Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của cây ý dĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỮU THẾ

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG SINH
HỌC CỦA CÂY Ý DĨ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỮU THẾ

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG SINH
HỌC CỦA CÂY Ý DĨ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Trần Văn Ơn
Nơi thực hiện:

Bộ môn Thực Vật – Trường ĐH
Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Trần Văn Ơn – Giảng viên Bộ môn Thực Vật, Trường Đại Học Dược Hà Nội đã
trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài
khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô TS. Hoàng Quỳnh Hoa,
ThS. Phạm Hà Thanh Tùng, DS. Nghiêm Đức Trọng, cùng toàn thể các thầy cô
giáo và các chị kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật, đã nhiệt tình chỉ bảo và giúp đỡ, tạo
điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới sự dạy dỗ, dìu dắt của các thầy cô giáo
trong nhà trường trong suốt 5 năm học vừa qua. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đặc
biệt tới bố mẹ, người thân và bạn bè đã luôn động viên tinh thần cho tôi trong suốt
thời gian học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Hữu Thế


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi

phi

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

3

1.1

Cây Ý dĩ

3

1.1.1

Vị trí phân loại của chi Coix L.

3

1.1.2

Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Coix L.

3

1.1.3

Thành phần hóa học

5

1.1.4

Tác dụng sinh học

8

1.1.5

Công dụng và sử dụng của cây Ý dĩ

10

1.2

DNA và phương pháp xác định trình tự gen

12

1.2.1

Một số tính chất và chức năng của DNA

12

1.2.2

Phương pháp xác định trình tự gen

14

1.3

Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

17

1.3.1

Sắc ký lớp nỏng hiệu năng cao

17

1.3.2

Dấu vân tay sắc ký

17

1.3.3

Ứng dụng HPTLC

18

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

19

2.1

Nguyên vật liệu, thiết bị, hoá chất

19

2.1.1

Nguyên vật liệu

19

2.1.2

Thiết bị, hóa chất

19

2.1.3

Phần mềm hỗ trợ

21

2.2

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

21

2.2.1

Nghiên cứu đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học

21

2.2.2

Nghiên cứu đa dạng về di truyền

24

2.2.3

Nghiên cứu về hóa học bằng phương pháp HPTLC

25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

27


3.1

Tính đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học

27

3.1.1

Đặc điểm hình thái của các mẫu Ý dĩ ở thời điểm ngày

27

02/05/2013

3.1.2

Đặc điểm nông học của các mẫu Ý dĩ

35

3.1.3

Kết quả nghiên cứu tính đa dạng về đặc điểm hình thái và

36

nông học

3.2

Sự khác biệt về thành phần hóa học trong hạt

38

3.3

Tính đa dạng về di truyền

40

BÀN LUẬN

42

KẾT LUẬN

45

KIẾN NGHỊ

47


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A

Adenin

C

Cystosin

CTAB

Cetyltrimethylammonium (cetrimonium) bromide

DNA

Acid deoxyribonucleic

dATP

Deoxy Adenosine Triphosphate

dCTP

Deoxy Cytidine Triphosphate

dGTP

Deoxy Guanosine Triphosphate

dTTP

Deoxy Thymidine Triphosphate

ddATP

Dideoxy Adenosine Triphosphate

ddCTP

Dideoxy Cytidine Triphosphate

ddGTP

Dideoxy Guanosine Triphosphate

ddTTP

Dideoxy Thymidine Triphosphate

ddNTP

Dideoxy Nucleoside Triphosphate

dNTP

Deoxy Nucleoside Triphosphate

EDTA

Ethylen Diamin Tetraacetic Axit

FDA

Cơ quan quản lý chất lượng thuốc và thực phẩm

GAP

Good Agricultural Practices - Thực hành tốt trồng trọt cây thuốc

HPTLC

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao

IC50

Inhibitory Concentration 50 - Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử

ITS

Internal Transcribed Spacer

KLT

Kanglaite

mARN

Messenger Acid Ribonucleic – ARN thông tin

MeOH

Methanol

Nu

Nucleotide

PCR

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

Rf

Retention Factor – Hệ số lưu trữ

STZ

Streptozocin


T

Thymin

TLC

Thin Layer Chromatography- Sắc kí lớp mỏng


Ket-noi.com

Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC BẢNG
TT

Ký hiệu

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1

Các phản ứng hóa học đặc hiệu khi thực hiện giải trình

15

tự gen bằng phương pháp Maxam và Gilbert
2

Bảng 2.1

Danh sách các mẫu nghiên cứu

19

3

Bảng 2.2

Các chỉ tiêu nông – sinh học được theo dõi

22

4

Bảng 2.3

Các bước thực hiện tách DNA từ mẫu lá Ý dĩ

24

5

Bảng 3.1

Bảng tổng kết các chỉ tiêu nông – sinh học và đặc điểm

36

hình thái để so sánh 7mẫu Ý dĩ
6

Bảng 3.2

Diện tích peak của mẫu Y1 tại Rf = 0,14; mẫu Y2 tại Rf

38

= 0,66 và mẫu Y5 tại Rf = 0,63
7

Bảng 3.3

Diện tích peak phổ HPTLC dịch chiết methanol các
mẫu Ý dĩ tại Rf = 0,69

39


DANH MỤC CÁC HÌNH
TT Ký

Tên hình

Trang

hiệu
1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Coixol và α-monolinolein

5

2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Coixenolide

6

3

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các hợp chất (4) – (8)

7

4

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của các hợp chất (9) – (13)

8

5

Hình 1.5 Thuốc tiêm Kanglaite

12

6

Hình 1.6 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS

14

7

Hình 2.1 Chậu nhựa dùng để trồng các mẫu Ý dĩ

22

8

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái mẫu Y1 (Mai Châu – Sơn La)

27

9

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái mẫu Y2 (Đà Bắc – Hòa Bình)

28

10

Hình 3.3 Thân mang lá mẫu Y3 (Đạo Trù – Vĩnh Phúc)

29

11

Hình 3.4 Thân mang lá mẫu Y4 (Hoàng Mai – Hà Nội)

29

12

Hình 3.5 Đặc điểm hình thái mẫu Y5 (Chiang Rai – Thái Lan)

30

13

Hình 3.6 Đặc điểm hình thái của mẫu Y6 (Thuận Châu – Sơn La)

31

14

Hình 3.7 Đặc điểm hình thái mẫu Y7 (Mường Thanh – Điện Biên)

32

15

Hình 3.8 Đặc điểm hình thái mẫu Y8 (Thành phố Hải Dương)

33

16

Hình 3.9 Đặc điểm hình thái mẫu Y9 (Văn Quan – Lạng Sơn)

34

17

Hình

Thân mang lá mẫu Y10 (Ba Vì – Hà Nội)

34

Các giai đoạn phát triển của cây Ý dĩ

35

3.10
18

Hình
3.11


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

19

20

Hình

Cây phân loại 7 mẫu Ý dĩ dựa trên đặc điểm hình thái và

3.12

nông học

Hình

Sắc ký đồ HPTLC của các mẫu Ý dĩ

39

Cây phân loại 9 mẫu Ý dĩ dựa trên trình tự nucleotid

41

38

3.13
21

Hình
3.14


DANH MỤC PHỤ LỤC

TT

Kí hiệu

Tên phụ lục

1

Phụ lục 1

Các chỉ tiêu nông – sinh học theo dõi được từ tháng 12/2012
đến tháng 05/2013

2

Phụ lục 2

Bảng mã hóa các biến số đặc điểm hình thái và chỉ tiêu nông
– sinh học

3

Phụ lục 3

Kết quả chồng peak sắc ký 10 mẫu Ý dĩ

4

Phụ lục 4

7 đoạn trình tự nucleotid dùng để so sánh từ ngân hàng gen
quốc tế

5

Phụ lục 5

Trình tự nucleotid của 9 mẫu Ý dĩ

6

Phụ lục 6

Độ tương đồng di truyền của 9 mẫu Ý dĩ

7

Phụ lục 7

Kết quả gióng hàng trình tự nucleotid của 9 mẫu Ý dĩ và 7
đoạn trình tự so sánh


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ý dĩ (Coix lachryma-jobi L.), họ Lúa (Poaceae), là cây thuốc đã được sử dụng
lâu đời và phổ biến trên Thế giới cũng như ở Việt Nam với nhiều công dụng. Rễ Ý
dĩ dùng để chữa viêm nhiễm đường niệu, sỏi thận, thủy thũng, phong thấp đau
xương, trẻ em ỉa chảy, bạch đới, rối loạn kinh nguyệt, kinh bế, trừ giun đũa, đau
bụng giun. Hạt Ý dĩ được dùng chữa áp-xe phổi, ruột thừa, viêm ruột ỉa chảy, phong
thấp sưng đau, loét dạ dày, loét cổ tử cung, mụn cóc, eczema. Ý dĩ là thuốc bổ và
bồi dưỡng cơ thể tốt, dùng bổ sức cho người già và trẻ em, dùng lợi sữa cho người
phụ nữ sinh đẻ. Gần đây, các nghiên cứu trong và ngoài nước đã phát hiện tác dụng
hạ đường huyết [10], [35] và tác dụng chống ung thư [29] của cây này.
Mặc dù được sử dụng phổ biến với nhiều công dụng quan trọng như vậy,
nhưng nguồn dược liệu Ý dĩ sử dụng ở trong nước chủ yếu được nhập khẩu từ
Trung Quốc. Ở miền Bắc Việt Nam, Ý dĩ chủ yếu mọc hoang và được trồng rải rác
với qui mô nhỏ, chưa đáp ứng được nhu cầu sử dụng trong nước. Vì vậy, cần phải
mở rộng qui mô trồng cây Ý dĩ theo các quy chuẩn của Thực hành tốt trồng cây
thuốc (GAP), nhưng ở miền Bắc Việt Nam có nhiều thứ/giống Ý dĩ khác nhau, với
hình thái khá giống nhau mà cho đến nay vẫn gây ra sự nhầm lẫn giữa các
thứ/giống. Mỗi thứ/giống có thể cho năng suất và chất lượng khác nhau, dẫn đến
hiệu quả kinh tế và điều trị có thể khác nhau.Vì vậy, việc xác định tính đa dạng sinh
học của cây Ý dĩ ở miền Bắc Việt Nam là cần thiết. Năm 2012, Dược sĩ Nguyễn
Kim Khanh đã nghiên cứu sự đa dạng sinh học của 6 mẫu Ý dĩ ở miền Bắc Việt
Nam. Kết quả thu được là 6 mẫu Ý dĩ ít có sự đa dạng về hóa học nhưng có sự khác
biệt về đặc điểm hình thái, nông học và di truyền [11]. Tuy nhiên nghiên cứu này
mới chỉ nghiên cứu trên 2 thứ là: Coix lachryma-jobi L. var. lachryma-jobi và Coix
lacryma-jobi L. var. stenocarpa Oliv.
Do đó đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của cây Ý dĩ” được tiếp tục
thực hiện với 2 mục tiêu chính là:
1. Xác định tính đa dạng về đặc điểm hình thái, nông học và di truyền của

một số giống Ý dĩ.


2

2. Khảo sát sự khác biệt về thành phần hóa học trong hạt của một số giống
Ý dĩ bằng phương pháp HPTLC.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Cây Ý dĩ
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Coix L.
Chi Coix L. thuộc họ Lúa (Poaceae), bộ Lúa (Poales), phân lớp Hành
(Liliidae), lớp Hành (Liliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) [3].
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Coix L.
Cây thảo sống hàng năm hay lâu năm. Thân mọc thẳng đứng cao 1,5 – 2m,
phân nhánh ở những ngọn có hoa. Ở gốc thân có nhiều rễ phụ. Lá mọc so le, mặt lá
ráp, gân lá song song không có cuống. Hoa đơn tính cùng gốc. Bông hoa đực ngắn
màu lục nhạt trông tựa một nhánh của bông lúa; hoa cái nằm trong một lá bắc dày
và cứng, từ màu xanh chuyển sang màu nâu đến tím đen. Quả hình trứng hơi nhọn
đầu (thường gọi nhầm là nhân) được bao bọc bởi một lá bắc cứng (thường gọi nhầm

là vỏ) [5], [18].
Bộ phận dùng: Hạt (Semen Coicis), thường gọi là Ý dĩ nhân. Rễ, lá cũng được
dùng [5].
Phân bố: Mọc phổ biến ở vùng nhiệt đới, đặc biệt là châu Á nhiệt đới, mọc
hoang ở ven bờ nước, nơi ẩm như bãi, ruộng. Cây cũng được trồng chủ yếu bằng
hạt [5].
Mùa hoa quả: Tháng 5 - 12 [2].
Ở Việt Nam, đã xác định Ý dĩ có 4 thứ sau: [5], [9]
- Coix lachryma-jobi L. var. lachryma-jobi - Cườm gạo: Cây cỏ sống nhiều
năm, thân có đường kính 8-10mm. Lá phẳng, cuống dài 40-50cm, rộng 4-5cm, gân
giữa to, gân bên rất mảnh; bẹ nhẵn, lưỡi nhỏ 1mm. Cụm hoa ở ngọn nhánh. Bông
chét đực ở trên, dài 6-7cm. Nhị vàng. Bông chét cái ở dưới, có bao hình bầu, dài 89mm, đường kính 6mm, khi chín nâu đen rồi trắng, rất cứng. Thứ này mọc ở các đất
hoang đến vùng nước lợ.
- Coix lacryma-jobi L. var. mayuen (Rom) Stapf (C.chinensis Todaro ex
Balansa) – Ý dĩ, Bo bo: Cây cỏ sống hàng năm. Thân phân nhánh, nhẵn, to, xốp,
cao 1-2m. Lá phẳng, thuôn dài, hình tim ở gốc, nhọn đầu, dài 10-50cm, gân giữa


4

lớn nổi rõ, gân bên rất mảnh; bẹ lá nhẵn, kéo dài, thường rất rộng. Cụm hoa là bông
mọc thẳng đứng, có cuống. Hoa đơn tính cùng gốc. Bông chét đực mọc chụm 2-3
chiếc một chỗ trên cuống chung mảnh, có mày cứng bao bọc. Bông chét cái hình
bầu dục; lá bắc rất dày, cứng mà trắng nhạt hay xanh xám. Quả hình cầu hay hình
bầu dục, có vỏ dạng giấy hay hóa cứng. Phân bố Ấn Độ, Việt Nam, Lào, Indonexia,
Philippin. Ở Việt Nam, cây mọc hoang và cũng được trồng, thường gặp ở các bờ
nước, nơi đất ẩm ven rừng, ven đường. Ra hoa từ tháng 7 đến tháng 12.
- Coix lacryma-jobi L. var. puellarum Balansa (C.puellarum Balansa) – Bo
bo dại, Cườm gạo: Cây cỏ sống nhiều năm, cao trên 50cm, phân nhánh nhiều, ruột
xốp, nhẵn. Lá mềm, phẳng, mép nhăn nheo, đầu nhọn, gốc hình tim, gân mảnh nổi

rõ cả 2 mặt; bẹ lá nhẵn, thuôn dài. Cụm hoa ở nách lá hay ngọn thân. Bông chét đực
ở trên đỉnh, hợp với cuống chung xếp sát nhau; mày bóng, cứng. Bông chét cái có lá
bắc cứng bao bọc, màu trắng tím, bóng. Quả có lá bắc phát triển ôm lấy toàn bộ
phần bên trong nhỏ bé, hình cầu,bóng, cứng rắn. Cây mọc hoang ở ven đồi thấp ẩm,
ven bờ nước hoặc ở trên các rẫy. Ra hoa quả gần như quanh năm.
- Coix lacryma-jobi L. var. stenocarpa Oliv: Cây cỏ sống nhiều năm, sống
trên cạn hay dưới nước. Thân nổi hay nằm, có rễ ở mắt dài đến 30m. Lá có phiến,
dài 30 – 90cm, rộng 2 – 4cm, mặt trên có lông; cuống không lông. Hoa mọc ở kẽ lá,
với bông chét đực thòng, màu xanh. Bông chét đực mọc chụm 3 chiếc một chỗ trên
cuống chung mảnh. Quả cứng, màu vàng hay nâu.
Năm 2012, Nguyễn Kim Khanh đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng sinh học
của 6 mẫu Ý dĩ, chủ yếu là các giống hoang dại có nguồn gốc từ 6 tỉnh ở miền Bắc
Việt Nam (Hà Nội, Quảng Ninh, Điện Biên, Bắc Giang, Hòa Bình, Lạng Sơn). Các
mẫu Ý dĩ được gieo trồng trong cùng một điều kiện và trong cùng một mùa vụ tại
Vườn thực vật Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, và được nghiên
cứu xác định tính đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học, tính đa dạng về di
truyền và tính đa dạng về hóa học. Kết quả là 6 mẫu Ý dĩ có sự khác biệt và được
chia thành 3 nhóm; nhóm 1 gồm các mẫu Ba Vì – Hà Nội, Sơn Động – Bắc Giang
và Văn Quan – Lạng Sơn; nhóm 2 gồm các mẫu Ba Chẽ - Quảng Ninh và Mường


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
5

Thanh - Điện Biên và nhóm 3 gồm mẫu Đà Bắc - Hoà Bình. Tuy nhiên, số lượng
mẫu nghiên cứu còn ít (6 mẫu); sự khác biệt dựa trên đặc điểm hình thái và nông
học không tương đồng với sự khác biệt về di truyền; dựa trên thành phần hoá học,
các mẫu Ý dĩ nghiên cứu không khác biệt rõ ràng về thành phần, nhưng sai khác rõ
ràng về hàm lượng [11].
1.1.3. Thành phần hóa học
Quả Ý dĩ chứa 50 – 79% tinh bột, 16 – 19% protein, 2 - 7% dầu béo, lipid
(5,67% glycolipid, 1,83% phospholipid, sterol…), thiamin, acid amin, adenosine,
chất vô cơ,… ; coixenolid (khoảng 0,25%), coixol, α-monolinolein (Hình 1.1) [2].
Rễ Ý dĩ chứa 17,6% protein, 7,2% chất béo, 52% tinh bột, benzoxazolon (chất
có tác dụng chống viêm rõ) [16], [2].
Vỏ quả chứa alcohol coniferyl, acid syringic, acid ferulic, syringaresinol, 4ketopinoresinol và mayuenolide [28].
7

MeO
6

1
9

O
2

5

8
4

O

N3
H

1. Coixol

2. α-monolinolein

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Coixol, α-monolinolein
1.1.3.1. Coixenolide [36]
Năm 1960, Tyunosin Ukita và cộng sự đã tách chiết được coixenolide từ dịch
chiết aceton của hạt Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf). Bột nhân hạt Ý
dĩ được chiết với aceton ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành phân lập và tinh chế
bằng sắc ký cột silicagel thu được hợp chất có công thức C38H70O4, n20D=1.4705,
[α]20D=0o. Hợp chất này có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u được gọi là
coixenolide (Hình 1.2).


6

3. Coixenolid
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Coixenolid
1.1.3.2. Các coixan [35]
Năm 1986, Takahashi và cộng sự đã phân lập được coixan A, B, C từ dịch
chiết hạt cây Ý dĩ (Coix lacryma-jobi var. ma-yuen). Bột nhân hạt Ý dĩ được chiết
với nước ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành sắc ký cột để tách riêng các hợp chất
coixan A, B, C. Xác định cấu trúc coixan A, B, C bằng các phương pháp phân tích:
H-NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton), 13C-NMR (phổ cộng hưởng từ hạt

1

nhân 13C).
1.1.3.3. Các hợp chất lactam [29]
Năm 2008, Ming-Yi Lee và cộng sự đã tìm ra 5 hợp chất ức chế tế bào ung
thư từ dịch chiết methanol thân Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf) là:
Coixspirolactam A (4), coixspirolactam B (5), coixspirolactam C (6), coixlactam (7)
và methyl dioxindol – 3 – acetat (8). Bột thân Ý dĩ được chiết bằng methanol, cắn
tạo thành được lắc với các dung môi: n-hexan, ethyl acetat và n-butanol. Năm hợp
chất trên phân lập từ phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký cột silicagel và được tinh
chế bằng HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) trên cột Si – 60 Lichrosorb. Dựa vào
các phương pháp phân tích quang phổ gồm IR (phổ hồng ngoại), 1H-NMR (phổ
cộng hưởng từ hạt nhân proton), 13C-NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C), 2DNMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều) và MS (phổ khối) người ta xác định
cấu trúc của 5 hợp chất đó (Hình 1.3).


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
7

7

7

7

7a

6

NH
2

5

3a
4

7a

6

1

5

3a

10
9

5

3

4. Coixspirolactam A

8

10

4
11
CH3 9

O

O

3

3a

8

H

O

O

10

4

O

2

2

8

1

1

O

3

NH

7a

6

NH

H

H3C
11

O

O

5. Coixspirolactam B

9

O

6. Coixspirolactam C
O

O
HO
5

8

4
9

4a

6

9

4

OCH3

3

3a

5

OCH3

3
2

2

7

8a
8

1

N
H

7. Coixlactam

O

6

7a
7

O

1

N
H

8. methyl dioxindol – 3 – acetat

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của các hợp chất (4) – (8)
1.1.3.4. Các hợp chất có tính acid [34]
Năm 1994, Numata M và cộng sự từ dịch chiết aceton của nhân hạt Ý dĩ đã
tìm thấy các thành phần có tác dụng ức chế sự tăng trưởng khối u trên chuột. Các
thành phần này được tách riêng bằng sắc ký cột silicagel và được xác định cấu trúc
bằng các phương pháp phân tích: Quang phổ hồng ngoại và sắc ký lỏng - khí. Các
thành phần này được xác định là 4 acid béo: Acid palmitic, acid stearic, acid oleic
và acid linoleic.
1.1.3.5. Coixol và các hợp chất benzoxazinones [33]
Năm 1985, Nagao và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất benzoxazinones (9)
– (13) và coixol (1) từ phân đoạn chloroform của dịch chiết methanol rễ cây Ý dĩ
(Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf). Hợp chất (9) là 2-hydroxy-7-methoxy1,4(2H)-benzoxazin-3-one. Hợp chất (10) là 2-O-β-D-glucopyranoside. Hợp chất
(11)

là

2-O-β-glucopyranosyl-4-hydroxy-7-methoxy-1,4(2H)-benzoxazin-3-one.


8

Hợp chất (12) là 2-O-β-glucopyranosyl-4,7-dimethoxy-1,4(2H)-benzoxazin-3-one.
Hợp chất (13) là 2-O-β-glucopyranosyl-7-hydroxy-1,4(2H)-benzoxazin-3 (Hình
1.4).
R5
12

R4

OR2

1

8

O

7

2

10

R2

R3

R4

R5

9

H

H

OMe

H

10

Glc

H

OMe

H

11

Glc

OH

OMe

H

12

Glc

OMe

OMe

H

13

Glc

H

OH

H

3
6

9
5

N4

O

R3

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của các hợp chất (9) – (13)
1.1.4. Tác dụng sinh học
1.1.4.1. Tác dụng chống ung thư
Năm 2008, Ming-Yi Lee và cs đã nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào khối u
từ thân Ý dĩ và 5 hợp chất lactam được tách từ dịch chiết MeOH thân Ý dĩ (Coix
lacryma-jobi L. var. ma-yuen). Các ông đã tiến hành thí nghiệm trên các dòng tế
bào là A549 – ung thư phổi ở người, HT – 29 (Ung thư tế bào biểu mô trực tràng ở
người) và COLO 205 – ung thư tế bào biểu mô ruột bằng phương pháp thử MTT (3
– 4,5 – dimethylthiazol – 2 – yl – 2,5 – diphenyl tetrazolium bromid). Kết quả cho
thấy dịch chiết thân Ý dĩ ở các phân đoạn và 5 hợp chất phân lập được đều có tác
dụng ức chế tế bào ung thư. Tuy nhiên, phân đoạn ethyl acetat có tác dụng ức chế
mạnh hơn các phân đoạn còn lại (IC50 trong phân đoạn ethyl acetat từ 82% đến
153%) [29].
Dịch chiết cồn bột Ý dĩ cũng được báo cáo là làm giảm có ý nghĩa số lượng
các tiểu nang bất thường tiền ung thư [30].
1.1.4.2. Tác dụng hạ đường huyết


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
9

Năm 1986, Michiko Takahashi và cs đã phân lập được 3 chất là coixan A, B
và C từ hạt của Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen) và đã chỉ ra rằng dịch
chiết hạt Ý dĩ và 3 chất này có tác dụng hạ đường huyết trên chuột [35].
Năm 2009, ThS. Phùng Thanh Hương và cs đã nghiên cứu tác dụng hạ đường
huyết của dịch chiết thân Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf) trên chuột
bình thường, chuột tiêm STZ (Streptozocin) và chuột tiêm adrenalin (Liều 20g dược
liệu khô/kg). Kết quả thu được như sau:
- Trên chuột bình thường: Sau khi cho uống dịch chiết thân cây Ý dĩ và tiến
hành xác định nồng độ glucose huyết của lô chứng và lô thử ở thời điểm 0h, 1h, 2h,
3h, 4h và 5h thấy glucose huyết không thay đổi theo thời gian.
- Trên chuột tiêm STZ: Sau khi tiêm STZ 72h, định lượng glucose huyết lúc
đói của chuột, sau đó cho chuột uống dịch chiết Ý dĩ và sau 10 ngày định lượng lại
nồng độ glucose huyết của lô chứng và lô thử. Tiến hành song song với lô chứng
uống nước cất. Kết quả cho thấy nồng độ glucose ở lô thử giảm khoảng 36%. Như
vậy dịch chiết thân Ý dĩ có tác dụng hạ glucose huyết trên chuột tiêm STZ.
- Trên chuột tiêm adrenalin: Chuột nhịn đói 12h được cho uống dịch chiết.
Sau 3h tiêm adrenalin với liều 0.6mg/kg, định lượng glucose huyết ở thời điểm
trước khi tiêm và sau khi tiêm 60ph. Tiến hành song song với lô chứng uống nước
cất. Kết quả cho thấy sau khi tiêm adrenalin liều 0.6mg/kg, glucose huyết của chuột
ở cả 2 lô đều tăng, nhưng ở lô uống dịch chiết, mức tăng glucose huyết (~72%) thấp
hơn lô chứng (~125%). Như vậy, dịch chiết thân Ý dĩ có tác dụng hạn chế tăng
glucose huyết bởi tác nhân adrenalin [10].
1.14.3. Tác dụng chống viêm
Năm 2009, Din – Wen Huang và cs đã điều tra những ảnh hưởng của dịch
chiết vỏ hạt Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf) trên lipopolysaccharide
gây ra đáp ứng viêm tại đại thực bào RAW 264.7 và cho thấy dịch chiết vỏ hạt Ý dĩ
có tác dụng chống viêm do chúng chống lại sự gia tăng sản sinh tế bào của nitric
oxide và prostaglandin E2 gây ra bởi lipopolysaccharide bằng cách làm giảm sự sản
xuất ra các enzym nitric dioxide synthase và cyclooxygenase [25].

10

1.1.4.4. Các tác dụng khác :
• Tác dụng hạ mỡ máu [21], [24], [27].
• Tác dụng chống dị ứng [20], [23].
• Tác dụng co rút tử cung trong thai kỳ: Dịch chiết nước hạt Ý dĩ có khả năng
làm nhiễm độc thai nhi và co rút tử cung trong thời gian mang thai [37].
• Tác dụng trên hệ nội tiết : Dịch chiết methanol làm giảm bài tiết
progesterone, dịch chiết methanol thân Ý dĩ làm giảm tiết testosterol [22].
1.1.5. Công dụng và sử dụng của cây Ý dĩ
1.1.5.1. Tính vị, quy kinh, công năng, chủ trị [14]
- Theo Y học cổ truyền, Ý dĩ có vị ngọt, nhạt, tính hơi hàn; quy vào 5 kinh
Tỳ, Vị, Phế, Can, Đại tràng.
- Công năng chủ trị:
• Lợi thủy: Dùng để trị các bệnh phù thũng, tiểu tiện khó khăn, đái buốt.
Dùng hạt hoặc cây, lá, rễ, sắc uống.
• Kiện tỳ hóa thấp: Dùng để trị bệnh tỳ hư, tiêu hóa kém, tiết tả. Ý dĩ sao
vàng cùng với một số vị thuốc khác trong bài Phì nhi cam tích, dùng tốt
cho trẻ em.
• Trừ phong thấp, đau nhức, phối hợp với Ma hoàng, Phòng kỷ, Mộc thông.
• Thanh nhiệt độc, trừ mủ: Dùng điều trị chứng phế quản hóa mủ (áp xe
phổi). Rễ Ý dĩ kết hợp với Lô căn, Đào nhân, Diếp cá.
• Thư cân giải kinh: Dùng khi chân tay bị co quắp.
• Giải độc tiêu viêm: Dùng Ý dĩ trong bệnh viêm ruột thừa. Phối hợp với
Kim ngân hoa trong bệnh nổi mụn ở mặt, trứng cá. Hạt Ý dĩ nấu cháo ngày
10g, hoặc phối với thuốc thanh nhiệt giải độc.
1.1.5.2. Sử dụng
Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là hạt, còn gọi là Dĩ mễ, Dĩ nhân, Ý dĩ nhân,
hạt Bo bo, Bo bo... Ngoài ra, người ta còn dùng thân, rễ để làm thuốc [12].

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
11

Do có lượng protid, chất béo và tinh bột khá cao nên quả Ý dĩ được coi là
nguồn lương thực có giá trị, đồng thời là một vị thuốc quý. Ý dĩ thường được dùng
chữa rối loạn tiêu hóa, phù thũng, bí đái, trường ung, tả lỵ, đau bụng, phong thấp
lâu ngày không khỏi, gân co quắp khó vận động. Nhân dân Việt Nam thường dùng
Ý dĩ làm thuốc bồi dưỡng cơ thể, nhất là đối với trẻ em. Dược liệu thường có mặt
trong nhiều đơn thuốc và biệt dược, như 54.5% trong bột bổ tỳ trừ giun, 40% trong
bột cam trẻ em và 10% trong viên Phì nhi liên hoàn hoặc kẹo bổ tỳ. Ý dĩ hầm với
hạt Sen và thịt nạc là món ăn – vị thuốc cho những người cơ thể gầy yếu, suy dinh
dưỡng [2].
Liều dùng 8 – 30g. Thường dùng dưới dạng thuốc sắc. Dùng riêng hay kết hợp
với các thuốc khác.
1.1.5.3. Một số bài thuốc trong Y học cổ truyền
• Chữa trường ung bụng trướng đầy tiểu tiện khó: Ý dĩ, Qua lâu nhân, mỗi vị
6 – 9g; Mẫu đơn bì, Đào nhân, mỗi vị 6g. Sắc nước uống [2].
• Chữa thủy thũng: Ý dĩ, Xích tiểu đậu, Đông qua bì, mỗi vị 30g; Hoàng kỳ,
Phục linh, mỗi vị 15g. Sắc nước uống [2].
• Chữa tiểu tiện ra máu: Ý dĩ 20g, nước 600ml, sắc đến khi còn 20ml.
Uống liên tục cho đến khi thấy tiểu tiện bình thường là được [12].
• Chữa bệnh phổi, nôn ra máu: Ý dĩ 40g, nước 400ml (2 bát) sắc còn

1 bát (200ml) thêm ít rượu vào uống làm 2 lần trong ngày. Uống luôn 10
ngày [12].
• Bổ, chữa lao lực: Ý dĩ 5g, Mạch môn đông 3g, Tang bạch bì 3g, Bách bộ
3g, Thiên môn đông 3g, nước 600ml. Sắc còn 200ml chia làm 3 lần uống
trong ngày [12].
• Chữa tê thấp: Ý dĩ nhân 40g, Thổ phục linh 20g, nước 600ml sắc còn
200ml. Chia làm 2 lần uống trong ngày. Uống liền 10 ngày nếu thấy tiểu
tiện nhiều là bệnh giảm [12].
1.1.5.4. Một số sản phẩm từ Ý dĩ


12

Thuốc tiêm Kanglaite (KLT) (Hình 1.5) [38] là thuốc chống ung thư mới được
chiết xuất từ hạt Ý dĩ. FDA (Cơ quan quản lý chất lượng thuốc và thực phẩm) của
Hoa Kỳ đã phê duyệt giai đoạn II thử nghiệm của KLT để kiểm tra hiệu quả của nó
trong điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ. Một số nghiên cứu cho thấy nó
có thể ức chế một số gen chống quá trình tự diệt tế bào và kích hoạt một số gen tiền
tự diệt tế bào.

Hình 1.5. Thuốc tiêm Kanglaite
Thuốc tiêm này có thể ức chế đáng kể nhiều loại tế bào ung thư khác nhau, do
đó, nó đã trở thành phần cốt lõi của nghiên cứu là làm thế nào để tiếp tục khám phá
thuốc tiêm KLT để thúc đẩy sự tự hủy diệt tế bào khối u bằng cách tác động lên các
gen có liên quan [31].
Thuốc tiêm KLT ức chế sự tăng trưởng tế bào HepG2 bằng cách gây chết tế
bào thông qua sự kích hoạt con đường Fas/FasL [32].
Tóm lại, các nghiên cứu trong nước và ngoài nước đã nghiên cứu nhiều tác
dụng và công dụng của cây Ý dĩ, chủ yếu trên thứ Coix lachryma jobi L. var.
mayuen và nghiên cứu trên thân và hạt. Về đa dạng sinh học của cây Ý dĩ, ở nước

ngoài đã nghiên cứu đa dạng các mẫu Ý dĩ dựa vào dấu vân tay DNA, hay dấu vân
tay TLC [26]. Ở Việt Nam đã có đề tài nghiên cứu đa dạng sinh học cây Ý dĩ với
các chỉ tiêu dấu vân tay DNA, dấu vân tay TLC và đặc điểm hình thái, nông học
[11].
1.2. DNA và phương pháp xác định trình tự DNA [6], [8], [15]
1.2.1. Một số tính chất và chức năng của DNA
Cấu tạo của DNA đảm bảo cho nó thực hiện chức năng "giữ" được thông tin
di truyền.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
13

DNA là 1 chuỗi xoắn kép. Trên mỗi mạch đơn của DNA các Nu liên kết với
nhau bằng liên kết phophodieste bền vững. Trên 2 mạch của DNA, các Nu liên kết
với nhau bằng liên kết cộng hóa trị theo nguyên tắc bổ sung. A liên kết với T bằng 2
liên kết H, G liên kết với C bằng 3 liên kết H (tuy liên kết H không bền, dễ dàng bị
cắt đứt bởi 1 loại enzym trong quá trình tháo xoắn nhưng với số lượng Nu lớn →
làm cho cấu trúc không gian ổn định). Từ 4 loại Nu nhưng do sự sắp xếp khác nhau,
số lượng và thành phần khác nhau, tạo ra sự đa dạng của các phân tử DNA ở các
loài sinh vật khác nhau.
Tính chất của DNA đảm bảo nó " truyền đạt" được thông tin di truyền: DNA
có khả năng tự nhân đôi, nhờ vậy NST sẽ nhân đôi đảm bảo thông tin di truyền
được truyền đạt qua các thế hệ sau. DNA chứa các gen cấu trúc, các gen này có khả

năng phiên mã để tạo mARN rời từ đó hình thành protein, quy định tính trạng cho
sinh vật.
DNA có khả năng đột biến, hình thành những thông tin di truyền mới, các
thông tin di truyền này tự nhân đôi nhờ cơ chế tái bản của DNA.
DNA có sự biến tính thuận nghịch: Khi dung dịch DNA bị đun nóng trên
nhiệt độ riêng thì cấu trúc tự nhiên bị phá hủy, hai chuỗi bổ sung tách khỏi nhau
và tạo ra cấu trúc đơn xoắn ngẫu nhiên. Nếu làm lạnh nhanh và duy trì nhiệt độ
khoảng 25°C dưới Tm trong một khoảng thời gian nhất định thì hai sợi đơn DNA
biến tính sẽ bắt cặp trở lại theo nguyên tắc bổ sung.
Trong cả chuỗi ADN nhân của tế bào thực vật, khu vực được nghiên cứu
nhiều nhất là vùng ADN ribosom 18S-26S và vùng phiên mã nội (Internal
Transcribed Spacer – ITS) với nhiều đoạn lặp về trình tự nucleotid . Vùng phiên mã
nội ITS của ADN ribosom (ITS-rADN) được sử dụng phổ biến trong các nghiên
cứu phân loại loài của thực vật. Vùng ITS có 3 phần: ITS1, 5.8S và ITS2 (Hình 1.6)
với kích thước thay đổi từ 500 đến 700bp.


14

26S ADNr nhân

18S ADNr nhân

Vùng ITS
Hình 1.6. Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS
Trình tự nucleotid vùng ITS đã được nghiên cứu nhiều và số lượng các trình
tự nucleotid của vùng này đã được công bố trong ngân hàng gen quốc tế khá phong
phú, thuận lợi cho phân tích so sánh. Vùng ITS có ưu điểm là: Vùng ITS có độ lặp
lại cao trong ADN nhân của thực vật, sản phẩm PCR của ADN nhân có thể sử dụng
cho thông tin nghiên cứu phát sinh loài của nhiều loài, và vùng ITS có kích thước

nhỏ và tính bảo thủ cao nên dễ dàng khuếch đại.
1.2.2. Phương pháp xác định trình tự gen
1.2.2.1. Khái niệm
Phương pháp giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị
trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử DNA.
1.2.2.2. Nguyên tắc: Dựa trên 1 trong 2 nguyên tắc sau
- Nguyên tắc hóa học: Dựa vào các phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu phân
tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.
- Nguyên tắc enzym học: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần
xác định nhờ ADN polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotid cùng
với các deoxynucleotid thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một
tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau.
1.2.2.3. Các phương pháp giải trình tự gen
a. Phương pháp Maxam và Gilbert
- Phương pháp này được thực hiện dựa theo nguyên tắc hóa học.
- Các bước thực hiện: