CHẨN ĐOÁN VIRUS SỞI (MEASLES VIRUS – MV) BẰNG PHƯƠNG PHÁP REALTIME PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHẨN ĐOÁN VIRUS SỞI (MEASLES VIRUS – MV)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ QUẾ
Niên khóa

: 2006 – 2010

Tháng 7/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHẨN ĐOÁN VIRUS SỞI (MEASLES VIRUS – MV)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN

TRẦN THỊ QUẾ

Tháng 7/2010


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
9 Quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh học đã truyền đạt kiến thức, dạy dỗ tôi
trong suốt bốn năm qua.
9 Thầy Phạm Hùng Vân đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài cả về mặt lý
thuyết lẫn phương pháp tiến hành.
9 Các anh chị trong công ty Nam Khoa đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ dẫn thao tác cho
tôi.
9 Gia đình cô Đông đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về chỗ ở trong suốt quá
trình thực tập.
9 Toàn thể các bạn lớp DH06SH trường đại học Nông Lâm đã ủng hộ, giúp đỡ tôi
về mặt vật chất và tinh thần.
9 Cuối cùng con xin chân thành cảm ơn cha mẹ, đấng sinh thành nuôi nấng dạy
dỗ con cũng như luôn bên con, động viên con mỗi lúc gặp khó khăn.

iii


TÓM TẮT
Trong chiến dịch kiểm soát và loại bỏ bệnh sởi thì sự khẳng định của chẩn đoán

phòng thí nghiệm đóng vai trò rất quan trọng. Phương pháp real time PCR được thiết
kế để chẩn đoán bệnh sởi trên những mẫu phết mũi. Đề tài đã sử dụng dãy pha loãng
chủng virus vaccine sởi Schawarz (chủng vaccine sống, giảm độc lực) và mẫu phết
mũi (được thu thập từ người bình thường rồi thả chủng vaccine đã biết trước nồng độ
vào) để kiểm tra độ nhạy của bộ kit. Tiến hành ly trích RNA, phiên mã ngược, rồi
khuếch đại gene N của MV-cDNA, việc xác định số lượng bộ gene virus trong mẫu
thử bằng so sánh với các mẫu chuẩn đã được chuẩn bị từ pha loãng plasmid chứa MV
N gene, chỉ ra rằng bộ kit có độ nhạy cao cho virus sởi: giới hạn phát hiện của bộ kit
gần như là 1 copy MV-cDNA/phản ứng. Sự tương quan giữa giá trị Ct và nồng độ
RNA virus tuyến tính từ 104–100 RNA copies/giếng phản ứng, và mức độ biến động
trong thí nghiệm là thấp. Hơn nữa, những mẫu phết mũi âm tính được chứng minh
thực sự là âm tính nhờ sử dụng chứng nội tại RNAse P (gene chủ nhà). Kết quả chứng
minh bộ kit có khả năng phát hiện virus sởi, đạt yêu cầu.

iv


SUMMARY
Topic title “Detecting meseasle virus by real-time PCR”.
As

measles control and elimination campaigns progress,

laboratory

confirmation of clinically diagnosed measles cases becomes increasingly important. A
real-time PCR assay for measles virus was designed for testing nasopharyngeal
aspirate (NPA) samples. In this study we used dilution series of live-attenuated MV
Schawarz vaccine and NAP samples (collected from normal people and spiked known
quantities of MV vaccine) to check the sensitivity of the test. Extraction of RNA from

these samples and then reverse transcription and MV-N gene ampication and
calculation of virus genome number in these samples, by comparison with a standard
curve prepared from dilutions of clone MV-N gene, indicated that the test was highly
sensitive for measles virus: the limits of detection were determined to be
approximately 1 copy for each target RNA/reaction. The relationship between Ct
values and RNA concentration was linear within a range of 104–100 RNA
copies/reaction, and intra- and inter-assay variability was low. Furthermore, negative
NPA samples were illustrated actually negative by using RNAse P internal control
(gene keeping house). These results demonstrate that the kit is useful for rapid
diagnosing measles and meets the qualitive control.

v


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .................................................................................................................... iii
Tóm tắt ........................................................................................................................... iv
Summary ......................................................................................................................... v
Mục lục .......................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. ix
Danh sách các hình ......................................................................................................... x
Danh sách các bảng ........................................................................................................ xi
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu đề tài ......................................................................................................... 1
1.2.1. Mục tiêu chung ..................................................................................................... 1
1.2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thí nghiệm ................................................................................................ 2
Chương 2 TỔNG QUAN

2.1. Bệnh sởi ................................................................................................................... 3
2.1.1. Lịch sử bệnh sởi .................................................................................................... 3
2.1.2. Giới thiệu bệnh sởi ............................................................................................... 4
2.1.2.1. Khái niệm bệnh sởi ............................................................................................ 4
2.1.2.2. Biểu hiện lâm sàng ............................................................................................ 4
2.1.2.3. Biến chứng ......................................................................................................... 5
2.1.2.4. Đường truyền lây ............................................................................................... 5
2.1.2.5. Miễn dịch ........................................................................................................... 5
2.1.2.6. Điều trị bệnh sởi ................................................................................................ 6
2.1.2.7. Phòng ngừa ......................................................................................................... 6
2.1.3. Tình hình bệnh sởi trên thế giới ........................................................................... 6
2.1.4. Tình hình bệnh sởi ở Việt Nam ............................................................................ 6
2.2. Virus sởi (Measles virus – MV) .............................................................................. 7
2.2.1. Phân loại, hình thái học và cấu trúc...................................................................... 7
2.2.2. Vai trò của các protein của MV ............................................................................ 7

vi


2.2.3. Quá trình sao chép của MV (replication) ............................................................. 8
2.2.4. Thụ thể (receptor) của MV ................................................................................... 9
2.2.5. Sức chống chịu của MV ....................................................................................... 9
2.2.6. Loài cảm nhiễm .................................................................................................... 9
2.2.7. Cơ chế sinh bệnh của MV .................................................................................... 9
2.2.8. Giới thiệu về gene N của MV ............................................................................. 10
2.3. Một số phương pháp chẩn đoán bệnh sởi .............................................................. 10
2.3.1. Chẩn đoán lâm sàng ............................................................................................ 10
2.3.2. Xét nghiệm cơ bản .............................................................................................. 10
2.3.3. Phân lập và định danh virus................................................................................ 11
2.3.4. Huyết thanh học .................................................................................................. 11

2.3.5. ELISA gián tiếp .................................................................................................. 11
2.3.6. Phương pháp RT-PCR ........................................................................................ 12
2.4. Phương pháp real-time PCR .................................................................................. 12
2.4.1. Phương pháp PCR .............................................................................................. 12
2.4.1.1. Nguyên lý ........................................................................................................ 12
2.4.1.2. Thành phần phản ứng PCR .............................................................................. 12
2.4.1.3. Các giai đoạn của phản ứng PCR .................................................................... 12
2.4.1.4. Tối ưu hóa PCR ............................................................................................... 13
2.4.2. RT - PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) ....................... 13
2.5.7. Real-time PCR .................................................................................................... 14
2.5.7.1. Máy real-time PCR .......................................................................................... 15
2.5.7.2. Biểu đồ khuếch đại real-time PCR (amplification graph) ............................... 15
2.5.7.3. Biểu đồ chuẩn của real-time PCR ................................................................... 16
2.5.4. Hóa chất và thuốc thử cho real-time PCR .......................................................... 18
2.5.4.1. Real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn ................................................. 18
2.5.4.2. Real-time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang .............. 18
2.5.4.3 Real-time PCR sử dụng Molecular Beacon probe ........................................... 20
2.5.5. Phân tích dữ liệu Real-time PCR ........................................................................ 21
2.5.5.1. Định lượng tuyệt đối ........................................................................................ 21
2.5.5.2. Định lượng tương đối ..................................................................................... 21
2.6. Loại trừ nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại............................................. 21
vii


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài ................................................................... 23
3.2. Vật liệu .................................................................................................................. 23
3.2.1 Mẫu ...................................................................................................................... 23
3.2.2 Hóa chất ............................................................................................................... 23
3.2.2.1. Hóa chất dùng để tách chiết RNA ................................................................... 23

3.2.2.2. Hóa chất tổng hợp cDNA ................................................................................ 23
3.2.2.3. Hóa chất dùng cho phản ứng real – time PCR ................................................ 23
3.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 24
3.3.1. Dụng cụ và thiết bị dùng cho ly trích RNA ........................................................ 24
3.3.2. Dụng cụ và thiết bị dùng cho tổng hợp cDNA ................................................... 25
3.3.3. Dụng cụ và thiết bị dùng cho Real – time PCR .................................................. 25
3.4. Phương pháp xác định và đánh giá độ nhạy của quy trình .................................... 25
3.5. Phương pháp thí nghiệm ........................................................................................ 26
3.5.1. Ly trích RNA toàn phần ...................................................................................... 26
3.5.1.1. Xử lý mẫu ........................................................................................................ 26
3.5.1.2. Ly trích RNA ................................................................................................... 28
3.5.2. Tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên ................................................................. 28
3.5.3. Thực hiện phản ứng real-time PCR .................................................................... 29
3.5.4. Phân tích kết quả real time PCR ......................................................................... 31
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả ................................................................................................................... 32
4.1.1. Kết quả khảo sát trên chủng vaccine sởi ............................................................ 32
4.1.2. Khảo sát độ nhạy của bộ kit trên dãy pha loãng chủng vaccine sởi ................... 33
4.1.3. Khảo sát độ nhạy của bộ kit trên mẫu phết mũi ................................................. 36
4.2. Thảo luận ............................................................................................................... 39
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết Luận ................................................................................................................ 42
5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 43

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CDC

: Centers for Disease Control and Prevention

cDNA

: complementary DNA

Ct

: threshold cycle

dATP

: deoxyadenine triphosphate

dCTP

: deoxycytocine triphosphate

dGTP

: deoxyguanine triphosphate

dNTP

: deoxyribonucleotide triphosphate

dTTP

: deoxythymidine triphosphate

dUTP

: deoxyuracil triphosphate

DEPC

: diethyl pyrocarbonate

DNA

: deoxyribonucleic acid

E%

: PCR efficiency

Kb

: Kilo base

KDa

: Kilo Dalton

ELISA

: Enzyme link Immunosorbent Assay

mRNA

: messenger RNA

MV

: Measles virus

RNA

: Ribonucleic acid

PCR

: Polymerase Chain Reaction

rpm

: round per minute

RT – PCR

: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

UNG

: Uracil-DNA Glycosilase

SQ

: Starting quantity

TE

: Tris - EDTA

Tm

: melting temperature

TN1

: Thí nghiệm 1

TN2

: Thí nghiệm 2

V

: Volume

WHO

: World Health Organization
ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Thành phần của MV TQ PCR master mix cho 20 PCR mix ........................ 24

Bảng 3.2 Thành phần của RNAse P TQ master mix cho 20 PCR mix ........................ 24
Bảng 4.1 Số lượng copy cDNA ban đầu của mẫu chủng vaccine ................................ 33
Bảng 4.2 Số lượng copy ban đầu của dãy pha loãng chủng vaccine MV .................... 35
Bảng 4.3 Giá trị Ct và SQ của 6 mẫu thử cùng RNAse P tương ứng của mẫu (TN1) .. 38
Bảng 4.4 Giá trị Ct của 6 mẫu thử (tiếp theo) cùng RNAse P tương ứng của mẫu ..... 38

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Triệu chứng bệnh sởi ...................................................................................... 4
Hình 2.2 Cấu trúc measles virus (MV) và cơ chế nhân lên của MV ............................. 8
Hình 2.3 Máy real – time PCR .................................................................................... 15
Hình 2.4 Biểu đồ khuếch đại real – time PCR ............................................................. 16
Hình 2.5 Biểu đồ chuẩn ............................................................................................... 17
Hình 2.6 Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe ............................................... 19
Hình 2.7 Cơ chế phát huỳnh quang của Molecular Beacon probe .............................. 20
Hình 3.1 Cách pha loãng MV vaccine ......................................................................... 27
Hình 3.2 Cách lấy mẫu phết mũi ................................................................................. 27
Hình 3.3 Tạo mẫu giả lập.............................................................................................. 27
Hình 3.4 Nguyên tắc hoạt động của bộ thuốc thử tổng hợp cDNA .............................. 29
Hình 4.1 Đường biểu diễn khuếch đại của các mẫu chủng MV vaccine ............................... 32
Hình 4.2 Biểu đồ chuẩn của các mẫu chuẩn và mẫu ................................................... 32
Hình 4.3 Biểu đồ khuếch đại của các mẫu chuẩn và chứng âm .................................. 34
Hình 4.4: Biểu đồ chuẩn của các mẫu chuẩn và dãy pha loãng của chủng vaccine sởi ... 34
Hình 4.5 Biểu đồ khuếch đại của dãy MV vaccine pha loãng ..................................... 35
Hình 4.6 Đường biểu diễn khếch đại của một số mẫu phết mũi (TN1)........................ 36
Hình 4.7 Biểu đồ chuẩn của các mẫu chuẩn và các mẫu thử (TN1)........................... 36
Hình 4.8 Đường biểu diễn khuếch đại của mẫu âm tính và RNAse P của mẫu ......... 37

Hình 4.9 Đường biểu diễn khuếch đại của mẫu dương tính và RNAse P của mẫu .... 37

xi


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sởi là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nên cái chết của trẻ em toàn
cầu. Trên thế giới có khoảng 20 triệu trường hợp mắc bệnh sởi mỗi năm. Ước tính vào
năm 2008 có 164000 người chết vì bệnh sởi và hầu hết là trẻ em dưới năm tuổi
(WHO). Từ vài chục năm nay bệnh sởi ít xảy ra ở những quốc gia phát triển, nhưng
vẫn còn là một ám ảnh kinh hoàng đối với người dân các nước đang phát triển. Bệnh
rất dễ lây và dễ dàng lan ra từ những người đi du lịch, 90% những người tiếp xúc với
bệnh nhân sẽ bị lây nếu chưa chích ngừa. Sự nguy hiểm của bệnh sởi là khả năng biến
chứng của bệnh: viêm não, viêm tai giữa, viêm phổi, gây sảy thai… tình trạng nặng có
thể dẫn đến hôn mê và chết.
Việc chẩn đoán sớm bệnh sởi có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc tránh sự
lây lan cũng như loại bỏ bệnh sởi. Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh sởi
như chẩn đoán lâm sàng, ELISA, phân lập và định danh virus, PCR, real-time PCR…
Tuy chẩn đoán lâm sàng và ELISA được áp dụng phổ biến nhưng chỉ phát hiện được
bệnh sởi ở giai đoạn muộn khi ban đã xuất hiện. Phân lập virus có thể dùng phát hiện
virus sởi nhưng cần thời gian dài, khó và tỷ lệ thành công thấp. Virus sởi có thể được
phát hiện bằng PCR trước khi kháng thể IgM xuất hiện. Khả năng phát hiện virus sởi
bằng real-time PCR trong nhiều loại mẫu như nước tiểu, dịch phết khoang miệng, mẫu
phết mũi…không chỉ đơn giản mà còn có khả năng phát hiện virus trước khi có ban xuất
hiện, điều này rất có ý nghĩa trong chẩn đoán, ngăn chặn cũng như loại bỏ dịch sởi.
Chính vì những ưu điểm vượt trội nhanh, đặc hiệu và chính xác của real-time PCR
đây là cách tiếp cận đầy tiềm năng, hỗ trợ cho công tác chẩn đoán, điều trị của bác sĩ (đặc
biệt trong những trường hợp thể không điển hình) cũng như phòng và dập tắt dịch.
Từ thực tế nêu trên tôi thực hiện đề tài: “Chẩn đoán virus sởi (measles virus - MV)

bằng phương pháp real-time PCR”.
1.2. Mục tiêu đề tài
1.2.1. Mục tiêu chung
- Đánh giá độ nhạy bộ kit phát hiện virus sởi.

1


1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Khảo sát độ nhạy của bộ kit trên chủng vaccine sởi.
- Khảo sát độ nhạy của bộ kit trên mẫu phết mũi pha lẫn chủng vaccine sởi.
1.3. Nội dung thí nghiệm
- Tiến hành ly trích MV – RNA.
- Thực hiện phản ứng RT – PCR chuyển MV - RNA thành cDNA.
- Thực hiện phản ứng real –time PCR.
- Phân tích kết quả, đánh giá độ nhạy của bộ kit.

2


Chương 2 TỔNG QUAN
2.1. Bệnh sởi
2.1.1. Lịch sử bệnh sởi
Sởi đã hiện diện trong quần thể con người khoảng 5000 năm. Những mô tả đầu
tiên thường không phân biệt được bệnh sởi với bệnh đậu mùa. Rhazes, một thầy thuốc
Ba Tư (860 - 932), đã mô tả có tính khoa học về bệnh sởi đầu tiên và phân biệt được
bệnh sởi với đậu mùa, nhưng lại cho rằng hai bệnh này có chung một nguyên nhân.
Trước Rhazes người ta cho rằng màu đỏ của ban sởi vốn do máu kinh nguyệt
của người mẹ mà đứa bé nhiễm phải khi nằm trong bụng mẹ, và sởi được coi là cách
duy nhất để đứa bé gột rửa "chất độc hại "đó. Vì vậy một thời gian dài, tại phương

Tây, người ta cố ý cho đứa trẻ mắc sởi để bay đi vết dơ bẩm sinh.
Năm 1670, Thomas Sydenham (1624-1689) phân biệt rõ ràng bệnh sởi và bệnh
đậu mùa, hai biến chứng của bệnh sởi là viêm loét hoại tử miệng và viêm não. Cùng
lúc Mauriceau bác bỏ thuyết ban sởi có nguồn gốc từ máu kinh nguyệt mẹ và thuyết
cho rằng sởi là một bệnh truyền nhiễm được chấp nhận rộng rãi. Năm 1758, Francis
Home lấy máu của một đứa trẻ bị sởi lây cho đứa khác. Ông thành công 8 trên 10 trẻ,
chứng minh được sự hiện diện của một yếu tố lây nhiễm trong máu mà ông không biết
có bản chất virus.
Năm 1846, Panum điều tra một vụ dịch sởi xảy ra tại quần đảo Faroe (Đan
Mạch). Tại Faroe, bệnh sởi đã vắng bóng 65 năm. Một thợ mộc vốn đã mắc sởi tại
Copenhague (chưa có dấu hiệu bệnh sởi) trở về Faroe. Chuyến đi khá dài để bệnh xuất
hiện, nhưng cũng không đủ dài để anh ta hồi phục và ngưng thải tiết virus. Đến nơi,
anh ta lây bệnh cho hai người bạn, từ đó bệnh lan ra thành dịch. Trong một thời gian
ngắn, trên 6000 người trong tổng số 7782 toàn bộ dân cư bị tấn công. Nhà nào cũng có
người mắc bệnh, và chỉ những ai đã từng mắc bệnh sởi 65 năm trước đó mới không bị
mắc bệnh. Từ vụ dịch tại Faroe, Panum đưa ra bốn nhận xét: (1) Ban sởi xuất hiện từ
12 - 14 ngày sau khi tiếp xúc. (2) Bệnh lây cao nhất vào cuối giai đọan tiền triệu (3 - 4
ngày trước khi ban xuất hiện). (3) Bệnh lây truyền qua những giọt dịch tiết hô hấp (qua
ho, hắt hơi). (4) Sau khi bị sởi, cả đời sẽ không bị mắc bệnh trở lại.

3


Năm 1910, Ludvig Hektoen phát hiện ra virus sởi. Năm 1954, tại Mỹ, Enders
và Peebles phân lập được virus sởi từ một cậu bé 11 tuổi mắc bệnh sởi và nuôi cấy
thành công trên môi trường cấy mô phôi gà. Năm 1963, vaccin sởi sống và chết được
đưa ra sử dụng tại Mỹ (Axton, 1979).
2.1.2. Giới thiệu bệnh sởi
2.1.2.1. Khái niệm bệnh sởi
Bệnh sởi theo tiếng Anh là measles, hoặc rubeola, tiếng Pháp là rougeole. Từ

measles có nguồn gốc từ tiếng Đức "masern", đi từ tiếng Bắc Phạn (Sanskrit)
“masura”, có nghĩa là "đốm”.
Bệnh sởi là bệnh truyền nhiễm gây dịch lây qua đường hô hấp do virus sởi gây
nên. Trước đây bệnh sởi chủ yếu gặp ở trẻ em dưới 5 tuổi, hay xảy ra vào mùa đông
xuân. Hiện nay bệnh có thể xuất hiện ở người lớn do chưa được tiêm phòng hoặc đã
tiêm phòng nhưng chưa được tiêm nhắc lại. Bệnh có biểu hiện đặc trưng là sốt, viêm
long và phát ban, có thể dẫn đến nhiều biến chứng như tiêu chảy, viêm phổi, viêm giác
mạc, thậm chí có thể viêm não dễ dẫn đến tử vong (Bộ Y Tế, 2009).
2.1.2.2. Biểu hiện lâm sàng (Bộ Y Tế, 2009)
a. Thể điển hình

(a)

(b)

(c)

Hình 2.1 Triệu chứng bệnh sởi. (a) hạt Koplik trên niêm mạc miệng. (b) ban sởi
xuất hiện với những nốt đỏ; (c) viêm kết mạc do sởi.
( />
Giai đoạn ủ bệnh: 10 - 14 ngày
Giai đoạn khởi phát: 2 - 4 ngày. Bệnh nhân sốt cao, viêm long đường hô hấp
trên và viêm kết mạc, đôi khi có viêm thanh quản cấp, có thể thấy hạt Koplik là các hạt
nhỏ 0,5 - 1 mm màu trắng có quầng ban đỏ ở trên niêm mạc miệng.
Giai đoạn toàn phát: kéo dài 2 - 5 ngày. Thường sau khi sốt cao 3 - 4 ngày bệnh
nhân bắt đầu phát ban, xuất hiện từ sau tai, sau gáy, trán, mặt, cổ dần lan đến thân
4


mình và tứ chi, cả ở lòng bàn tay và gan bàn chân, ban hồng dát sẩn, khi căng da thì

ban biến mất. Khi ban mọc hết toàn thân thì thân nhiệt giảm dần.
Giai đoạn hồi phục: ban nhạt dần rồi chuyển sang màu xám, bong vảy phấn sẫm
màu. Nếu không xuất hiện biến chứng thì bệnh tự khỏi. Có thể có ho kéo dài 1 - 2 tuần
sau khi hết ban.
b. Thể không điển hình
Bệnh nhân AIDS, hội chứng thận hư, điều trị thuốc ức chế miễn dịch... ban có thể
không điển hình. Biểu hiện lâm sàng có thể sốt nhẹ thoáng qua, viêm long nhẹ và phát
ban ít, toàn trạng tốt. Thể này dễ bị bỏ qua, dẫn đến lây lan bệnh mà không biết. Bệnh
nhân cũng có thể sốt cao liên tục, phát ban không điển hình, phù nề tứ chi, đau mỏi toàn
thân, thường có viêm phổi nặng kèm theo. Xét nghiệm có thể có tăng men gan.
2.1.2.3. Biến chứng
Tình trạng dinh dưỡng kém làm giảm cơ chế bảo vệ của cơ thể, làm suy giảm
miễn dịch, cho nên khi bị sởi thì nguy cơ bị các biến chứng nặng sẽ cao hơn trẻ có
chức năng miễn dịch bình thường.
Biến chứng thần kinh: viêm màng não cấp tính, thường xuất hiện khi bệnh vào
giai đoạn hồi phục. Biểu hiện lâm sàng có thể sốt lại, đau đầu, cứng gáy, co giật và
thay đổi ý thức từ lú lẫn, ngủ gà tới hôn mê. Ngoài ra có thể có rung giật cơ, múa giật
và các dấu hiệu viêm tuỷ như liệt hai chi dưới, liệt tứ chi, mất cảm giác, rối loạn
cơ...Ngoài ra còn có thể viêm não sau khi mắc sởi nhiều năm.
Biến chứng bội nhiễm hay gặp ở trẻ em. Sau khi ban bay bệnh nhân sốt lại, có
tình trạng nhiễm trùng, bạch cầu máu ngoại vi tăng. Có thể gặp bội nhiễm ở các bộ
phận sau: viêm tai giữa, viêm thanh quản, viêm phế quản phổi, viêm phổi, lao tiến
triển, viêm loét hoại tử miệng, tiêu chảy, viêm kết - giác mạc, viêm cơ tim.
Phụ nữ mang thai bị sởi có thể bị sảy thai, thai chết lưu, đẻ non hoặc thai nhiễm sởi
tiên phát (Bộ Y Tế, 2009).
2.1.2.4. Đường truyền lây
Người bệnh phát tán virus mạnh nhất là vào giai đoạn tiền triệu (giai đoạn khởi
phát) thông qua các hạt nhỏ bắn ra khi ho, khi nói chuyện hoặc khi tiếp xúc (Butel, 2004).
2.1.2.5. Miễn dịch
Miễn dịch sau khi bị mắc sởi thường kéo dài suốt đời. Còn miễn dịch chủ động

sau khi tiêm vaccin sởi cũng kéo dài trong nhiều năm, và đa số có thể kéo dài cả đời.
5


Miễn dịch qua trung gian tế bào có cũng có vai trò ngăn ngừa bị sởi tái diễn, vì bệnh
nhân mắc chứng thiếu globuline-máu (miễn dịch dịch thể giảm nhưng miễn dịch tế bào
còn nguyên vẹn) sẽ không bị mắc sởi nhiều lần.
2.1.2.6. Điều trị bệnh sởi
Bệnh nhân sởi cần được cách ly, điều trị hỗ trợ: vệ sinh da, mắt, miệng họng;
tăng cường dinh dưỡng; hạ sốt; bổ sung vitamin A.
Phát hiện và điều trị sớm biến chứng: điều trị kháng sinh nếu có bội nhiễm vi
khuẩn. Hạn chế truyền dịch nếu bệnh nhân có biến chứng viêm phổi, viêm não hoặc
viêm cơ tim.Trường hợp viêm não màng não cấp tính: tích cực điều trị hỗ trợ duy trì
chức năng sống, chống co giật, chống phù não, chống suy hô hấp.
2.1.2.7. Phòng ngừa bệnh sởi
Phòng bệnh sởi bằng vaccine: Biện pháp phòng bệnh sởi tốt nhất là tiêm chủng
đầy đủ 2 liều vaccine sởi. Thường vaccine ở dạng MMR (vaccine đa giá) phòng bệnh
sởi, quai bị, ban Đức.
2.1.3. Tình hình bệnh sởi trên thế giới
Sởi vẫn còn là dịch bệnh phổ biến ở cả các nước đang phát triển cũng như các
nước phát triển. Năm 2009, Châu Phi báo cáo có nhiều trường hợp mắc sởi. Ở Nam
Phi dịch sởi vẫn đang hoành hành, có hơn 9000 trường hợp mắc sởi từ 1/2009 đến
3/2010, nguyên nhân chính bắt nguồn từ tỉnh Gauteng (CDC). Từ 1 - 2/2010 Tại
Philipines hơn 1300 trường hợp mắc sởi (gồm 5 ca tử vong). Dịch sởi xảy ra tại thủ đô
Manila và 10 vùng khác của Philipines (CDC).
2.1.4. Tình hình bệnh sởi ở Việt Nam
Trước đây bệnh sởi xảy ra rất thường xuyên và có tỷ lệ lây nhiễm và tử vong rất
cao nhưng hiện nay không còn phổ biến nhờ vào chương trình tiêm chủng mở rộng.
Năm 2004 tỉ lệ bệnh sởi đã giảm đến 573 lần so với trước năm 1985. Tuy hàng năm,
trên cả nước ghi nhận từ 1500 - 2000 trường hợp mắc sởi rải rác, chủ yếu tại các tỉnh

phía Bắc vào mùa đông, xuân, nhưng các quan chức thẩm quyền cho rằng căn bệnh
này đang được khống chế tốt và dự kiến sẽ bị loại trừ vào năm 2010. Tuy nhiên cuối
năm 2008 đến 2009, số ca mắc sởi tăng đột biến. Tính đến ngày 9/2/2009 dịch sởi đã
xảy ra tại 11 tỉnh miền Bắc với 370 trường hợp phát ban dạng sởi và tại các bệnh viện
nhiệt đới và truyền nhiễm quốc gia ngày 3/2/2009, có 340 trường hợp ở Hà Nội và các
tỉnh lân cận bị sốt phát ban vào viện, 147 người trong số này dương tính với bệnh sởi.
6


Trong đó có 8 ca nặng biến chứng viêm não, viêm màng não thể nặng, hôn mê sâu, rối
loạn tim, 3 người phải cho thở máy. Bệnh nhân chủ yếu ở độ tuổi từ 20 - 30. Điều bất
thường nhất là tỉ suất biến chủng viêm não và viêm màng não quá cao (8/147 tức là
54/1000 trong khi đó tỉ suất biến chứng viêm não ở trẻ em theo lý thuyết là 1/1000 ca).
Người dân thì xôn xao phân vân không biết có cần phải đi tiêm chủng hay không, còn
chính phủ chỉ đạo các ngành, địa phương khẩn cấp khai triển các biện pháp ngăn chặn
dịch lan rộng.
2.2. Virus sởi (Measles virus – MV)
2.2.1. Phân loại, hình thái học và cấu trúc
Virus sởi (measles virus - MV), thuộc chi Morbilivirus, họ Paramyxoviridae.
Đường kính một hạt virus từ 120 - >300 nm. MV là virus RNA chuỗi âm, gồm 15984
nucleotides, đóng gói trong nucleoside xoắn (Kulik và ctv, 2008). Sự sắp xếp bộ gene
của MV: 3’N, P/V/C, M, F, HA, L5’ mã hóa lần lượt các protein: nucleoprotein (N),
phosphoprotein (P)/C protein/V protein, matrix protein (M), fusion protein (F),
hemagglutinin protein (H), large polymerase protein (L).
MV chỉ có một type kháng nguyên duy nhất. MV có 23 genotypes (A, B1 - B3,
C1 - C2, D1 - D10, E, F, G1 - G3 và H1 - H2) đã được xác định, 5 số trong đó (B1,
D1, E, F và G1) được xem là bất hoạt do không được phát hiện từ nhiều năm qua
(Griffin và Oldstone, 2008).
2.2.2. Vai trò của các protein của MV

H (60 KDa) chịu trách nhiệm cho sự tấn công lên thụ thể tế bào chứa
neuraminic acid (MV thiếu hoạt động neuramidase). F có vai trò trong việc hòa màng
virus và màng tế bào chủ, làm cho virus có thể xâm nhiễm vào tế bào (F được phân cắt
thành F1 - 40KDa và F2 - 20 KDa bởi protease của tế bào). M (37 KDa) nằm dưới lớp
màng của virus, liên quan đến quá trình lắp ráp, đóng gói và nảy chồi của virus. N (60
KDa) liên quan đến RNA bộ gene, hình thành cấu trúc nucleocapsid bảo vệ RNA khỏi
sự phân giải của RNAse.
Những protein có liên quan khác: P (70 KDa) gắn với protein N (60 KDa) và L
(250 KDa) hình thành nên cấu trúc phức tạp của RNA polymerase, giúp cho quá trình
sao chép RNA của virus. Protein V (46 KDa) và C (21 KDa) chức năng chưa rõ (có
thể liên quan đến sự sao chép của virus).

7


2.2.3. Quá trình sao chép của MV (replication)

Hình 2.2 Cấu trúc measles virus (MV) và cơ chế nhân lên của MV. (a) Cấu
trúc measles virus. (b) Sự sắp xếp bộ gene của MV. (c) Cơ chế xâm nhập và sinh
sản của MV ( />_BX1.html).

Quá trình sao chép và tái bản RNA xảy ra trong tế bào chất của tế bào ký chủ.
(1) Giai đoạn bám của virus trên bề mặt tế bào
Virus bám vào thụ thể tế bào nhờ H protein.
(2) Giai đoạn xâm nhập vào tế bào
Vỏ virus hòa màng với màng tế bào nhờ hoạt động của F protein (F được phân
cắt thành F1 và F2). Tại pH trung tính hoặc kiềm của tế bào chất, virus giải phóng
nucleocapsid và polymerase protein.
(3) Quá trình tái bản RNA của virus
Từ RNA chuỗi âm polymerase virus phiên mã tạo ra RNA chuỗi dương hoàn

chỉnh, và đây sẽ là khuôn mẫu để tổng hợp các RNA chuỗi âm, tạo nên bộ genome
của thế hệ virus mới.

8


(4) Tổng hợp protein
mRNA được dịch mã tạo protein của virus (H, F, M, N, P, L, V, C). Các protein H,
F và M được chuyển đến màng nguyên sinh chất hình thành nên lớp vỏ của hạt virus
mới.
(5) Đóng gói hạt virus
Nucleocapsid (gồm N, P, L và RNA chuỗi âm của bộ gene) được lắp ráp trong
tế bào chất và di chuyển đến màng tế bào, nơi các protein H, F, M đang tập kết để
đóng gói hình thành hạt virus.
(6) Giai đoạn đâm chồi và phóng thích ra khỏi tế bào
M nằm dưới lớp màng và giúp cho quá trình nảy chồi (budding) của virus.
2.2.4. Thụ thể (receptor) của MV
CD46 vốn được coi là thụ thể tế bào của MV. Tuy nhiên CD150 được xác định là
receptor cơ bản của MV (và nói chung cho Morbilliviruses), có thể giải thích cho mọi tế
bào liên quan đến bệnh lý và bệnh học của measles virus (Griffin và Oldstone, 2008).
2.2.5. Sức chống chịu của MV
MV chịu đựng kém ở môi trường bên ngoài, chết ở ngoại cảnh trong vòng 30
phút, dễ bị bất hoạt bởi các thuốc sát trùng thường dùng.
2.2.6. Loài cảm nhiễm
Người là ký chủ tự nhiên duy nhất của MV, mặc dù có thể gây nhiễm thực
nghiệm trên những loài khác, bao gồm khỉ, chó và chuột, cho nên sự tồn tại của bệnh
sởi trong cộng đồng phụ thuộc vào sự lây chuyển liên tục từ người bị nhiễm sang
người dễ cảm thụ (Butel, 2004).
2.2.7. Cơ chế sinh bệnh của MV
Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp và nhân lên tại đây, sau đó nhiễm

vào mô lympho lân cận rồi tiếp tục nhân lên. Nhiễm virus máu lần đầu sẽ phát tán
virus đi khắp nơi, virus sau đó sẽ nhân lên trong hệ thống lưới nội mô. Cuối cùng,
nhiễm virus máu thứ phát sẽ giúp virus lan tới các biểu mô bề mặt cơ thể, bao gồm da
đường hô hấp và kết mạc, tại đó xuất hiện các ổ tăng sinh virus. MV có thể nhân lên ở
một số tế bào lymphô, từ đó lại phát tán khắp cơ thể. Các tế bào khổng lồ đa nhân
thường có ở trong mô lymphô của khắp cơ thể (hạch lymphô, amygdale, ruột thừa).
Các quá trình trên diễn ra trong thời kỳ ủ bệnh (kéo dài trung bình 9 - 11 ngày).

9


Trong suốt thời kỳ tiền triệu, diễn ra từ 2 - 4 ngày, virus có ở nước mắt, dịch tiết
mũi họng, nước tiểu và máu.
Nốt ban sẩn điển hình xuất hiện vào khoảng ngày thứ 14 ngay khi phát hiện
được kháng thể tuần hoàn, không còn virus trong máu và hết sốt. Nốt ban sẩn xuất
hiện là kết quả tương tác của tế bào miễn dịch T với tế bào nhiễm virus trong các tĩnh
mạch nhỏ, tồn tại khoảng 1 tuần. (Ở những bệnh nhân bị khiếm khuyết miễn dịch qua
trung gian tế bào, thường không xuất hiện các nốt sẩn) (Butel, 2004).
2.2.8. Giới thiệu về gene N của MV
Gene N (bắt đầu từ nucleotide 56 - 1744), có khung đọc mở (Open Reading
Frame, ORF) bắt đầu từ nucleotide 108 – 1682 (525 codon), mã hóa N protein. Chỉ có
một promoter trong bộ gene của MV tại vị trí đầu cuối 3’ của bộ gene, khi mã hóa
mRNA thì mRNA của gene N là được tổng hợp nhiều nhất, còn mRNA của gene L là
ít nhất. Chính vì vậy khi xâm nhiễm vào tế bào, kháng thể đầu tiên và nhiều nhất được
sinh ra là kháng thể chống lại protein N.
Sự đa dạng của gene N: Đầu C tận cùng (456 nucleotide) của gene N là vùng
biến đổi nhiều nhất của bộ gene MV, và đã được chứng minh là thích hợp cho việc
phân biệt những dòng khác nhau. Xác định genotype của MV có thể dựa trên việc giải
trình tự gene N của MV (thiết kế một đoạn chứa đầu C tận cùng thuộc gene N, khuếch
đại bằng cặp mồi đặc hiệu, rồi tiến hành giải trình tự). Từ kết quả có được ta có thể

biết được vùng dịch sởi đang xảy ra có nguồn gốc ở đâu, thuộc dòng nào, điều này có
ý nghĩa quan trọng trong kiểm soát bệnh sởi.
Trong chẩn đoán bệnh sởi bằng phương pháp RT- PCR, ta có thể lựa chọn
nhiều vùng trên bộ gene như: gene N, gene H, gene M…để phát hiện MV với độ đặc
hiệu và nhạy rất cao.
2.3. Một số phương pháp chẩn đoán bệnh sởi
2.3.1. Chẩn đoán lâm sàng
Dựa vào triệu chứng lâm sàng của người bị bệnh, đối với trường hợp thể không
điển hình thì phải chẩn đoán khẳng định lại.
2.3.2. Xét nghiệm cơ bản
Xét nghiệm công thức máu thấy giảm bạch cầu, giảm bạch cầu lympho và có thể giảm
tiểu cầu. X quang phổi có thể thấy viêm phổi kẽ, có thể tổn thương nhu mô phổi khi có
bội nhiễm (Bộ Y Tế, 2009).
10


2.3.3. Phân lập và định danh virus
Bệnh phẩm thích hợp nhất để phân lập virus là phết mũi họng và cấy máu của
bệnh nhân từ 2 - 3 ngày trước khi có triệu chứng đến một ngày sau khi có phát ban
(chủ yếu là trong giai đoạn sốt). Các loại tế bào thích hợp nhất để phân lập virus sởi là
tế bào thận khỉ hoặc thận người hoặc tế bào Hep-2. Virus sởi tăng trưởng chậm; hiệu
ứng huỷ hoại tế bào điển hình (tế bào khổng lồ đa nhân chứa thể vùi ở bào tương và
nhân) cần 7 - 10 ngày mới xuất hiện. Tuy nhiên, có thể tiến hành chẩn đoán nhanh
trong vòng 2 - 3 ngày bằng nuôi cấy virus trong ống nghiệm. Sử dụng miễn dịch
huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên MV trong canh cấy (Butel, 2004).
Ưu điểm: là phương pháp duy nhất thu nhận virus cho các nghiên cứu tiếp theo.
Sử dụng chủ yếu cho các phòng thí nghiệm tham chiếu.
Nhược điểm: chậm, đắt tiền, đòi hỏi tay nghề kỹ thuật cao.
2.3.4. Huyết thanh học
Lấy máu kể từ ngày thứ ba sau khi phát ban tìm kháng thể IgM. Những nơi chỉ

làm được IgG thì lấy máu ở giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục để xác định hiệu giá
kháng thể. Hiệu giá kháng thể lần hai cao gấp ít nhất bốn lần so với lần đầu. Có thể dùng
phương pháp ELISA, HI và trung hòa để tìm kháng thể kháng MV (Bộ Y Tế, 2009).
2.3.5. ELISA gián tiếp
Nguyên tắc: Kháng nguyên của MV được phủ trên bề mặt rắn trong giếng.
Huyết thanh của bệnh nhân và đối chứng được cho vào các giếng. Kháng thể IgM
(hoặc IgG) kháng MV hiện diện trong mẫu sẽ gắn với kháng nguyên của MV. Sau khi
rửa để lấy thành phần không chuyên biệt ra ngoài, kháng thể thứ hai được gắn với
enzyme (kháng thể này đặc hiệu với kháng thể IgM hoặc IgG kháng MV) được cho
vào giếng sẽ gắn vào kháng thể IgM hoặc IgG. Rửa thêm lần nữa, bổ sung cơ chất
(không màu) enzyme sẽ chuyển hóa cơ chất, có sự hiện màu. Nếu không có sự hiện
diện kháng thể IgM hoặc IgG kháng MV trong mẫu thì kháng thể thứ hai bị rửa trôi
trong quá trình rửa và không có sự hiện màu khi bổ sung cơ chất.
Ưu điểm: Nhanh, nhạy, ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh trên diện rộng.
Nhược điểm: Tính đặc hiệu chưa cao. Phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn sau khi
đã xuất hiện kháng thể.

11


2.3.6. Phương pháp RT-PCR
Là kỹ thuật invitro để khuếch đại trình tự gene đích của MV nhờ sử dụng các
mồi nucleotide. Sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ điện di trên gel agarose. Đây
là phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác, đặc hiệu.
2.4. Phương pháp real-time PCR
2.4.1. Phương pháp PCR
PCR (polymerase chain reaction) là phản ứng chuỗi trùng hợp nhân bội số lượng
một phân đoạn DNA nào đó trong ống nghiệm để tạo ra một số lượng lớn hơn hàng triệu
đến hàng tỷ lần so với số lượng ban đầu (Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải, 2008).
Ưu điểm: nhạy, nhanh, đặc hiệu.

Nhược điểm: vấn đề ngoại nhiễm trong khâu diện di, hóa chất độc hại (ethidium
bromide có khả năng gây ưng thư).
2.4.1.1. Nguyên lý
PCR là một phản ứng tổng hợp sợi DNA đơn dựa vào một DNA đơn khác làm
khuôn và một đoạn oligonucleotide làm mồi. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có trình
tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA mà người làm thử nghiệm muốn nhân bản, và
được kéo dài để hình thành mạch mới nhờ vào hoạt động của enzyme polymerase.
2.4.1.2. Thành phần phản ứng PCR
(1) Enzyme polymerase chịu nhiệt, thường được gọi là Taq polymerase, có
hoạt tính tối đa ở 720C, bền với nhiệt độ. (2) 4 loại dNTP là dATP, dTTP, dGTP,
dCTP. (3) DNA chứa các đoạn DNA đích sẽ được nhân bản trong ống phản ứng. (4)
Mồi: mồi xuôi và mồi ngược. (3) ion Mg2+. (4) Dung dịch đệm Tris-KCl để làm dung
môi thích hợp cho phản ứng.
2.4.1.3. Các giai đoạn của phản ứng PCR
Giai đoạn biến tính (Denaturation): biến tính mẫu bằng cách nâng nhiệt độ lên
94 - 950C (30 giây – 1 phút), liên kết hydro trong mạch đôi DNA bị phá vỡ, mạch đôi
DNA tách thành hai mạch đơn.
Giai đoạn bắt cặp (Annealing): hỗn hợp được làm lạnh dần đến 55 - 650C các
đoạn mồi bắt cặp bổ sung vào hai đầu đoạn DNA đích.
Giai đoạn kéo dài (Elongation – Extension): Nhiệt độ được nâng lên 72oC, là
nhiệt độ tối ưu cho chức năng xúc tác của Taq polymerse để kéo dài các mạch DNA.
Sự sinh tổng hợp bắt đầu ở đầu 3’OH của mỗi đoạn mồi.
12


Kết quả cuối cùng một đoạn DNA đích được khuếch đại lên rất nhiều lần. Tổng
số khuếch đại = m x 2n , trong đó
n: số chu kỳ
m: số bản sao của đoạn DNA đích
Phát hiện sản phẩm PCR: điện di sản phẩm PCR trên gel agarose chứa 0.4 - 4%

ethidium bromide. Các đoạn DNA có kích thước khác nhau phân tách thành các băng
khác nhau trên gel có thể nhìn thấy được dưới tia cực tím.
2.4.1.4. Tối ưu hóa PCR
Khuôn DNA: PCR cho kết quả tốt với đoạn DNA cần khuếch đại có kích thước
<1,5 Kb (nếu kích thước trình tự cần khuếch đại > 3 Kb phản ứng PCR thường không
hoạt động được). Số lượng DNA chỉ cần 5 - 10 ng DNA thuần khiết.
Mồi: là yếu tố quan trọng nhất quyết định sự thành công của PCR. Việc thiết kế
mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ thích hợp sẽ dẫn đến PCR có sản phẩm hay không.
Mồi tối ưu:
•

Dài khoảng 15 – 30 base.

•

Các đoạn mồi không nên chứa 3 nucleotide giống nhau liên tiếp.

•

Hàm lượng GC 40 – 60%.

•

Tránh hiện tượng tự bắt cặp hoặc bắt cặp bổ sung giữa hai đoạn mồi.

•

Tm của mồi không khác nhau quá 50C.

dNTP: nồng độ mỗi loại dNTP trong phản ứng là như nhau (thường là 200 µM).

Polymerase: Taq polymerase (1 – 1,5 unit) cho một hỗn hợp phản ứng 50µl. Hàm
lượng Taq polymerase cao hơn có thể tổng hợp nhiều sản phẩm PCR không đặc hiệu.
Mg2+: nồng độ Mg2+ ảnh hưởng đến bắt cặp mồi, Tm của sợi khuôn, sản phẩm
và liên kết mồi - khuôn, tính đặc hiệu sản phẩm, hoạt tính enzyme và tính chính xác.
Nồng độ Mg2+ trong PCR khoảng 0,5 – 2,5 mM ứng với nồng độ dNTP tổng số.
Số chu kỳ phản ứng PCR: không quá 40 chu kỳ. Do hiệu quả của phản ứng
khuếch đại có thể giảm dần ở những chu kỳ cuối (thành phần phản ứng cạn kiệt, sự xuất
hiện của sản phẩm phụ ức chế phản ứng…) (Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải, 2008).
2.4.2. RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)
RT–PCR là phương pháp PCR mà nucleic acid đích cần phải phát hiện là RNA.
Để có thể thực hiện PCR này thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (RT,

13


Reverse Transciption) thành cDNA, rồi sau đó dùng PCR khuếch đại trình tự đích
trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này (Phạm Hùng Vân, 2009).
Mồi sử dụng cho giai đoạn RT có thể là mồi đặc hiệu cho trình tự RNA sẽ được
phiên mã thành cDNA hay mồi ngẫu nhiên (random hexamer) gồm 6 nucleotide, phiên
mã ngược toàn bộ RNA có trong mẫu thành cDNA. Ngoài ra còn có mồi oligo (dT15)
– mồi poly T, tổng hợp cDNA từ mRNA biểu hiện từ một gene.
RT-PCR gồm hai loại: (1) RT-PCR hai bước: giai đoạn RT tổng hợp cDNA (sử
dụng enzyme reverse transcriptase) trong một ống nghiệm. Lấy sản phẩm cDNA làm
khuôn cho vào ống nghiệm PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu, thực hiện PCR
khuếch đại trình tự DNA muốn tìm nhờ enzyme Taq polymerase. Phương pháp này
làm tăng nguy cơ ngoại nhiễm, có thể giảm nguy cơ này bằng cách cho dUTP và UNG
vào PCR mix. (2) RT- PCR một bước: hai giai đoạn RT và PCR trong cùng ống phản
ứng, có cả enzyme reverse transcriptase sử dụng cho RT và enzyme Taq polymerase
sử dụng cho PCR. Ngoài ra cũng có một loại DNA polymerase tách chiết từ vi khuẩn
chịu nhiệt Thermus thermophilus, gọi là TthPol, có hai khả năng: có thể thực hiện

phiên mã ngược khi có sự hiện diện của Mn2+ và khả năng nhân bản DNA khi có sự
hiện diện của Mg2+ , do vậy có thể dùng enzyme này làm RT-PCR một bước.
Chu trình nhiệt giai đoạn RT: 42oC (10 -15 phút), mồi bắt cặp vào sợi khuôn
RNA và enzyme reverse transcriptase tổng hợp cDNA. Nếu dùng mồi ngẫu nhiên thì
để ống phản ứng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 10 phút để mồi bắt cặp vào sợi khuôn
RNA. Sau đó enzyme reverse transcriptase bị hủy hoạt tính bằng cách nâng nhiệt độ
ống phản ứng lên 95oC (5 phút).
2.5.7. Real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được
ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là real-time.
(Phạm Hùng Vân, 2009). Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại
được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc (bằng điện di DNA trên gel agarose khi
phản ứng kết thúc). Ngược lại, real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích
lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Kết quả real-time PCR có thể là
kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng
bản sao DNA).

14