ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHẢO SÁT STR (SHORT TANDEM REPEAT) TRONG PHÂN TÍCH LIÊN KẾT GEN DMD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHẢO SÁT STR
(SHORT TANDEM REPEAT) TRONG PHÂN TÍCH
LIÊN KẾT GEN DMD

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN DUY LAN

Niên khoá

: 2006 – 2010

Tháng 07/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHẢO SÁT STR
(SHORT TANDEM REPEAT) TRONG PHÂN TÍCH

LIÊN KẾT GEN DMD

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS.BS. NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN

NGUYỄN DUY LAN

ThS.BS. QUÁCH THỊ HOÀNG OANH

Tháng 07/2010


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đến:
Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các Thầy Cô đã
trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt bốn năm học vừa qua tại trường.
ThS.BS. Nguyễn Khắc Hân Hoan và ThS.BS. Quách Thị Hoàng Oanh đã tận tình
hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quý giá và động viên tôi trong suốt quá trình thực
hiện Khóa luận tốt nghiệp này.
Tập thể Y – Bác sĩ, Thầy Cô và Anh Chị - Phòng Di truyền đã tận tình giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Xin cảm ơn các bạn học cùng khóa đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt bốn
năm học qua.
Lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất con xin gửi tới bố mẹ đã yêu thương, chăm
sóc, dạy bảo và luôn dành cho con những điều tốt đẹp nhất.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2010

Sinh viên
Nguyễn Duy Lan

i


TÓM TẮT
Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một trong
những bệnh thần kinh – cơ di truyền phổ biến với tỷ lệ mới mắc là 1/3500 trẻ trai đẻ sống.
Bệnh DMD xảy ra do đột biến gen dystrophin trên nhiễm sắc thể giới tính X. Hơn 65%
trường hợp là đột biến mất hoặc lặp đoạn gen. Kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation
dependent probe amplification - Lai nhiều probe khuếch đại) gần đây được cho là chẩn
đoán mất đoạn gen rất hiệu quả. Tuy nhiên trong một số trường hợp bệnh nhân có triệu
chứng lâm sàng nhưng MLPA không phát hiện được đột biến. Lúc này, cần phải triển
khai phương pháp khác nhằm chẩn đoán nguồn gốc gen đột biến, đó chính là khảo sát
STR trong phân tích liên kết gen dystrophin. Đề tài nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật khảo
sát STR với ba cặp mồi đặc hiệu DYS6, DXS992 và STR49.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: ba mươi mẫu DNA của mười gia đình trong
đó gồm hai mươi mẫu từ bố mẹ và mười mẫu ối. Xác định giới tính mười mẫu ối bằng
multiplex PCR. Sau đó tất cả ba mươi mẫu được khảo sát STR – PCR, điện di mao quản
bằng CEQTM 8000, phân tích bằng chương trình Fragment Analysis. Trong nghiên cứu
này tôi đã tiến hành phản ứng multiplex PCR xác định được chính xác giới tính thai nhi
và xác định các thông số tối ưu cho việc khảo sát STR bằng kỹ thuật PCR sử dụng ba cặp
mồi đặc hiệu.

ii


SUMMARY
Topic title: “Using STR (Short tandem repeat) for analysing linkage of Duchenne

muscular dystrophy gene”.
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common genetic
neromuscular disorders affecting 1/3500 male births. DMD is caused by mutation in the X
– linked dystrophin gene. More than 65% of cases are deletion or duplication mutation.
Recently, MLPA (Multiplex ligation dependent probe amplification) is described as an
effective method to detect these mutations. However, in some cases, mutation cannot be
identified by this method although patient has clinical symptom. Original mutaion need to
be identified by a different method, it’s linkage analysis base on Short tandem
repeats (STR). In this study, we used three specific pairs of primer DYS6, DXS992
and STR49 for STR - PCR.
Method: DNA samples from thirty families included twenty samples from ten
couples and ten samples from amniotic fluid. Sex of ten samples from amniotic fluid was
determined by multiplex PCR. Then all samples were carried out STR - PCR, capillary
electrophoresis with CEQTM 8000, and analyzed by Fragment Analysis program. The sex
of fetals were determined accurately by using multiplex PCR and the protocol STR – PCR
was optimized successfully with three specific pair of primers in this study.

iii


MỤC LỤC
TÓM TẮT.............................................................................................................................ii
MỤC LỤC ...........................................................................................................................iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................................vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................................ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH ................................................................................................... x
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................................ 2
1.3. Nội dung thực hiện ........................................................................................................ 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3
2.1. Lược sử về bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ................................................................... 3
2.2. Tổng quan về bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ............................................................... 3
2.2.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne............................................. 3
2.2.2. Cơ chế di truyền bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ....................................................... 5
2.3. Nguyên nhân gây bệnh .................................................................................................. 7
2.3.1 Cấu trúc gen dystrophin............................................................................................... 8
2.3.2. Cấu trúc và chức năng protein dystrophin................................................................ 10
2.4. Phương pháp chẩn đoán bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ............................................ 13
2.4.1. Phương pháp chẩn đoán điện.................................................................................... 13
2.4.1.1. Đo tốc độ dẫn truyền vận động.............................................................................. 13
2.4.1.2. Điện cơ................................................................................................................... 13
2.4.2. Kiểm tra creatine kinase ........................................................................................... 14
2.4.3. Sinh thiết cơ .............................................................................................................. 14
2.4.4. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch ...................................................................................... 15
2.4.5. Kỹ thuật Western blot ............................................................................................... 15
2.4.6. Chẩn đoán di truyền phân tử .................................................................................... 16
2.4.6.1. Kỹ thuật Multiplex PCR ....................................................................................... 16
2.4.6.2. Kỹ thuật Southern blot........................................................................................... 16
iv


2.4.6.3. Kỹ thuật điện di trên gel biến tính ......................................................................... 17
2.4.6.4. Kỹ thuật PCR phiên mã ngược .............................................................................. 18
2.4.6.5. Kỹ thuật kiểm tra sự cắt ngắn protein .................................................................. 18
2.4.6.6. Kỹ thuật lai tại chỗ có gắn huỳnh quang ............................................................... 18
2.4.6.7. Kỹ thuật lai nhiều probe khuếch đại ...................................................................... 19
2.4.6.8. Kỹ thuật khuếch đại nhiều probe phụ thuộc quá trình nối ................................... 20
2.4.6.9. Phân tích liên kết gen ............................................................................................ 21
(1) Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn ....................................................... 21

(2) Trình tự lặp lại ngắn (Short Tandem Repeats, STR) .................................................... 22
2.5. Tổng quan nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne trên thế giới .......................... 22
2.6. Tổng quan nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne tại Việt Nam ......................... 23
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 26
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 26
3.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 26
3.3. Vật liệu ........................................................................................................................ 26
3.3.1. Xác định giới tính bằng multiplex PCR ................................................................... 26
3.3.2. Hóa chất cho tách chiết DNA ................................................................................... 27
3.3.3. Hóa chất cho phản ứng STR – PCR. ........................................................................ 27
3.3.4. Hóa chất cho điện di trên gel agarose....................................................................... 28
3.3.5. Hóa chất cho điện di mao quản trên máy Beckman Coulter CEQTM 8000 ............. 29
3.3.6. Các thiết bị, dụng cụ khác ........................................................................................ 29
3.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................. 31
3.4.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu ................................................................................. 31
3.4.1.1. Phương pháp thu mẫu ............................................................................................ 31
3.4.1.2. Phương pháp tách chiết DNA ................................................................................ 31
3.4.2. Thực hiện xác định giới tính bằng multiplex PCR ................................................... 32
3.4.2.1. Phương pháp multiplex PCR xác định giới tính thai nhi ...................................... 32
3.4.2.2 Đảm bảo chất lượng phản ứng................................................................................ 34
3.4.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose ................................................................... 34
v


3.4.3. Phương pháp khảo sát STR – PCR .......................................................................... 35
3.4.4. Phân tích liên kết gen dystrophin dựa trên kết quả khảo sát STR ............................ 38
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 40
4.1. Kết quả ......................................................................................................................... 40
4.1.1. Xác định giới tính bằng phương pháp mutiplex PCR .............................................. 40
4.1.2. Phương pháp khảo sát STR dựa trên kỹ thuật PCR ................................................. 43

4.2. Thảo luận ..................................................................................................................... 48
4.2.1. Xác định giới tính thai nhi bằng multiplex PCR ...................................................... 48
4.2.2. Phân tích liên kết gen dystrophin dựa vào khảo sát STR – PCR ............................. 49
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 51
5.1. Kết luận........................................................................................................................ 51
5.2. Đề nghị ........................................................................................................................ 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 52
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Array-cGH

Array comparative genomic hybridization

BMD

Becker muscular dystrophy

bp

base pair

cDNA

complementary deoxyribonucleic acid

CK

creatine kinase

DGGE

Denaturing gradient gel electrophoresis

DMD

Duchenne muscular dystrophy

DMSO

dimethyl sulfoxide

DNA

deoxyribonucleic acid

DSCP

Double strand conformation polymorphism

dNTP

2’- deoxynucleotide – 5’ - triphosphate

dATP

2’- deoxyadenosine - 5’ - triphosphate

dCTP

2’- deoxycytidine - 5’ - triphosphate

dGTP

2’- deoxyguanosin - 5’ - triphosphate

dTTP

2’- deoxythymidine - 5’ – triphosphate

EDTA

ethylene diamine tetraacetid acid

FISH

Flourescent in situ hybridization

HDA

Heteroduplex analysis

Kb

kilobase

MAPH

Multiplex amplifiable probe hybridization, MAPH

MLPA

Multiplex ligation dependent probe amplification

MK

marker

mRNA

messenger ribonucleic acid

NIL

nihil, nothing hay zero

NST

nhiễm sắc thể

nt

nucleotide

OD

optical density

PCR

Polymerase chain reaction

PTT

Protein Truncation test
vii


RFLP

Restriction fragment length polymorphism

RNA

ribonucleic acid

RT – PCR

Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction

SNP

Single nucleotide polymorphism

SRY

Sex-determining Region Y

STR

Short tandem repeats

SSCP

Single strand conformation polymorphism

tt

tiếp theo

UV

ultraviolet

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Trình tự 6 đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng multiplex PCR .................. 26
Bảng 3.2 Trình tự 3 cặp mồi dùng trong phản ứng STR – PCR ........................................ 28
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng multiplex PCR xác định giới tính thai nhi ...................... 33
Bảng 3.4 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR ............................................ 34
Bảng 3.5 Thành phần phản ứng STR – PCR ..................................................................... 36
Bảng 3.6 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR ............................................ 36
Bảng 4.1 Danh sách mẫu ối ............................................................................................... 40
Bảng 4.2 Kết quả xác định giới tính của 10 mẫu ối ........................................................... 41
Bảng 4.3 Danh sách mẫu 10 gia đình thực hiện khảo sát STR – PCR .............................. 43

Bảng 4.4 Bảng tổng kết alen của 30 mẫu thuộc 10 gia đình được khảo sát ...................... 44
Bảng 4.5 Tỷ lệ dị hợp tử của 10 mẫu mẹ ........................................................................... 45
Bảng 4.6 Tần số alen của locus DYS6 trên 20 mẫu máu bố mẹ ........................................ 46
Bảng 4.7 Tần số alen của locus STR49 trên 20 mẫu máu bố mẹ ..................................... 46
Bảng 4.8 Tần số alen của locus DXS992 trên 20 mẫu máu bố mẹ ................................... 46
Bảng 4.9 Các alen được di truyền cho đời con .................................................................. 47

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Dấu hiệu Gowers .................................................................................................. 4
Hình 2.2 So sánh giữa dạng bình thường và DMD/BMD ................................................... 5
Hình 2.3 Kiểu di truyền bệnh DMD .................................................................................... 6
Hình 2.4 Vị trí locus Xp21................................................................................................... 7
Hình 2.5 Vị trí 79 exon và 8 promoter của gen. .................................................................. 9
Hình 2.6 Vị trí protein dystrophin trên mặt trong màng tế bào cơ vân ............................. 10
Hình 2.7 Mối liên quan giữa các vùng của dystrophin và một số phức hợp protein ........ 11
Hình 2.8 Sự kết hợp của dystrophin với phức hệ protein trong tế bào cơ ......................... 12
Hình 3.1 Bộ kit tách chiết DNA của Qiagen ..................................................................... 27
Hình 3.2 Thang chuẩn DNA 100bp ................................................................................... 28
Hình 3.3 Bộ hóa chất cho điện di mao quản ...................................................................... 29
Hình 3.4 Các máy móc thiết bị phòng thí nghiệm sinh học phân tử ................................. 30
Hình 3.5 Nguyên lý hệ thống điện di mao quản. .................................................................37
Hình 4.1 Hình điện di sản phẩm multiplex PCR trên 10 mẫu ối ....................................... 41
Hình 4.2 Kết quả điện di mao quản của một mẫu ối xác định giới tính ............................ 42
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm STR – PCR 10 gia đình ............................................. 43
Hình 4.4 Kết quả phân tích bằng chương trình Fragment Analysis của máy CEQ ........... 48
Hình 4.5 Kết quả phân tích bằng chương trình Fragment Analysis của máy CEQ. .......... 48

x


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là bệnh di truyền
lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X. Bệnh DMD gây nên bởi đột biến gen dystrophin,
gen này nằm ở vị trí Xp21 trên NST X, có chiều dài 2400 kb, bao gồm 79 exon chỉ chiếm
0,6% cấu trúc gen, còn lại là intron. Protein mã hóa bởi gen có tên là dystrophin với trọng
khối phân tử 427 kDa, nằm ở màng bào tương của tế bào cơ, có chức năng chính trong việc
duy trì sự ổn định của màng cơ.
Bệnh DMD là một trong những bệnh thần kinh cơ - di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mắc
bệnh là 1/3.500 trẻ trai đẻ sống. Bệnh DMD có đặc trưng là thoái hóa và gây suy yếu cơ một
cách tiến triển dẫn đến tàn tật và tử vong. Đặc điểm lâm sàng của bệnh này rất đa dạng với
mức độ biểu hiện khác nhau, thường được nhận biết ở giai đoạn trẻ từ 2 – 3 tuổi với triệu
chứng yếu cơ xuất hiện sớm, tiến triển nhanh, mất khả năng đi lại lúc 10 – 13 tuổi và tử vong
ở lứa tuổi ngoài 20 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp.
Vì tính chất nặng nề và phổ biến nên bệnh Duchenne đã được quan tâm nghiên cứu ở
nước ta từ nhiều năm nay. Đó là nghiên cứu về tần suất mắc bệnh, mối liên quan giữa chẩn
đoán lâm sàng và xét nghiệm creatine kinase (CK), ứng dụng của xét nghiệm CK trong chẩn
đoán người mang gen bệnh. Đặc biệt trong vài năm trở lại đây đã có một số nghiên cứu ở mức
độ sinh học phân tử, song hầu hết các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ xác định đột
biến trên các đối tượng được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh nhược cơ Duchenne và chưa có
nghiên cứu nào xác định người mẹ mang gen để ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh. Chính vì
vậy, việc nghiên cứu chẩn đoán chính xác người mẹ mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh
cần được thực hiện một cách có hệ thống và là một việc làm hết sức cần thiết để sớm đưa ra
tư vấn di truyền nhằm mục đích ngăn ngừa và giảm tỷ lệ mắc bệnh.
Hiện nay, Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ đang triển khai áp dụng các kỹ thuật sinh
học phân tử để xác định các đột biến gây bệnh DMD, xác định người mang gen từ đó ứng

dụng trong chẩn đoán trước sinh. Khóa luận này nằm trong khuôn khổ của nghiên cứu trên,
được thực hiện tại Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ từ ngày 01/02/2010 đến ngày
1


31/05/2010 và được mang tên là “Thiết lập kỹ thuật khảo sát Short Tandem Repeat trong
phân tích liên kết gen gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Khóa luận này được tiến hành với mục tiêu tối ưu hóa các thông số cho việc khảo sát
Short Tandem Repeat (STR) trong phân tích liên kết gen dystrophin.
1.3. Nội dung thực hiện
Thực hiện phản ứng multiplex PCR nhằm xác định giới tính thai nhi trước khi khảo sát
STR – PCR.
Xác định các thông số tối ưu cho việc khảo sát STR trong phân tích liên kết gen
dystrophin với 3 cặp mồi đặc hiệu.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Lược sử về bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
Tháng 12-1851, Edward-Meryon, một thầy thuốc người Anh mô tả chi tiết về 8 trẻ trong
3 gia đình mắc cùng một bệnh với đặc điểm loạn dưỡng cơ. Năm 1861, Guillaume Benjamin
Duchenne de Boulogne, một nhà thần kinh học người Pháp – đã mô tả dạng giả phì đại của
bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai, phân biệt với các bệnh cơ khác nhau và sau đó,
bệnh được mang tên ông. Năm 1879, Gowers thu thập dữ liệu ở 220 bệnh nhân và mô tả bệnh
này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết.
Trong một thời gian dài hơn 100 năm bệnh DMD được đánh giá chủ yếu chỉ ở mức độ
lâm sàng và những chăm sóc hỗ trợ trong quá trình mắc bệnh đối với bệnh nhân. Trước và sau
năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặc biệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD

khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzyme CK
để phục vụ cho điều trị và tư vấn di truyền.
Năm 1981, Zatz và cộng sự đã phát hiện gen dystrophin nằm ở vị trí Xp21. Tiếp theo,
giai đoạn 1984 – 1987 Hoffman và các cộng sự đã phát hiện gen dystrophin và sản phẩm
protein tương ứng của gen. Năm 1987 – 1988, các nhà nghiên cứu mới chỉ biết gen dystrophin
gồm 60 exon. Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiện đầy đủ
gồm 79 exon với kích thước 2400 kb.
Đến nay, đặc điểm phân tử của bệnh ngày càng được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen
đã và đang được các nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất
khắc phục hậu quả nặng nề của bệnh.
2.2. Tổng quan về bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
2.2.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
Các triệu chứng lâm sàng của bệnh nhi thường xuất hiện lúc 3 – 5 tuổi. Trẻ thường chậm
biết đi và không chạy được một cách bình thường, trẻ có nhiều cử động nhưng tiến về phía
trước thì rất khó, vì trẻ không nâng đầu gối lên một cách thích hợp được; dáng đi lạch bạch và
đi nhón chân xuất hiện sớm.
3


Dần dần bệnh nhân đi lại, trèo cầu thang và đứng dậy khi đang ngồi ghế đều khó khăn,
cột sống ưỡn quá mức để giữ thăng bằng.
Trẻ thường dễ bị ngã khi xô đẩy, chen lấn, sau đó khó dậy được. Để ngồi và đứng dậy
được, trẻ thường dùng thao tác đặc trưng (dấu hiệu Gowers): trẻ lăn cuộn mình để quỳ, vươn
cẳng tay chống xuống đất để nâng mông lên và làm chân duỗi thẳng, sau đó chuyển tay về
đầu gối và đẩy nâng người lên (thao tác trèo trên thân mình). Triệu chứng này có thể gặp
trong những bệnh khác như yếu thân và gốc chi (bệnh teo cơ do tủy sống).

Hình 2.1 Dấu hiệu Gowers (Nguồn: ).
Giai đoạn sau, phản xạ gối có thể mất nhưng vẫn còn phản xạ gót, điều này chứng minh
do sự yếu cơ gốc chi.

Giai đoạn tiến triển, tay và bàn tay cũng bị ảnh hưởng. Có thể gặp yếu nhẹ cơ bám da
mặt, nhưng nói, nuốt và vận động nhãn cầu vẫn bình thường. Co cứng cơ chậu, đùi và cơ chày
làm hạn chế động tác gấp khớp háng, co cứng gân gót góp phần tạo nên dáng đi nhón chân.
Vào tuổi 9 – 12, trẻ không đi được nữa và phải ngồi xe đẩy, cột sống bị vẹo, co cứng khuỷu

4


tay và đầu gối làm trẻ bị tàn tật nặng nề. Khoảng 20 tuổi cơ hô hấp bị yếu, nên dễ viêm phổi
và suy hô hấp, cơ tim bị tổn thương dẫn đến tử vong.
Một thể bệnh nhẹ của DMD là loạn dưỡng cơ Becker (BMD). Bệnh nhân BMD xuất
hiện triệu chứng lâm sàng muộn hơn DMD, biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và thời gian tiến triển
chậm hơn, có tuổi thọ cao hơn, nhiều trường hợp có thể sống đến 60 tuổi.

Hình 2.2 So sánh giữa dạng bình thường và DMD/BMD
(Nguồn: www.humgen.nl).
Việc điều trị DMD/BMD vẫn còn là một vấn đề nan giải. Hiện nay liệu pháp gen đang
được nghiên cứu để áp dụng điều trị cho bệnh nhân DMD, mục đích là chuyển từ thể nặng
DMD sang thể nhẹ BMD để kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân. Tuy nhiên đây vẫn còn là
những bước đầu thử nghiệm, phương pháp điều trị này rất phức tạp, giá thành cao và hiệu quả
còn rất hạn chế. Do vậy, phần lớn bệnh nhân vẫn không được điều trị và cuối cùng đều tử
vong.
2.2.2. Cơ chế di truyền bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
Đối với cá thể nữ 46,XX có hai nhiễm sắc thể (NST) X, vì thế có hai gen dystrophin.
Nếu có một NST X mang gen bị đột biến thì người này vẫn còn một NST X mang gen gen
dystrophin bình thường và vẫn tạo ra dystrophin. Vì thế người nữ này có ít hoặc không có
biểu hiện bệnh. Tuy nhiên, vì có 50% khả năng truyền gen bệnh cho đời con nên người nữ
này được gọi là người mang gen bệnh. Trong một số trường hợp hiếm, bệnh biểu hiện ở cá
5

thể nữ do chỉ có một NST X (hội chứng Turner – 45,X) hoặc do hiện tượng bất hoạt của NST
X bình thường còn lại của cặp XX.
Còn đối với cá thể nam, 46, XY chỉ có một NST X nên nếu NST X này mang gen
dystrophin bị đột biến thì người nam sẽ biểu hiện bệnh.
Mẹ mang gen bệnh

25% mang gen

Bố bình thường

25% bình thường

25% mắc bệnh

25% bình thường

Con
trai

Con
gái

Hình 2.3 Kiểu di truyền bệnh DMD (Nguồn: www.mda.org.au).
Người con trai nhận NST Y từ bố và NST X từ mẹ. Vì trên NST Y không chứa gen
dystrophin nên protein dystrophin sẽ chỉ được tổng hợp từ gen dystrophin của NST X nhận
được từ mẹ. Nếu người con trai này nhận được NST X mang gen bị đột biến thì protein
dystrophin được tạo ra sẽ bị khiếm khuyết gây nên bệnh. Tuy nhiên con gái lại nhận được
NST X từ cả bố và mẹ nên nếu người bố bị bệnh thì sẽ nhận cả gen đột biến và trở thành
người mang gen.

6


2/3 các trường hợp người nam bị bệnh là do thừa hưởng NST X mang gen đột biến từ
mẹ. 1/3 trường hợp người nam bị bệnh, trong khi mẹ của họ không phải là người mang gen
đột biến, đó là do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử (Emery, 1993).
Có thể có hai cách giải thích cho trường hợp một gia đình không có tiền sử mắc bệnh
DMD lại bất ngờ có một đứa con bị mắc chứng bệnh này: đột biến gen đã xảy ra và di truyền
qua các thế hệ phụ nữ của gia đình trong nhiều thế hệ mà không ai hay biết, không có trẻ trai
nào được sinh ra bị mắc bệnh hoặc nếu có mắc bệnh thì không được hay được chẩn đoán phù
hợp; trẻ bị bệnh DMD là do thừa hưởng đột biến mới, nảy sinh từ một trong các tế bào noãn
của quá trình tạo trứng của người mẹ.
Trong trường hợp người mẹ dù không mang gen bệnh, một khi sinh con ra với chứng
DMD, bao giờ cũng có thể có khả năng trên tế bào noãn bị đột biến gen dystrophin vì thế
người mẹ này có nguy cơ cao hơn mức bình thường về việc truyền gen đột biến cho một đứa
con khác nữa, đứa trẻ này có thể truyền gen bệnh cho thế hệ kế tiếp.
2.3. Nguyên nhân gây bệnh

Hình 2.4 Vị trí locus Xp21 (Nguồn: ).
Năm 1986, nguyên nhân gây bệnh đã được xác định là do đột biến gen dystrophin tại
locus Xp21 mã hóa cho protein tên là dystrophin. Dystrophin là protein có trọng khối phân tử
7


427 kD nằm ở mặt trong màng tế bào cơ vân và hoạt động như một yếu tố ổn định chức năng
màng, biểu hiện ở cơ xương, cơ tim và vùng não. Thiếu dystrophin gây biến đổi thoái hóa cả
hệ cơ xương lẫn hệ cơ tim.
Dạng đột biến thường gặp nhất là đột biến mất đoạn, chiếm khoảng 60-65%, đột biến
điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%, đột biến lặp lại chiếm 10 – 15%.
Đột biến mất đoạn hay xảy ra tại hai vùng trọng điểm (hotspot region) là vùng 5’ tận cùng (từ

exon 3-19), và vùng trung tâm (vùng exon 45-52).
2.3.1. Cấu trúc gen dystrophin
Gen dystrophin có chiều dài 2400 kb, được biết đến là gen có kích thước lớn nhất trong
cơ thể người. Gen dystrophin gồm 79 exon và 99,4% cấu trúc gen là intron. Gen này phiên
mã cho mRNA có kích thước 14kb tổng hợp nên protein dystrophin có khối lượng phân tử là
427 kDa (Brown và Dickson, 1994).
Đến nay, 7 promoter độc lập đã được xác định nhờ việc kiểm soát phiên mã ở locus
DMD bằng những phương pháp đặc hiệu tế bào, bao gồm promoter B (Corticol, C ), M
(Muscle), P (Purkinje), R (Retina), CNS (B3, Brain- 3), S (Schawann) và G (General)
(Matsuo, 1996).
Gen dystrophin mã hóa cho 7 đồng phân protein khác nhau. Protein có chiều dài đầy đủ
427 kDa, được phiên mã từ các promoter ở đầu 5’ của gen. Mỗi mRNA mã hóa cho protein
427 kDa (Dp427) chỉ khác nhau về trình tự ở đầu N tận. Ba sản phẩm protein đó chính là
Dp427 (B), Dp427 (M) và Dp427 (P) biểu hiện ở các mô chuyên biệt: B ở não, M ở cơ và P ở
các tế bào Purkinje. Các promoter này là: B (Brain), M (muscle), P (Purkinje). Tên của các
promoter này phản ánh vị trí biểu hiện của dystrophin. Promoter B biểu hiện ở các tế bào thần
kinh vỏ não và vùng hippocampus của não bộ trong khi promoter P biểu hiện ở các tế bào
Purkinje và cả cơ xương. Promoter M biểu hiện ở mức độ cao tại cơ xương và cơ tim, đồng
thời biểu hiện mức độ thấp đối với vài tế bào thần kinh giao cảm (Blake và cộng sự, 2002).

8


Hình 2.5 Vị trí 79 exon và 8 promoter của gen (Nguồn: Blake và cộng sự, 2002).
Gen dystrophin có ít nhất bốn promoter trong gen, đó chính là retinal (R), brain-3 (B3),
Schwann cell (S), and general (G).
Các promoter S (tế bào Schawann) và G (General hay glial) kiểm soát sự biểu hiện của
protein apo-dystrophin. Promoter S phiên mã cho một mRNA 5,6 kb mã hóa cho protein 116
kDa (apo-dystrophin 2 hay Dp116) chỉ biểu hiện ở hệ thần kinh ngoại biên của người trưởng
thành (Blake và cộng sự, 1995).

Promoter G phiên mã cho ít nhất hai mRNA 4,8 và 2,2 kb có tên là apo-dystrophin 1 và
apo-dystrophin 3, mã hóa cho protein ở vùng C tận Dp71 (Ahn và cộng sự, 1993).
Hai bản phiên mã dystrophin bổ sung 260 kDa (Dp260) (Piller và cộng sự, 1993) và 140
kDa (Dp140) (Lodov và cộng sự, 1995) khởi đầu từ các promoter R mới (retina) và B3 (CNS,
brain-3).

9


2.3.2. Cấu trúc và chức năng protein dystrophin
Protein dystrophin gồm 4 vùng (hình 2.8):
-

Vùng N-tận: mã hóa bởi exon 1-8, bao gồm khoảng 240 amino acid đầu tiên, vùng
này là vị trí bám của actin, bao gồm β-spectrin và α-actinin (Koenig, M. và cộng sự,
1988)

-

Vùng rod: mã hóa bởi exon 9-64, gồm khoảng 2400 amino acid, thường được coi là
vùng ít chức năng nhất, vùng trung tâm của dystrophin bao gồm 24 đoạn lặp lại
tương đồng, mỗi đoạn trung bình khoảng 109 amino acid được nối bởi 4 vùng giàu
proline không có cấu trúc xoắn giúp dystrophin linh hoạt và đàn hồi (hình 2.8). Tuy
nhiên, vùng này thường được coi là vùng ít chức năng nhất.

-

Vùng giàu cystein: mã hóa bởi exon 65-67, vùng này chứa vị trí bám của βdystroglycan (exon 62-67).

-

Vùng C-tận: mã hóa bởi exon 68-79, bao gồm 420 amino acid cuối cùng, vùng này
chứa vị trí bám của α-syntrophin (exon 73-74) và α-dystrobevin (exon 74-76) (Ahn
và cộng sự, 1993).

Hình 2.6 Vị trí protein dystrophin trên mặt trong màng tế bào cơ vân
(Nguồn: Muscular Dystrophy Association of NSW).
10


Dystrophin là thành phần chính của các sợi cơ bình thường, định vị ở màng bao cơ với
mức đầy đủ ngay khi thai đang phát triển (Arahata và cộng sự, 1988). Ngay từ giai đoạn sớm
của sự tạo cơ, những nguyên bào cơ chưa biệt hóa bình thường đã có một lượng dystrophin.
Sự xuất hiện dystrophin trùng với việc hòa lẫn một cách tự động các tế bào tạo cơ đơn
nhân để hình thành một hợp bào đa nhân sau giảm phân. Tuy nhiên, trong loạn dưỡng cơ thì
không có hay thiếu hụt nhiều dystrophin, sở dĩ như vậy là do khi các sợi cơ được tái tạo, thoái
hóa hay hoại tử thì kích cỡ sợi sẽ bị biến đổi (Miranda và cộng sự, 1988).
Sự vắng mặt của dystrophin không làm chết tức thời tất cả các sợi cơ ở bệnh nhân DMD
và BMD, các chức năng của chúng vẫn được duy trì trong các quá trình tiến triển của bệnh.
Tuy nhiên, sự tái sinh của các sợi cơ bị hủy hoại không bù đắp được mức độ thoái hóa sợi cơ
ngày càng nghiêm trọng dẫn đến bất ổn định sợi cơ (Miller và cộng sự, 1994; Phạm Ngọc
Khôi, 2009).
Vùng N’ tận

Vùng giàu
base cystein

Vùng rod

Vùng C’ tận

Hình 2.7 Mối liên quan giữa các vùng của dystrophin và
một số phức hợp protein khác (Nguồn: Trần Vân Khánh, 2005).

11


Hình 2.8 Sự kết hợp của dystrophin với phức hệ protein trong tế bào cơ
(Nguồn: Blake và cộng sự, 2002).
Sự biểu hiện bệnh DMD và BMD cho đến nay đều do đột biến ở gen mã hóa cho
dystrophin. Nghiên cứu cho thấy có một vài mối liên quan giữa đột biến gen DMD và kết quả
kiểu hình, cho thấy tầm quan trọng trong cấu trúc các vùng của protein dystrophin (Blake và
cộng sự, 2002). Tại vùng N tận của dystrophin, tầm quan trọng của vùng gắn actin đã được
chứng minh qua việc xác định các đột biến nhầm nghĩa (Arg for Leu-54), kết quả là trong một
kiểu hình DMD liên kết với sự sụt giảm lượng protein. Hơn nữa, các bệnh nhân DMD được
mô tả bị xóa bỏ các exon 3 – 25 biến đổi khung dịch mã, và sản xuất các protein bị cắt ngắn.
Ở vùng rod của dystrophin, đáng chú ý nhất là sự phát hiện một bệnh nhân với một xóa trong
khung của 46% của dystrophin trình tự mã hóa mà kết quả chỉ là một trường hợp nhẹ BMD
(xóa bỏ các exon 17-48). Quan sát này cho thấy rằng các vùng rod hoạt động như một miếng
đệm giữa vùng gắn actin với vùng giàu cysteine và vùng C tận của dystrophin, và cắt ngắn
của khu vực này chỉ rút ngắn các cầu nối giữa hai khu vực chức năng mà không ảnh hưởng
xấu đến chức năng của protein.
Hầu hết các đột biến xóa đoạn tập trung chủ yếu ở hai vùng chính là vùng trung tâm rod
(exon 45-53) và vùng N-tận. Tuy nhiên kích thước của đột biến xóa đoạn thường không tương
xứng với mức độ biểu hiện bệnh trên lâm sàng, một số bệnh nhân với đột biến xóa đoạn rất
12


ngắn nhưng có biểu hiện bệnh nặng (DMD), ngược lại một số bệnh nhân với đột biến xóa
đoạn dài lại biểu hiện bệnh nhẹ (BMD).

Monaco đã đưa ra “thuyết chuyển mã”. Theo đó, đột biến trên bệnh nhân DMD thường
làm thay đổi khung dịch mã (out of frame) và tạo ra mã kết thúc sớm, kết quả là protein
dystrophin không được sản xuất và vắng mặt hoàn toàn ở màng tế bào cơ. Trong khi đó, đột
biến trên bệnh nhân BMD không làm biến đổi khung dịch mã (in-frame) dẫn đến protein
dystrophin được sản xuất ở dạng bán chức năng (semifunctional protein), với một protein có
trọng khối phân tử nhỏ hơn do bị đột biến cắt đoạn bên trong gen nhưng vẫn duy trì được mã
di truyền (Trần Vân Khánh, 2005).
2.4. Phương pháp chẩn đoán bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
Chẩn đoán bệnh DMD thường dựa vào: tiền sử bản thân và gia đình, khám và phát hiện
các triệu chứng lâm sàng, thực hiện các xét nghiệm chẩn đoán như điện cơ, xét nghiệm
enzyme creatine kinase, sinh thiết cơ và chẩn đoán phân tử.
2.4.1. Phương pháp chẩn đoán điện
2.4.1.1. Đo tốc độ dẫn truyền vận động
Khi kích thích một dây thần kinh vận động bằng một xung điện, dây thần kinh sẽ bị khử
cực tại điểm kích thích, tạo thành một xung thần kinh. Xung thần kinh này di chuyển dọc theo
dây thần kinh vận động, gây co cơ. Điện cực ghi đặt trên bắp cơ ghi được một làn sóng do co
cơ sinh ra.
Mục đích của phương pháp này là xác định tình trạng yếu của bệnh nhân bắt nguồn từ
cơ hay các dây thần kinh kiểm soát các cơ này. Các dây thần kinh kiểm soát cơ hay là các
neurone vận động, bắt nguồn từ não bộ, tủy sống và nối với tất cả các cơ, có thể gây ra
tình trạng yếu có vẻ như từ bắp thịt nhưng sự thật lại không phải như vậy (Nguyễn Hữu
Công, 2006).
2.4.1.2. Điện cơ (Electromyography, EMG)
Điện cơ là phương pháp dùng một điện cực có hình dáng giống một kim chích để ghi các
hoạt động điện của cơ vân. Nếu một cơ tăng hoạt động điện do đâm kim và có hoạt động điện
13