 11
2.3.2. Những nghiên cứu về chuyển gen thông qua A.tumefaciens .............................. 11
2.3.3. Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chuyển gen bằng A. tumefaciens ............ 15
2.3.4. Chuyển gen ở cây có quả hình nón thông qua vi khuẩn A.tumefaciens .............. 16
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 17
3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm............................................................................ 17
3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 17
3.2.1. Đối tượng thí nghiệm .......................................................................................... 17
3.2.2. Hóa chất sử dụng ................................................................................................. 17
3.2.3. Vi khuẩn A.tumefaciens ....................................................................................... 17
3.2.4. Môi trường nuôi cấy ............................................................................................ 17
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 18
3.3.1. Bố trí thí nghiệm .................................................................................................. 18

3.3.2. Cách thu phôi hữu tính ........................................................................................ 18
3.4. Khảo sát ngưỡng gây chết của kanamycin trên phôi hữu tính dòng 2 .................. 18
3.5. Xác định nồng độ timentin thích hợp để loại vi khuẩn dư sau lây nhiễm .............. 19
3.6. Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm A.tumefaciens vào phôi ................ 19
3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp gây vết thương cơ giới ........................... 20
3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn và thời gian lây nhiễm .................... 20
3.7. Nghiên cứu chọn lọc vật liệu biến nạp gen sau chuyển gen trên môi trường chọn lọc......... 21
3.8. Phương pháp xử lí số liệu ....................................................................................... 21
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 22
4.1. Kết quả .................................................................................................................... 22
4.1.1. Kết quả ngưỡng gây chết của kanamycin trên phôi hữu tính .............................. 22
4.1.2. Kết quả nồng độ timentin thích hợp để loại vi khuẩn dư sau lây nhiễm……. ... 23
4.1.3. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm .......................... 25
4.1.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp gây vết thương cơ giới .......... 25
4.1.3.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm và nồng độ vi khuẩn .................. 26
4.1.4. Kết quả loại vi khuẩn dư sau lây nhiễm của timentin ......................................... 28
v

 


 

4.1.5. Kết quả nghiên cứu chọn lọc vật liệu biến nạp gen sau chuyển gen ................... 29
4.2. Thảo luận ................................................................................................................ 30
4.2.1. Ngưỡng gây chết của kanamycin ........................................................................ 30
4.2.2. Nồng độ timentin để diệt khuẩn dư sau lây nhiễm ............................................. 31
4.2.3. Ảnh hưởng của vết thương cơ giới lên sự biến nạp ............................................ 31
4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn và thời gian lây nhiễm đến sự biến nạp……… 32
4.2.5. Tỉ lệ phôi sống và sạch khuẩn sau lây nhiễm thể hiện ........................................ 33

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 34
5.1. Kết luận................................................................................................................... 34
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 35
PHỤ LỤC

vi

 


 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BA: 6-Benzyl Adenin
Ctv: Cộng tác viên
DNA: Deoxyribonucleic acid
GUS: enzyme β-glucuronidase
LB: Luria Bertani broth, 1951
µg: Microgam
µl: Microlitre
µM: Micromol/litre
OD: Optical density
TE: Tang et al, 1998
T-DNA: Transferring DNA
UidA: β-glucuronidase gene

vii

 

 

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang
Bảng 2.1 Tóm tắt lịch sử chuyển gen thực vật ............................................................... 9
Bảng 2.2 Các tính trạng chuyển gen được quan tâm nhất ............................................ 10
Bảng 2.3 Các cây đã được biến nạp di truyền............................................................... 11
Bảng 2.4 Các cây được biến nạp gián tiếp qua A.tumefaciens ..................................... 12
Bảng 3.1 Bảng bố trí nghiệm thức thí nghiệm 2........................................................ 21
Bảng 4.1 Tỉ lệ sống của phôi trên môi trường TE bổ sung kanamycin ........................ 22
Bảng 4.2 Tỉ lệ phôi sống trên môi trường TE rắn bổ sung timentin ............................. 23
Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của vết thương cơ giới đến quá trình lây nhiễm ...... 25
Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của vết thương cơ giới đến tỉ lệ phôi thể hiện GUS....... 25
Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn và thời gian lây nhiễm .......... 26
Bảng 4.6 Tỉ lệ phôi sống, sạch khuẩn sau lây nhiễm ................................................ 28
Bảng 4.7 Tỉ lệ phôi sống trên môi trường 40 mg.l-1 kanamycin sau bốn tuần .............. 29

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang
Hình 4.1 Màu sắc và hình thái phôi trên môi trường TE có bổ sung kanamycin ......... 23
Hình 4.2 Tỉ lệ phôi sống trên môi trường TE bán rắn bổ sung timentin ................. 24
Hình 4.3 Biểu hiện GUS ở phôi hạt chín thông nhựa dòng 2 .................................. 26
Hình 4.4 Biểu hiện GUS ở nồng độ OD600nm = 0.7; 60 phút .................................... 28
Hình 4.5 Phôi trên môi trường TE rắn bổ sung 400 mg.l-1 timentin ............................. 29
Hình 4.6 Phôi trên môi trường TE rắn bổ sung 40 mg.l-1 kanamycin .......................... 30

viii

 


 

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thông là một trong những nguồn tài nguyên thực vật quí giá của nước ta. Thông
không những là nguồn cung cấp gỗ với tỉ lệ cellulose cao (trên 62%), mà còn là chiếc
máy lọc không khí khổng lồ, điều hòa khí hậu, điều hòa nước. Bên cạnh đó, thông còn
là cây có tiềm năng trong việc phủ xanh đất trống đồi trọc, bảo vệ và ngăn chặn gió
bão, chống xói mòn. Quan trọng hơn hết, thông là một loại cây cung cấp nhựa có giá
trị kinh tế rất cao. Nhựa thông tinh khiết chứa 13 - 20% tinh dầu và 68 - 70% tùng
hương (colophan) được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp khác nhau.
Ở nước ta, thông nhựa là loài thông được trồng nhiều nhất và cung cấp nhựa nhiều
nhất trong 6 loài thông (cây 15 - 20 tuổi bắt đầu cho nhựa, bình quân 4 – 6,5
kg/cây/năm và có thể khai thác trong 40 - 50 năm). Tuy nhiên, trong khoảng 10 năm
trở lại đây, sản lượng nhựa thông đang giảm sút trầm trọng do các dịch sâu hại từ
thông đuôi ngựa lây lan sang. Trong đó, nổi bật và nghiêm trọng nhất là dịch sâu róm
làm hàng ngàn hecta thông nhựa bị tàn phá. Hàng năm trên thế giới tốn rất nhiều chi
phí trong việc phòng trừ sâu hại (trong năm 2000 tổng chi phí thuốc trừ sâu hóa học
trên toàn thế giới là gần 5 tỷ đôla). Hơn nữa, việc phòng trừ dịch hại này thường gây ô
nhiễm môi trường ngày càng nghiêm trọng. Tại Campuchia, Indonesia, Lào,
Philippines và Thái Lan, Pinus merkusii là một loài cây bị đe dọa mà có thể được tìm
thấy trong danh sách các loài ưu tiên cho việc bảo tồn (Koskela và ctv, 2002).
Nghiên cứu chuyển nạp gen Bt (từ Bacillus thuringiensis) vào cây thông để cây tự
sản sinh các protein gây chết sâu hại đang rất được ứng dụng trong tạo giống kháng
sâu ở nhiều loài cây nông nghiệp và lâm nghiệp. Một khi được mang gen Bt, cây sẽ

hạn chế được sự tấn công của sâu hại.
Để tạo được cây thông kháng sâu róm thông qua ứng dụng kĩ thuật chuyển gen
bằng Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi đã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng
đến quá trình chuyển gen như ngưỡng kháng sinh kanamycin (phục vụ chọn lọc tính
kháng bền vững), nồng độ vi khuẩn, vết thương cơ giới, ngưỡng kháng sinh timentin
(phục vụ loại vi khuẩn dư sau chuyển gen) là hết sức cần thiết.

1

 


 

1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng tốt nhất đến sự lây nhiễm
Agrobacterium tumefaciens vào phôi hữu tính thông nhựa (Pinus merkusii) và sự thể
hiện gen uidA trên vật liệu biến nạp gen.
1.2.2. Yêu cầu
Thu được kết quả tạm thời thể hiện gen và vật liệu biến nạp gen sống được trên
môi trường chọn lọc có kanamycin.
1.3. Nội dung thực hiện
Thực hiện việc chuyển gen uidA vào phôi chín thông nhựa dòng 2 bằng vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Các thí nghiệm:
(I) Khảo sát ngưỡng gây chết của kanamycin trên phôi hữu tính thông nhựa
dòng 2
(II) Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm Agrobacterium
tumefaciens vào phôi hữu tính

+ Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp gây vết thương cơ giới đến quá
trình lây nhiễm
+ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn và thời gian lây nhiễm đến
quá trình biến nạp
(III) Xác định nồng độ timentin thích hợp để loại vi khuẩn dư sau lây nhiễm
(IV) Nghiên cứu chọn lọc vật liệu biến nạp gen trên môi trường chọn lọc bền vững.
Giới hạn của đề tài:
Thông nhựa là loài cây lâu năm nên yêu cầu thời gian dài để tạo chồi từ phôi trong điều kiện
in vitro, nhưng thời gian thực hiện đề tài có hạn (từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2010), vì thế chúng tôi
không có đủ thời gian để tái sinh chồi từ các vật liệu này mà chỉ theo dõi được tỉ lệ thể hiện gen
GUS sau khi chuyển gen Bt và bước đầu theo dõi vật liệu chuyển gen trên môi trường chọn lọc.

2

 


 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về thông nhựa
2.1.1. Phân loại
Tên tiếng Anh

Sumatran Pine

Tên khoa học

Pinus merkusii

Giới

Plantae

Ngành

Gymnospermae

Phân ngành

Pinicae

Lớp

Pinopsida

Phân lớp

Pinida

Bộ

Pirales

Họ

Pinaceae

Chi

Pinus

Loài

P. merkusii

2.1.2. Phân bố
Thông nhựa là loài thông nhiệt đới. Thông nhựa có phân bố tự nhiên trải rộng
theo phía Nam đường xích đạo và là cây đặc hữu của vùng khí hậu nhiệt đới Đông
Nam Á: Trung Quốc (đảo Hải Nam), Myanma, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Campuchia,
Indonesia (đảo Sumatra, namely Aceh, Tapanuli và Kerinci) và Philippin (đảo Luzon
và Mindoro) (Rajendra và ctv, 2008; Iskandar Z. Siregar và ctv, 1999). Ở Việt Nam,
thông nhựa phân bố trong một vùng rộng lớn hay tập trung thành những nhóm nhỏ ở
nhiều tỉnh nhưng chủ yếu là ở hai tỉnh Kon Tum và Lâm Đồng. Vùng phân bố rộng
nhất được phát hiện ở tây bắc Thái Lan, đông nam Mianma, và phía bắc Sumatra
(Nghĩa và ctv, 2005). Ngoài ra thông nhựa còn được tìm thấy ở một vùng lãnh thổ
rộng từ đông nam Ấn Độ đến miền nam Tây Tạng, có vùng phân bố rộng từ vài mét
đến hơn 1800 m so với mực nước biển (Rajendra và ctv, 2008). Thông nhựa được tìm
thấy ở nhiều loại đất và vùng khí hậu khác nhau, là loài cây thích nghi với lửa và mùa
khô hạn (Cooling, 1968).

3

 


 

2.1.3. Đặc điểm sinh thái
Thông nhựa là cây gỗ lớn, lá hình kim màu xanh, cao 25 - 45 m với độ dài cành

tới 1 m, cành cứng và giòn. Cây non có tán dạng tháp hoặc nón, cây già có tán cao và
trải rộng hơn, góc phân cành từ 25 - 800. Lá rất mảnh, cứng, thẳng, dài 15 – 25 cm, lá
kim mỏng hơn 1 mm, mọc thành chùm 2 lá, màu xanh đậm. Lá kim tồn tại trong 2
năm, lá khô có trọng lượng từ 60 – 90 mg/chùm (Rajendra và ctv, 2008). Thân thẳng
tròn, chứa nhiều nhựa, đường kính 60 - 70 cm có khi tới 1 m. Vỏ dày, màu nâu đỏ
nhạt, nứt dọc sâu. Gỗ màu hồng. Gốc lá có bẹ màu nâu nhạt dài từ 1 - 1,5 cm đính
vòng xoắn ốc vào cành lớn.
Thông nhựa là loài cây lưỡng tính, nón đực mọc ra ở nách các bẹ lá. Có chiều
rộng từ 2 - 3 cm, chiều dài 4 - 5 cm, màu vàng nhạt khi chín có màu vàng đậm. Là cây
tự thụ phấn nhờ gió nên nón tập trung chủ yếu ở những cành nằm phía dưới tầng tán
lá, nón cái tập trung chủ yếu ở phần trên của tán lá. Nón cái được mọc ra ở các đầu
cành, thường có 2 - 4 nón, nón gồm nhiều vảy xếp hình trôn ốc, bên trong có vảy chứa
noãn. Cuống nón thường thẳng và dài 1,5 cm. Hoa nở tháng 5 - tháng 6, quả nón chín
tháng 8 - tháng 9 năm sau. Khi quả chín thì có màu vàng xậm, chiều dài quả 10 - 12
cm, đường kính quả 3 - 4 cm. Hạt thông nhựa hình trái xoan, hơi dẹt, dài 5 - 6 mm và
có cánh, cánh hạt dài từ 1 - 1,5 cm, khi hạt chín vảy quả mở ra để hạt bay ra theo gió
(Võ Thành Tín, 2008).
Cây ưa sáng hoàn toàn, khi nhỏ chịu được bóng râm nhẹ, xanh quanh năm, tỉa
cành tự nhiên kém. Rễ rất phát triển, ăn lan rộng có nơi tới 8 – 10 m, rễ cọc đâm sâu.
Rễ có nấm cộng sinh (chủ yếu là hai giống Boletus granulates và Phizogopop
rosculus) giúp cho rễ hấp thu chất khoáng trong đất được tốt hơn (Viện Khoa học Lâm
nghiệp Việt Nam, nhóm tác giả, 2002).
2.1.4. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của thông nhựa
Thông nhựa là một trong các loài cây trồng rừng chủ yếu ở nước ta. Gỗ có
nhiều nhựa, nhựa là sản phẩm chủ yếu của rừng thông nhựa, là một đặc sản rừng có
giá trị lớn. Nhựa thông là mặt hàng có giá trị xuất khẩu cao, từ nhựa chế biến được hai
chất chính là dầu thông và tùng hương rất cần thiết cho các ngành công nghiệp như
dệt, sơn, giấy, thuộc da, mực in, dược, kĩ nghệ hương liệu, chất dẻo, bảo vệ thực vật…
Gỗ có vòng tăng trưởng hẹp, mịn mặt, vân rõ dùng làm đồ mộc gia dụng, phục
vụ xây dựng, bao bì, lấy củi. Là loại cây thích hợp với nhiều loại đất kể cả đất nghèo

4

 


 

dinh dưỡng, do đó thông còn là loại cây tiên phong trồng rừng ở những nơi đất khô
cằn, giúp phủ xanh đất trống đồi trọc, chắn gió và cát, chống xói mòn, phòng giữ được
lửa cháy trong giai đoạn cây non, thanh lọc không khí (tạo ra 5 - 7 tấn O2, giữ lại 30 70 tấn bụi, hấp thụ 3 - 7 tấn CO2/ha/năm) tạo nên tiểu khí hậu ôn hòa có lợi cho người
bệnh trong việc điều dưỡng, phục hồi sức khỏe. Thông nhựa hình dáng đẹp, mùi nhựa
tỏa thơm nên còn được trồng làm cây phong cảnh cho các khu vực nghỉ mát, an dưỡng,
danh lam thắng cảnh….(Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, nhóm tác giả, 2002).
2.1.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trong nước và trên thế giới
2.1.5.1. Trên thế giới
Theo số liệu của tổ chức FAO (năm 1994) sản lượng nhựa thông thế giới đạt
khoảng 1,2 triệu tấn, trong đó khoảng 60% là Colophan và 35% tinh dầu thông. Các
nước có tiềm năng xuất khẩu lớn loại sản phẩm này như Trung quốc (277.000 tấn),
Indonexia (46.000 tấn), Bồ đào nha (26.000 tấn)…. Nga, Mỹ và Brazin là những nước
có sản lượng lớn nhưng sản phẩm chủ yếu tiêu thụ nội địa. Nhu cầu về sản phẩm này
luôn gia tăng theo xu hướng phát triển của các ngành công nghiệp phụ trợ.
2.1.5.2. Ở Việt Nam
Theo số liệu báo cáo của các địa phương (Bộ NN&PTNT, năm 2005) tổng diện
tích rừng thông toàn quốc khoảng 194.721 ha, trong đó diện tích thông nhựa toàn quốc
khoảng 90.000 ha phân bố thành những vùng rộng hay những nhóm nhỏ ở nhiều tỉnh
của Việt Nam chủ yếu tập trung ở hai tỉnh Kon Tum và Lâm Đồng, miền Trung (Hà
Tĩnh, Nghệ An) và một số ở các tỉnh Đông Bắc Bộ như Quảng Ninh.
Tuy với diện tích lớn có thể cho khoảng 500.000 tấn nhựa/năm nhưng tình hình
chế biến nhựa thông nước ta hiện còn khá hạn chế, về năng lực chế biến mới đáp ứng
được khoảng 15.000 tấn/năm.

2.1.6. Tình hình nghiên cứu chuyển gen trên chi Pinus trong nước và trên thế giới
2.1.6.1. Trên thế giới
Công nghệ sinh học ứng dụng trong lâm nghiệp đang chủ yếu nhắm vào việc
tạo giống, cải thiện di truyền cho cây, đặc biệt là những cây sắp bị tuyệt chủng và
những cây cho giá trị kinh tế cao. Kỹ thuật vi nhân giống, biến nạp gen trực tiếp và
gián tiếp, tạo phôi vô tính đã thu được nhiều thành công (Poupin và Johnson, 2005
trích dẫn bởi Ravindra B. Malabadi1,2* và ctv, 2008).

5

 


 

Chuyển gen đã được báo cáo ở một số loài cây như: cây dương lai, thông, cây
dương lá rung, Citrus spp…. Báo cáo đầu tiên về chuyển gen cây rừng là của Fillatti
và cộng sự vào năm 1987, chuyển gen aroA mã hoá cho protein hoạt hoá cho sự tổng
hợp những axit amin thơm vào cây dương bằng vi khuẩn A. tumefaciens dòng
58/587/85 hoang dại, tạo được cây dương kháng thuốc diệt cỏ. Ngoài ra, các nhà khoa
học đã tạo được cây dương chuyển gen có thể hấp thu thủy ngân trong đất, cây thông
chuyển gen biểu hiện ptCL1 (coenzyme A ligase) liên quan trong con đường tổng hợp
lignin. Nhiều nghiên cứu chuyển gen Bt (từ Bacillus thuringiensis) với promoter 35S
vào loài thông lai Populus, tạo được cây kháng hai loài Lepidoptera: Malacosoma
disstria và L. dispar. Năm 2007, Adnan đã báo cáo chuyển gen uidA (β –
glucuronidase) và gen hpt (hygromycin phosphotransferase) bằng phương pháp bắn
gen vào cây gỗ tếch (Tectona grandis). Chuyển gen giải mã cho protein phát huỳnh
quang xanh, gen này đóng vai trò như gen chỉ thị (reporter gene) thành công vào một
số loài cây rừng như: Larix kaempferi, Pinus desiflora, Pinus thumbergii...
Kỹ thuật biến nạp gen đã thu được nhiều thành công đáng kể khi ứng dụng vào

cây rừng nói chung và chi thông nói riêng. Nhiều loài thông đã được nghiên cứu
chuyển gen như P. radiata, P. pinea, P. abies… bằng nhiều phương pháp khác nhau
nhưng chủ yếu đều biến nạp gen trực tiếp bằng súng bắn gen hay gián tiếp thông qua
A. tumefaciens (Malabadi và Nataraja, 2007). Pinus radiata là cây chuyển gen Bt
thành công và được thương mại hoá.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen đã được báo cáo ở một số
loài Picea abies, Picea glauca, Picea mariana và Pinus radiata (Walter và ctv, 1998),
Pinus roxbughii , P. wallichiana (Malabadi và Nataraja, 2007).
Chuyển gen bằng súng bắn gen được thực hiện trên cây một lá mầm và một số
loại cây rừng, tuy nhiên đối với cây cho quả hình nón phương pháp này hiệu quả
không ổn định, đồng thời số phiên bản tạo ra quá nhiều, gen không biểu hiện. Tuy hiệu
quả ban đầu cao nhưng không tạo ra được cây chuyển gen ổn định bằng phương pháp
gián tiếp. Ngược lại, phương pháp gián tiếp dùng A. tumefaciens cho số phiên bản
không nhiều, hiệu quả chuyển gen lâu dài, đây là một phương pháp được ưu tiên sử
dụng cho mục đích tạo giống cây rừng (Tang, 2001; Poupin và Johnson, 2005).
Theo Tang (2000), biến nạp gen thành công vào phôi hữu tính thông Loblolly
(P. tadae L.) nhờ vào vi khuẩn A. tumefaciens. Sau đó, năm 2002, Tang báo cáo đã
6

 


 

chuyển thành công gen chịu mặn bằng vi khuẩn A. tumefaciens dòng LBA 4404 mang
plasmid pBIGM chứa mannitol-l-phosphate dehydrogenase (MtlD) và glucitol-6phosphate dehydrogenase (GutD) vào phôi hữu tính thông lobolly (P. tadae L.) tạo
được mô sẹo có khả năng chịu độ mặn cao và tái tạo ra cây con. Bên cạnh đó, khi đồng
nuôi cấy vi khuẩn A. tumefaciens với phôi các loài thông (Pinus pisnaster, P. strobus,
P. tadae, P. radiata) cho hiệu quả biến nạp gen cao (Trontin và ctv, 2007).
Phương pháp bắn gen Bt (Cry1Ac) vào phôi hữu tính thông loblolly (Pinus

taeda L.) cho hiệu quả chuyển gen cao, tạo được thông chống lại sâu róm thông
(Dendrolimus punctatus) và Crypyothelea formosicola đã qua thí nghiệm chứng minh
(Tang và Tian, 2003). Đây được coi là nền tảng cho các nghiên cứu tạo cây thông
loblolly kháng bệnh sau này. Năm 2005, Grace và ctv đã nghiên cứu đưa gen Cry1Ac,
gen chọn lọc là nptII vào mô phôi của 20 dòng Pinus radiata bằng phương pháp bắn
gen, kết quả được kiểm chứng bằng PCR, lai Southern, thử nghiệm Bt Elisa và thí
nghiệm trực tiếp trên một số loài côn trùng, tạo được một dòng có tính kháng cao đối
với côn trùng gây hại.
Bên cạnh phương pháp bắn gen, biến nạp gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens đã
thu được nhiều thành công trên một số loài thông như P. taeda L. qua phôi hữu tính
(Tang, 2000), P. radiata qua lá mầm cho thấy sự biểu hiện tạm thời của gen uidA và
sau đó Grant và ctv (2004) đã chuyển gen thành công ổn định vào P. radiata.
2.1.6.2. Ở Việt Nam
Hiện tại chưa có công bố chính thức nào về thành công trong chuyển gen kháng
sâu ở chi Pinus.
2.2. Giới thiệu chung về chuyển gene thực vật
2.2.1. Định nghĩa chuyển gen
Chuyển gen là quá trình chuyển một đoạn DNA ngoại lai (foreign DNA) bằng
các kỹ thuật khác nhau (Agrobacterium, vi tiêm, bắn gen, xung điện...) vào một cơ thể
vật chủ (vi sinh vật, động vật hoặc thực vật) (Trần Nguyễn Thúy An, 2007).
2.2.2. Thực vật chuyển gene
Muốn tạo một sinh vật biến đổi gen (genetically modified organism-GMO) cần
phải có phương pháp thích hợp để đưa DNA ngoại lai (foreign DNA) vào trong tế bào
của chúng. Ở vi khuẩn, tế bào được xử lí bằng dung dịch muối calcium chloride. Ở tế
bào nấm men, sự tiếp nhận DNA tăng lên khi tế bào tiếp xúc với lithium chloride hoặc
7

 

 

lithium acetate. Tuy nhiên, đối với phần lớn sinh vật bậc cao cần phải có các phương
pháp khác tinh vi hơn. Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của
các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Nó đã trở thành phương tiện quan trọng
để nghiên cứu cơ bản trong sinh học thực vật. Ngoài việc mở ra triển vọng chuyển các
gen có ý nghĩa kinh tế vào cây trồng, các kỹ thuật này còn cho phép nghiên cứu cấu
trúc và điều khiển hoạt động của gen. Quá trình đưa một DNA ngoại lai vào genome
(hệ gen) của một sinh vật được gọi là quá trình biến nạp (transformation). Những cây
được biến nạp được gọi là cây biến đổi gen (genetically modified plant-GMP).
Ứng dụng công nghệ gen trong công tác giống cây trồng hiện đại có rất nhiều
ưu điểm, chẳng hạn như:
- Biến nạp một hoặc một số gen để thu được cây mang một đặc tính mới xác định.
- Rào cản về loài không còn có tác dụng, và không chỉ các gen từ thực vật mà còn từ vi
khuẩn, nấm, động vật hoặc con người được chuyển thành công vào thực vật. Về
nguyên tắc chỉ thay đổi vùng điều khiển gen, promoter và terminator. Tuy nhiên, trong
một số trường hợp đòi hỏi những thay đổi tiếp theo như sự phù hợp codon.
- Những đặc điểm không mong muốn của thực vật. Chẳng hạn, sự tổng hợp các chất
độc hoặc chất gây dị ứng có thể được loại trừ bằng công nghệ gen.
- Thực vật biến đổi gen có thể là lò phản ứng sinh học (bioreactor) sản xuất hiệu quả
các protein và các chất cần thiết dùng trong dược phẩm và thực phẩm.
- Mở ra khả năng nghiên cứu chức năng của gen trong quá trình phát triển của thực vật
và các quá trình sinh học khác.
- Trong lai tạo giống hiện đại, công nghệ gen giúp làm giảm sự mâu thuẫn giữa kinh tế
và môi trường sinh thái. Bằng việc sử dụng cây trồng kháng thuốc diệt cỏ có thể giảm
được lượng thuốc bảo vệ thực vật.
Mục đích của nông nghiệp hiện đại không chỉ là tăng năng suất mà còn hướng
đến những lĩnh vực quan trọng sau:
+

Duy trì và mở rộng đa dạng sinh học (biodiversity).

+

Tăng khả năng kháng (sức khỏe cây trồng và chống chịu các điều kiện bất lợi).

+

Nâng cao chất lượng sản phẩm.

+

Cải thiện khả năng tích lũy dinh dưỡng.

+

Tăng cường tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học.

+

Tạo ra sản phẩm không gây hại môi trường.
8

 


 

2.2.3. Tóm tắt lịch sử phát triển của công nghệ chuyển gen thực vật
Bảng 2.1 Tóm tắt lịch sử chuyển gen thực vật

Năm
1980

1983

1984
1985
1986

1987

1989
1990

1991

1994
1998
1999

Sự kiện
Lần đầu tiên DNA ngoại lai (transposon Tn7) được chuyển vào thực vật nhờ
A.tumefaciens, tuy nhiên T-DNA vẫn chưa được thay đổi
T-DNA đã được biến đổi và đưa DNA ngoại lai vào, tạo ra tính kháng một số
chất kháng sinh. Các gen tạo khối u được cắt ra, DNA ngoại lai cùng với
phần còn lại được chuyển vào thực vật và được biến nạp. Từ kết quả này số
lượng các loài được biến nạp ngày càng tăng.
Biến nạp bằng tế bào trần (protoplast) ở ngô. DNA được đưa vào tế bào trần
nhờ polyethylene glycol (PEG) hoặc xung điện
Lần đầu tiên cây biến đổi gen được mô tả có tính kháng thuốc diệt cỏ

Thành công trong việc tạo ra thực vật kháng virus
Phương pháp biến nạp phi sinh học được sử dụng
Tế bào thực vật được bắn phá bằng các hạt vàng hoặc wolfram bọc DNA
ngoại lai tạo ra sự biến nạp thành công ở các cây một lá mầm quan trọng như
lúa (1988), ngô (1990) và lúa mì (1992)
Cà chua và thuốc lá kháng côn trùng, sự điều khiển quá trình chín ở cà chua
(FlavrSaver) đã làm cho công nghệ gen đạt được một bước phát triển quan
trọng hơn
Thành công trong việc chuyển các gen mã hóa các kháng thể vào thực vật và
tạo nên các sản phẩm gen này như mong muốn đã mở ra một bước tiến mới
cho việc sản xuất vaccine và khả năng chống bệnh ở thực vật
Thành công trong việc tạo ra cây biến đổi gen bất dục đực, không có khả
năng tạo hạt phấn có ý nghĩa lớn trong việc sản xuất hạt giống.
Thành phần carbohydrate của thực vật được biến đổi
Lần đầu tiên thành phần alkaloid ở một loại cà được cải thiện tạo ra một bước
quan trọng đối với thực vật trong việc tổng hợp nhóm hợp chất này để thu
nhận dược liệu
Chất nhân tạo phân giải sinh học được tổng hợp mở ta tiềm năng tạo ra
những thực vật có đặc tính mới, được sử dụng như là các bioreactor thực vật
để sản xuất “nguyên liệu tái sinh”.
Cà chua Flavr SavrR là cây trồng đầu tiên biến đổi gen và quả của nó được
đưa ra thị trường
Trên thế giới đã có 48 giống cây trồng biến đổi gen và sản phẩm được thị
trường hóa
Năm 1999, cây lúa biến đổi gen được đưa ra với 7 gen được biến nạp.
Khoảng 90% thực vật biến đổi gen chống chịu thuốc diệt cỏ hoặc sâu bệnh
hại.

9

 


 

Lịch sử phát triển công nghệ gen của thực vật có rất nhiều sự kiện quan trọng.
Bảng 2.1 chỉ nêu lên những mốc có ý nghĩa đặc biệt nhằm làm rõ sự phát triển rất
nhanh của lĩnh vực này.
Trong năm 2002 – 2003, công nghệ chuyển gen thực vật tập trung chủ yếu vào
bốn mục đích: kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ, tăng cường phẩm chất và kháng bệnh.
Bảng 2.2 Các tính trạng chuyển gen được quan tâm nhất
Tính trạng

Năm 2002 – 2003 (%)

Kháng sâu

31%

Kháng thuốc trừ cỏ

29%

Tăng cường phẩm chất

16%

Kháng bệnh

7%

2001-03 data; collated from: Information Systems for biotechnology.

2.2.4. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật
Có hai phương pháp chủ yếu để chuyển gen vào thực vật:
Phương pháp chuyển gen nhờ vi sinh vật (gián tiếp): gen được chuyển vào tế
bào thực vật thông qua sinh vật trung gian nhờ Agrobacterium, nhờ virus.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp: gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực
vật thông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định mà không cần các sinh vật trung
gian. Hiện tại có các phương pháp cơ bản sau:
+ Dùng hóa chất (Polyethylene glycol)
+ Biến nạp qua protoplast (protoplast fusion)
+ Hấp thu DNA
+ Dùng xung điện (electroporation)
+ Vi tiêm (microprojection)
+ Bắn gen (gen gun)
+ Qua ống phấn (pollen tube pathways)
+ Dùng silicon carbide
Một số cây nông nghiệp và lâm nghiệp đã được biến nạp thành công nhờ hai
phương pháp biến nạp trực tiếp và gián tiếp.

10

 


 

Bảng 2.3 Các cây đã được biến nạp di truyền
Cỏ linh lăng

Cẩm chướng

Cây kiwi

Đu đủ

Táo

Cà rốt

Rau diếp

Đỗ

Arabidopsis

Ngô

Cây cam thảo

Lạc

Măng tây

Bông

Hoa ly

Lê

Chuối

Dâu

Hoa sen

Kê

Lúa mạch

Dưa chuột

Vân sam Nauy

Cây mẫu đơn

Đậu

Cà tím

Yến mạch

Cây hông

Bắp cải

Lanh

Cỏ vườn cây ăn quả

Cây dương

Cải dầu

Nho

Hoa lan

Cây chuối lá

Khoai tây

Mía

Cỏ đuôi trâu cao

Hướng dương

Lúa

Khoai lang

Lúa mạch

Cà chua

Lúa miến

Thuốc lá

Đậu tương

Vân sam trắng

Dâu tây

Lúa mì

Củ cải đường

2.3. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
2.3.1. Giới thiệu đặc điểm nuôi cấy Agrobacterium tumefaciens
-

Điều kiện phát triển: phổ nhiệt độ thích hợp từ 200C – 280C, nhiệt độ tối ưu cho sự
phát triển của vi khuẩn từ 260C – 280C.

-

Nhu cầu O2: tăng sinh trong điều kiện hiếu khí

-

Độ pH: pH thích hợp từ 7,0 – 7,3

-

Môi trường: trên môi trường LB rắn khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, không màu.
(Vi sinh vật học - tuyển tập, 1971)

2.3.2. Những nghiên cứu về chuyển gene thông qua A.tumefaciens
Trước đây, người ta thường chuyển gen gián tiếp thông qua A.tumefaciens để
tạo cây biến đổi gen. Hiệu quả của phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua
A.tumefaciens đã được thiết lập chủ yếu trên cây hai lá mầm. Có rất nhiều tính trạng
mới đã được tạo ra và biến đổi ở một số loài cây nông nghiệp như cây ăn quả và lâm
nghiệp như cây lấy gỗ, hầu hết các tính trạng mới này có giá trị thương mại cao. Qua
bảng 2.4, Poupin và ctv đã thống kê một số gen đã được đưa vào một số loài cây nhờ
phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua A.tumefaciens.
11

 


 

Bảng 2.4 Các cây được biến nạp gián tiếp qua A.tumefaciens
Loài

Mô

Táo
(Malus Đĩa lá
domestica Borkh)
Táo
Đĩa lá

Kỹ thuật

Gene

A.tumefaciens

Điều khiển sự tăng trưởng: Zhu et al. 2001
Kìm hãm sự tăng trưởng của cây
rol A rol B
Enzyme nội bào chitinase từ Bolar et al.2000
Đề kháng với loài nấm Venturia
loài
nấm
Trichoderma
inaequalis; cây chậm phát triển.
harzianum kháng lại một số
loài nấm
Gene tổng hợp Stilbene từ Szankowski et al. Sự biểu hiện chuyển gene ổn định.
cây nho, protein ức chế 2003
Phân tích sắc kí lỏng cao áp cho thấy
enzyme polygalacturonase
một hợp chất trong nho chống tim
mạch, một hợp chất glycoside trong
cây chuyển gen.
uidA
Cruz-Hernandez et Sự biểu hiện chuyển gene bền vững.
al. 1998
LFY, API
Pena et al. 2001
Các thay đổi di truyền rút ngắn giai
đoạn cây con, ra hoa sớn, ra hoa và
hạt đều đặn. Biểu hiện LFY tạo ra sự
biến đổi nhưng biểu hiện API tạo ra
kiểu hình bình thường.

uidA
Gartland et al. Sự biểu hiện chuyển gene ổn định
2000

A.tumefaciens

Táo (cvs. Elstar và ND
Holsteiner)

A.tumefaciens

Bơ

Phôi soma

A.tumefaciens

Cây có múi

Chồi

A.tumefaciens

Cây du Anh (Ulmus
procera), cây dẻ
châu Âu

ND

A.tumefaciens

Cây vân sam Nauy
Huyền phù phôi
Cây dẻ ngựa Ohio Phôi soma
(Aesculus glabra)

A.tumefaciens
A.tumefaciens

Tác giả

uidA
Kháng Hygromycin và uidA

12

 

Ảnh hưởng chính

Wenk et al. 1999
Sự biểu hiện chuyển gen tạm thời.
Trick và Finer. Sự biểu hiện chuyển gene bền vững.
1999


 

Bảng 2.4 (tt) Các cây được biến nạp gián tiếp qua A.tumefaciens
Loài

Mô

Kĩ thuật

Gene

Tác giả

Lê

Lá

A.tumefaciens

uidA

Pinus pinea

Lá mầm

A.tumefaciens

uidA

Pinus radiata
Pinus strobes

Phôi soma
Mô phôi

A.tumefaciens
A.tumefaciens

uidA
uidA

Bishop- Hurley et Các promoter thuốc lá đáp ứng với sự
al. 2001
nhiễm Erwinia amylovora đã được
kiểm tra. Chúng đáp ứng một cách
khác biệt với sự lây nhiễm hay căng
thẳng phi sinh học.
Humara et al. 1999 Nhạy cảm với sự lây nhiễm
Agrobacterium (tỉ lệ chết cao).
Cerda et al. 2002
Sự biểu hiện chuyển gene ổn định.
Levee et al. 1999
Sự biểu hiện chuyển gene ổn định.

Cây bạch dương

ND

A.tumefaciens

Enzyme oxalate oxidase từ Liang et al. 2001
lúa mì

Cây bạch dương

ND

A.tumefaciens

Nở hoa: gen LEAFY và Rottmann
PTLF
2000

Robinia
pseudoacacia

Cây cao su (Hevea
brasiliensis)

Đoạn thân và A.tumefaciens
đĩa lá

Khối sẹo

A.tumefaciens

et

Những cây chuyển gen giảm được sự
xâm nhiễm của septoria musiva.
al. Ra hoa sớm và biến đổi mô phân sinh
trong 2/19 dòng gỗ dương biểu hiện
PTLF từ Populus trichocarpa.

uidA

Igasaki et al. 2000

uidA

Arokiaraj
1998

13

 

Ảnh hưởng chính

et

Tần số biến đổi từ những đoạn thân
xấp xỉ 24% và hình thái của cây tái
sinh giống nhau mà có cùng nguồn
gốc.

al. Sự biểu hiện chuyển gene ổn định.


 

Bảng 2.4 (tt) Các cây được biến nạp gián tiếp qua A.tumefaciens
Loài
Mô

Kĩ thuật
Gene
Cây cao su

Khối sẹo

A.tumefaciens

Cây cam chua (citrus
aurantium)

Sẹo hóa gỗ

A.tumefaciens

Tác giả

Đề
kháng
sự
stress Jayashree et al.
oxidative: sự biểu hiện cơ 2003
bản của gen superoxide
dismutase
Protein virus tristeza của Ghorbel et al. 2000
cam bao phủ gene

M. josefina Poupin và Patricio Arce-Johnson*, 2004
ND: data not shown

14

 

Ảnh hưởng chính
Tần số biến đổi 4% là thành công.
Hình thái của cây chuyển gen tương
tự cây không chuyển gen.
Mục đích là tránh giai đoạn cây con.


 

2.3.3. Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen bằng
Agrobacterium tumefaciens
Theo Hong và Bhatnagar (2007), quá trình chuyển gen bằng A.tumafaciens chịu
sự ảnh hưởng của một số yếu tố như: khả năng gây độc của vi khuẩn để chuyển TDNA từ vi khuẩn vào vật chủ, nồng độ vi khuẩn, sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với vật
chủ, thời gian đồng nuôi cấy, hợp chất phenol tiết ra tại vết thương, sự chọn lọc hiệu
quả tạo điều kiện cho những tế bào đã được chuyển phát triển và tạo rễ. Nồng độ vi
khuẩn là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu quả chuyển gen. Nồng độ
vi khuẩn cao sẽ làm cho tế bào bị “stress”, ngược lại nếu nồng độ vi khuẩn thấp thì
hiệu quả chuyển gen thấp. Acacia mangium chuyển gen được tạo ra bằng cách đồng
nuôi cấy rễ với A.tumefaciens dòng LBA4404 mang pBI121 sử dụng những môi
trường chọn lọc chứa TDZ (1mg/l), IAA (0,25mg/l), genitin và timentin (50-300mg/l).
Kháng sinh là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình chọn lọc và tái sinh mô
chuyển gen. Quy trình sử dụng A.tumefaciens hiệu quả cho sự lựa chọn loại kháng sinh
phù hợp (Tang và ctv, 2003). Ba loại kháng sinh ampicilin, carbernicilin và cefotaxime
ảnh hưởng đến sự phát triển và biệt hóa của mô sẹo cũng như khả năng tạo rễ của ba
loài thông loblly.
Để làm tăng tính độc của vi khuẩn đối với tế bào đích có thể dùng plasmid có

tính độc cao như pTOK47 và hợp chất của phenol: acetosyringone (AS). Vi khuẩn
thường bám vào bề mặt vết thương dẫn đến sự tạo bướu, sản phẩm của gen vir là hợp
chất của phenol tiết ra tại vết thương hỗ trợ cho quá trình gây độc của vi khuẩn đối với
tế bào chủ. Hợp chất này làm tăng hiệu quả chuyển gen ở nhiều loài.
Patnalk và ctv (2006) đã sử dụng A. tumefaciens dòng LBA4404 mang pBI10
OD600nm = 0,5; đồng nuôi cấy hai - ba ngày với phôi trưởng thành của Triticum
aestivum, Triticum durum có bổ sung AS 200 µM cho hiệu quả chuyển gen là 5,57%.
Ở Casuarinaceae, đồng nuôi cấy ba ngày epicotyls từ cây con Casuarina glauca 45
ngày tuổi với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dòng C58C1 (pGV2260; pBIN35Sgus-int) ở pH = 5,6 trong môi trường có 50 mg/l kanamycin và 250 mg/l cefotaxime.
Sau hai tháng nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung chất kích thích tăng
trưởng và kháng sinh 26% epicotyls tạo được mô sẹo trên môi trường có kháng sinh và
95% mô sẹo đều thể hiện GUS.

15