TUYỂN CHỌN MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ĐỂ SẢN XUẤT BỘT BÀO TỬ DÙNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TUYỂN CHỌN MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ĐỂ SẢN XUẤT
BỘT BÀO TỬ DÙNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THỊ THU THẢO
Ngành: BẢO QUẢN, CHẾ BIẾN NÔNG SẢN VÀ VI SINH THỰC
PHẨM
Niên khóa: 2006 – 2010

Tháng 08/2010


TUYỂN CHỌN MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ĐỂ SẢN XUẤT BỘT BÀO
TỬ DÙNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG

Tác giả

NGUYỄN THỊ THU THẢO

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng Kỹ sư ngành
Bảo quản chế biến nông sản và vi sinh thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:
ThS. Nguyễn Minh Hiền
ThS. Phạm Tuấn Anh

 

Tháng 8 năm 2010

i


LỜI CÁM ƠN
Suốt cả cuộc đời tần tảo khó nhọc ba mẹ nuôi con khôn lớn thành người. Công lao to
lớn đó con xin dành trọn những thành quả mà mình đạt được cho đến ngày hôm nay dâng
lên ba mẹ.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, các thầy cô, đặc biệt là quý Thầy Cô ở
Khoa công nghệ thực phẩm đã hướng dẫn, giảng dạy và truyền cho em những kiến thức
vô cùng quý báu làm hành trang cho em vững bước trên đường đời.
Thật là vô cùng hạnh phúc, nhờ vào lòng từ bi của Hòa Thượng Trụ Trì Thiền viện
Thường Chiếu, Thiền viện Trí Đức. Chính tại nơi đây con đã được tạo mọi điều kiện
hoàn thành đề tài và học tập được những kinh nghiệm sản xuất nước tương truyền thống
Em xin bày tỏ sự biết ơn tới Thầy Phạm Tuấn Anh, Cô Nguyễn Minh Hiền, đã tận tâm
chỉ dạy, hướng dẫn suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới Bác Lâm Minh Thuận, Cô Vũ Thị Lâm An và các bạn bè đã
động viên em trong quá trình thực hiện đề tài.

ii


TÓM TẮT 
Đề tài “Tuyển chọn mốc Aspergillus oryzae để sản xuất bột bào tử dùng trong
sản xuất nước tương” được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Vi sinh – Khoa công nghệ
thực phẩm – Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và Thiền viện Thường chiếu số
1C – Huyện Long Thành – Đồng Nai. Thời gian tiến hành đề tài từ tháng 4/2010 đến
tháng 7/2010.
Kết quả nghiên cứu cho thấy: Quan sát đại thể 5 khuẩn lạc của mẫu nấm mốc thu

nhận từ 5 nguồn khác nhau không có sự khác biệt về màu sắc và sợi khuẩn ty . Tuy nhiên,
sau khi nuôi cấy 72 giờ, đường kính khuẩn lạc của các mẫu nấm mốc đo được cho thấy,
M3 từ Thường viện Thường Chiếu sinh trưởng mạnh mẽ nhất vì có đường kính lớn nhất
(4,3cm), sau đó là tới mẫu M4 (4,3cm) phân lập tự nhiên và M5 (4,1cm) từ Khoa Công
nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa. Đồng thời, kết quả đo vòng phân giải tinh bột của 5
mẫu cũng chỉ ra rằng: mốc M3 là có hoạt lực enzyme amylase mạnh nhất, hiệu số vòng
phân giải tinh bột là 2cm sau 48 giờ nuôi cấy và tăng lên thành 4cm sau 72 giờ, kế tiếp là
mẫu M4 và M5 ( cùng được 3,5cm sau 72 giờ), hoạt lực enzyme amylase kém nhất là thu
nhận từ mẫu M1 và M2, hiệu số vòng phân giải chỉ đạt được 3cm sau 72 giờ.
Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lên quá trình sản xuất bột
bào tử Aspergillus oryzae , kết quả thu được NT1 (150 g bã đậu nành : 30 g bắp mảnh : 15
g trấu) nấm Asp. oryzae phát triển tốt nhất. Với việc bổ sung 1% MgSO4 (w/w) so với bã
đậu nành, đã kích thích sự phát triển của Aspergillus oryzae.

iii


MỤC LỤC
Trang
TRANG TỰA ........................................................................................................................ i
LỜI CÁM ƠN.......................................................................................................................ii
TÓM TẮT........................................................................................................................... iii
MỤC LỤC .......................................................................................................................... iii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .................................................................................................vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................................. viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................................ 1
1.2 Mục đích .............................................................................................................................. 2
1.3 Nội dung ..................................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3

2.1 Giới thiệu về nước tương ................................................................................................... 3
2.1.1 Khái niệm ............................................................................................................. 3
2.1.2 Giá trị dinh dưỡng ................................................................................................ 3
2.2 Phương pháp sản xuất ........................................................................................................ 4
2.2.1 Phương pháp vi sinh ............................................................................................. 4
2.2.2 Phương pháp hóa học ........................................................................................... 4
2.2.3 Phương pháp enzyme ........................................................................................... 5
2.3 Phương pháp sản xuất nước tương truyền thống ............................................................ 5
2.3.1 Quy trình sản xuất ................................................................................................ 5
2.3.2 Nấm mốc Aspergillus oryzae sử dụng trong sản xuất nước tương ...................... 8
2.3.2.1 Giới thiệu chung về Asp. oryzae................................................................... 8
2.3.2.2 Điều kiện sinh trưởng và phát triển ............................................................. 10
2.4 Sản xuất bột bào tử Asp. oryzae trên môi trường bán rắn ........................................... 10
2.4.1 Quy trình sản xuất bột bào tử nấm Aspergillus oryzae ...................................... 11
2.4.2 Các nguyên liệu sử dụng để sản xuất bột bào tử trong đề tài ............................ 11
iv


2.4.2.1 Bã đậu nành ................................................................................................. 11
2.4.2.2 Bắp mảnh (ngô mảnh) ................................................................................. 12
2.4.2.3 Trấu.............................................................................................................. 13
2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quy trình sản xuất bột bào tử .................................... 13
2.5 Các sự cố thường gặp trong sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men ........ 15
2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất nước tương bằng phương pháp lên
men ............................................................................................................................................ 16
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 17
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................................. 17
3.1.1 Thời gian ............................................................................................................ 17
3.1.2 Địa điểm ............................................................................................................. 17
3.2 Nguyên vật liệu ................................................................................................................. 17

3.3 Hóa chất – Môi trường – Thuốc nhuộm: ....................................................................... 17
3.3.1 Môi trường ......................................................................................................... 17
3.3.2 Hóa chất ............................................................................................................. 18
3.3.3 Thuốc nhuộm ..................................................................................................... 18
3.4 Thiết bị - Dụng cụ............................................................................................................. 18
3.4.1 Thiết bị ............................................................................................................... 18
3.4.2 Dụng cụ .............................................................................................................. 18
3.4.3 Tiến trình thực hiện…………………………………………………………….19
3.5 Phương pháp thực hiện .................................................................................................... 19
3.5.1 Thí nghiệm 1: Thu thập nấm Asp. oryzae từ các cơ sở và PTN ........................ 19
3.5.2 Thí nghiệm 2: Tuyển chọn nấm Aspergillus oryzae có hoạt lực cao ................. 20
3.5.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy tới quá trình sản
xuất bột bào tử Aspergillus oryzae.................................................................................... 20
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 23
4.1 Kết quả thí nghiệm 1: Thu thập nấm Asp. oryzae từ các cơ sở và PTN................... 23
4.2 Kết quả thí nghiệm 2: Tuyển chọn Aspergillus oryzae có hoạt lực cao .................... 28
v


4.3 Kết quả thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy tới quá trình
sản xuất bột bào tử Aspergillus oryzae................................................................................. 31
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 35
5.1 Kết luận .............................................................................................................................. 35
5.2 Đề nghị ............................................................................................................................... 35

vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang

Hình 2.1: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh .................................. 7
Hình 2.2: Hình thái Aspergillus oryzae và Aspergillus flavus ............................................ 9
Hình 2.3: Quy trình sản xuất bột bào tử nấm Aspergillus oryzae ..................................... 11
Hình 3.1. Tiến trình thực hiện đề tài .................................................................................. 19
Hình 3.2: Quy trình sản xuất bột bào tử nấm mốc Asp. oryzae ......................................... 21
Hình 4.1: Khuẩn lạc M1 đến M5 sau 48 và 72 giờ nuôi cấy ............................................. 26
Hình 4.2: Hình ảnh tế bào M1 – M5 dưới kính hiển vi vật kính x40 ................................ 27
Hình 4.3: Vòng phân giải tinh bột ..................................................................................... 30
Hình 4.4: NT 1 (150 g bã đậu nành: 30 g bắp mảnh: 15 g trấu) sau 72 giờ nuôi Asp.
oryzae.................................................................................................................................. 32
Hình 4.5: NT 2 (150 g bã đậu nành: 50 g bắp mảnh: 15 g trấu) sau 72 giờ nuôi Asp.
oryzae.................................................................................................................................. 32
Hình 4.6: NT 3 (150 g bã đậu nành : 70 g bắp mảnh : 15 g trấu) sau 72 giờ nuôi Asp.
oryzae.................................................................................................................................. 33
Hình 4.7: NT 4 (150 g bã đậu nành : 30 g bắp mảnh : 15 g trấu : 1,5 g MgSO4) sau 72 giờ
nuôi Asp. oryzae ................................................................................................................. 34
Hình 4.8: Bột bào tử Asp. oryzae....................................................................................... 34

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Điều kiện sinh trưởng của nấm Asp. oryzae...................................................... 10 
Bảng 2.2: Thành phần dinh dưỡng của bã đậu nành.......................................................... 12 
Bảng 2.3: Thành phần hóa học trung bình của bắp mảnh ................................................. 13 
Bảng 3.1: Bảng bố trí thí nghiệm ....................................................................................... 22 
Bảng 4.1: Đặc điểm của khuẩn lạc ở các thời điểm 24, 48, 72 giờ. .................................. 24 
Bảng 4.2: Đường kính khuẩn lạc ở thời điểm 48h và 72h ................................................. 24 
Bảng 4.3: Hiệu số vòng phân giải tinh bột ........................................................................ 28 

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ bắp mảnh trong môi trường sản xuất bào tử tới sinh
trưởng của Asp. oryzae ....................................................................................................... 31 

viii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Nước tương là gia vị không thể thiếu trong ẩm thực của người dân châu Á nói chung
và người dân Việt Nam nói riêng. Không những thế, loại gia vị này đang được ưa chuộng
trên khắp trên thế giới (Mỹ, Úc,…).
Hiện nay, nước tương được sản suất chủ yếu bằng phương pháp hóa học. Ưu điểm của
phương pháp này là rút ngắn được thời gian và chi phí cho sản xuất. Tuy nhiên, một
nhược điểm lớn không thể chấp nhận là sự hình thành độc tố gây ung thư, đại diện là chất
3 - MCPD (3 - monochloropropanol), xuất phát từ tác nhân acid HCl trong quá trình thủy
phân nguyên liệu có chứa dầu. Vì thế, công nghệ hóa học không thể tạo ra sản phẩm nước
tương an toàn được.
Trong khi đó, từ ngàn xưa con người đã biết và làm ra nước tương mà không cần dùng
đến bất cứ một chất hóa học nào, đó là phương pháp lên men nước tương truyền thống.
Bằng cách sử dụng mốc trong tự nhiên, ngày nay được biết tới với tên khoa học là
Aspergillus oryzae. Nấm mốc này có khả năng tạo ra các loại enzyme (amylase,
protease,…) thủy phân cơ chất (tinh bột, protein,…) trên hạt đậu nành thành các chất dinh
dưỡng (đường, acid amin,…). Phương pháp này không sinh ra độc tố 3 – MCPD, đồng
thời tạo cho sản phẩm có hương vị thơm ngon đặc trưng. Phương pháp truyền thống
thường được áp dụng ở các cơ sở nhỏ nên chưa được kiểm soát chặt chẽ, cụ thể là ở khâu
tuyển chọn mốc giống, nhân giống mốc, ủ mốc... Hiện nay, một số Chùa và Thiền viện
của Việt Nam như chùa Bảo Hải ở Vũng Tàu, thiền viện Thường Chiếu ở Đồng Nai,…đã
và đang sản xuất nước tương theo phương pháp truyền thống. Với mục đích tuyển chọn
giống có hoạt tính cao và kiểm soát khâu nhân giống ở Thiền viện Thường Chiếu chúng

tôi thực hiện đề tài “Tuyển chọn mốc Aspergillus oryzae để sản xuất bột bào tử dùng
trong sản xuất nước tương”.
1


1.2 Mục tiêu
Phân lập và tuyển chọn chủng Aspergillus oryzae cho hoạt lực enzyme amylase.
Sản xuất bột bào tử nấm mốc Asp. Oryzae.
1.3 Nội dung
Phân lập, thuần chủng và định danh nấm mốc Aspergillus oryzae từ các nguồn mẫu
giống đã thu thập ở các cơ sở sản xuất.
Tuyển chọn chủng Aspergillus oryzae cho hoạt lực enzyme amylase và protease cao
nhất.
Sản xuất bột bào tử nấm mốc Aspergillus oryzae từ chủng đã qua tuyển chọn.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về nước tương
2.1.1 Khái niệm
Nước tương là sản phẩm thủy phân từ protein có nguồn gốc thực vật hay động vật.
Nước tương được thủy phân từ protein thực vật còn gọi chung là HVP (hydrolyzed
vegetable protein).
Ở Việt Nam, nước tương là sản phẩm thực phẩm truyền thống được dùng làm gia vị ở
khắp ba miền Bắc, Trung, Nam. Còn trên thế giới, nước tương cũng được dùng làm gia
vị, cụ thể như ở Nhật nổi tiếng với các sản phẩm như xì dầu tamari Koyo, xì dầu Shiro, xì
dầu Saishikomi, Kikoman; còn ở Trung Quốc lại có các sản phẩm xì dầu đặc, xì dầu bột
nhão…

Tương có vị ngọt của đường, vị đậm đà của đạm và mặn của muối ăn. Thành phần hóa
học chính của tương gồm đường đơn giản, acid amine, lipid, NaCl, nước. Ngoài ra còn có
các vitamine (đặc biệt là vitamine nhóm B) (Nguyễn Thị Hiền, 2007).
Các nguyên liệu trong sản xuất tương phải có đủ đạm và tinh bột. Trong đó, chất đạm
chiếm 70 - 80% chủ yếu từ nguồn protein thực vật như đậu nành, bánh khô dầu đậu nành
hoặc đậu phộng. Còn chất bột chiếm 20 - 30%, thường sử dụng bột gạo, nếp, bột mì…
2.1.2 Giá trị dinh dưỡng
Tác giả Umeda (1969) phân tích nước chấm lên men từ đậu nành ở Nhật đã thấy: sản
phẩm đạt hiệu suất chuyển hóa đạm 75,7% trong đó đạm amin đạt trên 50%. Theo
Yokotsuka (1960) trong đạm toàn phần của Shoyu có 40 – 50% đạm amin, 40 – 50%
peptide và pepton, 10 – 15% amoniac và dưới 1% protein. Trong đó có đầy đủ 17 acid
amin phổ biến mà chủ yếu là acid glutamic và muối của nó, các base hữu cơ như Adenine,
Guanine, Uracil, Cytosine. Các loại đường như glucose, saccharose, galactose, arabinose,
3


maltose, rượu glycerol, acid hữu cơ là acetic, lactic… (Trích dẫn bởi Đồng Thị Thanh
Thu, 2005)
2.2 Phương pháp sản xuất
2.2.1 Phương pháp vi sinh
Phương pháp này đã có từ lâu đời. Người ta sử dụng mốc có màu vàng hoa cau trong
tự nhiên để phân giải đậu nành. Mốc này có tên khoa học là Aspergillus oryzae. Nấm mốc
tham gia thủy phân tinh bột và thủy phân protein. Ngoài ra, còn tạo thành rượu và các
este. Các chất này tạo nên hương vị đặc trưng của tương. Với tác nhân thủy phân là vi
sinh vật sản phẩm không tạo thành 3 - MCPD. Tuy nhiên có một loài nấm sợi có màu sắc
và hình thái rất giống với loài Aspergillus oryzae nhưng lại rất nguy hiểm rất có thể nhiễm
từ không khí hay có trong các nguyên liệu có dầu như đậu phộng, đậu nành bảo quản
không tốt. Đó là loài Aspergillus flavus, một loài nấm có thể sinh ra độc tố Aflatoxin một loại độc tố có thể gây ung thư. Loài nấm này có hình thái và màu sắc rất giống với
loài Aspergillus oryzae. Chỉ có các chuyên gia có kinh nghiệm mới phân biệt được hai
loài này (Nguyễn Lân Dũng, 2007) .

2.2.2 Phương pháp hóa học
Nhằm tăng hiệu suất thủy phân và rút ngắn thời gian sản xuất, người ta sử dụng các
hóa chất để phân giải cơ chất. Nguyên liệu dùng sản xuất nước tương thường bao gồm bã
khô đậu nành, bã khô đậu phộng đã trích ly dầu có protein tổng hợp từ 42 - 50%. Hàm
lượng chất béo còn 5 - 8% trong bánh khô đậu phộng ép thủ công và 3 - 5% trong bánh
khô dầu đậu phộng ép công nghiệp. Dùng tác nhân xúc tác là acid mạnh (HCl, H2SO4)
hay kiềm mạnh (NaOH) để thủy phân protein trong nguyên liệu sản xuất, sau đó quá trình
tiến hành trung hòa dung dịch để đưa pH về 6,5 – 7 cuối cùng bổ sung NaCl đạt 23 – 25%
nồng độ muối. Khi thủy phân, chất béo phân giải thành glycerol và acid béo. Trong môi
trường acid (nếu dùng HCl) và nhiệt độ cao thì Glycerol tạo thành phản ứng với HCl tạo
độc tố 3 – Monochlopropanol - 1,2 -diol. 3 – Monochlopropanol - 1,2 - diol là hóa chất
tiêu biểu thuộc nhóm Chloropropanol. Cùng với 1,3 - dichloropropanol (1,3 - DPC), 3 MCPD đã được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm nhất là trong nước tương
4


(). Nếu dùng H2SO4 thì sản phẩm lại có vị chát và bị cặn do tạo
thành CaSO4 trong quá trình trung hòa. Phương pháp hóa học có ưu điểm là rút ngắn thời
gian sản xuất từ vài tháng theo phương pháp lên men xuống chỉ còn 2 - 3 ngày/ mẻ, hiệu
suất thủy phân cao từ 85 - 90%. Sản phẩm giàu acid amin có mùi vị ngọt thơm, dễ bảo
quản. Nhưng nhược điểm không thể chấp nhận là tạo thành độc tố khi thủy phân bằng
HCl đồng thời có ảnh hưởng xấu cho người sản xuất và môi trường.
2.2.3 Phương pháp enzyme
Do nhược điểm phương pháp vi sinh là tốc độ phân giải cơ chất chậm làm thời gian
sản xuất dài nên bổ sung enzyme để tăng hiệu quả thủy phân và rút ngắn quá trình sản
xuất. Người ta sử dụng các enzyme protease trong công nghiệp hoặc bổ sung các nguyên
liệu có chứa enzyme như đu đủ, dứa… Yêu cầu các nguồn nguyên liệu kết hợp phải có
hàm lượng thủy phân protein cao, không làm ảnh hưởng tới thành phần, mùi vị của sản
phẩm. Tuy nhiên, phương pháp này chưa tạo thành mùi vị đặc trưng cho sản phẩm.
Trong phạm vi đề tài, chúng tôi đề cập chi tiết tới phương pháp sản xuất nước tương
truyền thống.

2.3 Phương pháp sản xuất nước tương truyền thống
2.3.1 Quy trình sản xuất
Trong phương pháp thủ công, mốc được dùng trong sản xuất tương thường có sẵn
trong tự nhiên. Người ta nấu nếp rồi trải nếp ra nia, phủ lá nhãn, lá sen để bẫy mốc. Mốc
bẫy xong sẽ được trộn với đậu nành hấp chín và ủ tương từ 3 đến 6 tháng. Quá trình bẫy
mốc diễn ra khoảng 3 ngày, khối ủ có thể gồm nhiều loại nấm mốc. Điển hình là
Aspergillus oryzae khi còn non có màu vàng hoa cau, khi già chuyển qua màu xanh lục.
Nấm mốc này có vai trò quan trọng nhất trong sản xuất tương. Đôi khi trong khối ủ cũng
xuất hiện màu vàng cam do Monilia sitofila; màu trắng, xám do Mucor mucedo, M.
rouxii, Rhizopus nigicans. Tuy nhiên mốc màu cam và màu trắng thường không gây nguy
hiểm cho sản phẩm. Các mốc gây ảnh hưởng xấu cho quá trình làm tương thường là mốc
màu đen Asp. niger hay xanh rêu, xanh dương do Penicillium notatum, P. expansum,
Trichoderma lignorum. Đặc biệt nguy hiểm là nấm Asp. flavus vì nấm này cũng có màu
5


xanh lục như Asp. oryzae nhưng lại sinh ra độc tố aflatoxin có khả năng gây bệnh ung
thư.
Nhằm khắc phục hiện tượng tạp nhiễm và kiểm soát không để các loài nấm mốc có hại
bị nhiễm vào khối ủ, người ta đã sử dụng bột bào tử Asp. oryzae để rắc vào khối ủ. Việc
làm này dựa trên nguyên tắc về quy luật cạnh tranh, nghĩa là khi chủ động cấy một lượng
Asp. oryzae vào khối nguyên liệu thì nấm mốc này sẽ phát triển chiếm ưu thế và lấn át các
loài khác phát triển. Do đó sẽ giảm thiểu sự tạp nhiễm và sản phẩm sẽ có chất lượng tốt
hơn. Hình 2.1 trình bày về sơ đồ quy trình sản xuất nước tương bằng việc cấy bào tử Asp.
oryzae trong quá trình nhân giống.

6


Đậu nành

Làm sach

Bào tử nấm
Asp. oryzae

Bột mì

Ngâm

Nhân giống

Rang chín vàng

Hấp

Trộn

Để nguội

Để nguội

Mốc giống

Ủ mốc
Làm tơi
Thủy phân
Lọc

Nước

cốt

Nước
tương

Phối chế
gia vị

Hình 2.1: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh
7


Trong quy trình này, đậu nành là nguyên liệu chính, đồng thời là nguồn protein và
glucid cho quá trình thủy phân. Sau khi được loại bỏ tạp chất, đậu nành được ngâm
khoảng 8 – 12 giờ để hạt đậu được trương nở rồi đem đi hấp chín. Để khối đậu nguội
xuống khoảng 40oC, người ta tiến hành trộn mốc giống đã chuẩn bị từ trước vào. Hỗn hợp
mốc giống và bột mì đã rang chín vàng được trộn sao cho “áo” đều xung quanh từng hạt
đậu. Theo Nguyễn Đức Lượng, 2006 thì tỉ lệ mốc giống được trộn chiếm 0,5 – 1% so với
toàn khối lượng đậu hấp. Sau đó, đậu được trải đều ra khắp mặt nia với độ dày khoảng 1,5
– 2 cm. Kết thúc quá trình quá trình ủ đậu khoảng 3 – 4 ngày, những hạt đậu đã lên mốc
đều có màu xanh hoa lý sẽ được bóp rời. Lượng đậu này sẽ được thêm nước muối có độ
mặn từ 20 – 22% để thực hiện quá trình thủy phân. Thời gian phân giải tối thiểu là 3
tháng rồi lọc dịch thủy phân để cho nước tương cốt. Có thể bổ sung thêm nước muối để
tiếp tục thủy phân hoặc vớt đậu nành làm tương hột. Nước tương cốt có vị rất mặn nên
cần phối chế gia vị như đường, nước, caramen…để thu được nước tương thành phẩm.
2.3.2 Nấm mốc Aspergillus oryzae sử dụng trong sản xuất nước tương
2.3.2.1 Giới thiệu chung về Asp. oryzae
Theo quy luật quốc tế về danh pháp, Aspergillus oryzae thuộc giống Aspergillus; họ
nấm bông Moniliaceae có hệ sợi không màu, màu nhạt hoặc sáng; bộ nấm bông
Moniliales; lớp nấm khuyết hay nấm bất toàn Deuteromycetes không có sinh sản hữu

tính, sinh sản vô tính bằng bào tử; ngành nấm (mycota); giới thực vật.
Nó được nghiên cứu nhiều nhất vì liên quan đến nông nghiệp, y tế, lương thực thực
phẩm (Lê Thị Ngọc Mai, 1993).
Mốc Asp. oryzae thường gọi là nấm màu vàng hoa cau. Khi mới phát triển, hệ sợi có
màu trắng, sau đó chuyển sang màu vàng, khi già chuyển hẳn sang màu lục. Chúng có hệ
bào tử đính (hình 2.1). Bào tử đính là bào tử được sinh ra từ bộ cuống đính bào tử ngoài
cùng, phát triển từ thành tế bào rất dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc. Nó tạo
thành sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi.
Xung quanh túi là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể
bình. Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang
8


5 – 7 μm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang chia sợi thành nhiều tế bào (nấm đa
bào). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính
bào tử, ở đầu có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp. oryzae thường dài
1,0 – 2,0 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng
lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài gọi là những tế
bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử dính vào nhau, nên
gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp. oryzae có màu vàng lục và đây cũng chính là
màu ta thường thấy ở mốc tương. Nấm mốc Asp. flavus cũng là mốc vàng rất giống Asp.
oryzae chỉ khác là Asp. flavus có kích thước nhỏ hơn (chiều cao của cuống sinh bào tử từ
0,4 – 1 mm so với Asp. oryzae từ 1 – 2 mm). Mốc này có thể sinh ra độc tố aflatoxin gây
ung thư.

Aspergillus oryzae

Aspergillus flavus

Hình 2.2: Hình thái Aspergillus oryzae và Aspergillus flavus

(Vương Thị Việt Hoa, 2006)
Nấm mốc Asp. oryzae có khả năng sinh enzyme rất mạnh, chủ yếu là amylase,
invertase, maltose, protease, lipase, cellulase, các enzyme oxy hóa khử. Chúng có khả
năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm cho tương có vị ngọt.
9


2.3.2.2 Điều kiện sinh trưởng và phát triển
Aspergillus oryzae là chủng mốc ưa không khí, khi có đủ oxy thì nó phát triển rất
mạnh. Điều kiện sinh trưởng của loài nấm mốc này được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Điều kiện sinh trưởng của nấm Asp. oryzae
Điều kiện sinh trưởng

Thông số

Độ ẩm (%)

45 - 55

pH môi trường

5,5 - 6,5

Độ ẩm không khí (%)

85 - 95

Nhiệt độ nuôi cấy (oC)

27 - 30

Thời gian (giờ)

40 - 42
(Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Nếu nuôi mốc làm giống thì cần nuôi trong khoảng thời gian 60 - 70 giờ bào tử mới
hình thành đầy đủ. Còn nếu nuôi mốc để có enzyme amilase thì thời gian tối đa là 40 giờ
còn để có enzyme protease cần thời gian tối đa là 42 giờ (Nguyễn Thị Diệu Bích, 2007).
2.4 Sản xuất bột bào tử Asp. oryzae trên môi trường bán rắn
Người ta thường nuôi Asp. oryzae trên môi trường bán rắn cho việc sản xuất bột bào
tử. Nấm mốc sau khi gieo cấy sẽ phát triển trên bề mặt và dần dần lan xuống phía dưới
theo các kẽ hở, các cấu tử thành phần môi trường. Môi trường bán rắn thường dùng các
nguyên liệu tự nhiên như bã đậu nành, bột bắp, cám mì, cám gạo, bột ngô, hạt kê… Ngoài
ra có thể bổ sung thêm trấu, rơm băm vụn, lõi ngô, mùn cưa…để làm cho môi trường tăng
độ thông thoáng. Tuy nhiên, vì các phụ liệu cho thêm vào thường nghèo chất dinh dưỡng
nên lượng cho thêm vào phải ở lượng giới hạn. Để đảm bảo đủ các chất dinh dưỡng trong
môi trường người ta có thể bổ sung các nguồn N, P, K hoặc các chất sinh trưởng như
Mg… Để đảm bảo cho mốc mọc đều trên bề mặt môi trường, lớp môi trường bán rắn cần
phải mỏng, chiều dày chỉ vào khoảng 2 - 5 cm (Phan Thị Hiền, 2009).

10


2.4.1 Quy trình sản xuất bột bào tử nấm Aspergillus oryzae

Nguyên liệu
(bã đậu nành, cám
mì, cám bắp,…)

Phối trộn
Hấp tiệt trùng
Để nguội
Cấy giống

Aspergillus
oryzae

Nuôi nấm
Sấy khô
Xay nhỏ

Bột bào tử
Asp.oryzae

Hình 2.3: Quy trình sản xuất bột bào tử nấm Aspergillus oryzae
2.4.2 Các nguyên liệu sử dụng để sản xuất bột bào tử trong đề tài
2.4.2.1 Bã đậu nành
Bã đậu nành là phụ phế phẩm của quá trình chế biến hạt đậu nành sống làm tàu hũ
(đậu phụ) hoặc sữa đậu nành. Thành phần dinh dưỡng của bã đậu nành thể hiện trong
bảng 2.2.

11


Bảng 2.2: Thành phần dinh dưỡng của bã đậu nành
Thành phần

Trong 1kg tươi

Trong 1kg chất
khô

Chất khô (g)

130

1000

Protein thô (g)

33

253

17,2

132

27

207

Tinh bột (g)

26,1

201

Calci (g)

1,0

7,6

Phosphor (g)

0,4

3,0

Năng lượng (Kcal)

321

2480

Chất béo (g)
Xơ (g)

(Đinh Văn Cải, 1975)
Qua bảng 2.2 thấy rằng thành phần dinh dưỡng phụ thuộc hàm lượng nước còn lại
trong bã. Tính về tỉ lệ chất khô, protein chiếm 25,3% cao nhất, tiếp theo tỉ lệ chất xơ và
tinh bột xấp xỉ nhau 20,7% và 20,1%. Trong khi đó, lượng chất béo chỉ chiếm 13,2%.
Ngoài ra, trong bã đậu nành còn chứa 2 loại muối khoáng Ca và P với tỉ lệ đáng kể.
2.4.2.2 Bắp mảnh (ngô mảnh)
Bắp mảnh là một loại nguyên liệu chứa nhiều glucid, protein, lipid và cả những
nguyên tố khoáng cần thiết cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật, đặc biệt là nấm sợi. Ưu
điểm lớn nhất của ngô mảnh là loại vật liệu rời, tinh bột có trong ngô mảnh thường không
tạo thành khối kết dính nên rất thuận lợi để làm môi trường bán rắn trong nuôi cấy bề mặt.

Thêm nữa, loại nguyên liệu này dễ mua, giá rẻ và có thể bảo quản được lâu (Nguyễn Đức
Lượng, 2006). Vì thế, bắp mảnh được sử dụng trong các quá trình nuôi cấy các nấm sợi
như Asp. oryzae để tạo ra hai enzyme quan trọng protease và amylase ứng dụng trong sản
xuất nước tương theo phương pháp lên men tự nhiên.

12


Bảng 2.3: Thành phần hóa học trung bình của bắp mảnh
Thành phần

Số lượng

Protein (%)

8,5

Lipid (%)

3,2

Glucid (%)

71,8

Cellulose (%)

1,7

Tro (%)

0,8

Natri (mg/100g)

10,4

Kali (mg/100g)

310,6

Canxi (mg/100g)

30,0

Photpho (mg/100g)

190,0

Magiê (mg/100g)

85

Sắt (mg/100g)

2,3

Kẽm (mg/100g)

1,4

Đồng (mg/100g)

0,16

Mangan (mg/100g)

O,5

Coban (mg/100g)

22,4

Molipden (mg/100g)

35
(Nguyễn Đức Lượng, 2006)

2.4.2.3 Trấu
Trấu có nhiều trong các nhà máy xay lúa. Nó thường được dùng làm nguyên liệu bổ
sung vào môi trường bán rắn để nuôi cấy nấm mốc. Việc bổ sung trấu giúp tăng độ thông
thoáng cho môi trường, tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển.
2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quy trình sản xuất bột bào tử
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sản xuất bột bào tử như thành phần môi
trường, điều kiện nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy….

13


 Độ ẩm của môi trường tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc là 55 58%. Độ ẩm môi trường thích hợp sự hình thành bào tử là khoảng 45%. Cần giữ

cho độ ẩm môi trưởng không bị giảm trong quá trình phát triển.
 Độ ẩm tương đối của không khí từ 80% trở lên đến bão hòa đều thích hợp cho nấm
mốc. Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môi
trường không bị khô.
 Ảnh hưởng của không khí: Asp. oryzae là sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát
triển bình thường khi đầy đủ oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này môi trường nuôi
phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2,5 – 3cm, phòng nuôi phải thoáng.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành
enzyme của Asp. oryzae khoảng 28 – 32oC. Trong quá trình sinh trưởng, phát triển,
nấm mốc cũng sinh nhiệt và tỏa nhiệt vào môi trường làm khối ủ có thể lên tới
40oC hoặc cao hơn. Do đó, để đảm bảo quá trình nuôi cấy nấm mốc tốt cần giữ cho
nhiệt độ môi trường không thấp hơn 27oC và không cao quá 36oC.
 Thời gian nuôi nấm mốc: Hầu hết các chủng Asp. oryzae có hoạt động cực đại của
amylase ở khoảng giờ thứ 30 – 36, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36 –
42. Một số chủng cho hai cực đại amylase ở giờ thứ 36 và giờ thứ 60. Thời gian
nuôi mốc giống để thu bào tử thường hết 60 – 70 giờ.
 pH thích hợp cho Asp. oryzae là môi trường acid yếu 5,5 – 6,5. Các môi trường
nhân giống có thành phần chính từ cám, đậu, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này
nên không cần điều chỉnh pH.
 Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn. Để khôi phục khả
năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ.

14


2.5 Các sự cố thường gặp trong sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men 
Trong quá trình ngâm đậu, các nấm mốc không phát triển nhưng vi khuẩn thường có
trong nước đậu như Bacillus subtilis, Bac. mensentericus có khả năng phân giải protein.
Còn bề mặt của nước đậu có một số nấm men thường gặp thuộc giống Oidium và
Geotrichum. Các vi sinh vật này làm cho nước đậu bị thối và chua.

Trong quá trình nhân giống mốc thường xảy ra hiện tượng mốc phát triển không tốt;
mốc có màu bạc và xuất hiện tơ trắng (do nhiễm Mucor sp.); bị nhiễm mốc đen do Asp.
niger thậm chí bị nhớt thiu, làm cho tương chua. Nếu sử dụng mốc giống bị tạp nhiễm để
sản xuất tương sẽ làm cho mặt tương bị váng chua và sinh hơi. Khi gặp các sự cố trên thì
phải loại bỏ mốc giống khâu nhân giống. Nếu khối ủ liên tục bị nhiễm mốc đen, khay mốc
phát triển chậm phải thay nguồn giống mới.
Ở công đoạn nhân giống, nếu mốc giống không tốt thì thường xảy ra các biểu hiện
mốc cằn, tơ ngắn, ít bào tử, màu sắc xấu. Nguyên nhân có thể là hoạt lực của giống yếu,
môi trường sản xuất bào tử chưa được vô trùng, dụng cụ thanh trùng chưa vệ sinh sạch sẽ
hoặc do thao tác không đảm bảo, nhiệt độ nuôi cấy quá cao, nguyên liệu quá khô hay quá
ẩm ... Nếu nhiệt độ ủ lớn hơn 60oC, độ ẩm không khí trong phòng ủ thấp thì mốc bị khô,
rời rạc. Khối ủ khô cần che một lớp vải mỏng trên bề mặt của đậu, để hạn chế sự thoát hơi
nước từ khối ủ, mở cửa sổ để tạo độ thông thoáng Còn nếu nguyên liệu quá ẩm sẽ làm cho
các sợi khuẩn ty không phát triển được lúc đó cần trộn thêm bột rang vàng để giảm độ ẩm
của đậu.
Nước tương thành phẩm có thể bị váng chua do thiếu muối hoặc bị sình hơi có thể do
hai nguyên nhân tương chưa ngấu chín đầy đủ hoặc nhiễm vi khuẩn kị khí. Khi thấy nước
tương bị váng chua cần phải vớt bỏ váng, thêm dung dịch muối tới khi đủ mặn cần thiết.
Đun nước tương cốt ở 80 – 90oC trong 2 giờ sẽ khắc phục được hiện tượng váng ở nước
tương.

15


2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất nước tương bằng phương pháp lên
men
Quá trình sản xuất nước tương trải qua nhiều công đoạn. Ở mỗi công đoạn đều đòi hỏi
yêu cầu và sự kiểm soát chặt chẽ để cho ra thành phẩm mang chất lượng tốt nhất.
Đối với nguyên liệu chính là đậu nành, giống đậu Miên, được mua từ biên giới
Campuchia, được ưa chuộng hơn hết. Đặc điểm của giống đậu này chất dinh dưỡng cao

hơn giống đậu nành ở Việt Nam, hạt đậu tròn, màu vàng, cứng chắc. Độ chắc của hạt giúp
tương hột không bị bể nát sau thời gian thủy phân dài.
Thời gian ngâm cũng ảnh hưởng tới sản phẩm. Nếu thời gian ngâm ngắn thì hạt đậu
còn cứng, thời gian nấu phải kéo dài gây tốn kém chi phí. Nếu ngâm lâu thì pH của khối
hạt giảm, đậu dễ bị chua.
Mốc giống là nhân tố tạo ra nguồn enzyme phân giải protein, glucid…trong cơ chất.
Vì thế, nguồn giống phải thuần, cần có sự tuyển chọn giống có hoạt lực enzyme cao nhằm
tăng hiệu suất thủy phân, rút ngắn thời gian sản xuất.
Tỷ lệ cấy giống tốt nhất khoảng 0,5 – 1 %, nếu tỉ lệ cấy giống quá nhiều làm hao phí
lượng bột bào tử và tăng chi phí sản xuất, còn nếu tỉ lệ cấy giống quá ít thì mốc phát triển
chậm và mọc không đều trên khối hạt, lượng enzyme sinh ra ít dẫn đến tốc độ phân giải
chậm.
Độ dày của khối ủ cũng ảnh hưởng tới quá trình nhân giống. Nếu khối hạt quá dày sẽ
tạo môi trường kỵ khí trong lòng khối ủ làm ức chế sự phát triển của nấm và vi khuẩn
phát triển làm khối ủ bị nhớt. Khối hạt mỏng lại tốn diện tích khay ủ và công sức người
sản xuất. Chiều dày khoảng 1,5 – 2 cm là thích hợp.
Nhiệt độ ủ cũng ảnh hưởng tới quá trình bẫy mốc và thủy phân. Để đảm bảo cho Asp.
oryzae phát triển tốt cần tạo điều kiện nhiệt độ thích hợp trong khoảng 27 – 30oC. Vì vậy,
với điều kiện sản xuất thủ công, vào mùa mưa, khí hậu lạnh người ta thường đặt thêm bếp
than trong phòng ủ.
Độ ẩm môi trường không được quá khô, dưới 50%, nếu không mốc không phát triển
được. Vì vậy, phòng ủ phải tránh gió.

16