khảo sát hoạt tính và tinh sạch protease từ hai chủng nấm mốc aspergillus oryzae và aspergillus kawasaki trên môi trường bán rắn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
ĐẬU THỊ KIM DUNG
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI
CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ
ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN
Luận văn kỹ sư
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI
CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ
ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN
Luận văn kỹ sư
Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện :
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI ĐẬU THỊ KIM DUNG
PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Khóa : 2002 - 2006
CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
SURVEYING ACTIVITY OF PROTEASE AND PURIFYING
PROTEASE EXTRACTING FROM TWO FUNGAL SPECIES
ASPERGILLUS ORYZAE AND ASPERGILLUS KAWASAKI ON
SEMI SOLID MEDIUM

Graduation thesis
Major : Biotechnology
Professors : Student :
PhD. NGUYEN NGOC HAI ĐAU THI KIM DUNG
Vice Professor-PhD. NGUYEN TIEN THANG Term : 2002 - 2006
BA. ĐO THI TUYEN
HCMC, 09/2006
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến :
* Ban Giám hiệu trường đại học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học,
cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại
trường.
* Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng
hướng dẫn, giải đáp mọi thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
* Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ
Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện
Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em có
thể hoàn tất khóa luận này.
* Anh Nguyễn Diên Sanh, anh
Nguyễn Duy Long là những cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã hỗ
trợ cũng như cung cấp cho em nhiều kiến thức xung quanh đề tài.
* Các bạn lớp CNSH K28 đã động
viên, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn cũng như chia xẻ những vui buồn trong suốt thời
gian học tập.
* Các bạn phòng Các Chất Có Hoạt
Tính Sinh Học đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
* Cuối cùng con xin cảm ơn bố mẹ
đã, đang và mãi mãi là chỗ dựa vững chắc cả về tinh thần lẫn vật chất cho con niềm tin
và động lực bước vào đời.

iv
TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Đậu Thị Kim Dung, Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Tháng 9/2006. “KHẢO SÁT
HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC
ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƯỜNG
BÁN RẮN”. Đề tài được thực hiện từ ngày 10/2/2006 đến ngày 1/6/2006 tại Viện Sinh
Học Nhiệt Đới TP.HCM.
Hội đồng hướng dẫn :
PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG
TS. NGUYỄN NGOC HẢI
CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Chế phẩm enzyme thô dạng bột của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và
Aspergillus kawasaki được chiết bằng nước cất, thu được dịch chiết enzyme thô. Dịch
chiết thô này được tủa với muối (NH
4
)
2
SO
4
ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60,
65, 70, 75 và cồn 96
0
ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6
Cặn tủa thu được hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính protease nhằm tìm ra
nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease. Từ đó khảo sát điều kiện tối ưu
cho hoạt động của protease từ dịch tủa enzyme thu được từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn
tối ưu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm được chạy qua sắc ký lọc gel và xác định
trọng lượng phân tử protease bằng điện di. Kết quả thu được như sau :
 Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ưu để
tủa protease.

 Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 47
0
C.
 Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus
kawasaki.
v
MỤC LỤC
NỘI DUNG TRANG
Bìa i
Trang tựa ii
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt khóa luận iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt viii
Danh sách các bảng ix
Danh sách các hình và đồ thị xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích nghiên cứu 2
1.3 Yêu cầu 2
2.1 Khái quát chung về enzyme 3
2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3
2.1.2 Định nghĩa về enzyme 5
2.1.3 Phân loại enzyme 6
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 7
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme 7
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 7
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống 9
2.1.5.1 Nguồn thu nhận 9
2.1.5.2 Vai trò 11

2.2 Khái quát chung về enzyme protease 11
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease 11
2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease 12
2.2.2.1 Protease từ động vật 12
2.2.2.2 Protease từ thực vật 12
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật 13
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease 13
2.2.3.1 Từ động vật 13
2.2.3.2 Từ thực vật 13
2.2.3.3 Từ vi sinh vật 14
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease 14
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 15
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 15
2.3.1.1 Phân loại 15
2.3.1.2 Đặc điểm 15
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt 16
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease 18
2.5.1 Trích ly enzyme 19
2.5.2 Quá trình tủa 20
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký 22
vi
2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di SDS –
PAGE 27
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29
3.1 Thời gian và địa điểm 29
3.2 Vật liệu 29
3.2.1 Chế phẩm enzyme thô 29
3.2.2 Hóa chất 29
3.2.3 Thiết bị 29
3.3 Phương pháp thí nghiệm 30

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 30
3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme
thô 30
3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH
4
)
2
SO
4
và tỷ lệ cồn tối ưu để tủa
enzyme protease 36
3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của protease 37
3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel 37
3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lượng phân tử enzyme bằng phương pháp điện
di SDS – PAGE 41
3.4 Phương pháp xử lý số liệu 44
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45
4.1 Hàm lượng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô 45
4.2 Nồng độ muối (NH
4
)
2
SO
4
tối ưu cho việc tủa protease 45
4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 46
4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 48
4.3 Tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease 49
4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 49
4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 51

4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 96
0
và tủa bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
53
4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease 54
4.5.1 pH tối ưu 54
4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae 54
4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki 54
4.5.2 Nhiệt độ tối ưu 55
4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 55
4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 56
4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel 56
4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae 57
4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki 59
4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 62
4.7.1 Tủa protease bằng muối 62
4.7.2 Tủa protease bằng cồn 62
4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phương pháp điện di trên gel SDS –
PAGE 63
PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ 67
5.1 Kết luận 67
5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 67
vii
5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki 67

5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 68
5.2 Đề nghị 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO 69
PHỤ LỤC 70
viii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ
Asp.oryzae : Aspergillus oryzae
Asp.kawasaki : Aspergillus kawasaki
CP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh
ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp).
CBB : Coomasie Brilliant Blue.
ĐVHT : Đơn vị hoạt tính.
HT : Hoạt tính
HTR : Hoạt tính riêng.
TCA : Trichloacetic acid
A.U : Độ hấp thụ.
mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lường độ dẫn điện).
UI : Đơn vị hoạt tính enzyme.
ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein 22
Bảng 3.1 Đường chuẩn Albumin 32
Bảng 3.2 Đường chuẩn Tyrosine 34

Bảng 3.3 Khối lượng (NH
4
)
2
SO

4
tương ứng với mỗi nồng độ 36
Bảng 3.4 Thể tích cồn tương ứng với các tỷ lệ 36
Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme thô
của hai chủng Asp.oryzae và Asp. kawasaki 45
Bảng 4.2 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 46

Bảng 4.3 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 46

Bảng 4.4 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 48
Bảng 4.5 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 48
Bảng 4.6 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 50
Bảng 4.7 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 50
Bảng 4.8 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 51
Bảng 4.9 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1 g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 52
x
Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 53
Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH 54

Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH 55
Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ 55

Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ 56
Bảng 4.15 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel 59
Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel 61
Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease
bằng muối 62
Bảng 4.18 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease
bằng cồn 62
Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử của những protein trong thang 65
Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae 66
Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki 66
xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
HÌNH TRANG
Hình 2.1 Đường biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ
phản ứng 8
Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ
cơ chất 8
Hình 2.3 Công thức cấu tạo enzyme protease 11
Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi 16
Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi
trường CBS – MEA2% 16
Hình 2.6 Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch
bằng sắc ký 23
Hình 2.7 Quá trình lọc gel 26
Hình 3.1 Máy quang phổ UV-Vis 31
Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad,
Mỹ 38
Hình 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P-
100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus
oryzae 58

Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P
– 100 khi tủa protease bằng cồn đối với nấm Aspergillus
oryzae 58
xii
Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P
– 100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus
kawasaki 60
Hình 4.4 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-
100 khi tủa protease bằng cồn đối với Aspergillus
kawasaki 60
ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lượng protein và hoạt tính
enzyme protease trong dịch chiết enzyme thô giữa hai
chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki 45
Đồ thị 4.2 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong
1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease
bằng muối 47
Đồ thị 4.3 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong
1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa
protease bằng muối 49
Đồ thị 4.4 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong
1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease
bằng cồn 51
Đồ thị 4.5 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong
1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa
protease bằng cồn 52
Đồ thị 4.6 Ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme
protease từ Asp.oryzae 54
Đồ thị 4.7 Ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme
protease từ Asp.kawasaki 55

Đồ thị 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính
protease từ Asp.oryzae 55
Đồ thị 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính
protease từ Asp.kawasaki 56
xiii
Đồ thị 4.10 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các
bước tinh sạch khi tủa protein bằng muối 62
Đồ thị 4.11 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các
bước tinh sạch khi tủa protease bằng cồn 63
Đồ thị 4.12 Sự tương quan giữa Lg của trọng lượng phân
tử và giá trị Rf 65
xiv
1
PHẦN 1 : MỞ ĐẦU
1.2 Đặt vấn đề
Để duy trì sự sống, cơ thể mỗi sinh vật phải thực hiện rất nhiều phản ứng hóa
sinh. Như vậy điều gì đã giúp các phản ứng này được tiến hành mau lẹ phi thường mà
vẫn nhịp nhàng cân đối. Đó là nhờ khả năng xúc tác và điều hòa to lớn của enzyme.
Có bản chất là một protein, enzyme không chỉ có thể thực hiện khả năng xúc
tác sinh học bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện các xúc tác bên ngoài cơ thể khi
tạo cho chúng một điều kiện thích hợp để hoạt động. Bởi lẽ đó, trong vòng vài chục
năm gần đây việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme trên thế giới đã phát
triển với tốc độ rất mạnh mẽ.
Nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy cho sự phát triển của nền công nghiệp
sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo
enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra
một lượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng
tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm
môi trường nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme.
Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và

phổ biến trong đời sống. Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của
enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Điều
kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme
hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu cho hoạt động của enzyme đó.
Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng
trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh
sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus
kawasaki trên môi trường bán rắn”.
Aspergillus oryzae từ lâu đã được dùng như là nguồn vi sinh vật được nuôi
cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì người ta
2
chỉ biết đến như là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase. Do đó, qua đề tài, chúng ta
có thể đánh giá được hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki.
1.2 Mục đích nghiên cứu.
 Xác định các điều kiện thu nhận và đặc tính của enzyme protease từ hai chủng
nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspgillus kawasaki.
 So sánh hoạt tính enzyme protease giữa hai chủng nấm mốc Aspergillus
oryzae và Aspergillus kawasaki.
1.3 Yêu cầu.
 Thu nhận enzyme , xác định nồng độ muối (NH
4
)
2
SO
4
bão hòa và tỷ lệ cồn tối
ưu trong việc tủa enzyme - bước đầu trong quá trình tinh sạch enzyme.
 Xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme protease.
 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.

 Xác định trọng lượng phân tử của enzyme protease bằng kỹ thuật điện di SDS
– PAGE.
3
PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái quát chung về enzyme
2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme
Từ trước thế kỷ 17, khi loài người hoàn toàn chưa hiểu biết gì về ezyme,
người ta đã biết sử dụng rộng rãi các quá trình enzyme trong hoạt động thực tế như
làm bánh mì, làm bia, rượu,…Việc ứng dụng enzyme trong giai đoạn này hoàn toàn có
tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống của tế
bào vi sinh vật.
Ngay từ thế kỷ 17, các nhà khoa học đã quen dùng từ “ferment” do nhà khoa
học người Hà Lan Van Heltmon đề xướng. Theo nghĩa tiếng La Tinh thì “fermentatio”
nghĩa là sự lên men, đó cũng là nguồn gốc của từ “ferment”. Theo ý kiến của ông, yếu
tố tham gia tích cực vào quá trình lên men rượu là “ferment”. Yếu tố đó là gì thì còn là
điều bí ẩn. Các nhà khoa học đã không vừa lòng với hiểu biết này và đã đi sâu vào
thực nghiệm, quan sát, mô tả.
Đến nửa cuối thế kỷ 18 bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn
giản chứng minh tác dụng của men tiêu hóa được nhà tự nhiên học người Pháp
Réaunur tiến hành vào năm 1713 và được Spallanzani người Ý khẳng định lại một
cách chặt chẽ hơn vào năm 1783 với tác dụng của dịch dạ dày phân hủy thịt.
Năm 1814, viện sĩ viện hàn lâm khoa học Petecbua là Kirchov người Nga
làm thí nghiệm chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển
hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ 40 – 60
0
C .
Năm 1817 hai nhà khoa học Manaxenia (Nga) và Buchner (Đức) đã làm thí
nghiệm thành công quá trình lên men bằng chất dịch vô bào từ nấm men. Nhà sinh lý
học thực vật K.Tinniriazev đã viết “Không còn nghi ngờ gì nữa, lần đầu tiên người ta
đã chứng minh được rằng hiện tượng lên men chung quy chỉ là một quá trình hóa học,

nó có thể dễ dàng lập lại ngoài cơ thể sống nhờ những enzyme hòa tan chiết xuất từ
những tế bào đã bị phá hủy cấu trúc”.
Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là A.Payen và J.Person thu nhận
được chế phẩm enzyme amylase ở dạng kết tủa bằng cách thêm cồn vào dịch chiết từ
hạt lúa nảy mầm. Kết tủa này có khả năng phân giải tinh bột thành đường và được gọi
4
là diastase. Đây là thực nghiệm đặt nền móng cho các tiến bộ trong lĩnh vực enzyme
vào nửa sau thế kỷ 19.
Năm 1835, Berzelius lần đầu tiên đã đề ra khả năng giải thích tác dụng của
enzyme trên cơ sở hóa học. Ông gọi hiện tượng làm tăng quá trình phản ứng là sự xúc
tác và chất gây ra hiện tượng này là chất xúc tác.
Năm 1856, Pasteur đã tiến hành nghiên cứu bản chất của quá trình lên men
rượu. Theo ông, chính nấm men hay vi khuẩn lên men mà ta nhìn thấy dưới kính hiển
vi là nguyên nhân gây ra hiện tượng lên men rượu . Ông cho rằng chỉ có nấm men hay
vi khuẩn còn sống mới có thể thực hiện quá trình lên men. Từ đó dẫn đến hai khái
niệm mâu thuẫn nhau : men hữu hình (ferment hữu hình ) và men không nhìn được
(ferment hòa tan).
Năm 1862, nhà khoa học người Nga Danilevxki đã sử dụng một kỹ thuật đặc
biệt để tách chiết trypsine ra khỏi hỗn hợp với amylase trong dịch tụy bằng kỹ thuật
“phương pháp hấp thụ chọn lọc enzyme” (tức là gắn enzyme lên bề mặt chất đỡ) và
“phản hấp thụ” (nghĩa là giải phóng enzyme ra khỏi bề mặt chất đỡ) rồi kết tinh. Hiện
nay chúng ta gọi đó là một dạng của “kỹ thuật sắc ký ”.
Năm 1894, nhà khoa học người Pháp G.Bertrand phát hiện ra một loại enzyme
mới là enzyme oxy hóa với việc phát hiện ra enzyme lacasae trong nhựa mủ cây sơn ta
Rhus succedanea.
Từ những thành tựu ban đầu đó, enzyme bắt đầu được chú ý nghiên cứu nhiều
hơn vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20. Liên tiếp trong những năm 1930, 1931 hai nhà
khoa học D.Northop và M.Kunitz đã tách được pepsine và trypsine dưới dạng tinh thể.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Năm 1913, hai nhà khoa học L.Michalis và Menten đã nghiên cứu cơ chế xúc

tác nhờ enzyme có sử dụng chất đồng vị, sử dụng phương pháp quang học và phương
pháp hóa học nghiên cứu các nhóm hoạt động của enzyme đã đem lại cho chúng ta
“phương trình Michalis-Menten” nổi tiếng trong nghiên cứu động học của enzyme.
(Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Hiện nay enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn phát triển rất
nhanh trên thế giới phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành như hóa
lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học,…Hàng năm trên thế giới xuất bản
hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phương
5
pháp tách chiết và tinh chế, sự điều hòa về rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái
sinh lý và bệnh lý.
2.1.2 Định nghĩa về enzyme
Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học, do
tế bào sống tiết ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau
phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Nguyễn Tiến Thắng, 2004)
Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể
sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với
tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hướng xác định. Pavlôv đã nói : “Hoạt
động đầu tiên của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có sự sống
nào lại không có quá trình enzyme”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của
Anghen : “Sự sống, đó là phương thức tồn tại của thể protein”. (Lê Ngọc Tú và ctv,
1982).
Enzyme có trong mọi tế bào, mọi mô của mọi sinh vật nhưng mỗi loại mô, mỗi
loại tế bào thường có những hệ thống enzyme đặc biệt. Các enzyme không chỉ tham
gia xúc tác các phản ứng sinh học trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng
ngoài tế bào (in vitro). (Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp
suất thấp và nhiệt độ bình thường của cơ thể. Trong khi đó các chất xúc tác hóa học
cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Hơn nữa, các enzyme có khả năng chọn
lựa cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng.

(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Các loại enzyme trong cơ thể được tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để
sao cho các chất ban đầu được chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt
xích hoàn chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở một trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm rối loạn
cho cả hệ thống. Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzyme lại do
gen. Mỗi một gen chịu trách nhiệm điều khiển tổng hợp một enzyme. (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh học có thể tóm tắt
như sau :
 Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng
sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.
6
 Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển
hóa rất cao.
 Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản
ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
 Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.
 Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng
enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy
ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi
enzyme.
 Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay các nhà khoa
học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này
là rất nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã
biết, loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại. (Nguyễn Đức Lượng,
2002).
2.1.3 Phân loại enzyme
Khi số lượng enzyme được phát hiện còn ít, người ta đặt tên enzyme theo ý
thích từng người tìm ra nó. Dần dần theo thời gian, số lượng enzyme tìm ra ngày càng
nhiều nên cần có một hệ thống phân loại theo quy ước quốc tế. Enzyme được phân loại

theo tính chất của nó, được xếp vào từng nhóm nhỏ tương ứng với các enzyme có bản
chất tương tự nhau, làm cho việc tìm hiểu và nghiên cứu trở nên dễ dàng hơn.
Theo quy ước quốc tế, tên gọi của enzyme thường được đặt theo cơ chất đặc
hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên enzyme
thường có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân các phản
ứng. Tuy nhiên, có nhiều enzyme theo thói quen vẫn được gọi theo tên cũ, không theo
hệ thống như trypsine, pepsine.
Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme
ra làm 6 lớp và được đánh số thứ tự từ một đến sáu. Các số thứ tự này là cố định cho
mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm. Chính vì thế theo hệ
thống phân loại, mỗi enzyme thường có bốn số : số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự hai
chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzyme. Tên của các lớp, tổ và nhóm như
sau :
7
I. Oxydoreductase
a. Dehydrogenase
b. Oxydase
c. Oxygenase
d. Peroxydase
II. Transferase
a. Acyltransferase
b. Glucosyltransferase
c. Aminotransferase
d. Phosphotransferase
III. Hydrolase
a. Peptide hydrolase
b. Lipase
IV. Liase
a. Pyruvate decarboxylase
b. Fumarate hydrolase

V. Isomerase
VI. Ligase
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme
Hoạt tính xúc tác của enzyme là do cấu trúc không gian ba chiều của các
phân tử protein quyết định. Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm,
hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác.
Tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau
như nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ của các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ,
pH môi trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất
hoạt hóa enzyme. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme.
a) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng
độ enzyme. Đường biểu diễn có dạng như ở hình 2.1
8

Hình 2.1 : Đường biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng
b) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme được giữ cố định và
nồng độ cơ chất thay đổi, người ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ
chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục gia tăng, đường biểu diễn uốn cong và với
nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đường biểu diễn tiệm cận
với giá trị v
max
.
K
m
: Hằng số Michalis, là nồng độ cơ chất ứng với vận tốc bằng 1/2 vận tốc v
max

.
Hình 2.2 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất
c) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng
chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ
giảm và dẫn đến mức triệt tiêu.
Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị
giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
V
[E]
V = k[E]
V
max
[S]
v
2
Km
0
9
Ngược lại, ở nhiệt độ 0
0
C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi
đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ưu.
Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), người ta
thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tương ứng với hai hiện tượng khác nhau :
 Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 40
0
C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng.
Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng.

Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme, ở vào khoảng 45
0
C),
vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80
– 100
0
C.
Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ
chất, pH, lực ion của môi trường.
d) Ảnh hưởng của pH
Sự thay đổi pH gây nên :
 Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của
enzyme, do đó làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ
chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme.
 Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn
cản sự tạo thành enzyme – cơ chất trong trường hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở
dưới dạng ion.
Như vậy, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường. Đó là vì
pH môi trường có ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm
hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Người ta có thể xác định một giới hạn pH tối ưu cho hoạt động của một
enzyme. Ngoài pH tối ưu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng. Điều này cho thấy
tầm quan trọng của môi trường phản ứng trong quá trình nghiên cứu các phản ứng
enzyme in vitro.
Mỗi một enzyme có một pH tối ưu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2),
hoặc rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ưu của đa số các enzyme vào khoảng chung quanh giá
trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tối ưu của một enzyme cũng không cố định mà phụ
thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch
đệm, nhiệt độ.
10

2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống
2.1.5.1 Nguồn thu nhận
Enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : động vật (pepsin từ dạ
dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ
thơm…). Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất với
quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzyme nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền
kinh tế quốc dân. Như vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu
vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Enzyme thu
nhận từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa các
enzyme từ động vật và thực vật :
 Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với một lượng
lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm
cũng dễ dàng và có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công
nghiệp khác nhau.
 Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Do đó vi sinh vật có thể đồng
hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong khi đó có nhiều chất mà thực vật và động
vật không thể đồng hóa được.
 Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác.
Do vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất.
 Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ,
kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quá trình sản xuất
chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao.
 Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh
vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản, rẻ tiền như
các phụ phế liệu, phế phẩm của các nghành sản xuất.
 Ưu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cường
sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực
cao. Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trường, có khả năng thích ứng với
nguồn dinh dưỡng. Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động
lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng như

hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi
11
cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo được những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu nhận
được enzym có độ thuần khiết cao.
2.1.5.2 Vai trò
Cùng với những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lí
thuyết về enzym, các nghiên cứu ứng dụng enzym trong
thực tế ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quả cao. Các
chế phẩm enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực khác nhau như trong hoá phân tích để định tính, định
lượng các chất trong nông nghiệp, y học, công nghiệp thực
phẩm, công nghiệp dược liệu, công nghiệp nhẹ như công
nghiệp dệt, công nghiệp da.
 Trong y học có thể sử dụng enzym tinh chế để chữa bệnh, sản xuất các
sinh tố và các chất kháng sinh.
 Sử dụng chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm
nông nghiệp sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt
trước khi gieo.
 Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzym được sử dụng khá rộng
rãi trong nhiều ngành chế biến khác nhau : chế biến thịt, cá, sữa, công nghiệp sản xuất
bánh mì và các thứ bánh kẹo khác. Sử dụng chế phẩm enzym thường làm tăng nhanh
quá trình chế biến, tăng hương vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử
dụng enzym còn có thể tái tạo hương vị của các loại rau quả tươi sau khi chế biến.
Ngày nay, người ta cũng đã đạt được nhiều kết quả trong việc sử dụng một số enzyme
trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác.
2.2 Khái quát chung về enzyme protease
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá
trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử
protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid

ngắn, pepton.