Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi trong thực phẩm

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS. Nguyễn văn Duy, ThS. Trần Đình
Quang - Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn
trực tiếp đề tài, các thầy đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài này.
Tôi xin được cảm ơn KS. Lã Văn Hiền cán bộ phòng thực hành Sinh
học phân tử và kỹ thuật di truyền khoa CNSH & CNTP cùng học viên cao học
Phạm Văn Phúc cùng các bạn sinh viên khoa CNSH & CNTP làm nghiên cứu
tại phòng.
Tôi xin được cảm ơn TS. Lê Quang Hòa, Viện CNSH & CNTP trường
Đại học Bách Khoa Hà Nội, TS. Nguyễn Khắc Trung bộ môn cơ sở Đại học
Y Dược Thái Nguyên, KS. Đỗ Bích Duệ và các cán bộ Viện Khoa Học Sự
Sống - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, cán bộ Trung tâm Y tế Dự Phòng
Thái Nguyên đã cung cấp các chủng vi sinh vật để thực hiện đề tài này.Tôi
xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học và Công
Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ chúng tôi trong suốt thời gian qua, cảm ơn các
cán bộ đang công tác tại phòng thí nghiệm khoa CNSH &CNTP đã tạo môi
trường thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bố mẹ, thầy cô, bạn bè tôi đã ủng hộ về mặt
vật chất cũng như tinh thần giúp tôi hoàn thành đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, tháng 6 năm 2012
Sinh viên
Trịnh Thị Tuyết
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Trang
Bảng 2.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ
theo danh pháp Kauffmann- White 6
Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 28
Bảng 3.2 : Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 29
Bảng 3.3 : Thành phần phản ứng PCR 32

Bảng 4.2. Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR 39
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Cấu trúc của vi khuẩn Salmonella typhi 7
Hình 4.1: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA 35
Đường chạy 1: Mẫu YD1;Đường chạy 2: Mẫu YD2 35
Hình 4.2: Kết quả khuếch đại vùng gen đặc hiệu của Salmonella typhi
bằng phản ứng PCR sử dụng sản phẩm DNA tách chiết bằng hóa
chất 37
Hình 4.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng các nồng độ
khuôn DNA khác nhau 38
Hình 4.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở
nhiệt độ gắn mồi và nồng độ MgCl2 khác nhau 40
Hình 4.5. So sánh hiệu quả tách chiết DNA tổng số
bằng phương pháp sốc nhiệt và hóa chất 43
Hình 4.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA
tách chiết từ các loài vi khuẩn kiểm định 45
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
STT Từ viết tắt Từ, thuật ngữ đầy đủ
1 BGLS Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar
2 BSA Bismuth Suffite Agar
3 CFU Cell Forming unit – đơn vị đo khuẩn lạc
4 CIAA 24 Chloroform : 1 Isoamylacohol
5 Cs Cộng sự
6 CTAB Hexadecyltrimethylammonium Bromide
7 DNA
Deoxynucleotideacid
8 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Xét nghiệm
hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme
9 HE Hektoen Entric Agar

10 MLPA Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification
11 OD Optical Density – Giá trị mật độ quang
12 PBW Buffered Peptone Water
13 PCR Polymerase Chain Rection
14 PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis – Điện di trường
xung
15 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA – Tính đa hình
các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên
16 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism - Đa hình
chiều dài đoạn cắt giới hạn
17 SC Selenite Cystein Broth
18 SSR Inter - Simple sequence repeat
19 TAE Tris Acid acetic EDTA
20 TE Tris EDTA
21 TT Mueler Kauffman Broth
22 v/p Vòng/phút
23 XLD Xylose Lysine Desoxycholate Agar
MỤC LỤC
Trang
Phần 1
MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích nghiên cứu 2
1.3. Yêu cầu nghiên cứu 2
1.4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella typhi 3

2.1.1. Trên thế giới 3
2.1.2. Ở Việt Nam 4
2.2. Tổng quan về Salmonella typhi 5
2.2.1. Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica
serotype typhi 5
2.2.2. . Đặc điểm cấu trúc 7
2.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 8
2.2.4. Đặc điểm di truyền 9
2.2.5. Bệnh học sốt thương hàn do Salmonella typhi 9
2.3. Các phương pháp phân loại di truyền Salmonella typhi 13
2.3.1. Phát hiện Salmonella typhi bằng phương pháp nuôi cấy truyền
thống 13
2.3.2. Phát hiện Salmonella typhi bằng phương pháp hiện đại 16
2.3.3 Tổng quan phương pháp PCR 22
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
27
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 27
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 27
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu 27
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu 27
3.2.2. Thời gian nghiên cứu: 27
Từ 12/2012 – 05/2013 27
3.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 27
3.3.1. Vật liệu nghiên cứu 27
3.3.2. Hóa chất 28
3.3.3. Thiết bị 29
3.4. Nội dung nghiên cứu 30
3.4.1. Tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi 30

3.4.2. Xây dựng quy trình phát hiện Salmonella typhi bằng kỹ thuật PCR
phát hiện nhanh Salmonella typhi 30
3.4.3. Đánh giá khả năng tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn
Salmonella typhi bằng phương pháp tách chiết hóa chất và phương
pháp sốc nhiệt 30
3.4.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR phát hiện nhanh
Salmonella typhi 30
3.5. Phương pháp nghiên cứu 30
3.5.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi 30
3.5.2. Phản ứng PCR 31
3.5.3. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện của phản ứng PCR [ 5].32
3.5.4. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR [ 13] 33
3.5.5. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 33
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35
4.1. Tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi 35
4.1.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA bằng phương
pháp sử dụng hóa chất 35
4.1.3. Kết quả kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết bằng phản ứng PCR. .36
4.2. Xây dựng quy trình phát hiện Salmonella typhi bằng kỹ thuật PCR
phát hiện nhanh Salmonella typhi 38
4.2.1 Xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR phát hiện
nhanh Salmonella typhi 38
4.2.2. Tối ưu phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi 39
4.3. Đánh giá khả năng tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Salmonella
typhi bằng phương pháp tách chiết bằng hóa chất và phương pháp
sốc nhiệt 42
4.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR 44
Phần 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

5.1. Kết luận 47
5.2. Kiến nghị 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm lớn của
nhiều quốc gia. Thực phẩm không đảm bảo yêu cầu sẽ ảnh hưởng trực tiếp
đến sức khoẻ và tính mạng của người tiêu dùng và chất lượng cuộc sống của
nhân dân cùng với sự phát triển kinh tế xã hội.
Phần lớn các vụ ngộ độc đã xảy ra với quy mô nhiều người mắc,
nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật chiếm tỷ
lệ cao nhất (43,2%) [18]. Đặc biệt là vi khuẩn Salmonella typhi là thủ phạm
gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Ngày nay người ta đã biết được tới trên
2500 chủng hoặc chủng huyết thanh của Salmonella [18]. Bệnh Salmonella
trên người do vi khuẩn Salmonella typhi gây nên, chủ yếu lây nhiễm thông
qua sử dụng các thực phẩm có nguồn gốc động vật bị nhiễm vi khuẩn này
(chủ yếu là thịt, gia cầm, trứng và sữa). Trên thế giới, các vụ ngộ độc thực
phẩm do Salmonella là rất phổ biến: tháng 7 năm 2007 tại Rumani có 117
người lớn và trẻ em bị ngộ độc do ăn bánh kem trong thời gian cắm trại, tháng
8 năm 2007, tại Hungary bùng nổ vụ ngộ độc tại nhà hàng Budapes làm 31
du khách ngộ độc. Tác nhân gây ngộ độc chủ yếu là các vi khuẩn thương hàn,
trong đó hàng đầu là Salmonella typhi.
Quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm vẫn chủ yếu sử dụng
phương pháp nuôi cấy truyền thống. Phương pháp này luôn bao gồm nhiều công
đoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra sinh hóa, tốn nhiều thời gian (thời
gian phát hiện là 4 – 6 ngày), tốn nhiều công sức, gây khó khăn trong việc phân
tích nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm mầm bệnh và chẩn đoán nguyên nhân gây
ngộ độc được nghi ngờ do Salmonella gây ra. Mặt khác quy trình phân tích này
không cho phép phân biệt các loài hay loài phụ Salmonella với nhau. Sự phát hiện

chậm các vi khuẩn sẽ làm cho những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan
trong cộng đồng ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
Đã có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để phát hiện vi
khuẩn gây bệnh có trong mẫu phân tích như lai DNA, kỹ thuật PCR, ELISA,
1
…Trong số các phương pháp trên, PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ
thuật đã được sử dụng phổ biến trong phát hiện nhanh nhiều loài vi khuẩn gây
bệnh vì kỹ thuật này đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian chẩn
đoán ngắn và không yêu cầu thiết bị phức tạp. Dựa vào việc sử dụng cặp mồi
đặc hiệu với vùng DNA đặc hiệu cho từng chủng, kỹ thuật PCR cho phép
phát hiện đến mức độ chủng vi khuẩn gây bệnh. Do đó, việc ứng dụng kỹ
thuật PCR trong phát hiện nhanh Salmonella typhi là một đề tài có ý nghĩa
thiết thực, góp phần vào việc kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm do
Salmonella gây nên, đảm bảo sức khỏe cộng đồng.
Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên
cứu của Khoa CNSH và CNTP – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh
Salmonella typhi trong thực phẩm”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh Salmonella typhi trong thực
phẩm bằng kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu cao.
1.3. Yêu cầu nghiên cứu
- Xây dựng được quy trình tách chiết DNA tổng số của Salmonella
typhi phục vụ phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi
- Tối ưu được điều kiện của phản ứng PCR phát hiện Salmonella typhi.
- Xác định được giới hạn phát hiện, độ đặc hiệu của phản ứng PCR phát
hiện nhanh Salmonella typhi trong thực phẩm.
1.4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Xây dựng thành công quy trình phát hiện nhanh và đặc hiệu

Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm. Tạo tiều đề cho việc xây dựng bộ kít
chẩn đoán nhanh Salmonella typhi dựa trên kỹ thuật PCR.
- Giúp sinh viên rèn luyện các kỹ năng thí nghiệm, nghiên cứu, tác
phong làm việc chủ động, khoa học.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán
nhanh và đặc hiệu Salmonella typhi gây bệnh trong thực phẩm.
2
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella typhi
2.1.1. Trên thế giới
Bệnh Salmonella là một trong những bệnh ngộ độc thực phẩm phổ biến
và phân bố rộng rãi nhất. Mỗi năm thế giới đã ghi nhận hàng triệu ca bệnh
trên người và bệnh đã gây ra hàng nghìn ca tử vong. Bệnh Salmonella do vi
khuẩn Salmonella gây ra. Ngộ độc do nhiễm vi khuẩn Salmonella lần đầu
tiên được phát hiện cách đây hơn 100 năm, Salmonella là một trong những tác
nhân gây bệnh cho người và súc vật truyền từ thực phẩm, chủ yếu do thịt
(heo, bò, gia cầm…) và các sản phẩm của thịt, trứng, và các sản phẩm của
trứng. Ở Đan Mạch 1995 có 2911 trường hợp nhiễm Salmonella, trong đó có
19% gây bệnh thương hàn do ăn thức ăn là trứng và các sản phẩm của trứng
bị nhiễm vi khuẩn này . Gần đây ở Mỹ hàng năm có khoảng 4000 trường hợp
bị bệnh do thực phẩm bị nhiễm Salmonella [20] . Năm 2000, người ta ước
tính rằng hơn 2,16 triệu người mắc bệnh thương hàn trên toàn thế giới, kết
quả là 216000 người chết và tỷ lệ tử vong cao xảy ra ở châu Á [31]. Ở
Indonesia, tỷ lệ mắc bệnh thương hàn là 1487 nghìn người mỗi năm. Năm
2001 nghiên cứu của Swanen Burg và cộng sự cho thấy 26% thịt heo nhiễm
Salmonella. Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là các vi khuẩn thương
hàn, trong đó hàng đầu là Salmonella typhi.
Bệnh Salmonella đã trở thành một gánh nặng y tế công cộng lớn và thể

hiện bằng chi phí đáng kể ở nhiều quốc gia. Một số quốc gia đã tính toán chi
phí kinh tế của bệnh. Ở Mỹ hàng năm ước tính có khoảng 1,4 triệu người
nhiễm trùng Salmonella không phải thương hàn đã đưa đến 168000 lượt
khám, 15000 lượt điều trị nội trú và 580 ca tử vong. Chi phí ước tính cho mỗi
ca nhiễm Salmonella ở người dao động trong khoảng từ 40 đô la Mỹ đến 4,6
triệu đô la Mỹ tương ứng với từ các ca đơn giản đến các ca phải nhập viện và
3
tử vong. Tổng chi phí liên quan đến Salmonella hàng năm ở Mỹ vào khoảng 3
tỷ đô la [20]. Ở Đan Mạch, ước tính chi phí hàng năm cho các bệnh
Salmonella do ngộ độc thực phẩm là khoảng 15,5 triệu đô la Mỹ (2001) tương
đương với khoảng 0,009% GDP. Một chương trình khống chế Salmonella đã
được thực hiện vài năm ở Đan Mạch với chi phí hàng năm cho chương trình
khoảng 14,1 triệu đô la Mỹ, ước tính chương trình này đã tiết kiệm 25,5 triệu
đô la chi phí công cộng của Đan Mạch [18]. Các số liệu liên quan đến chi phí
của các bệnh ngộ độc thực phẩm thường không sẵn có ở các nước đang phát
triển.
2.1.2. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam trong những năm gần đây, tình hình bệnh thương hàn
cũng gia tăng trở lại trở thành vấn đề rất nghiêm trọng về sức khỏe cộng đồng
và là mối quan tâm hàng đầu hiện nay của các nhà dịch tễ, vi sinh và lâm sàng
trong cả nước. Theo thống kê ở Việt Nam mỗi năm có hàng trăm vụ ngộ độc
thực phẩm, trong đó số vụ do nhiễm vi sinh vật chiếm 33- 49% và chủ yếu là
Salmonella typhi chiếm 70% các vụ ngộ độc [ 7].
Theo báo cáo của Bộ y tế về tình hình mắc bệnh thương hàn thì năm
2012 ghi nhận 617 trường hợp, không có tử vong. So với cùng kỳ năm 2011
(873 trường hợp mắc, không có tử vong), số mắc giảm 29,3%. Số mắc giảm
dần trong giai đoạn 2007 - 2011 từ 2148 (năm 2007) còn 873 (năm 2011), tử
vong duy trì 0 – 2 trường hợp/năm. Trung bình giai đoạn 5 năm tỷ lệ mắc trên
100.000 dân là 1,806; tỷ lệ chết trên 100.000 dân là 0,001. Khu vực miền
Nam chiếm đa số (>60%), tập trung tại các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, TP.

Hồ Chí Minh, Kiên Giang. Trong năm 1999 số ca mắc bệnh thương hàn tại
các tỉnh miền Nam tăng khá cao như: Sóc Trăng (205,57/100.000 dân), Đồng
Tháp (108,78/100.000 dân), An Giang ( 96,37/100.000 dân) [ 7, 8].
4
2.2. Tổng quan về Salmonella typhi
2.2.1. Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica
serotype typhi
Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Họ vi
khuẩn này có đặc điểm chung là gram âm, hình que, oxidase âm và có thể di
động được [24,27]. Có nhiều phương pháp khác nhau để định danh
Salmonella trong đó Kauffmann - White là phương pháp định danh được công
nhận và sử dụng rộng rãi từ năm 2003 [3]. Phương pháp này dựa vào sự
ngưng kết của huyết thanh với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là
kháng nguyên O và kháng nguyên H.
Kháng nguyên O có bản chất là một polysaccharide nằm ở ngoài cùng
của màng tế bào. Cấu trúc của kháng nguyên O là cao phân tử gồm nhiều tiểu
đơn vị, mỗi tiểu đơn vị gồm từ 4 đến 6 gốc đường. Những thay đổi trong
thành phần hay liên kết giữa các gốc đường của tiểu đơn vị tạo ra những loại
kháng nguyên O khác nhau. Kháng nguyên O được chia thành các nhóm
kháng huyết thanh khác nhau (serogroup) qui ước bằng số như O9, O2, O4…
(Ban đầu các nhóm O phổ biến được qui ước bằng chữ cái và đến nay vẫn còn
dùng ở một số nơi). Ví dụ Salmonella typhimurium thuộc nhóm O4 hay còn
gọi nhóm B, Salmonella typhi thuộc nhóm O9 (nhóm D1), Salmonell
paratyphi thuộc nhóm O2 (nhóm A).
Kháng nguyên H là phần tạo thành cấu trúc roi của vi khuẩn. Kháng
nguyên H có bản chất là protein, hình thành từ các tiểu đơn vị protein
flagellin. Salmonella là vi khuẩn đường ruột duy nhất có thể biểu hiện hai loại
kháng nguyên H khác nhau được mã hóa bởi hai gen khác nhau. Tuy nhiên
hoạt động của 2 gen được phối hợp sao cho chỉ một kháng nguyên H được
biểu hiện ở một thời điểm trong một tế bào vi khuẩn. Hai kháng nguyên H

này được xếp vào pha 1 và pha 2. Các chủng “đơn pha” là các chủng chỉ biểu
hiện một kiểu kháng nguyên duy nhất do sự bất hoạt của gen mã hóa cho
5
kháng nguyên pha 1 hoặc pha 2. Ngoài ra một số týp huyết thanh “đơn pha”
do tự nhiên như Salmonella enteriditis, Salmonella typhi [1,4,20]
Theo phương pháp định danh này, Salmonella được chia thành hai loài:
Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vào
Salmonella enterica phân loài V). Salmonella enterica được chia thành 6
phân loài qui định bằng tên hoặc số La Mã, trong đó Salmonella typhi thuộc
phân loài I [2]
Bảng 2.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ
theo danh pháp Kauffmann- White.
Loài và phân loài Salmonella
Số lượng tuýt
huyết thanh
Vật chủ
S. enterica subsp. enterica (I) 1454 Động vật máu nóng
S. enterica subsp. salamae (II) 489
Động vật máu lạnh và
môi trường
S. enterica subsp. arizonae (IIIa) 94
Động vật máu lạnh và
môi trường
S.enterica subsp. diarizonae (IIIb) 324
Động vật máu lạnh và
môi trường
S. enterica subsp.houtenae (IV) 70
Động vật máu lạnh và
môi trường
S. enterica subsp. indica (VI) 12

Động vật máu lạnh và
môi trường
S. bongori 20
Động vật máu lạnh và
môi trường
Tổng cộng: 2463 tuýt huyết thanh.
Tên của týp huyết thanh không được viết in nghiêng và chữ cái đầu tiên
được viết hoa để nhấn mạnh các týp huyết thanh này không phải là những loài
khác nhau. Tóm lại Salmonella enterica subsp enterica serotype typhi
(Salmonella typhi) là chủng vi khuẩn có tên týp huyết thanh (serotype) là typhi
thuộc giống Salmonella, loài Salmonella enterica và phân loài enterica [1]
6
Samonella typhi còn được qui ước bằng công thức kháng nguyên: I
9,12(Vi):d:- để mô tả vi khuẩn này thuộc phân loài I có kháng nguyên O là 9,
12 và mang thêm kháng nguyên vỏ Vi, kháng nguyên H pha I là d và không
có kháng nguyên H pha 2[1,2].
Phần lớn 59% týp huyết thanh của Salmonella thuộc Samonella
enterica phân loài I trong đó các nhóm kháng huyết thanh O phổ biến nhất là
O2, O4, O9, … gây ra khoảng 99% sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và
động vật máu nóng [4].
2.2.2. . Đặc điểm cấu trúc
Hình 2.1. Cấu trúc của vi khuẩn Salmonella typhi
Samonella typhi có chiều dài 2-3µm và đường kính 0.5 µm, cấu trúc
gồm 2 màng: màng trong và màng ngoài ngăn cách nhau bởi vách murein
mỏng nhưng chắc chắn giúp định hình tế bào. Màng trong và màng ngoài đều
là các lớp lipoprotein, đóng vai trò là hàng rào có tính thấm chọn lọc đối với
tế bào. Trên màng có các kênh chuyên biệt để vận chuyển các phân tử vào và
ra khỏi tế bào chất [16].
7
Màng ngoài được bao phủ bởi các kháng nguyên O. Ở Samonella typhi

và Samonella paratyphi đặc biệt còn mang kháng nguyên vỏ Vi, là cao phân
tử của acid N- acetylglucosamine uronic nằm bên ngoài bề mặt tế bào và bao
phủ kháng nguyên O. Samonella typhi còn mang các roi dài 2 – 5 µm là sự
kéo dài của các thể nền bên trong tế bào. Hầu hết Salmonella được bao phủ
bởi lớp lông giúp cho sự gắn của tế bào vi khuẩn lên tế bào chủ. Những sợi
lông này có đường kính khoảng 10nm, ngắn hơn và thẳng hơn so với các sợi
roi, cấu trúc từ các tiểu đơn vị fimbrillin hoặc pilin [2,3].
Cấu trúc bề mặt của Samonella typhi đóng vai trò quan trọng quyết
định các đặc tính sinh lý và sự bám vào các mô của tế bào chủ. Nếu
Salmonella mất hoặc không biểu hiện kháng nguyên O sẽ không có khả năng
sống sót trong tế bào chủ do kháng nguyên O là lớp lipopolisaccharide bảo vệ
vi khuẩn khỏi sự tấn công của các bổ thể của hệ miễn dịch [16]
2.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Salmonella typhi là trực trùng gram âm không tạo bào tử, kị khí tùy ý,
di động được bằng các roi có vành lông rung, phát triển tốt nhất ở 37
o
C, có
khả năng lên men glucose nhưng không lên men lactose, có thể tạo một ít H
2
S
từ cơ chất sulphat tan. Chúng sinh catalase nhưng không tạo oxidase trong
quá tình sống [13].
Salmonella typhi khác so với hầu hết Salmonella ở chỗ chúng không
bao giờ sinh hơi từ glucose, không sử dụng citrate hoặc decarboxylate
orthinine và không lên men rhamnose. Samonella typhi không sinh
indole, thử nghiệm Voges - Proskauer âm tính, phenylalanine deaminase và
urease âm tính. Các đặc tính sinh hóa này được sử dụng kết hợp với các thử
nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh trong định danh Salmonella typhi [15].
Salmonella typhi là vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người mà không
gây bệnh ở bất kỳ sinh vật nào khác. Salmonella typhi có khả năng thay đổi

để chống lại các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp vì vậy
rất khó để loại bỏ tận gốc vi khuẩn này khỏi chuỗi thức ăn. Salmonella typhi
8
có thể tồn tại ở thịt chưa được nấu chín và xâm nhập qua hàng rào cản acid dạ
dày để gây bệnh ở người [6].
2.2.4. Đặc điểm di truyền
Bộ gen Salmonella typhi mang 204 pseudogen chiếm hơn 4% trình tự
mang mã [3], tương tự với bộ gen của Salmonella paratyphi (Pseudogen là
những trình tự DNA mang mã nhưng không được dịch mã). Những gen này
có thể bị bất hoạt do đột biến tạo stop codon, đột biến gây lệch khung, mất
đoạn hay tái sắp xếp đoạn. Trong khi hầu hết các týp huyết thanh của
Salmonella enterica đều gây bệnh ở nhiều kí chủ khác nhau và giới hạn ở
viêm dạ dày ruột thì Salmonella typhi và Salmonella paratyphi chỉ gây bệnh ở
người và còn gây nhiễm trùng hệ thống [7]. Trình tự DNA bộ gen Salmonella
typhi và Salmonella paratyphi có mức độ tương đồng cao nhất so với các týp
huyết thanh còn lại. Sự bất hoạt những gen đóng vai trò quan trọng trong
tương tác với các tế bào chủ, các gen làm thay đổi chu trình kí sinh nội bào
được xem là cơ chế tiến hóa để Salmonella typhi cũng như Salmonella
paratyphi trở thành vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người [13].
Một đặc điểm quan trọng khác ở Salmonella typhi là vi khuẩn này
mang rất ít đặc tính đa dạng di truyền. Khi giải trình tự vài gen để phân biệt
Salmonella typhi chỉ thu được rất ít vị trí đa hình [14]. Việc tìm hiểu những vi
khuẩn có tính đa dạng di truyền thấp như Salmonella typhi gặp rất nhiều khó
khăn và đòi hỏi những kỹ thuật phức tạp.
2.2.5. Bệnh học sốt thương hàn do Salmonella typhi
2.2.5.1. Nguồn lây bệnh và con đường truyền bệnh
Sốt thương hàn là bệnh nhiễm trùng hệ thống do Salmonella typhi gây
ra, con người là kí chủ duy nhất của Salmonella typhi. Người lành mang trùng
có thể thải từ 10
6

đến 10
9
vi khuẩn thương hàn trong mỗi gram phân [31].
Salmonella typhi có thể tồn tại trong nước ao, hồ, nước ngầm, trong sữa, thịt,
trứng và sò bị nhiễm khuẩn. Liều gây bệnh là 10
3
đến 10
6
vi khuẩn theo
đường miệng [18].
9
Vi khuẩn thương hàn lây qua đường tiêu hóa. Đa số các trường hợp
mắc bệnh là do ăn uống thực phẩm, nước bị nhiễm khuẩn và không được nấu
chín. Những yếu tố nguy cơ phải kể đến nguồn nước nhiễm bẩn, kem, thực
phẩm và nước uống đường phố, rau quả được tưới bằng nước thải bẩn hoặc
được rửa bằng nước nhiễm khuẩn như nước sông, nước ao hồ, cống rãnh. Do
liên quan đến những yếu tố điều kiện sống nên bệnh thường lưu hành ở những
nơi có mật độ dân số cao cùng với tập quán sinh hoạt kém vệ sinh [6]
2.2.5.2. Triệu chứng lâm sàng.
Sau khi Salmonella typhi xâm nhập vào cơ thể từ 7 – 21 ngày thì bắt
đầu xuất hiện các triệu chứng khó ở, mệt mỏi, nhức đầu, biếng ăn, sốt nhẹ sau
đó sốt cao dần, đặc biệt về đêm (39-40
o
C) kéo dài hàng tuần nếu không điều
trị cùng với đó là tiêu chảy hoặc táo bón, ho, nôn mửa, đau bụng, cổ cứng.
Bệnh nhân còn có thể bị chậm nhịp tim, lách to, mơ sảng. Trong tuần thứ hai
30% bệnh nhân có những đốm hồng ở bụng, ngực, lưng còn gọi là hồng ban,
sau tuần thứ ba bệnh nhân dần hồi phục. Tuy nhiên 10% bệnh nhân bị tái phát
hay biến chứng nặng hơn, các biến chứng nguy hiểm bao gồm xuất huyết tiêu
hóa và thủng ruột [6].

Ngoài ra 1-6% bệnh nhân trở thành nguồn mang Salmonella typhi
mãn tính. Những người này có thể mang vi khuẩn Salmonella typhi trong tủy
xương hay túi mật từ vài tháng đến cả cuộc đời, đồng thời thải vi khuẩn qua
phân và nước tiểu theo định kỳ mà không hề biểu hiện triệu chứng bệnh nào.
Đây là vấn đề y tế công cộng quan trọng vì những người này là có thể là
nguồn lây nhiễm và làm bùng phát dịch bệnh trong tương lai.
2.2.5.3. Sự phát sinh bệnh do Salmonella typhi.
Sau khi vào cơ thể vi khuẩn tấn công vào ruột. Tại đây chúng xâm nhập
qua các tế bào M của mảng Peyer hoặc di chuyển qua các tế bào biểu mô hấp
thu để xuyên qua lớp dưới niêm mạc ruột non. Tiếp đó vi khuẩn kích thích
phản ứng viêm và hoạt động thực bào bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào,
đồng thời huy động tế bào bạch huyết B và T. Vi khuẩn này có thể tồn tại và
10
nhân lên trong các bạch cầu đơn nhân, qua đó giúp Salmonella typhi phát tán
theo đường máu và bạch huyết đến các hạch bạch huyết mạng treo ruột và các
mô sâu hơn. Sau khi phát tán vi khuẩn sẽ gây nhiễm trùng máu sơ cấp với các
triệu chứng nhẹ như hồng ban, ho tiếp đó Salmonella typhi nhiễm vào lách,
gan và tủy xương gây nhiễm trùng máu thứ cấp. Trong tuần thứ hai của bệnh
Salmonella typhi nhiễm vào túi mật sau đó vi khuẩn nhân lên, theo ống mật
vào ruột non và được thải ra ngoài qua phân [4,6].
2.2.5.4. Biện pháp phòng bệnh sốt thương hàn.
Bệnh chủ yếu lây qua đường ăn uống thức ăn hoặc nước bị nhiễm
khuẩn nên biện pháp quan trọng hàng đầu là tạo điều kiện vệ sinh an toàn
thực phẩm, cải thiện hệ thống xử lý chất thải và nguồn cung cấp nước. Ở các
nước phát triển, bệnh chủ yếu xảy ra ở khách du lịch trở về từ các nước có
dịch nên khách du lịch khi đến những vùng này cần chú ý đến vấn đề an toàn
thực phẩm.
Do Salmonella typhi chỉ gây bệnh ở người nên nguồn gốc lây lan bệnh
luôn liên quan đến những người mắc sốt thương hàn hoặc mang mầm bệnh
mãn tính. Những người chế biến thực phẩm mang mầm bệnh mãn tính có thể

là nguyên nhân của những đợt dịch sốt thương hàn nghiêm trọng. Những
người mang Salmonella typhi mãn tính có thể làm lan tràn bệnh dịch nếu họ
gây nhiễm nguồn cung cấp nước. Vì vậy, việc tầm soát và chữa trị cho những
người mang Salmonella typhi mãn tính là hết sức quan trọng trong công tác
phòng chống dịch [6].
Vacxin là một biện pháp hiệu quả trong phòng bệnh sốt thương hàn.
Vacxin đầu tiên là chủng Salmonella typhi bị bất hoạt do nhiệt, phenol,…Tuy
nhiên vacxin này gây nhiều phản ứng phụ. Tiếp theo là Vacxin Ty21a có nguồn
gốc từ chủng Salmonella typhi Ty2 được làm yếu và không mang vỏ Vi. Đây là
vacxin dạng uống, uống 3 lần, mỗi lần cách nhau 2 ngày. Vacxin này tương đối
an toàn cho hiệu quả bảo vệ trong 5 năm và ít có tác dụng phụ, tuy nhiên lại
không được sử dụng cho trẻ em dưới 6 tuổi. Vacxin thứ 3 có bản chất là
11
polysaccharide Vi tinh chế, được dùng ở dạng tiêm một lần duy nhất. Do vacxin
này ít tác dụng phụ nên được sử dụng rộng rãi và có thể dùng cho trẻ em trên 2
tuổi, tuy nhiên hiệu quả bảo vệ cũng chỉ khoảng 2-3 năm. Sau 3 năm phải tiêm
nhắc lại. Vacxin này thường được tiêm cùng với một số vacxin khác cho những
người đi du lịch đến các vùng lưu hành dịch. Ngoài ra còn có vacxin tái tổ hợp
Vi cho trẻ em từ 2-5 tuổi ở Việt Nam. Vacxin này cho hiệu quả bảo vệ 91.1%
trong 27 tháng, có thể dùng cho trẻ em dưới 2 tuổi và đã được đưa vào chương
trình tiêm chủng quốc gia mở rộng [18].
2.2.5.5. Biện pháp điều trị sốt thương hàn
Ở các vùng dịch tễ sốt thương hàn, hơn 60-90% trường hợp bệnh được
điều trị tại nhà bằng kháng sinh và nghỉ ngơi hợp lý. Đối với bệnh nhân nhập
viện sẽ được điều trị bằng kháng sinh, dinh dưỡng, chăm sóc hợp lý, cân bằng
điện giải, bù nước [15].
Trong các kháng sinh sử dụng điều trị sốt thương hàn hiện nay thì
fluoroquinolone (oxfloxacin, ciprofloxacin, gatifloxacin, levofloxacin) được
xem là họ kháng sinh hiệu quả nhất. Hiệu quả của các kháng sinh này đã được
chứng minh qua các thử nghiệm lâm sàng.

Tuy nhiên việc vi khuẩn kháng quinolone ở những vùng lưu hành dịch
đã làm giảm hiệu quả của fluoroquinolone. Ở những nơi vi khuẩn vẫn nhạy
với quinolone thì fluoroquinolone là lựa chọn tốt nhất để điều trị sốt thương
hàn. Ngược lại, nếu vi khuẩn kháng quinolone thì hiệu quả điều trị với
fluoroquinolone giảm, thời gian điều trị kéo dài, liều dùng phải cao và tăng
nguy cơ thất bại.
Ngoài fluoroquinolone thì azithromycin và cephalosporin thế hệ thứ 3
(ceftriaxone, cefixime, cefotaxime và cefoperazone) cũng là những kháng
sinh hiệu quả trong điều trị sốt thương hàn. Chloramphenicol, amoxicillin và
cotrimoxazole vẫn là lựa chọn thích hợp trong điều trị sốt thương hàn ở những
nơi vi khuẩn vẫn còn nhạy với các kháng sinh này [1,6,7].
12
2.3. Các phương pháp phân loại di truyền Salmonella typhi
2.3.1. Phát hiện Salmonella typhi bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống
Đây là phương pháp định tính và kết quả là có hay không phát hiện
Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm. Do quy định không cho phép
có mặt trong thực phẩm nhưng lại khó phát hiện, nên mẫu lấy tối thiểu phải 25
g và quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải có thêm giai đoạn tiền tăng
sinh để đạt hiệu quả cao. Điều này cần thiết vì Salmonella thường có mặt trong
mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương nặng trong quá trình bảo quản chế biến và
sự tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae,
những vi khuẩn này sẽ cạnh tranh hay ức chế sự phát triển của Salmonella. Để
phát hiện Salmonella cần tiến hành bốn giai đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh
chọn lọc, phân lập và khẳng định. Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử
nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh phù hợp [3,17].
Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment): Đây là khâu quan trọng
không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm nghiệm không
phải là mẫu bệnh phẩm. Người ta thường sử dụng môi trường tiền tăng sinh
không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc hiệu tạo
điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều vi sinh vật hiện

diện trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực
phẩm. Ví dụ: nước peptone đệm Buffered Peptone Water (BPW) là môi
trường tiền tăng sinh được khuyến khích sử dụng trong môi trường kiểm tra
nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae [15]. Tùy theo
đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền tăng sinh phù
hợp, thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh là 1:9, tuy
nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi [29].
Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment): Giai đoạn này
làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng cách ức chế hoặc
ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận lợi cho
việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập.
13
Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella thường được dùng
là Rappaport Vassiliadis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT),
Selenite Cystein Broth (SC) [32]…Thông thường môi trường TT được dùng để
phân tích các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống, các
mẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc, hay các loại thực
phẩm khác. Cần lưu ý là không môi trường tăng sinh chọn lọc nào là môi
trường tối ưu chung cho tất cả các dòng Salmonella. Mỗi loại môi trường tăng
sinh chọn lọc được thiết lập dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau của
Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này
nhưng lại không tăng trưởng được trong môi trường khác [2]. Ví dụ:
Salmonella typhi không phát triển được trong môi trường RV và TT,
Salmonella dublin không phát triển được trong môi trường RV. Ngoài ra, mỗi
môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt nuôi cấy khác nhau như môi trường
RV được ủ ở 42
o
C, môi trường TT và SC được ủ ở 37
o
C trong 22 – 24 giờ [18].

Giai đoạn phân lập (isolation): Đây là bước tách biệt Salmonella
trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng. Một số môi trường phân lập
như Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth Suffite Agar (BSA),
Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS), Hektoen Entric
Agar (HEP). Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái
khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau [16,18].
Trên các môi trường phân lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu
khuẩn lạc đặc trưng khác nhau. Trên môi trường XLD: khuẩn lạc màu hồng
tròn, trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có khả
năng sinh H
2
S, trừ Salmonella typhi thì khuẩn lạc trong suốt và không có tâm
đen [2]. Trên môi trường BSA: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay
đen, có hay không có ánh kim tím trên bề mặt khuẩn lạc, môi trường xung
quanh có màu nâu chuyển sang đen khi tăng thời gian ủ ấm, gây khó khăn cho
việc nhận biết khuẩn lạc vi khuẩn Salmonella. Trên môi trường BPLS: khuẩn
lạc Salmonella điển hình trong suốt và hơi đỏ trong môi trường, có màu đỏ
14
hồng xung quanh khuẩn lạc. Một số Salmonella xuất hiện khuẩn lạc màu lục
trong suốt nếu bao quanh là vi khuẩn lên men lactose hoặc glucose gây ra
vùng đó màu vàng xanh hoặc xanh, dưới 1% Salmonella không điển hình,
chúng lên men đường lactose và xuất hiện khuẩn lạc vàng lục hoặc lục.Trên
môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu xanh dương đến màu xanh lục,
có hay không có tâm đen. Một số loài Salmonella có thể phát triển thành
khuẩn lạc có các chấm màu đen bóng, lớn hay phần lớn các khuẩn lạc hoàn
toàn có màu đen. Có một số ít loài Salmonella sinh ra khuẩn lạc màu vàng có
hoặc không có tâm đen [2,3,15,18].
Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa: Đây là bước xác nhận các
dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonella trên môi trường phân lập bằng các thử
nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng. Các biểu hiện sinh hóa của

Salmonella như sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase
(+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), mannitol (+), sorbitol (+) [16]. Nếu
các biểu hiện sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng các
thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá. Vi khuẩn
sau khi phục hồi được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa
nhằm xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella [24].
- Phương pháp nuôi cấy truyền thống vẫn đang được áp dụng tại Việt
Nam cũng như các nước khác trên thế giới để phát hiện Salmonella trong thực
phẩm, đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn được chấp nhận rộng rãi. Tuy
nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức lao động cho các
công việc như: chuẩn bị môi trường, dụng cụ, thực hiện quy trình, thời gian
để có kết quả phân tích phải mất từ 4 – 6 ngày. Với thời gian này đã không
đáp ứng được các yêu cầu cho kết quả nhanh trong việc phục vụ các chương
trình giám sát chất lượng thực phẩm trên dây chuyền sản xuất như hiện nay
hoặc gây thiệt hại cho các nhà quản lí doanh nghiệp vì các chi phí lưu kho để
chờ kết quả phân tích [29,13].
15
2.3.2. Phát hiện Salmonella typhi bằng phương pháp hiện đại
* Phương pháp Phage Typing
Phage typing là phương pháp đầu tiên nhằm phân biệt Salmonella typhi
trong các nghiên cứu về dịch tễ thương hàn và cho hiệu quả khá tốt.
Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi loại phage chỉ ly giải một
chủng vi khuẩn mà không thể ly giải chủng vi khuẩn khác trong cùng một
loài. Do đó các chủng của một loài vi khuẩn có thể được phân biệt dựa trên
tính nhạy khác nhau của chúng với một hỗn hợp nhiều loại phage khác nhau
[20].
Ưu điểm của phương pháp này là so với phương pháp kiểu gen, phương
pháp huyết thanh là có giá thành rẻ hơn, không tốn công lao động. Nhược
điểm là nặng về kỹ thuật và chỉ được thực hiện ở một số phòng thí nghiệm
chuẩn. Hiệu quả phân biệt của phương pháp còn hạn chế do độ đa dạng của

hỗn hợp phage không cao, đặc biệt khi chủng phân lập trong một vùng địa
phương. Ngoài ra nhiều chủng Salmonella typhi không thể xác định được kiểu
Vi do chúng kháng với hoạt động của các Vi-phage hoặc phản ứng chéo với
nhiều loại Vi-phage khác nhau [24].
Trong nhiều năm qua phương pháp Phage typing đã được sử dụng như
một công cụ hữu hiệu cho việc nghiên cứu sự bùng phát của Salmonella
typhi. Điển hình như Ward L. R. et al (1987) đã mô tả phương pháp Phage
typing nhằm phát hiện ra vi khuẩn Salmonella enterica [20].
* Phương pháp RAPD (Random amplified polymorphic DNA)
Là phương pháp phân tích đa dạng DNA khuyếch đại ngẫu nhiên, kỹ
thuật này được phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và McClelland, được sử
dụng lần đầu tiên bởi Williams và cộng sự (1990) để kiểm tra mẫu ADN của
con người chưa rõ danh tính [19]. Random amplified polymorphic DNA (tính
đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) là phương pháp phân biệt dựa trên
sự khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA trên nhiễm sắc thể, dùng nghiên cứu
sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau. Mồi được sử dụng trong kỹ
16
thuật RAPD là những sợi oligonucleotide có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên, các
sản phẩm RAPD được phân tích bằng cách điện di trên gel agarose. Hệ gen
của hai loài khác nhau sẽ cho những đoạn băng trên gel khác nhau, từ đó có
thể so sánh sự đa dạng sinh học của các giống cây [15, 19].
Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử
dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước bắt cặp
và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của
các primer. Các đoạn mồi oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai
mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đại
được (dưới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thước khác nhau sau
khi khuếch đại. Sự có mặt của các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã có
một sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA bộ gen và mồi. Các
mồi dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương

đồng trên mạch đơn DNA bộ gen. Do đó tính đa dạng thu được nhờ RAPD là
đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một base nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản
việc tiếp hợp giữa mồi và DNA mạch khuôn. Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc
sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng như sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm
thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch đại [11].
Dùng nhiều primer khác nhau sẽ khuếch đại nhiều đoạn gen với kích
thước khác nhau, kết quả này được thể hiện trên gel với nhiều băng ở những
vị trí khác nhau, các băng đa hình được ghi nhận và từ đó có thể vẽ được bản
đồ trên một quần thể đang phân ly.
Sinh vật cùng loài sẽ có kiểu gen hoàn toàn giống nhau, khuyếch đại
các đoạn DNA có kích thước giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên
nào để chạy PCR. Sinh vật khác nhau ít nhiều sẽ khác nhau về kiểu gen thì
một số mồi ngẫu nhiên nào đó các đoạn DNA được khuyếch đại sẽ có kích
thước khác nhau.r
Phương pháp này có ưu điểm là phát hiện nhanh tính đa dạng di truyền,
thao tác đơn giản không đòi hỏi kỹ thuật cao, tương đối rẻ tiền hơn so với các
17
phương pháp RFLP, SSR, không dùng đồng vị phóng xạ nên tránh được độc
hại cho người thao tác [15], thường được áp dụng để phân loại Salmonella
typhi và cho hiệu quả phân biệt khá cao. Nhược điểm là có sự xuất hiện các
băng tính trội điều đó sẽ không phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị
hợp tử, tính lặp lại không cao do mồi là ngẫu nhiên và phụ thuộc vào điều
kiện phản ứng PCR, trở ngại trong việc giải thích các băng có cùng tốc độ di
chuyển. Việc sử dụng mồi, các loại enzyme polymerase khác nhau, qui trình
chuẩn bị DNA khác nhau hay thực hiện ở các phòng thí nghiệm khác nhau
đều có thể ảnh hưởng đến kết quả [3].
Các công trình nghiên cứu trên thế giới ứng dụng kỹ thuật RAPD đã
được công bố như Bianca R. Q.và cs (2004) Tối ưu hóa của phản ứng RAPD
đặc trưng cho Salmonella enterica serovar Typhi để đảm bảo khả năng tái
sinh và khả năng phân biệt của kỹ thuật này, trong nghiên cứu này để tối ưu

phản ứng RAPD các nhà khoa học đã sử dụng nồng độ khác nhau của DNA
khuôn, mồi, MgCl
2
và Taq polymerase để kiểm tra 8 chủng Salmonella typhi
được phân lập ở các khu vực khác nhau của Brazil [30],
* Phương pháp ELISA.
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay - Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng
mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và
kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Nguyên tắc đó là sử
dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng, nếu có sự hiện diện
của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ giữ lại trên bề
mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng các
loại kháng thể thứ cấp có gắn enzyme alkaline phosphate. Khi bổ sung một cơ
chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ
chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Sự xuất hiện màu chứng tỏ
đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua
cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát
18