NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP LÂY NHIỄM VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes VÀO CÂY CÀ ĐỘC DƯỢC (Datura innoxia Mill)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP LÂY NHIỄM
VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes VÀO
CÂY CÀ ĐỘC DƯỢC (Datura innoxia Mill)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: VŨ THỊ NGUYỆT

Niên khóa

: 2006 – 2010

Tháng 7/ 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP LÂY NHIỄM
VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes VÀO

CÂY CÀ ĐỘC DƯỢC (Datura innoxia Mill)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN VŨ PHONG

VŨ THỊ NGUYỆT

Tháng 7/2010


LỜI CẢM ƠN
Cuộc sống đã mang cho con rất nhiều ưu đãi, có được những điều đó đều do tình
yêu thương mà mọi người đã giành cho con.
Thưa bố mẹ kính yêu, con xin cảm ơn bố mẹ đã sinh thành và dưỡng dục con đến
ngày hôm nay, luôn bên con, động viên an ủi để con có thể vững vàng bước đi.
Em cảm ơn thầy Lê Đình Đôn, Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại
học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho chúng em học tập trong suốt
4 năm học và trong 6 tháng làm khóa luận tốt nghiệp tại bộ môn.
Em cảm ơn thầy hướng dẫn, thạc sĩ Nguyễn Vũ Phong, trong suốt thời gian thực
hiện khóa luận thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên giúp em làm tốt đề tài của
mình.
Em cũng rất cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học, các thầy cô
trong trường đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho chúng em trong suốt bốn năm đại học.
Các anh chị trong Bộ môn, trong Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh – Viện
Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường của Trường đại học Nông Lâm TP.HCM
đã nhiệt tình chỉ bảo em.
Cảm ơn các bạn lớp DH06SH, đặc biệc là các bạn trong nhóm nuôi cấy mô đã bên

cạnh giúp đỡ mình.
Cầu chúc mọi điều tốt đẹp sẽ đến với bố mẹ, thầy cô và các bạn, chúc mọi người
luôn hạnh phúc.
Xin chân thành cảm ơn!

.

i

Vũ Thị Nguyệt


TÓM TẮT
Cà độc dược có khả năng sản xuất các alkaloid tropane ở bộ phận rễ, hai alkaloid
chủ yếu ở rễ là scopolamine và hyoscyamine, tuy nhiên với số lượng không đáng kể. Một
trong những con đường để tăng cường sản xuất các hợp chất alkaloid là sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes gây biến đổi di truyền, kích thích rễ tóc phát triển làm tăng
sinh khối của rễ. Ở Việt Nam đến nay chưa có kết quả nghiên cứu nào về chuyển gen và
khảo sát hàm lượng alkaloid trên cây cà độc dược. Mặt khác, nhằm xây dựng một quy
trình chuyển gen vào thực vật bằng vi khuẩn để có thể ứng dụng vào loại cây có giá trị
cao hơn về mặt kinh tế nên đề tài được tiến hành để tìm ra phương pháp và nồng độ vi
khuẩn thích hợp nhằm đạt được hiệu quả chuyển gen của vi khuẩn A. rhizogenes vào cây
cà độc dược.
Sau 15 ngày đồng nuôi cấy mẫu lá với dung dịch vi khuẩn được pha loãng ở các
nồng độ khác nhau, đã có một số mẫu xuất hiện rễ. Sau 15 ngày nuôi đoạn thân trên
rockwool có chứa môi trường MS lỏng, bổ sung 10 ml/l dịch vi khuẩn thì số lượng mẫu
sống, ra rễ và có nhiều rễ tóc nhất.
Cần tiếp tục xác định có hay không sự hiện diện của gen rol, ntpII, h6h ở các rễ tạo
ra nhằm khẳng định tính hiệu quả của phương pháp lây nhiễm đã thực hiện

ii


SUMMARY
Datura can produce medicinal secondary metabolites at root. Transformed hairy
roots cultures are one of the approaches to enhance alkaloid production. This subject was
carried out to find the suitable method to achieve efficient gene transfer of Agrobacterium
rhizogenes highest.
After 15 days co - culture with different concentrations bacterial solution, some
form roots appeared in the leaf discs. Hairy roots were emerged at slanting cuts 15
days after infecting stem sections with bacterial solution 10 ml/l in rock wool
plugs.

iii


MỤC LỤC
Lời cảm ơn ......................................................................................................................... i
Tóm tắt .............................................................................................................................. ii
Summary .......................................................................................................................... iii
Mục lục ............................................................................................................................ iv
Danh mục các chữ viết tắt .............................................................................................. vii
Danh sách các bảng ....................................................................................................... viii
Danh sách các hình ........................................................................................................ viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu đề tài ............................................................................................................ 1
1.3. Nội dung thực hiện .................................................................................................... 1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 2
2.1. Giới thiệu về chuyển gen ........................................................................................... 2

2.1.1. Định nghĩa .............................................................................................................. 2
2.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium............................................... 2
2.2. Giới thiệu cây cà độc dược ........................................................................................ 3
2.2.1. Vị trí phân loại ........................................................................................................ 3
2.2.2. Đặc điểm sinh học .................................................................................................. 3
2.2.3. Hợp chất thứ cấp trong cây..................................................................................... 4
2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.................................................... 4
2.3.1. Vị trí phân loại ........................................................................................................ 4
2.3.2. Đặc điểm chung ...................................................................................................... 4
2.3.3. Ri plasmid và T-DNA vủa vi khuẩn ....................................................................... 7
2.3.3. Gen rol kích thích tạo rễ ......................................................................................... 8
2.3.4. Quá trình chuyển T – DNA vào tế bào thực vật ................................................... 10
2.4. Phương pháp xác định gen ngoại lai ....................................................................... 12
2.5. Một số nghiên cứu chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogenes ................................. 12
iv


2.5.1. Phương pháp đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn .................................................... 13
2.5.2. Phương pháp tiêm vi khuẩn vào nốt lá mầm của cây ........................................... 14
2.5.3. Phương pháp nuôi đoạn chồi trong dịch vi khuẩn ................................................ 15
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 16
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .................................................................... 16
3.2. Vật liệu .................................................................................................................... 16
3.2.1. Đối tượng thí nghiệm............................................................................................ 16
3.2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ................................................................................... 17
3.2.2.1. Nuôi cấy in vitro và lây nhiễm mẫu cây cà độc dược với vi khuẩn .................. 17
3.2.3. Môi trường nuôi cấy ............................................................................................. 17
3.2.3.1. Môi trường ......................................................................................................... 17
3.2.3.2. Môi trường dùng để nuôi vi khuẩn .................................................................... 18
3.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 18

3.3.1. Lây nhiễm mẫu lá với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ................................ 18
3.3.1.1. Chuẩn bị vật liệu lá ............................................................................................ 18
3.3.1.2. Chuẩn bị vi khuẩn .............................................................................................. 19
3.3.1.3. Đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn ...................................................................... 19
3.3.1.4. Loại bỏ vi khuẩn ................................................................................................ 20
3.3.2. Nuôi đoạn thân trên rock wool có chứa dịch vi khuẩn ......................................... 20
3.3.2.1. Chuẩn bị vật liệu lây nhiễm ............................................................................... 20
3.3.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn .............................................................................................. 20
3.3.2.3. Lây nhiễm vi khuẩn vào đoạn thân ................................................................... 20
3.3.3. Tiêm vi khuẩn vào cây cà độc dược ..................................................................... 20
3.3.3.1. Chuẩn bị vật liệu lây nhiễm ............................................................................... 21
3.3.3.2. Chuẩn bị vi khuẩn .............................................................................................. 21
3.3.3.3. Tiêm vi khuẩn .................................................................................................... 21
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 22
4.1. Lây nhiễm mẫu lá với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ................................... 22
4.2. Nuôi đoạn thân trên rock wool có chứa dịch vi khuẩn ............................................ 24

v


4.3. Tiêm vi khuẩn vào cây cà độc dược ........................................................................ 27
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 29
5.1. Kết luận.................................................................................................................... 29
5.2. Đề nghị .................................................................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................ 30
PHỤ LỤC

vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ach

: Acetycholin

A. rhizogenes

: Agrobacterium rhizogenes

A. tumefaciens

: Agrobacterium tumefaciens

Chv

: Chromosomal virulence

Ctv

: Cộng tác viên

DNA

: Deoxyribonucleotic acid

D. arborea

: Datura arborea

D. sanguinea

: Datura sanguinea

LB

: Left border

MS

: Murashige & Skoog

OD

: Optical density (độ hấp thu quang phổ)

ORF

: Open reading frame

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RB

: Right border

Ri plasmid

: Root inducing plasmid

Rol

: Resistance to osmotic lysis

Ti plasmid

: Tumor inducing plasmid

TL-DNA

: Transferred left DNA

TR-DNA

: Transferred right DNA

TSS

: Transport stimulation system

T – DNA

: Transfer - DNA

Vir

: Virulence

YMB

: Yeast Mannitol Broth

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1 Tỉ lệ mẫu sống sau khi lây nhiễm mẫu lá với vi khuẩn .................................... 22
Bảng 4.2 Tỉ lệ mẫu lá ra rễ sau 17 ngày lây nhiễm .......................................................... 24
Bảng4.3 Kết quả thu được khi nuôi đoạn thân trên rock wool ........................................ 25
Bảng 4.4 Số liệu sau khi thu nhận và xử lí ...................................................................... 25
Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm tiêm trực tiếp vi khuẩn vào cây non.................................. 28

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Hoa và quả cây cà độc dược ............................................................................. .4
Hình 2.2 Vi khuẩn Agrobacterium .................................................................................. .6
Hình 2.3 Cấu trúc Ri plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ........................ .7
Hình 2.4 Sự tương tác giữa Agrobacterium chế chuyển T-DNA ................................ ...11
Hình 2.7 Rễ tóc mọc ra ngẫu nhiên trên cà rốt ................................................................ 14
Hình 2.8 Tiêm vi khuẩn vào cây đậu ............................................................................... 15
Hình 2.9 Nuôi đoạn thân trên rock wool ......................................................................... 15
Hình 3.1 Plasmid pLAL21 ............................................................................................... 16
Hình 4.1 Mẫu lá lây nhiễm vi khuẩn ............................................................................... 23
Hình 4.2 Mẫu sau 15 ngày lây nhiễm .............................................................................. 23
Hình 4.3 Đoạn thân dùng để nuôi trên rock wool............................................................ 26
Hình 4.4 Rễ của đoạn thân nuôi trên rock wool dưới kính hiển vi .................................. 27
Hình 4.5 Rễ của đoạn thân nuôi trên rock wool dưới kính hiển vi 10X .......................... 27

viii

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Các hợp chất thứ cấp được tích lũy trong cây với số lượng rất ít được dùng làm
dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm. Đây là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực
vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Đã có rất
nhiều nghiên cứu nhằm tăng lượng hợp chất thứ cấp trong cây như: nuôi cấy tế bào,
chuyển gen mong muốn vào thực vật thông qua các kĩ thuật gen, sử dụng vi khuẩn để kích
thích sự tích lũy các hợp chất đó.
Một trong những phương tiện sử dụng để chuyển gen vào thực vật rất được chú ý
đó là vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Biểu hiện của quá trình này là xuất hiện các rễ
tóc xung quanh vị trí tiếp xúc. Rễ tóc (hairy - root) phát triển ổn định và có thể tăng
trưởng nhanh trong môi trường nuôi cấy thích hợp mà không cần bổ sung các chất điều
hòa sinh trưởng (Boitel - Conti và ctv, 2000) (trích dẫn bởi Dechaux C. và ctv, 2005),
ngoài ra rễ tóc có thể cung cấp số lượng sinh khối lớn và ổn định.
Ở Việt Nam, hiện nay đã có một số nghiên cứu trên cây cà độc dược với mục đích
tăng cường sự tích lũy các hợp chất alkaloid như trồng trong hệ thống thủy canh có tác
động của các yếu tố sinh học và phi sinh học (Trần Thị Lệ Minh, 2005), nuôi cấy tế bào
(Nguyễn Thị Thanh Uyên, 2006), nhưng chưa có công bố kết quả nào về việc sử dụng
Agrobacterium rhizogenes tạo rễ tóc ở cây cà độc dược nên đề tài: “Nghiên cứu lây nhiễm
vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào cây cà độc dược” được tiến hành.
1.2. Yêu cầu đề tài
Thực hiện lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes với mẫu cà độc dược
bằng nhiều phương pháp khác nhau.
1.3. Nội dung thực hiện
™ Lây nhiễm mẫu lá với dịch vi khuẩn ở các nồng độ khác nhau.
™ Nuôi đoạn thân trong rock wool có chứa dịch vi khuẩn ở các nồng độ khác nhau.
™ Tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn lên cây cà độc dược.

1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về chuyển gen
2.1.1. Định nghĩa
Chuyển gen (biến nạp thông tin di truyền) là kĩ thuật sử dụng DNA tinh khiết để
đưa vào cơ thể hay tế bào khác và theo dõi biểu hiện của thông tin di truyền mới này.
Để chuyển gen hiệu quả nguyên liệu di truyền vào tế bào vật chủ, các cấu trúc di
truyền cần được thiết kế thích hợp cho sự hợp nhất và biểu hiện của gen ngoại lai. Cấu
trúc di truyền phải mang một gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker gene: gen mã hóa
một protein khử độc của hóa chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy, cho phép sinh
trưởng ưu tiên của các tế bào có DNA ngoại lai được hợp nhất) hoặc sàng lọc (screenable
marker gene: Gen mã hóa một protein cho kết quả trong sản phẩm sống sót nhờ đó có thể
xác định tế bào biến nạp thể hiện gen) để nhận biết hiệu quả biến nạp gen.
Công nghệ chuyển gen thực hiện việc chuyển gen ngoại lai vào tế bào thực vật. Có
nhiều phương pháp khác nhau để chuyển gen ở thực vật nhưng trong phạm vi nghiên cứu
chúng tôi chỉ đề cập đến phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn
Agrobacterium mà đối tượng cụ thể là Agrobacterium rhizogenes.
2.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium
Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium là phương pháp chuyển gen hữu hiệu đầu tiên
dùng để chuyển gen ở thực vật đã được thực hiện có hiệu quả. Hai loài vi khuẩn gây bệnh
cho thực vật được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và
tế bào thực vật là Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes. Trên hai loài
này có các plasmid với kích thước khác nhau, với A. tumefaciens đoạn plasmid có kích
thước 200kb gọi là Ti - plasmid, còn A. rhizogenes chứa Ri - plasmid. Người ta nhận thấy
Agrobacterium có xu hướng chuyển gen vào những mô đang phân sinh mạnh. Đây là lợi
thế lớn nhất của phương pháp vì mô phân sinh là nơi mà chồi con (đã “bị”chuyển gen) có
thể dễ dàng được tạo thành. Khai thác đặc tính này, trước khi tiến hành hoạt hóa vi khuẩn,
người ta còn tiến hành hoạt hóa mô thực vật, mô càng tăng sinh mạnh thì hiệu suất
chuyển gen càng cao. Ngoài ra, một ưu điểm nữa của phương pháp này là gen mục tiêu ít

2


bị đào thải, nó tồn tại khá bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụ thuộc chặt chẽ vào hệ
thống protein vir.
Nhược điểm của phương pháp là Agrobacterium có phổ tấn công giới hạn, nó có
thể gây khối u cho cây khảo tử và cây hai lá mầm nhưng lại không thể gây khối u cho cây
một lá mầm. Lí do cây một lá mầm thuộc nhóm thực vật tiến hóa hơn, nó tích lũy nhiều
cơ chế kháng bệnh hơn các cây hai lá mầm như vách cellulose tẩm silic làm tăng độ bền;
hoặc khi bị thương, phần mô bị thương có xu hướng hóa gỗ để bảo vệ, chứ không phân
chia mạnh để tái tạo hoặc tiết hợp chất phenol như cây hai lá mầm. Tuy nhiên, cho đến
nay người ta đã tìm được nhiều chung Agrobacterium có khả năng chuyển gen cho một số
cây một lá mầm như bắp, lúa, cỏ, mía, lan… Sự đa dạng về đối tượng đã làm cho phương
pháp càng trở lên hấp dẫn đối với các nhà khoa học.
2.2. Giới thiệu cây cà độc dược
2.2.1. Vị trí phân loại
Giới:

Plantae

Ngành:

Magnoliopsida

Lớp:

Magnoliopsida

Bộ:

Solanales

Họ:

Solanaceae

Chi:

Datura

Loài:

Datura innoxia Mill

( ).
2.2.2. Đặc điểm sinh học
Cà độc dược (Datura innoxia Mill) là cây thân thảo cao 1 - 2 m. sống quanh năm,
phần gốc của cây hóa gỗ. Thân và cành non màu xanh lục hay tím và có nhiều lông tơ
ngắn. Lá đơn mọc so le, phiến lá nguyên hình trứng nhọn, gốc phiến lá không đều. Hoa to
mọc đứng, thường đơn độc, đài hoa liền nhau hình ống, màu xanh; cánh hoa màu trắng
hoặc tím dính liền với nhau thành hình phễu có thể dài đến 20 cm nhưng vẫn chia ra năm
thùy và có năm nhị dính trên cánh hoa; bầu trên, có hai lá noãn hàn liền nhau chứa nhiều

3


noãn. Quả hình cầu, màu lục, đường kính khoảng 3 cm, có nhiều gai mềm ở mặt ngoài,
khi chín nở làm bốn mảnh; hạt nhiều màu nâu nhạt.

Hình 2.1: Hoa và quả cây cà độc dược.

( />
Cà độc dược được trồng chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới (Nam Mỹ, Ấn Độ, Úc).
Ở nước ta, cây mọc hoang dại khắp nơi và cũng được trồng làm cảnh, làm thuốc. Trồng
bằng hạt trước mùa mưa. Người ta đã tạo ra nhiều giống trồng với lá có màu khác nhau:
xanh, tía hay tim tím, hoa đơn hay hoa đôi. Cây cho thu hoạch hoa vào mùa thu, thu lá
quanh năm.
Đây là cây được ghi trong danh mục cây thuốc trị hen suyễn. Các tài liệu cổ cũng
ghi nhận cà độc dược có vị cay, tính ôn, có tác dụng trong khử phong tê thấp, chữa hen
suyễn, nước sắc uống trong các trường hợp chữa kinh sợ, cuốn thuốc hút chữa ho do hàn.
Hai loại chất trong cây đó là: atropin và hyoxin, có trong lá, hoa, thân cây. Liều
độc của atropin tác động lên não làm say, có khi làm nạn nhân phát điên, hô hấp tăng, sốt,
có lúc tê liệt tứ chi do thần kinh trung ương bị ức chế. Hyoxin tác dụng gần như atropin
nhưng làm giãn đồng tử trong thời gian ngắn hơn, ức chế thần kinh nhiều hơn là kích
thích. Vì vậy hyoxin được dùng trong lĩnh vực điều trị thần kinh nhằm chữa co giật trong
bệnh Parkinson, hoặc phối hợp với atropin để chống say tàu xe, làm dịu thần kinh. Tuy có
lợi như vậy nhưng cà độc dược thuộc vào loại cây có độc có thể gây tử vong nên phải hết

4


sức cẩn thận, không được dùng cho người có thể lực yếu và có bệnh về đường tim mạch,
sử dụng theo hướng dẫn của thầy thuốc.
2.2.3. Hợp chất thứ cấp trong cây
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực
phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết đến như là các chất trao đổi thứ cấp,
thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong các chất trao đổi chất chưa được biết
đầy đủ. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi
trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Các chất trao đổi thứ
cấp có thể xếp vào ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside.
Cây cà độc dược cũng sản sinh ra các alkaloid, chủ yếu là scopolamin, còn có

hyoscyamin, atropin, norhyoscyamin với tỷ lệ ít hơn. Người ta cũng tìm thấy những chất
khác như saponin, cumarin, flavonoid, tanin và chất béo. Hai alkaloid tropane chủ yếu
được tạo ra từ rễ là hyoscyamin và scopolamin. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong cây
là rất cao: 0,1 - 0,5% trong lá; 0,25 - 0,6% trong hoa; 0,1 - 0,2% trong rễ. Về mặt hóa học,
các phân tử của các hợp chất này có cấu trúc hai vòng đặc trưng. Về mặt dược học, chúng
là những chất chống cholin mạnh nhất hiện có, nghĩa là chúng ngăn cản các tín hiệu thần
kinh được các chất truyền tải tín hiệu thần kinh nội sinh là acetycholin (Ach) truyền tải.
2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
2.3.1. Vị trí phân loại
Giới: Bacteria
Ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Alpha Proteobacteria

Bộ:

Rhizobiales

Họ:

Rhizobiaceae

Chi:

Agrobacterium

Loài:

Agrobacterium rhizogenes

2.3.2. Đặc điểm chung
Agrobacterium rhizogenes là vi khuẩn Gram âm sống trong đất, hình que, có tính
di động, không sinh bào tử. Vi khuẩn này sở hữu Ri - plasmid và là tác nhân gây ra bệnh

5


trên tầng lông hút của rễ cây hai lá mầm. A. rhizogenes, có quan hệ rất gần với A.
tumefaciens. Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất là các
khối u được hình thành ngay ở chỗ nhiễm. Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà
không cần thiết có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được là do A. tumefaciens
đã chuyển một đoạn DNA của Ti - plasmid (T - DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây bị
bệnh.

Hình 2.2 Vi khuẩn Agrobacterium.
( />
Hiện tại thì sự hiểu biết về cơ chế chuyển gen của vi khuẩn A. rhizogenes còn được
biết rất ít, chủ yếu dựa trên những nghiên cứu của vi khuẩn tương đồng với nó đó là A.
tumefaciens. Toàn bộ quá trình lây nhiễm được cho là giống nhau giữa hai loài. A.
rhizogenes xâm nhập vào tế bào thực vật tại các vị trí vết thương. Các hợp chất phenol
được tiết ra từ các vết thương hấp dẫn vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Ri - plasmid
của vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào thực vật. Theo cách này T - DNA được duy thì ổn
định trong hệ gen mà chúng chuyển vào. Từ vùng bị nhiễm sẽ tạo ra những rễ nhánh bất
thường - rễ tóc (hairy root). Những rễ này có đặc điểm là phát triển ăn nghiêng, phân
nhánh nhiều, tăng trưởng nhanh và có khả năng phát triển in vitro trong điều kiện không
có các yếu tố kích thích tăng trưởng. Rễ tóc giúp cho việc tổng hợp các hợp chất thứ cấp

6


trong cây được ổn định hơn với khối lượng tăng lên một cách nhanh chóng, trong khi đó
nuôi cấy tế bào thông thường thì hợp chất thứ cấp được tạo ra không thường xuyên và với
mức độ thấp hơn (Rhodes và cs 1990; Merkli và cs. 1997; Kittipongpatana và cs. 1998).
Ngoài sự hiện diện của rễ tóc, tại vị trí vết thương còn sản xuất ra hợp chất opines
để nuôi vi khuẩn (Chilton và cs. 1982). Căn cứ vào các hợp chất opines được tiết ra, các
chủng A. rhizogenes được chia làm các dòng khác nhau: agropine (đại diện là Ri plasmid
pRiA4, pRi1855, pRiHRI, pRi15834, pRiLB9402), mannopine (đại diện là Ri plasmid
pRi8196), cucumopine (đại diện là Ri plasmid pRi2659), mikimopine (đại diện là Ri
plasmid pRi1724). Trong các dòng vi khuẩn được biết đến thì K47, K599 và HRI là các
dòng gây độc cao có khả năng lây nhiễm cho nhiều loại thực vật khác nhau.
2.3.3. Ri plasmid và T-DNA vủa vi khuẩn

Hình 2.3 Cấu trúc Ri plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes (Taylor, 2007).

7


Ri - plasmid của A.rhizogene. Gần vùng biên giới T - DNA của Ri - plasmid chứa
chuỗi mã có tính chất lặp lại gồm 24bp, được gọi là trình tự lề (border sequences). T DNA nguyên thủy mang một nhóm gen gây ung thư và dị hóa opine, biểu hiện ở những tế
bào thực vật chuyển gen là sự phát triển của các mô ung thư và sự sản xuất opine. Ri plasmid đều chứa gen điều khiển quá trình gắn và chuyển T - DNA vào tế bào thực vật và
cho hiện tượng dị hóa các opine trong mô thực vật đã chuyển gen. Trên cấu trúc của Ri –
plasmid còn chứa vùng gen vir, các protein của các gen vùng vir có tác dụng cho việc dẫn
truyền T – DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật.
Ri - plasmid mang gen tổng hợp auxin và opine, sở hữu trình tự lặp lại 8bp gọi là
trình tự kích thích vận chuyển T-DNA (TSS), trình tự này làm gia tăng hiệu quả biến nạp
T - DNA vào hệ gen thực vật. TSS gồm 12 trình tự lặp lại 5 – TGCCTTCG - 3 trong dòng

sản xuất mikimopine, 6 trình tự lặp lại 5 – ATTAGTTC - 3 trong dòng sản xuất
mannopine, 5 trình tự lặp lại 5 – TTGTTCAA - 3 trong dòng sản xuất agropine, và 16
trình tự lặp lại 5 – GTTCGTCA - 3 trong dòng sản xuất cucumopine của A. rhizogenes.
Các dòng A. rhizogenes đều chứa một vùng T - DNA trên Ri plasmid mang những
gen liên quan đến sự tổng hợp opine, và những gen chưa rõ chức năng. Một T - DNA thứ
hai có thể xuất hiện chứa những gen liên qua đến sự tổng hợp auxin (aux1 hoặc iaaM và
aux2 hoặc iaaH) cùng với các gen chưa rõ chức năng khác. Ri - plasmid có hai T - DNA,
TL và TR, được gọi là “split” T - DNA. Ri plasmid của dòng sản xuất cumumopine và
mannopine chỉ chứa một vùng T - DNA, dòng sản xuất agropine có một split T - DNA
chứa hai vùng là TL và TR, mỗi vùng có kích thước khoảng 15 – 20 kb. Cả vùng TL - DNA
và vùng TR - DNA đều được chuyển nạp và hợp nhất một cách độc lập trong hệ gen cây
chủ, sự vận chuyển TL - DNA chủ yếu là để cảm ứng tạo rễ tóc.
2.3.3. Gen rol kích thích tạo rễ
Một vài vị trí trên TL - DNA của Ri plasmid có chứa gen thiết yếu cho sự cảm ứng
tạo rễ tóc (được gọi là gen rol). TL - DNA của agropine Ri plasmid có ít nhất bốn vị trí
chứa gen rol: rolA, rolB, rolC, rolD tương ứng với các khung đọc mở (open reading
frame - ORF) 10, 11, 12, 15. Từ những năm 90, sự kết hợp của rolA, rolB và rolC đã
được chứng minh là đủ để tạo ra kiểu hình rễ tóc, phụ thuộc loài thực vật và kiểu mô.

8


TR - DNA chỉ được tìm thấy trong Ri plasmid của A. rhizogenes dòng sản xuất
agropine gồm các gen (aux1, aux2, rolB TR, mas1, mas2, ags) điều khiển quá trình tổng
hợp opine và auxin. Các gen aux được coi là đóng vai trò phụ trong cảm ứng tạo rễ tóc và
không thiết yếu cho sự sản xuất rễ tóc. Các dòng A. rhizogenes sản xuất opine như
mannopine, cucumopine, hay mikimopine chuyển một đoạn T-DNA đơn tương đồng với
agropine TL - DNA nhưng không có gen rolD. T - DNA của dòng sản xuất cucumopine và
mannopine không có các gen aux mà chỉ có gen rol là đủ cho việc tạo ra kiểu hình rễ tóc.
Gen rolA đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành rễ tóc vì sự biểu hiện của

rolA trong cây chuyển gen ổn định tạo ra kiểu hình biến dạng cao: Lá xoăn, xanh đậm, đốt
dài, có hiện tượng lùn hoặc bán lùn, hóa già chậm. Gen rolA có liên quan đến sự thay đổi
sinh lí hormone gồm cả sự can thiệp vào gibberellin, nó cũng có thể liên quan đến sự mất
cân bằng mức độ hormone thực vật.
Phụ thuộc vào dòng vi khuẩn, gen rolB sẽ có kích thước từ 762 – 837 bp và mã hóa
một protein có 259 – 279 amino acid. Gen rolB sử dụng một cấu trúc promoter trong cây
chuyển gen ức chế sự cảm ứng và hoại tử rễ bất định, cả trong mô sẹo và lá cây con. Sự
biểu hiện của rolB cần thiết cho hoạt động tăng trưởng của rễ tóc vì mức độ biểu hiện cao
hay thấp sẽ làm yếu sự tăng trưởng của những cơ quan này.
Gen rolC từ nhiều T - DNA của Ri - plasmid khác nhau thì tương tự nhau về kích
thước vào khoảng 540 bp và mã hóa protein có 179 – 181 amino acid. Cây chuyển gen có
biểu hiện rolC thì thấp, giảm tính trội ngọn, lá mũi mác, hoa tự sớm. Sự bất hoạt của các
gen rol đưa đến sự thay đổi hình thái học của rễ hoặc loại bỏ sự hình thành rễ tóc. Sự biểu
hiện của rolC ảnh hưởng đến sự cân bằng của các cytokinin dạng tự do và kết hợp, cũng
như auxin và gibberellin trong tế bào thực vật. Sự biểu hiện rolC cũng làm giảm đáng kể
mức độ acid abscisic (ABA), polyamine và ethylene.
Gen rolD chỉ được tìm thấy trong Ri plasmid của dòng sản xuất agropine. Nó có
kích thước 1032 bp, mã hóa cho một protein có 344 amino acid, đó là một ornithine
cyclodeaminase enzyme xúc tác sự chuyển hóa ornithine thành proline. Sự hiện diện của
rolD trong cây chuyển gen sẽ kích thích ra hoa sớm, làm tăng số lượng hoa và có thể liên

9


quan đến sức sản xuất của cây. Thêm vào đó, sự tích lũy proline có thể là một phản ứng
bảo vệ liên quan đến stress (Taylor, 2007).
2.3.4. Quá trình chuyển T – DNA vào tế bào thực vật
Các vùng T - DNA của cả A. tumefaciens và A. rhizogenes đều nằm bên cạnh các
đoạn lặp lại trực tiếp 25 bp và các điểm kết thúc của T - DNA đã hợp nhất trong genome
thực vật nằm sát với các trình tự này. Hầu hết các nghiên cứu cơ chế chuyển T - DNA từ

Agrobacterium vào tế bào thực vật đã được tiến hành trên A. tumefaciens, còn trên A.
rhizogenes thì chưa được chú ý nhiều, vì vậy ta sẽ giải thích chung cho chi
Agrobacterium.
Để gắn T - DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. rhizogenes phải tiếp xúc
với tế bào bị tổn thương. Quá trình này thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB
mã hoá một protein liên qua đến hình thành β - 1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen
chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein
vận chuyển giúp vận chuyển β - 1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh
chất. β - 1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành
tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T - DNA. Các
sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T - DNA từ vi khuẩn vào
tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T - DNA khỏi plasmid,
cảm ứng thay đổi màng tế bào của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm
nhập vào genome của cây chủ.
Thực chất chỉ T - DNA của plasmid được chuyển vào genome tế bào thực vật. Quá
trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của gen vir và gen chv quyết định mà không liên quan
đến gen khác trên T - DNA. Tuy nhiên chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T - DNA) có vai
trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ
gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu
nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir
được phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất phenol được giải phóng ra từ tế bào
thực vật bị tổn thương. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG.
Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối

10


Hình 2.4 Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế chuyển
T - DNA (Nguyễn Hoàng Lộc và ctv, 2006).

11


cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hóa, sản phẩm
của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T - DNA và làm đứt phần T - DNA ra khỏi DNA
của plasmid thành các sợi đơn. Đồng thời, quá trình phosphoryl hóa này cũng bị thay đổi
thẩm suất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T - DNA
được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn.
Ngay sau đó, sợi T - DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự
tiếp hợp giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T - DNA đã được
chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất vào genome tế bào thực vật
được ổn định và di truyền như gen bình thường khác (Nguyễn Hoàng Lộc, 2008) (Hình
2.4).
2.4. Phương pháp xác định gen ngoại lai
Có nhiều phương pháp xác định gen ngoại lai như Southern blot, Northern blot,
Western blot, ELISA (Enzymee - Linked Immunosorbent Assay), nhưng phương pháp
được sử dụng rộng rãi nhất trong sinh học phân tử là PCR (polymease chain reaction phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymease).
Phương pháp này dựa trên sự khá phá tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA
polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt. Phần lớn DNA polymerase chỉ làm
việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase
không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phân tử. Nhưng các polymerase chịu
nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 1000C. Ở nhiệt độ này DNA (dạng
thẳng) sẽ bị biến tính.
2.5. Một số nghiên cứu chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogenes
Đã có nhiều nghiên cứu chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium được công bố,
nhưng ở Việt Nam chưa có kết quả nào về chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes vào cây cà độc dược thông qua nuôi cấy tế bào, mà chỉ có một số nghiên cứu
về sự kích thích sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của cây cà độc dược bằng phương
pháp thủy canh có bổ sung dung dịch vi khuẩn vào môi trường (Trần Thị Lệ Minh, 2005).
Sau một thời gian đồng nuôi cấy, cây sinh trưởng và phát triển tốt hơn với nồng độ thích

12


hợp, rễ mọc nhiều rễ tóc hơn và lượng hợp chất thứ cấp scopolamine và hyoscyamine
trong cây cũng cao hơn so với đối chứng.
2.5.1. Phương pháp đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn
Những nghiên cứu chuyển gen vào cây cà độc dược trên thế giới đã được thực hiện
từ những năm 1990 nhưng chủ yếu là nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Sangwan và ctv
(1991) đã nghiên cứu một số ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng chuyển nạp
gen của A. tumefaciens dòng LBA4404 vào cà độc dược. Theo đó, đĩa lá là mẫu nhiễm tốt
nhất so với mẫu thân, cuống lá và rễ. Đĩa lá được tiền nuôi cấy một ngày và đồng nuôi
cấy với vi khuẩn hai ngày ở 270C sẽ cho hiệu quả chuyển nạp tốt nhất, lên đến 70%.
Một số nghiên cứu chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogenes đã được thực hiện với
một số loài khác của cây cà dộc dược. Năm 1997, Giovannini, Pecchioni, Rabaglio và
Allavene đã nghiên cứu lây nhiễm Datura arborea và Datura sanguinea với vi khuẩn A.
rhizogenes dòng NCPPB 1855. Các mảnh lá được ngâm trong dịch vi khuẩn 20 phút và
đồng nuôi cấy trong hai ngày. Hai tuần sau khi đồng nuôi cấy, rễ tóc xuất hiện ở cả hai
loài Datura. D. arborea cho tỉ lệ mẫu lá tạo rễ tóc (88%) cao hơn D. sanguinea (61%), số
rễ trung bình trên một mẫu ở cả hai loài thì tương tự nhau (6,3%). Các rễ này có rất nhiều
rễ phụ và không có tính hướng đất. Tách từng dòng rễ tóc (hairy root clone) ra nuôi cấy
riêng, sau 7 tháng, số chồi bất định xuất hiện từ rễ tóc của D. arborea (7 trong 10) cũng
nhiều hơn D. sanguinea (1 trong 6 hairy root clones).
R. Baranski và ctv (2005) đã nghiên cứu lây nhiễm các chủng khác nhau của A.
rhizogenes với củ cà rốt. Kết quả thu được là rễ phát triển trên bề mặt của đĩa cà rốt trong
vòng một tuần sau khi lây nhiễm, rễ ngẫu nhiên đó kéo dài đến 6cm trong những tuần kế
tiếp, và độ dài khác nhau ở các chủng vi khuẩn khác nhau.
Sukuli và ctv (1997), đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy đến sự tích
lũy sinh khối và sản lượng alkaloid của rễ tóc thu được sau khi lây nhiễm cây Datura
stramonium với chủng Agrobacterium ATCC 15834. Hàm lượng hyoscyamine ở rễ đạt

cực đại sau 6 tuần nuôi cấy khoảng 100 mg/l. Bên cạnh đó, các tác giả này còn nghiên
cứu ảnh hưởng của sự cân bằng ion (NO3-, SO42-, H2PO4-, K+, Ca2+, Mg2+) đến sản lượng
sinh khối và sự tích lũy hyoscyamine. Nồng độ NO3- và K+ cao cho sinh khối cao nhất,

13


còn sản lượng hycyamine cao nhất khi SO42- và K+ cao (trích dẫn bởi Lê Văn Hoàng,
2008).

Hình 2.7 Rễ tóc mọc ra ngẫu nhiên trên bề mặt cà rốt sau khi
lây nhiễm với chủng A. rhizogenes LB1334. (R. Baranski và ctv, 2005).
Một nghiên cứu khác nhau làm tăng cường tích trữ scopolamine bằng tăng sinh
khối rễ tóc cà độc dược đã được chuyển gen bằng A. rhizogenes dòng 1855 có plasmid
pLAL21 trong bioreactor đã được thực hiện bởi Dechaux C. và ctv (2005). Rễ tóc được
gia tăng sinh khối với môi trường Gamborg’s B5 lỏng trong bioreactor ở 270C, pH môi
trường là 5,8. Sau 20 ngày, sinh khối rễ tóc đã lấp đầy dung tích của môi trường nuôi cấy,
hàm lượng alkaloid tropane tăng lên rất nhiều.
2.5.2. Phương pháp tiêm vi khuẩn vào nốt lá mầm của cây
Đây là phương pháp lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes đạt hiệu quả cao hiện đang
được sử dụng nhiều. Estrada - Navarrete và ctv (2006, 2007), đã được lây nhiễm với A.
rhizogenes bằng cách dùng kim tiêm tạo vết thương ở nốt lá mầm rồi tiêm dịch vi khuẩn
vào. Giữ cây trong điều kiện ẩm độ cao (hơn 90%) ở 250C. Sau 5 - 8 ngày, từ chỗ vết
thương sẽ phát triển khối u nhỏ và sau một tuần, các rễ tóc sẽ xuất hiện tại vị trí khối u

14


này. Sau 3 tuần, có tới 85 - 100% số cây có xuất hiện rễ tóc, một tỉ lệ rất cao. Hiệu quả tạo
rễ tóc của dòng A. rhizogenes khác nhau thì khác nhau.

Phương pháp này cũng đã được thược hiện trên cây đậu nành bởi Keretszt và ctv
(2007). Kết quả là trung bình một cây có thể tạo ra 6 - 7 rễ tóc, với ít nhất một rễ có mang
gen mong muốn.

a)
b)
Hình 2.8 Tiêm vi khuẩn vào cây đậu. (a) Tiêm vi khuẩn vào cây đậu. (b) Rễ mọc ra tại vị trí
tiêm. (Georgina Estrada - Navarrete và ctv, 2006).

2.5.3. Phương pháp nuôi đoạn chồi trong dịch vi khuẩn
Juan Zhang và ctv (2006) đã nuôi đoạn chồi Medicoga truncatula trong rock wool
có chứa dịch vi khuẩn. Theo nghiên cứu của này thì rễ được mọc ra sau 2 - 3 tuần đồng
nuôi cấy.

Hình 2.9 Nuôi đoạn thân trên rock wool. (A) Đoạn thân cắm trên rock wool và đặt trên đĩa
petri. (A, B) Rễ tóc xuất hiện trren rock wool sau 2 - 3 tuần. (Mireille Chabaud và ctv, 2006).
15