XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY LAN MOKARA CHAO PRAYA SUNSET SẠCH BỆNH VIRUS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY LAN
MOKARA CHAO PRAYA SUNSET SẠCH BỆNH VIRUS

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ HOA THÙY
Niên khóa: 2006 – 2010

Tháng 7/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY LAN
MOKARA CHAO PRAYA SUNSET SẠCH BỆNH VIRUS

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. Nguyễn Xuân Dũng

Nguyễn Thị Hoa Thùy

KS. Nguyễn Phúc Trường

Tháng 7/2010 


 

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành cuốn khóa luận này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, động viên,
hướng dẫn tận tình của thầy cô, gia đình và bạn bè. Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành
đến:
™ Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại học Nông Lâm
Tp.HCM cùng các thầy cô của trường đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian
qua.
™ Trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM, đặc biệt là phòng Công nghệ sinh
học Thực vật đã tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
™ ThS. Nguyễn Xuân Dũng và KS. Nguyễn Phúc Trường đã tận tình hướng dẫn,
động viên trong thời gian tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp tại trung tâm Công nghệ Sinh
học TP.HCM.
™ Anh Lâm Vỹ Nguyên (trước đây học lớp DH02SH) cùng các anh chị hiện đang
công tác tại Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. HCM.
™ Ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện tốt nhất và
động viên con trong suốt quá trình học tập và làm đề tài tốt nghiệp.
™ Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã tạo mọi điều kiện cho
tôi trong suốt thời gian học tập.
™ Bạn Đỗ Phong Lưu cùng tập thể lớp DH06SH đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình tôi làm đề tài.

i


 

TÓM TẮT
Đề tài được tiến hành từ ngày 01/02/2010 đến ngày 01/07/2010 tại Trung tâm
Công Nghệ Sinh Học Tp. Hồ Chí Minh trên cây lan Mokara Chao Praya Sunset, dòng
lan có nguồn gốc từ Thái Lan và đang được trồng tại vườn ươm của Trung tâm Công
Nghệ Sinh Học Tp. Hồ Chí Minh.
Mục đích nghiên cứu là tạo được cây lan Mokara Chao Praya Sunset in vitro
sạch bệnh virus từ nguồn giống sạch ban đầu. Vì khi lan bị nhiễm virus sẽ ảnh hưởng
đến phẩm chất của hoa hoặc có thể làm cho cây không ra hoa, điều này gây ảnh
hưởng rất lớn cho người sản xuất và tiêu dùng. Quy trình tạo cây lan sạch virus được
xây dựng thông qua các bước như sau: trước tiên, vận dụng kỹ thuật RT-PCR thanh
lọc được những mẫu sạch virus lấy từ vườn, sau đó tiến hành quá trình vô mẫu ở
những nồng độ chất khử trùng khác nhau (chất khử trùng được sử dụng là javen với 3
nồng độ 20%; 25%; 33,33%) với thời gian khử trùng là 30 phút, sau đó tiến hành thử
nghiệm các môi trường tái sinh PLBs và chồi cây lan in vitro từ nguồn giống phát hoa
sạch virus ban đầu (sử dụng môi trường MS có bổ sung các nồng độ BA (2 mg/l; 2,5
mg/l và 3 mg/l) và NAA (0,2 mg/l và 0,5 mg/l)) để tìm ra môi trường tối ưu, cuối cùng
sử dụng kỹ thuật RT-PCR để kiểm tra tình trạng sạch virus đối với những chồi lan in
vitro vừa được tái sinh sau 8 tuần nuôi cấy.
Kết quả cho thấy đã chọn lọc được các mẫu lan Mokara Chao Praya Sunset sạch
virus từ vườn ươm để sử dụng làm nguồn giống ban đầu cho thí nghiệm. Xác định
được nồng đô chất khử trùng javen: 20% với thời gian 30 phút cho tỉ lệ mẫu sống và
vô trùng cao nhất. Xác định môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,5 mg/l BA và 0,5
mg/l NAA cho khả năng tái sinh PLBs cao nhất. Sau 8 tuần nuôi cấy, các PLBs và
chồi tái sinh từ nguồn mẫu sạch virus ban đầu được kiểm tra lại bằng phương pháp
RT-PCR để khẳng định hoàn toàn sạch virus.

ii


 

SUMMARY

The topic was conducted from 01/02/2010 to 01/07/2010 in Biotechnology Center
of Ho Chi Minh City. With the object of study is the Mokara Chao Praya Sunset, an
Thailand  imported orchid, planted in the garden of the Biotechnology Center of Ho Chi

Minh City.  
The aim of study is the producing of the in vitro virus-free Mokara Chao Praya
Sunset orchid from the clean original source. Because infected virus orchid will affect
the quality of the flower or plant can not make flowers, which greatly influence the
productions and consumptions. The process of creating virus-free orchid was built
through the following steps: the first, using RT-PCR technique to purge the virus-free
samples, then sterilizing them with different disinfectants concentrations (disinfectants
are used with three levels 20%, 25%, 33.33%) with disinfection time is 30 minutes.
Then they were cultured into different nutritious environments to regenerate PLBs and
buds (using MS medium supplemented with BA concentrations (2 mg/l; 2,5 mg/l and
3 mg/l) and NAA (0,2 mg/l and 0,5 mg/l) to find the optimal nutritious environment.
In the end, using RT-PCR technique to check the virus-free of the in vitro regenerated
buds after 8 weeks cultured. 
The results show that selecting Mokara Chao Praya Sunset free-virus samples
to use as a initial material for the study. The concentration of javen 20% with time (30
minutes) brings the highest percentage of live samples. MS culture medium
supplemented with 2.5 mg/l BA and 0.5 mg/l NAA brings a best possible PLBs
regeneration. Using RT-PCR technique on the samples after 8 weeks cultured brings

the result of virus-free regenerated completed PLBs and buds.

iii


 

MỤC LỤC
Lời cảm ơn ................................................................................................................. i
Tóm tắt ....................................................................................................................... ii
Summary .................................................................................................................... iii
Mục lục ...................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... vii
Danh sách các bảng ................................................................................................... viii
Danh sách hình ......................................................................................................... ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu của đề tài............................................................................................... 1
1.3. Nội dung thực hiện ............................................................................................. 1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 2
2.1. Sơ lược về giống lan Mokara ............................................................................. 2
2.1.1. Phân loại .......................................................................................................... 2
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố ..................................................................................... 2
2.1.3. Đặc điểm hình thái........................................................................................... 2
2.1.4. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng sự phát triển của Lan Mokara .................. 3
2.1.5. Cách trồng và chăm sóc lan Mokara ............................................................... 4
2.1.6. Sơ lược về giống lan Mokara Chao Praya Sunset ........................................... 5
2.2. Giới thiệu chung về virus ................................................................................... 7
2.2.1. Cách gọi tên ..................................................................................................... 7
2.2.2. Thành phần cấu tạo .......................................................................................... 7

2.2.2.1. Vỏ protein (capsid) ....................................................................................... 7

iv


 

2.2.2.2. Màng bao (envelop) ...................................................................................... 8
2.2.2.3. Cấu trúc bộ gene ........................................................................................... 9
2.2.3. Phương thức sinh sản và lan truyền ................................................................. 9
2.3. Sơ lược về virus gây bệnh trên lan ..................................................................... 9
2.3.1. Cymbidium mosaic virus (CyMV)................................................................... 10
2.3.2. Odontoglossum ringspot virus (ORSV) .......................................................... 11
2.4. Sơ lược về phương pháp RT-PCR ...................................................................... 12
2.5. Sơ lược về phương pháp nuôi cấy mô ................................................................ 15
2.5.1. Vài nét về kỹ thuật nuôi cấy mô ...................................................................... 15
2.5.2. Lịch sử phát triển và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô ............... 15
2.5.3. Các giai đoạn của quá trình nhân giống in vitro.............................................. 16
2.5.4. Những thuận lợi và khó khăn của kỹ thuật nhân giống in vitro ...................... 17
2.6. Sơ lược về nuôi cấy mô lan ................................................................................ 17
2.7. Sơ lược kết quả sử dụng chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô lan ....... 18
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 20
3.1. Vật liệu ............................................................................................................... 20
3.1.1. Mẫu thí nghiệm................................................................................................ 20
3.1.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ...................................................................... 20
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................................ 20
3.1.3.1. Thiết bị và dụng cụ trong kỹ thuật RT-PCR ................................................ 20
3.1.3.2. Thiết bị và dụng cụ trong quá trình nuôi cấy mô ......................................... 20
3.1.4. Các hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm ................................................ 21
3.1.4.1. Hóa chất dùng trong tách chiết RNA virus .................................................. 21

3.1.4.2. Hóa chất dùng trong phản ứng RT-PCR ...................................................... 21
3.1.4.3. Hóa chất dùng trong điện di ......................................................................... 21
v


 

3.1.4.4. Hóa chất dùng trong nhuộm gel .................................................................. 21
3.1.4.5. Hóa chất dùng trong quá trinh vô mẫu và nuôi cấy...................................... 21
3.2. Phương pháp ....................................................................................................... 22
3.2.1. Thanh lọc nguồn mẫu sạch virus bằng phương pháp RT-PCR ....................... 22
3.2.2. Khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu ban đầu cho nhân giống in vitro ............... 23
3.2.3. Khảo sát nồng độ BA và NAA tối ưu cho sự tái sinh PLBs từ mẫu cấy......... 24
3.2.4. Kiểm tra sự nhiễm virus của mẫu sau khi nuôi cấy......................................... 24
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 25
4.1. Thanh lọc nguồn mẫu sạch virus ....................................................................... 25
4.2. Khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu ban đầu cho nhân giống in vitro .................. 25
4.3. Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự tái sinh PLBs từ mô cấy ............................ 26
4.4. Kiểm tra sự nhiễm virus của mẫu sau khi nuôi cấy ............................................ 29
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 30
5.1. Kết luận............................................................................................................... 30
5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 31
PHỤ LỤC

vi


 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

A.O.S

American Orchid Spciety

BA

Benzyladenine

cDNA

complementary deoxynucleic acid

cs

cộng sự

CyMV

Cymbidium mosaic virus

DNA

deoxy nucleic acid

dUTP

Deoxy uridine Triphosphate

NAA

Naphthalene acetic acid

ORSV

Odontoglossum ringspot virus

PCR

Polymerase chain reaction

PLB

Protocorm-like body

RNA

ribose nucleic acid

RT

reverse transcription

RT-PCR

Reverse transcription-polymerase chain reaction

TAE

Tris-acetate-EDTA

TDZ

5-Phenylcarbamoylamino-1,2,3-thiadiazole

Tp. HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

TT CNSH

Trung tâm công nghệ sinh học

UNG

Uracil-DNA glycosilase

vii


 

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Các thành phần của phản ứng multiplex RT-PCR .................................. 22
Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR....................................... 23

Bảng 3.3 Các nồng độ chất khử trùng ..................................................................... 24
Bảng 3.4 Các môi trường bổ sung BA và NAA ..................................................... 24
Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu lan Mokara Chao Praya Sunset sống vô trùng sau 7 ngày ..... 26
Bảng 4.2 Tình trạng mẫu sau 5 tuần nuôi cấy......................................................... 27
Bảng 4.3 Tình trạng mẫu sau 8 tuần nuôi cấy......................................................... 28

viii


 

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Lan Mokara Chao Praya Sunset ................................................................ 5
Hình 2.2 Rễ và lá của lan Mokara Chao Praya Sunset ............................................. 6
Hình 2.3 Hoa của lan Mokara Chao Praya Sunset ................................................... 6
Hình 2.4 Hình dạng của CyMV ................................................................................ 10
Hình 2.5 Triệu chứng do CyMV gây ra .................................................................... 11
Hình 2.6 Hình dạng của ORSV ................................................................................ 11
Hình 2.7 Triệu chứng do ORSV gây ra .................................................................... 12
Hình 2.8 RT-PCR với giai đoạn mồi đặc hiệu .......................................................... 13
Hình 2.9 RT-PCR với giai đoạn mồi ngẫu nhiên...................................................... 13
Hình 2.10 Sơ đồ minh họa các bước hoàn chỉnh của phản ứng RT-PCR ................ 14
Hình 4.1 Kết quả phát hiện virus trên các mẫu lan bằng phương pháp RT-PCR ..... 25
Hình 4.2 Khả năng tái sinh tạo PLBs của mẫu cấy trên các môi trường .................. 27
Hình 4.3 Khả năng tạo chồi từ PLBs của mẫu cấy trên các môi trường .................. 28
Hình 4.4 Kết quả phát hiện virus trên mẫu sau 8 tuần nuôi cấy bằng RT-PCR ....... 29
 

ix

 

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, hoa kiểng đang đóng vai trò rất
quan trọng trong đời sống văn hóa, tinh thần con người đồng thời cũng góp phần làm
đẹp cho cảnh quan môi trường; Vì vậy quan tâm phát triển hoa kiểng đang là vấn đề
cấp thiết. Trong số các cây hoa kiểng thì lan Mokara là một trong những giống lan cắt
cành đang được ưa chuộng trên thị trường vì hình dáng, màu sắc phong phú, đa dạng
lại rất siêng hoa, mang lại rất nhiều lợi ích cho người trồng lan. Trên thị trường thế
giới, nhu cầu về giống lan này ngày càng tăng. Ở Việt Nam, việc sản xuất hoa lan là
một nghề cho tỷ suất lợi nhuận cao, đồng thời điều kiện địa lý ở Việt Nam cũng rất
thích hợp cho cây lan phát triển.
Hiện nay các giống lan Mokara được nhập vào Việt Nam, phần lớn có nguồn
gốc từ các nhà vườn hay các trại hoa ở Thái Lan và Đài Loan với nhiều chủng loại rất
đa dạng. Thế nhưng một vấn đề cần giải quyết đó là hiện tượng lan bị nhiễm virus.
Khi lan bị nhiễm virus sẽ ảnh hưởng đến phẩm chất và làm giảm vẻ đẹp của hoa hoặc
làm cho cây không ra hoa. Do đó, việc cung cấp cây lan con Mokara có phẩm chất tốt
và sạch bệnh virus đang là vấn đề cấp thiết. Để góp phần giải quyết vấn đề trên, đề tài
“Xây dựng quy trình nhân giống lan Mokara Chao Praya Sunset sạch bệnh virus”
được thực hiện.
1.2 Yêu cầu của đề tài
Xây dựng thành công quy trình nhân giống cây lan Mokara Chao Praya Sunset
sạch bệnh virus.
1.3. Nội dung thực hiện
Thanh lọc được các mẫu sạch virus. Thực hiện quá trình vô mẫu, xác định được
nồng độ javen và thời gian thích hợp. Cuối cùng, tiến hành nuôi cấy mẫu thí nghiệm,
xác định được môi trường phù hợp cho sự tái sinh PLBs và chồi từ phát hoa ban đầu.

Kiểm tra lại tình trạng sạch virus của các chồi sau quá trình nuôi cấy.

1


 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về giống lan Mokara
2.1.1. Phân loại
Cây Lan Mokara là loài lan thuộc:
Giới: Plantae (Thực Vật)
Ngành: Angiospermatophyta (hiển hoa bí tử)
Lớp: Monocotyledon (đơn tử điệp)
Bộ: Orchiddales
Họ: Orchidaceae
Loài: Vandaneous
Giống: Vandan Jones
Tên lai: Mokara
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố
a) Nguồn gốc:
Năm 1969, cây Lan lai tên Mokara Wai Liang đầu tiên trên thế giới được chính
thức ra đời ở Singapore, dưới bàn tay tài hoa của C.Y. Mork. Đây là loài lan lai giữa
ba giống Arachnis (lan bò cạp), Ascoentrum và Vanda, do đó có đặc tính nổi bật từ bố
mẹ: dạng hoa và màu sắc đẹp từ Vanda, tăng trưởng nhanh từ Ascocenda
(Ascocentrum x Vanda) (Dương Công Kiên, 2003).
b) Phân bố:
Phần lớn hoa Lan trên thế giới đều mọc tự nhiên ở vùng nhiệt đới và á nhiệt
đới, nhất là ở Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ la-tinh. Trên thế giới có từ 25.000 đến
30.000 loài hoa Lan gồm khoảng 800 chi. Lan Mokara có xuất xứ từ Thái Lan và

Singapore, hiện nay được trồng với mục đích thương mại ở nhiều nơi kéo dài từ
Philippin đến Nam Á, Hawaii,... (Dương Công Kiên, 2003).

2


 

2.1.3. Đặc điểm hình thái
Mokara là nhóm lan được lai tạo từ các giống: Arachnis x Vanda x
Ascocentrum nên có đặc điểm tương tự như nhóm Vanda là loài Lan đơn thân, thân
hình trụ dài, không có giả hành, lá dài hình lòng máng hay hình trụ mọc cách hai bên
thân. Phát hoa mọc từ nách lá giữa thân, phát hoa dài mang nhiều hoa thường không
phân nhánh. Hoa cỡ trung bình đến lớn, cánh đài của hoa rất lớn. Hoa có nhiều màu
sắc phong phú: trắng, tím, hồng đỏ, cam, vàng nâu và xanh. Đặc biệt trên cánh hoa
thường có chấm, có đốm hoặc hình carô (Dương Công Kiên, 2003).
2.1.4. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây
lan Mokara
a) Ánh sáng
Ánh sáng là yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của lan. Ánh sáng cung cấp
năng lượng cần thiết cho phản ứng quang tổng hợp. Khi ánh sáng ít, cây không tạo đủ
dưỡng liệu để sống. Do cường độ quang hợp tỉ lệ với cường độ ánh sáng nên vào
những ngày nắng nóng cây cần nhiều nước và muối khoáng để tạo ra dưỡng chất hơn
là lúc trời âm u, vì vậy cần phải tăng lượng nước tưới và phân bón vào mùa nắng,
giảm vào mùa mưa. Mokara là loài ưa sáng, khi ánh sáng yếu thì cường độ quang hợp
giảm, khi đó cây sẽ thiếu dinh dưỡng, suy yếu hoặc không ra hoa (Dương Công Kiên,
2003).
b) Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến cây lan thông qua con đường quang tổng hợp. Cường
độ quang hợp tăng theo nhiệt độ: thường khi nhiệt độ tăng 100C thì tốc độ quang hợp

tăng lên gấp hai lần. Khi nhiệt độ tăng, nhu cầu dinh dưỡng ở cây tăng, cần phải tăng
cường phân bón cho lan để đáp ứng đủ nhu cầu của cây. Thế nhưng, nếu nhiệt độ
trong cây tăng quá cao mà không tỏa ra được sẽ làm diệp lục tố bị hủy, lá ngã sang
vàng, quá trình quang hợp bị đình chỉ, chất nguyên sinh mất nước, cô đặc lại, dẫn đến
cây ngừng hô hấp và chết. Ngược lại, nếu nhiệt độ quá thấp, nước trong tế bào cây sẽ
kết tinh thành đá làm gia tăng thể tích dẫn đến phá vỡ cấu trúc tế bào (Dương Công
Kiên, 2003).

3


 

c) Ẩm độ
Yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đối với ẩm độ chính là sự phân bố lượng
mưa trong năm: mưa rải rác tạo ẩm độ cao hơn mưa tập trung. Nước từ mưa, không
khí ẩm đi vào rễ, di chuyển đến thân, và thoát hơi nước qua lá. Sự di chuyển này có ý
nghĩa quan trọng với lan vì giúp vận chuyển chất dinh dưỡng và các sản phẩm tạo
thành trong cây được dễ dàng. Sự thoát hơi nước ảnh hưởng đến tình trạng thiếu nước
của cây và tùy thuộc vào độ ẩm. Nếu không khí bão hòa hơi nước thì không có hiện
tượng thoát hơi nước, nhưng nếu không khí khô ráo sẽ làm sự thoát hơi nước gia tăng.
Sự thiếu nước xảy ra vào mùa khô, lúc này lá khô héo và rụng, cường độ quang hợp
thấp, nên cần phải tăng cường tưới nước cho lan vào mùa khô (Dương Công Kiên,
2003).
d) Độ thông thoáng
Đây cũng là một trong những yếu tố cần thiết cho sự phát triển của lan. Không
khí vườn lan cần được thay đổi liên tục. Lượng không khí luân lưu này vừa làm mát
cây vừa làm thay đổi một phần lượng CO2 trong không khí (khoảng 340/1000.000)
đồng thời cũng cần để tái lập lượng CO2 xung quanh lá. Trong vườn lan, càng thiếu
thông thoáng càng dễ gia tăng bệnh cho lan. Nhưng sự thông thoáng quá lớn thì lại

tăng sự bốc hơi làm cho môi trường có độ ẩm thấp, dẫn đến sự thoát hơi nước cao, cây
kém phát triển (Dương Công Kiên, 2003).
2.1.5. Cách trồng và chăm sóc lan Mokara
Mokara là loàn Lan độc trụ, phát triển nhanh. Cây con khi mới mua về thường
có chiều cao 30 – 40 cm, với vài rễ mới nhú. Vì vậy, trước tiên phải giúp cây phát
triển bộ rễ bằng cách bổ sung vitamin B1 và chế phẩm Atonik. Với những cây cho hoa
sớm, nên loại bỏ hoa để đảm bảo sinh trưởng cho cây (Dương Công Kiên, 2003).
Ngoài ra cũng cần phải chú ý đến chế độ phân bón và phòng trừ bệnh cho cây.
Thời gian đầu nên sử dụng loại phân bón lá có chứa B1 và NAA để kích thích cây
phát triển rễ và mau phục hồi. Sau đó luân phiên sử dụng B1, phân cá và loại phân
bón lá có hàm lượng N cao để phun cho lan. Về chế độ tưới hàng ngày nhất là vào
mùa nắng cần đảm bảo tưới hai lần mỗi ngày vào buổi sáng và buổi chiều mát. Đối
với những ngày có sương hoặc hơi lạnh có thể tưới sớm để rửa lá trước khi mặt trời
mọc. Có thể phòng trừ sâu bệnh bằng cách phun các loại thuốc: Aliette, Score, COC
4


 

85, Carbendazim, Rampart luân phiên nhau. Không được bón phân chuồng tươi vì sẽ
làm nấm bệnh phát triển, cây dễ bị nhiễm bệnh. Khi cây lan đã lớn, lượng rễ nhiều,
nên sử dung phân bón lá có hàm lượng N-P-K tương đương nhau. Thời gian sau 6
tháng trở đi một số giống hoa đã bắt đầu cho hoa, cần phun bổ sung phân bón lá để
kích thích ra hoa, hoa đẹp, phát hoa dài.
Về đất trồng, nên chọn đất phù sa ven sông, có tỷ lệ cát cao. Cần làm luống cao
15 – 20 cm, rãnh sâu 15 – 22 cm, luống rộng khoảng 1m, chiều dài luống tùy theo nhà
vườn (nhưng không quá 10 m). Đất trồng không nên đập vụn ra (Dương Công Kiên,
2003). Cần rải vỏ đậu phộng khô với độ dày khoảng 10 – 15 cm để tạo lớp nền cho vỏ
lan bãm xuống. Đầu luống nên đóng cọc bằng gỗ, bêtông hay ống nhựa để cột chặt
các cây tầm vông theo 2 - 3 hàng dọc theo luống. Các cây lan được trồng dọc theo

luống. Dùng dây kẽm nhỏ có bọc nhựa để cột cây, tránh đổ ngã. Đặt cây lan theo mật
độ lá của cây này giáp với đầu lá cây kia. Như vậy bình quân khoảng 1.000 m2 nhà
lưới trồng được khoảng 4.000 cành Mokara (Dương Công Kiên, 2003).

Hình 2.1 Lan Mokara Chao Praya sunset (TT CNSH TP. HCM).

5


 

2.1.6. Sơ lược về giống lan Mokara Chao Praya Sunset
Mokara Chao Praya Sunset là giống lan Mokara cắt cành có nguồn gốc từ Thái
Lan.
a) Thân: Có cấu tạo đơn thân tương tự như các giống Mokara khác. Thân luôn
mọc cao về phía đỉnh. Sự mọc dài của đỉnh không giới hạn nên cây chỉ có một cây
phát triển không giới hạn theo chiều thẳng đứng. Sự phát triển này chỉ dừng lại khi
ngọn bị tổn thương, lúc đó chồi bên xẻ rách bẹ lá để mọc dài ra thành nhánh. Các
nhánh này cũng phát triển vô hạn về đỉnh. Thân mang rễ và lá, rễ và lá mọc theo hai
chiều vuông góc, phát hoa mọc trên thân ở nách lá, song song với rễ và thẳng góc với
lá (Dương Công Kiên, 2003).
b) Lá: có dạng đơn nguyên hình giáo thuôn dài. Lá
dày và cứng màu xanh bóng, đậm và nhẵn. Một cây
trưởng thành cao khoảng 2 m có từ 40 đến 50 lá (Dương
Công Kiên, 2003).
c) Rễ: thuộc loại rễ trần (rễ phơi ra ngoài không khí)
nên đòi hỏi ẩm độ của vườn rất cao. Từ các bẹ lá các rễ
chính mọc thành nhiều tầng vuông góc với trục thân và
lá, rễ chính thường có màu xanh. Từ rễ chính mọc ra các
rễ phụ màu trắng chóp rễ màu nâu, rễ phụ thường mềm

và mọng nước (Dương Công Kiên, 2003).

Hình 2.2 Rễ và lá của lan
Mokara Chao Praya
Sunset.

d) Hoa: có 5 cánh với màu vàng chanh, trên cánh
hoa có chấm phối đều trên cánh hoa rất đẹp. Hoa mọc
thành từng phát hoa, mọc từ nách lá giữa thân, mỗi đợt
ra hoa có thể cho từ 2 đến 3 phát hoa, mỗi phát hoa có
từ 8- 16 hoa. Phát hoa có kết cấu tỏa đều với các cánh
hoa sắp xếp dày, đều về bốn phía (hình 2.3) (Dương
Công Kiên, 2003).
e) Quả: thuộc loại quả nang mở bằng ba khe hay
Hình 2.3 Hoa của lan
Mokara Chao Praya Sunset.

sáu khe nứt dài theo 2 bên đường của giá noãn (Dương
Công Kiên, 2003).

6


 

f) Hạt: Hạt của lan Mokara Chao Praya Sunset cần trải qua hơn một năm mới
chín. Hạt nhỏ nhiều phôi chưa phân hóa. Hạt rất nhỏ được gió mang đi như hạt bụi
phần lớn bị chết vì không có chất dự trữ để sử dụng lúc nảy mầm hoặc chết do rơi vào
môi trường không thích hợp để nảy mầm. Hạt muốn nảy mầm phải cộng sinh được
với nấm để lấy dinh dưỡng. Trong thiên nhiên, hạt lan chỉ nảy mầm khi có được sự

cộng sinh với loài nấm phù hợp (Dương Công Kiên, 2003).
2.2. Giới thiệu chung về Virus
2.2.1. Cách gọi tên virus
Tên virus thường được đặt theo quy tắc sau:
Tên virus = tên cây chủ + đặc điểm bệnh + virus
Ví dụ: Odontoglossum Ringspott Virus: đây là virus gây hại trên cây lan thuộc
chi Odontoglossum, lá cây bị bệnh có các vết bệnh hình đốm vòng.
2.2.2. Thành phần cấu tạo
Virus thuộc loại ký sinh phân tử không có cấu tạo tế bào. Nhìn chung cấu tạo
virus bao gồm các thành phần sau: vỏ Protein, nucleic acid (DNA hoặc RNA), màng
bao (envelop) (Chỉ có ở một số virus).
2.2.2.1. Vỏ protein (capsid)
Sự sắp xếp một cách phức tạp của các đại phân tử tạo thành lớp vỏ của virus
thực sự có thể được coi là công trình kiến trúc kỳ diệu. Những yêu cầu đặc biệt của
mỗi loại virus dẫn đến sự đa dạng về bố cục lập thể của lớp vỏ. Tuy vậy, vẫn có thể
khái quát những đặc điểm cơ bản về hình dạng của lớp vỏ protein của các loại virus.
Đã có rất nhiều nhà khoa học đưa ra khái niệm cho lớp vỏ protein của virus nhưng
nhìn chung không được chấp nhận. Cho đến năm 1962, Caspar và cộng sự đưa các
khái niệm về lớp vỏ protein virus và đã được chấp nhận:
- Capsid: là lớp vỏ protein của virus bao bọc nucleic acid và được cấu thành
từ các đơn vị cấu trúc. Các đơn vị cấu trúc là đơn vị cấu tạo nhỏ nhất của lớp vỏ với
chức năng kiến tạo tương đồng.
- Capsomer: là các đơn vị hình thái quan sát được trên bề mặt của các hạt
virus tương ứng với tập hợp các đơn vị cấu trúc.

7


 

- Nucleocapsid: nucleic acid được "gói" bên trong các capsid. Nucleocapsid
có thể được "khoác" một lớp vỏ bọc (envelop) mang các vật liệu có nguồn gốc từ tế
bào chủ cũng như từ bản thân virus.
- Các virion là các hạt virus hoàn chỉnh và có khả năng nhiễm vào tế bào
chủ
Chức năng của Capsid:
- Bảo vệ nucleic acid của virus không chịu sự tác động của các enzyme.
- Các vị trí đặc biệt trên lớp vỏ cho phép các virion gắn vào tế bào chủ.
- Cung cấp các protein tạo điều kiện để virion thâm nhập qua màng tế bào
chủ. Trong một số trường hợp, lớp vỏ có tác dụng đưa nucleic acid của virus vào tế
bào chủ. Vỏ capsid có kích thước và cách sắp xếp khác nhau khiến cho virus có hình
dạng khác nhau. Có thể chia ra ba loại cấu trúc: đối xứng xoắn, đối xứng hình khối và
cấu trúc phức tạp (Nguyễn Bá Tiếp, 2007).
2.2.2.2. Màng bao (envelop)
Nhiều virus còn có lớp vỏ glycoprotein bao bọc bên ngoài capsid. Lớp vỏ bọc
này được tạo thành từ hai lớp lipid xen kẽ với các phân tử protein. Các phân tử lipid
được lấy từ màng của tế bào chủ trong khi những phân tử protein do virus tổng hợp.
Chính vì vậy, có thể gọi đây là lớp màng "lai tạo" (Nguyễn Bá Tiếp, 2007).
Các protein do virus tổng hợp để tạo thành lớp màng này gồm hai loại chính:
(1) Matrix protein liên kết với phần capsid bên trong;
(2) Glycoprotein nằm xuyên qua màng, gồm hai loại:
+ Glycoprotein ngoài (external glycoprotein) có phần lớn nằm bên ngoài
màng tạo thành các "gai" (spike) quan sát được trên bề mặt virus bằng kính hiển vi
điện tử. Phần nằm bên trong tạo thành chiếc "đuôi" ngắn. Loại protein này là thành
phần kháng nguyên chính của lớp vỏ virus.
+ Protein tạo các kênh vận chuyển (transport channel) mang nhiều cấu trúc
kỵ nước và nằm xuyên qua màng tạo các kênh (ví dụ các kênh ion: ion-channels) giúp
cho virus có khả năng thay đổi tính thấm của màng (Nguyễn Bá Tiếp, 2007).

8

 

2.2.2.3. Cấu trúc bộ gene
Bộ gene của virus rất đa dạng về cấu trúc, kích thước và thành phần nucleotid.
Chúng có thể là DNA hoặc RNA, mạch đơn hoặc kép, mạch thẳng hoặc khép vòng.
Kích thước bộ gene có thể từ 3500 nucleotid (ở phage nhỏ) đến 560.000 nucleotid (ở
virus herpes). Bộ gene virus có thể từ vài gene đến vài trăm gene (Nguyễn Lân Dũng
và cs, 2007).
2.2.3. Phương thức sinh sản và lan truyền
Virus không sinh sản bằng cách phân đôi như vi khuẩn. Virus kí sinh vào tế
bào sống và sử dụng bộ máy di truyền của tế bào này tổng hợp ra các thành phần cấu
tạo sau đó lắp ráp lại thành virus mới. Phần lớn các virus ký sinh ở thực vật có vật
chất di truyền là RNA. Virus thực vật muốn kí sinh và gây bệnh cho cây chủ thì chúng
phải bám được vào thành tế bào và xâm nhiễm vào bên trong tế bào. Bản thân virus
không chủ động di chuyển và xâm nhập vào bên trong tế bào được. Sự xâm nhiễm của
virus thực vật vào cây chủ thông qua các vector truyền bệnh như côn trùng, nhện,...
hoặc qua các vết thương cơ giới do con người gây ra trong quá trình cắt tỉa cây trồng.
Sau khi xâm nhập được vào bên trong tế bào, sự lây lan của virus từ tế bào này sang tế
bào khác có thể qua cầu nguyên sinh giữa các tế bào, hoặc qua dòng vận chuyển vật
chất (Nguyễn Xuân Dũng và cs, 2009).
2.3. Sơ lược về virus gây bệnh trên lan
Virus là một trong những loài gây hại nghiêm trọng trên hoa lan (Seoh và cs,
1998). Có ít nhất 25 loại virus gây bệnh trên lan đã được đề cập, trong đó Cymbidium
mosaic virus (CyMV) và Odontoglossum ringspot virus (ORSV) là 2 loài phổ biến
nhất (Zettler và cs 1990; Flynn, 1996).
2.3.1. Cymbidium mosaic virus (CyMV)
Cymbidium mosaic virus (CyMV) (giống Potexvirus, họ Flexiviridae) hay còn
gọi là virus khảm vàng, được mô tả lần đầu tiên bởi Jensen. Đây là một trong những

loại virus quan trọng và phổ biến nhất gây nhiễm các loại lan trên thế giới (Wong và
cs, 1997). Phần tử virus có dạng sợi, không màng bao, dài 480 nm, rộng 13 nm (Hình
1) (Navalinskiene và cs, 2005). Virus này có vật chất di truyền là RNA, mạch đơn, sợi

9


 

dương, có chiều dài 6227 nucleotide không tính đuôi poly A ở đầu tận cùng 3’ (Wong
và cs, 1997).

Hình 2.4 Hình dạng của CyMV (Navalinskiene và cs, 2005)

CyMV gây ra hiện tượng vàng lá thể khảm đi kèm với sự hóa đen và chết của
những vùng lá dọc theo gân lá (Moran và Knoxfield, 1999). Cây bị nhiễm virus có các
đốm và vệt mô chết kéo dài, màu nâu đến đen, không đều trên cả 2 mặt của các lá già.
Các lá có triệu chứng này thường lão hóa nhanh và khô (University of Illinois, 1990).
Ở các giống lan Phalaenopsis, Cattleya, Dendrobium và nhiều giống khác, virus gây
ra các đốm hoại tử đen và các kiểu đường hoại tử với các vết lõm xuống trên lá
(Marais, 2002).

Hình 2.5 Triệu chứng do CyMV gây ra (Nguyễn Xuân Dũng và cs,
2009) 

10


 

Triệu chứng trên hoa thường ít biểu hiện nhưng hoa có thể nở với hình dạng
kém phát triển. Nếu lá chết trước khi trưởng thành, hoa thường có kích thước nhỏ và
số lượng hoa ít (University of Illinois, 1990). Trong trường hợp có triệu chứng, trên
hoa có thể xuất hiện các vệt hoại tử trong một vài ngày khi hoa đang nở. Tuy nhiên,
các triệu chứng trên hoa thường chỉ biểu hiện sau khoảng 2 tuần và đặc biệt dễ dàng
nhận thấy trên hoa Cattleya trắng (Marais 2002). Ngoài ra, virus này còn tạo ra sự
khảm màu (thường đậm hay nhạt hơn màu hoa) trên hoa Cattleya (Moran và
Knoxfield, 1999).
2.3.2. Odontoglossum ringspot virus (ORSV)
Odontoglossum ringspot virus (ORSV) là một thành viên của nhóm
tobamovirus (TOV). Cùng với CyMV, ORSV cũng là một trong những virus gây hại
nghiêm trọng và phổ biến nhất trên hoa lan (Zetter và cs, 1990). Phần tử virus có dạng
hình que, dài 290-300 nm (Navalinskiene và cs, 2005). Vật chất di truyền là RNA,
mạch đơn, sợi dương, bao gồm 6618 nucleotide (Ryu và Park, 1995).

Hình 2.6 Hình dạng của ORSV (Navalinskiene và cs, 2005).

ORSV được biết đến trước tiên với việc gây ra các đốm vòng vàng trên lá lan
Odontoglossum grande Lindl. Tuy nhiên, nó được biết phổ biến hơn với triệu chứng
vàng lá dạng hình thoi đặc trưng trên lá lan Cymbidium. Các đốm hình thoi này cũng
đi kèm với các vệt vàng ở Cymbidium (Moran và Knoxfield, 1999).

11


 

Trên hoa, ORSV tạo ra sự khảm màu (đậm hay nhạt hơn màu hoa) (Marais,
2000; McMillian và cs 2005). Sự khảm màu hoa được gây ra bởi 2 chủng virus riêng
biệt đó là chủng nhẹ và nặng. Các cây bị nhiễm chủng nhẹ có ít đốm trên hoa hơn các

cây bị nhiễm chủng nặng, hoa không bị biến dạng và lá chỉ có triệu chứng khảm nhẹ
(University of Illinois, 1990). Sự khảm màu nặng được thể hiện đặc trưng bởi nhiều
đốm màu khác nhau trên hoa, ở đó màu sắc bình thường của đài và cánh hoa được
thay bởi các mảng mô không đều có màu đậm hay nhạt hơn màu hoa bình thường.
ORSV cũng gây ra vệt hoại tử nâu trên hoa Cattleya (McMillian và cs 2005).
Nói chung, virus gây ra một loạt các sự biến đổi bất thường trên lan, với các
triệu chứng thay đổi rất lớn trong các giống lan khác nhau bị nhiễm cùng một loại
virus. Các triệu chứng nổi bật nhất là vàng lá (mất diệp lục) và chết mô (hoại tử) cũng
như sự cằn cỗi cây. Các triệu chứng này có thể xảy ra riêng biệt, kết hợp với nhau
hoặc hoàn toàn không biểu hiện do điều kiện nuôi trồng tốt ngăn cản sự phát triển
triệu chứng. Các cây ở trong điều kiện stress thường có xu hướng biểu hiện triệu
chứng nghiêm trọng khi bị nhiễm virus (Marais, 2002).
Sự thay đổi của các triệu chứng virus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dòng
virus, loài thực vật bị nhiễm và các điều kiện môi trường như cường độ sáng, nhiệt độ,
dinh dưỡng và sự ngộ độc Ure (biểu hiện triệu chứng giống với nhiễm Cymbidium
mosaic virus trên lá Cymbidium) (Marais, 2002). Sự mất cân bằng dinh dưỡng, ngộ
độc muối, cường độ sáng cao, côn trùng, bệnh do nấm hay sự rối loạn di truyền có thể
gây ra các triệu chứng tương tự như bệnh virus (Flynn, 1996).

Hình 2.6 Triệu chứng của ORSV (Nguyễn Xuân Dũng và cs, 2009).

12


 

2.4. Phương pháp RT-PCR
PCR là phương pháp nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các
chu kỳ nhiệt. Và RT-PCR chính là phương pháp PCR mà nucleic acid đích cần phát
hiện là RNA. Trước hết, RNA đích được phiên mã ngược (reverse transcription, RT)

tạo cDNA, sau đó dùng phản ứng PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng
cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này. Do phương pháp này phải thực hiện quá trình phiên
mã ngược rồi mới đến phản ứng PCR nên được gọi là kỹ thuật RT-PCR (Phạm Hùng
Vân, 2009).
Giai đoạn phiên mã ngược là một bước hết sức quan trọng quyết định sự thành
công của kỹ thuật RT-PCR. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) dùng
trong giai đoạn này được tách chiết từ Moloney murine leukemia virus (MMLV) gây
bệnh ung thư bạch cầu trên chuột hay Avian myeloblastosis virus (AMV) gây bệnh
ung thư tủy trên gia cầm. Enzyme này là một loại DNA polymerase không chịu nhiệt,
sử dụng mạch đơn RNA làm khuôn để tổng hợp sợi cDNA (Phạm Hùng Vân, 2009).
Để enzyme phiên mã ngược tổng hợp được cDNA từ khuôn RNA mạch đơn
cần phải có mồi đặc hiệu bám trên sợi khuôn RNA. Mồi được sử dụng trong giai đoạn
RT có thể là mồi đặc hiệu cho trình tự RNA sẽ được phiên mã ngược thành cDNA
(hình 2.8), và mồi này có thể là mồi xuôi hay mồi ngược của giai đoạn PCR tùy chiều
5’ đến 3’ của RNA bắt cặp được với mồi nào (Phạm Hùng Vân, 2009)
Ngoài ra, cũng có thể sử dụng một loại mồi ngẫu nhiên (random hexamer) gồm
6 nucleotide có thứ tự ngẫu nhiên để phiên mã ngược toàn bộ RNA có trong mẫu
thành cDNA (Hình 2.9). Tuy nhiên, mồi ngẫu nhiên này chỉ có hiệu quả khi phiên mã
ngược các đoạn DNA dài dưới 600 bases, còn với những đoạn dài hơn thì phải dùng
mồi đặc hiệu mới đạt hiệu quả. Tiếp sau giai đoạn RT là PCR, giai đoạn này làm gia
tăng số lượng bản sao DNA một cách nhanh chóng giúp việc phát hiện DNA trong
mẫu dễ dàng hơn (Phạm Hùng Vân, 2009).

13


 

Hình 2.8 RT-PCR với giai đoạn RT dùng mồi đặc hiệu.

Hình 2.9 RT-PCR với giai đoạn RT dùng mồi ngẫu nhiên.

Có

hai kiểu thực hiện RT-PCR: RT-PCR hai bước và RT-PCR một bước.
Trong RT-PCR hai bước, giai đoạn RT tổng hợp cDNA được thực hiện trước
trong một tube, sau đó cDNA được cho vào tube khác có chứa PCR mix và mồi đặc
hiệu để thực hiện giai đoạn PCR khuếch đại. RT-PCR hai bước có nguy cơ xảy ra tình
trạng ngoại nhiễm cao do phải mở nắp tube PCR mix để cho sản phẩm cDNA của giai
đoạn RT vào. Để hạn chế tình trạng trên, có thể cho thêm dUTP và UNG vào phản
ứng PCR (Phạm Hùng Vân, 2009).
Trong RT-PCR một bước, cả hai giai đoạn RT và PCR được thực hiện trong
cùng một phản ứng, nghĩa là giai đoạn RT sẽ được thực hiện trước và giai đoạn PCR
sẽ đi liền theo sau. Để thực hiện RT-PCR một bước, trong ống phản ứng phải có đủ
các thành phần hóa chất cần thiết cho cả hai giai đoạn RT và PCR. Trong trường hợp
này, toàn bộ sản phẩm cDNA đều tham gia vào PCR và không nhất thiết phải có mồi
riêng cho giai đoạn RT vì chính mồi của giai đoạn PCR sẽ được sử dụng làm mồi cho
giai đoạn RT. RT-PCR một bước thường được sử dụng hơn RT-PCR hai bước vì nó
tiện lợi hơn và tránh được nguy cơ ngoại nhiễm do phải mở tube PCR để cho sản
phẩm cDNA vào. Tuy nhiên, trong RT-PCR một bước không thể ứng dụng kỹ thuật
14