Đặc điểm của đoạn gen mã hóa protein vỏ phân lập từ soybean mosaic virus

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả
cùng cộng tác với các

trong nhóm nghiên cứu. Các số liệu và kết

quả trình bày trong luận văn là trung thực, mọi trích dẫn trong luận văn đều
ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Hải Yến

XÁC NHẬN CỦA

XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG

KHOA CHUYÊN MÔN

DẪN KHOA HỌC

GS.TS. Chu Hoàng Mậu


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành
Đại học Tây Bắc. Xin cảm ơn t

NCS. Lò Thị Mai Thu, giảng viên Trường
cán bộ Phòng Công nghệ

,

Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen, Viện Công nghệ
sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp
đỡ tôi trong quá trình thực hiện

thí nghiệm của đề tài.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn

thầy cô Bộ môn Di truyền&Sinh

học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi bày tỏ lời cảm ơn đến các đồng nghiệp, bạn bè cùng toàn
thể gia đình đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Thái Nguyên, ngày 03 tháng 06 năm 2014
Tác giả

Hoàng Thị Hải Yến


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan ........................................................................................................ i
Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii

Mục lục ............................................................................................................... iii
Danh mục các chữ viết tắt .................................................................................. iv
Danh mục các bảng.............................................................................................. v
Danh mục các hình ............................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 3
TƯƠNG ............................................................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây đậu tương ....................................................... 3
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tương .............................................................. 4
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam ....................... 5
BEAN MOSAIC
VIRUS (SMV) ..................................................................................................... 8
1.2.1. Bệnh virus hạ

........................................................................... 8
, kí chủ

1.2.3. Triệu chứng của bệ

ế truyền bệnh ............... 11

...................................................... 13

1.2.4. Biện pháp phòng trừ ................................................................................ 14
................................................................................... 15
...................................................................... 15
1.3.2. Protein vỏ (CP) và gen mã hóa protein vỏ của SMV .............................. 17

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 19
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

.......... 19

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 19
2.1.2. Hoá chất và thiết bị .................................................................................. 19
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu................................................................................ 19
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 20
2.2.1. Phương pháp thu mẫu .............................................................................. 20
......................................................... 20
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 29
3.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU.................................................................... 29
CP
CP

...................... 30
........................................................... 30
CP .............................. 32

3.3.

Ự ĐA DẠNG CỦA CÁC DÒNG SMV ............................ 40
CP .... 40
ễn từ
CP....................................................................................................... 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 45

1. Kết luận.......................................................................................................... 45
2. Đề nghị........................................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 46


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
DNA

: Deoxyribonucleic Acid

RNA

: Ribonucleic Acid

bp

: Cặp bazơ

cDNA : Sợi bổ sung DNA (Complementary DNA) tổng hợp từ
mARN nhờ Enzym phiên mã ngược
CP
: Coat protein
cs

: cộng sự

DEPC : Diethy pyrocarbonate
dNTP : Deoxynucleotide
Kb

: Kilo bazơ

LB

: Luria Bertani

PCR

: Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi
polymerase
: Reverse trancriptase - Polymerase chain reaction (PCR
ngược)

RTPCR
Rase

: Ribonuclease

SMV

: Soybean mosaic virus

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside

IPTG

: isopropylthio-β-galactoside

RNAi

: RNA interference

TN

: Thái Nguyên

SL3

:


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam giai đoạn 2008 - 2012 ........7
Bảng 1.2. Một số virus gây bệnh trên đậu tương .................................................11
2.1.

..............................22

Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ........................................23
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR ...........................................................23
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .........................................................23
Bảng 2.5. Thành phần gắn gen CP vào vector tách dòng pBT ............................25
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng colony – PCR ...................................................27
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng colony - PCR........................................27
Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa trình tự đoạn gen CP của SMV dòng SL3 so
với

trình

tự

có

mã

số

X63771

................................................................36
Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn từ gen CP phân
lập từ SMV dòng SL3 và trình tự amino acid của protein có mã số
CAA45307.............................................................................................38
CP
............41
gen CP

........................................................................41

Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự amino
CP

.............................43


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 1.1. Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV ........................................ 16
Hình 1.2. Hình ảnh 3D protein vỏ của SMV ............................................. 17
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT ..................................................................... . 25
Hình 3.1. Hình ản
........................................................................ . 29
sản phẩm PCR trên gel agarose .......... 31
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc ............... 33
Hình 3.4. So sánh trình tự đoạn gen CP

3 thu tại

tỉnh Sơn La và trình tự gen CP của dòng virus SMV được đăng ký
GenBank có mã số X63771 ....................................................... . 35
Hình 3.5. So sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen CP phân lập từ SMV
dòng SL3 và trình tự amino acid của protein có mã số CAA45307
trên GenBank ............................................................................. . 36
protein có mã số CAA45307 trên GenBank ................................. 37
Hình 3.7. Kết quả so sánh bằng Nucleotide blast của đoạn gen CP của
SMV dòng SL3 trên NCBI.......................................................... . 39
Hình 3.8. Kết quả so sánh bằng Protein blast của trình tự amino acid suy
diễn từ gen CP của SMV dòng SL3 trên NCBI ............................ 40
CP .................................................... 42
Hình 3.10. Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự amino acid suy diễn từ
gen CP của 10 dòng SMV .......................................................... . 43


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có
giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao. Tỉ lệ khối lượng các chất khô

trong hạt đậu tương có đến 30 - 45% protein với đầy đủ và cân đối các loại axit
amin cần thiết, 19 - 25% lipit, 20% gluxit, 4 - 5% chất khoáng và các vitamin
(B1, B2, C, D, E, K...). Hạt đậu tương cung cấp nguồn dinh dưỡng phong phú
cho con người và động vật. Rễ đậu tương có nốt sần chứa vi khuẩn có khả năng
cố định nitơ không khí, vì vậy trồng đậu tương góp phần cải tạo đất và bảo vệ
môi trường. Với những giá trị to lớn đó, cây đậu tương được đánh giá là cây
trồng quan trọng trong sản xuất nông nghiệp và đời sống xã hội nhiều nước
trên thế giới. Hiện nay ở Việt Nam, cây đậu tương chiếm một vị trí rất quan
trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp, được gieo trồng ở cả 7 vùng nông
nghiệp trên cả nước với mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho người và
gia súc, xuất khẩu và cải tạo đất.
Những năm gần đây, năng suất đậu tương bình quân của thế giới và của
nước ta bị giảm sút đáng kể do nhiều nguyên nhân như tác động xấu của môi
trường, sâu bệnh, chất lượng hạt giống, kỹ thuật canh tác… Trong những
nguyên nhân trên, các bệnh do nhiễm virus đã gây tổn thất lớn về năng suất,
chất lượng đậu tương và hiện nay vẫn chưa có biện pháp hiệu quả để phòng
trừ. Đậu tương là cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, như bệnh khảm
(Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng (Bean yellow mosaic virus BYMV), bệnh xoăn lá và một số bệnh virus khác.
Soybean mosaic virus (SMV) là một trong những loại virus gây bệnh
nghiêm trọng nhất ở cây đậu tương. Sau khi nhiễm SMV, đậu tương sẽ suy giảm
khả năng sinh trưởng, phát triển, giảm năng suất và chất lượng hạt. Nghiên cứu
hệ gen của SMV sẽ cung cấp những gợi ý để xác định các yếu tố quyết định đến


triệu chứng bệnh khảm lá ở cây đậu tương, từ đó nghiên cứu tạo cây đậu tương
kháng virus phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tương sạch bệnh.
Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi lựa chọn và tiến hành đề tài: “Đặc
điểm của

gen mã hóa protein vỏ

Soybean mosaic virus”.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được đặc điểm

trình tự

-coat

CP phân lập từ SMV gây bệnh khảm lá ở

cây đậu tương.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thu thập

mẫu lá đậu tương nhiễm SMV từ

vùng trồng đậu

tương hai tỉnh Sơn La và Thái Nguyên.
3.2. Tách chiết RNA tổng số, tạo cDNA và nhân bản

gen CP từ hệ gen

của SMV.
3.3. Tách dòng và xác định trình tự

gen CP mã hóa protein vỏ của SMV.

3.4. So sánh trình tự nucleotide của

gen CP; trình tự amino acid

poty-coat trong protein do đoạn gen CP mã hóa

được với

trên GenBank.
3.5.
trình tự nucleotide của
-coat trong protein do

gen CP; trình tự amino acid

gen CP mã hóa.


Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
TƯƠNG
Cây đậu tương (Glycine max L. Merill) là một trong những loài cây
trồng được biết đến rất sớm. Đậu tương được thuần hoá đầu tiên ở Trung Quốc
vào khoảng thế kỉ XVII trước công nguyên. Từ Trung Quốc, đậu tương được
đưa đến Triều Tiên, Nhật Bản, Nga sang Nam Á và Đông Nam Á qua con
đường tơ lụa. Ở Việt Nam, đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các
tỉnh thuộc khu vực trung du, miền núi phía Bắc và miền Đông Nam Bộ [1], [2].
Về phân loại thực vật học, cây đậu tương hay còn gọi là đậu nành, tên

khoa học Glycine max (L.) Merill (2n= 40) thuộc họ đậu (Lengunoceace), họ
phụ cánh bướm (Papilinoideae) (Hymowitz và Newell, 1981). Các giống đậu
tương trồng ở Việt Nam thuộc loài Glycine max (L.) Merill (2n= 40) trong
giống phụ G.Soya, giống Glycine thuộc họ đậu (Lengunoceace) họ phụ cánh
bướm (Papilinoideae)[1]. Đối với đậu tương trồng có thể phân loại theo đặc
điểm thực vật học, dựa theo thời gian sinh trưởng, theo thời vụ.
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây đậu tương
Đậu tương là loại cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính như: rễ,
thân, cành, lá, hoa, quả, hạt.
Rễ đậu tương là rễ cọc gồm rễ cái và rễ bên. Rễ cái thường phát triển ăn
sâu 20 - 30cm, xung quanh mọc ra các rễ bên. Trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi
khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm của không khí tạo thành
đạm dễ tiêu. Khi mới hình thành thì nốt sần có màu trắng sữa, khi phát triển tốt
nhất nó có màu hồng, số lượng và chất lượng nốt sần có ảnh hưởng đến sinh
trưởng và năng suất của đậu tương.


Đậu tương là cây thân thảo, ít phân cành dạng bụi. Thân đậu tương có
hình trụ, nhiều lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi bò hay nửa
bò. Mỗi cây có khoảng 8 - 14 đốt tuỳ theo loại hình sinh trưởng, chiều dài các
đốt cũng thay đổi tuỳ theo giống, thời vụ, mật độ cây, đất đai, phân bón…
Cành mọc ra từ các đốt trên thân. Đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá
mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt
mang một lá kép.
Lá đậu tương là lá kép với ba lá chét nhưng cá biệt cũng có lúc có 4 đến
5 lá chét. Lá có hình dạng khác nhau: tròn, hẹp, bầu dục, lưỡi mác hoặc hình
thoi… nhưng thường quy thành hai loại là lá rộng và lá hẹp.
Hoa có màu trắng hoặc màu tím mọc ở ngọn hay nách lá. Thời kỳ cây ra
hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo
do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ.

Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, đa số ngoài vỏ có lông bao phủ, khi
chín có màu vàng hoặc xám đen. Mỗi quả trung bình có từ 2 – 3 hạt. Hạt đậu
tương có hình dạng tròn hay bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, vỏ hạt thường nhẵn và
có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu đen… nhưng phổ biến là hạt màu
vàng. Đậu tương là cây trồng tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và
sâu bệnh [5].
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tương
Đậu tương là cây công nghiệp ngắn ngày và có tác dụng nhiều mặt. Sản
phẩm của nó làm thức ăn cho con người, gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp,
là mặt hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt.
Về mặt thực phẩm, hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao. Protein
của đậu tương được coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một
lượng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể, dễ tiêu hoá
và không có các thành phần tạo thành cholesteron. Ngoài ra, lipit của đậu
tương chứa tỉ lệ lớn các axit béo chưa no, có hệ số đồng hoá lớn (98%), chỉ số


iot cao (120 - 137) có tác dụng phòng chống bệnh bướu cổ cho con người đặc
biệt đối với trung du và miền núi). Hiện nay, từ hạt đậu tương người ta đã chế
biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có nhiều loại làm thực
phẩm như đậu phụ, tương, xì dầu, cà phê đậu tương, bánh kẹo...
Về mặt công nghiệp, đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công
nghiệp như chế biến thực phẩm, công nghiệp ép dầu…Hiện nay, trên thế giới
đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu. Dầu đậu tương
chiếm 30 - 35% tổng lượng dầu thực vật. Từ dầu đậu tương người ta chế biến
ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như nến, xà phòng…
Trong chăn nuôi, đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc. 1kg hạt đậu
tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Toàn cây đậu tương có
hàm lượng đạm khá cao nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể sử dụng
làm thức ăn cho gia súc. Đậu tương còn là cây cải tạo đất tốt. Trong hệ thống

luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng
tốt đối với cây trồng vụ sau [5].
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam
Cây đậu tương được xem là một loại cây trồng chiến lược của nhiều
quốc gia trên thế giới, với vị trí đứng thứ tư chỉ sau lúa, ngô và lúa mì. Khả
năng thích nghi với điều kiện khí hậu và sinh thái của đậu tương là khá rộng
nên chúng được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, đặc biệt nhiều nhất là ở
châu Mỹ, tiếp đến là châu Á. Trong đó, 4 nước sản xuất đậu tương nhiều nhất là
Mỹ, Brazil, Argentina và Trung Quốc, chiếm khoảng 90 - 95% tổng sản lượng
đậu tương trên thế giới.
Thống kê của FAO (Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp
quốc) cho thấy trong 4 năm (2009 - 2012), diện tích gieo trồng đậu tương trên
thế giới tăng khoảng 5,7 triệu ha (năm 2009 là 99,3 triệu ha và năm 2012 là
105 triệu ha). Trong đó, Mỹ vẫn là quốc gia đứng đầu về diện tích gieo trồng
30,80 triệu ha trong khi đó Việt Nam chỉ chiếm một con số khiêm tốn là 0,12


triệu ha. Mặc dù diện tích gieo trồng tăng đáng kể nhưng sản lượng đậu tương
của toàn thế giới lại có nhiều biến động cụ thể, năm 2009 tổng sản lượng trên
thế giới đạt 223,4 triệu tấn, năm 2010 tăng lên đáng kể đạt 265,25 triệu tấn,
năm 2011 sản lượng giảm chút ít còn 262,35 triệu tấn, nhưng đến năm 2012 thì
chỉ còn là 241,84 triệu tấn. Tương ứng với sự biến động về sản lượng là sự biến
động về năng suất đậu tương. Cũng theo FAO, trong vòng 4 năm (2009 2012), năng suất đậu tương bình quân của toàn thế giới đạt cao nhất vào năm
2010 đạt 25,85 tạ/ha, nhưng đến năm 2012 chỉ là 23,03 tạ/ha. Trong nhiều
nguyên nhân làm năng suất và sản lượng đậu tương thế giới có sự giao động và
sụt giảm đáng kể là do bệnh virus. Bệnh virus ở đậu tương gây thiệt hại rất lớn
không những làm giảm năng suất, giảm phẩm chất hạt, mà còn gây thoái hoá
giống. Vì vậy, phòng trừ bệnh virus đang là vấn đề được trú trọng ở nhiều quốc
gia nhằm thúc đẩy năng suất, sản lượng và nâng cao chất lượng đậu tương.
Ở Việt Nam, đậu tương được trồng từ rất lâu, trước cây đậu xanh và các

cây họ đậu khác. Cây đậu tương chiếm một vị trí quan trọng trong cơ cấu cây
trồng nông nghiệp của nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo kinh
tế chưa phát triển.
Hiện nay, đậu tương được trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp, năm 1997 thì
diện tích gieo trồng đậu tương lớn nhất là trung du miền núi phía bắc (46,6%),
tiếp đến là đồng bằng sông Hồng (19,3%), vùng Tây Nguyên (11%), miền
Đông Nam Bộ (10,2%), đồng bằng sông Cửu Long (8,9%), khu Bốn (2,3%),
vùng Duyên hải miền Trung (1,6%).
Theo số liệu thống kê chính thức của chính phủ, đậu tương được trồng ở
28 tỉnh trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền bắc và 30% ở miền nam.
Khoảng 65% đậu tương nước ta được trồng ở vùng cao, những nơi đất không
cần màu mỡ; và 35% được trồng ở những vùng đất thấp. Đậu tương được trồng
ở nhiều địa phương trên khắp cả nước vào từng thời điểm khác nhau nên có cả
vụ xuân, vụ hè và vụ đông.


Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam giai đoạn 2008 - 2012
2008

2009

2010

2011

2012

2013*

2014*

Diện tích canh
tác (nghìn ha)

192,1

146,2

197,8

181,1

120,8

180

200

Năng suất
(tấn/ha)

1,39

1,46

1,51

1,47

1,45

1,5

1,5

Tổng sản lượng
(nghìn tấn)

267,6

213,6

298,6

266,9

175,3

270

300

(Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, *số liệu dự báo)
Nếu xét về diện tích gieo trồng vẫn tăng qua các năm nhưng tỉ lệ diện
tích gieo trồng đậu tương thì vẫn còn khá thấp chỉ chiếm khoảng 1,5 - 1,6%
tổng diện tích cây công nghiệp [5]. Năng suất bình quân của đậu tương ở nước
ta là rất thấp, chỉ b ng 50% - 70% năng suất đậu tương của thế giới. Năm
2012, sản lượng đậu tương nước ta giảm 34,3% so với cùng kỳ năm trước,
xuống còn 175,3 nghìn tấn. Sản lượng đậu tương sản xuất ra không đủ đáp
ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước, nên hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu

một số lượng đáng kể từ nước ngoài.
Phươ

, bộ giống năng suất thấp, sản

xuất nhỏ lẻ, giá thành cao, lãi suất thấp, giá thành đậu tương trong nuớc
không có khả năng cạnh tranh với đậu tương nhập

u là nguyên nhân

n mà với cây đậu tương. Mặt khác, tình hình
thời tiết bất thường và sâu bệnh là yếu tố quan trọng làm hạn chế sản xuất
đậu tương ở Việt Nam. Như vậy, để phát triển cả về diện tích và sản lượng
đậu tương ở nước ta cần chọn tạo và đưa vào sản xuất các giống đậu tương
có năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt bằng các biện pháp
công nghệ sinh học, đặc biệt là ứng dụng công nghệ gen trong chọn giống
kháng bệnh.


1.2.

SOYBEAN MOSAIC

VIRUS (SMV)
1.2.1. Bệnh virus hại
Virus được phát hiện cuối thế kỉ XIX do nhiều nhà khoa học . Hiện nay,
người ta đã biết tới 2000 loài virus gây bệnh cho các sinh vật trong đó có 1/2
(khoảng hơn 1000 loài) là các virus hại thực vật chưa kể đến các chủng loại của
chúng. Virus gây bệnh trên thực vật phần lớn chúng là virus RNA sợi đơn hoặc
kép (Cucumber mosaic virus - CMV, Tobacco mosaic virus - TMV, Tomato

spotted wilt virus - TSWV...) nhưng cũng có một số ít là virus DNA (Tomato
yellow leaf curl virus - TYLCV, Cauliflower mosaic virus - CaMV). Các virus
này thường có phổ gây bệnh rộng, có loài gây hại tới trên 900 loại thực vật khác
nhau với những biểu hiện bệnh phức tạp, khó nhận biết. Các bệnh do virus trên
các loại cây có triệu chứng điển hình là lá nhỏ, có vệt biến màu loang lổ, đọt và
lá non xoăn lại, cây thấp bé hẳn đi. Bệnh virus thường kèm theo triệu chứng do
các côn trùng chích hút và cũng là môi giới truyền bệnh.
Bệnh virus không chỉ làm giảm năng suất cây trồng mà còn là một trong
những nguyên nhân gây thoái hóa giống cây trồng. Virus cũng có thể gây nên
những thiệt hại nặng nề và nhanh chóng ngay trong vụ trồng của các cây
thường năm như virus gây bệnh lúa vàng lụi bệnh vàng lá lúa, bệnh xoăn lá cà
chua, bệnh virus khoai tây, bệnh khảm sọc lá hành tây. Bệnh virus hại lúa,
virus hại sắn đã từng huỷ diệt hàng chục vạn ha ở châu Á và châu Phi trong
một thời gian ngắn chưa tới 30 ngày từ một cánh đồng xanh tươi trở thành
vàng úa, chết lụi. Bệnh virus hại cà chua làm giảm năng suất từ 15 - 25%, bệnh
virus hại thuốc lá làm giảm thiệt hại trên 520.000 đô la trong năm 1978 tại bắc
Carolina [20]. Bệnh Tungro ở Philipines năm 1971 đã gây thiệt hại trên nửa
triệu tấn thóc,... Ở cây lâu năm, một số virus sau khi gây bệnh nặng trong mùa
khi có thời tiết và nhiệt độ ôn hoà, nhưng khi nhiệt độ thấp hay quá cao thường
gây nên hiện tượng mất triệu chứng làm cho người sản xuất bị nhầm lẫn, không


phát hiện được cây bị bệnh và mức nguy hiểm của bệnh, chỉ đến lúc nào đó cây
không còn khả năng phục hồi theo chu kỳ bệnh nữa, cây hoàn toàn tàn lụi, khi
đó mới biết thì đã quá muộn.
Không chỉ vậy, virus còn ảnh hưởng tới phẩm chất của các sản phẩm
nông nghiệp. Ví dụ: hạt lúa bị bệnh vàng lụi thường bị lép hoặc hạt thường rất
nhỏ, hạt gạo bị đen, ăn có vị đắng; khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn
cỗi, lá khảm loang lổ, củ khoai nhỏ, hàm lượng tinh bột và các chất dinh
dưỡng đều thấp; virus làm cho cà chua bị xoăn lá, quả bé, múi khô và hoa

rụng, năng suất và phẩm chất đều rất thấp; virus Tristeza hại ở cây ca m
ngọt làm cho quả cam chín ép và rụng sớm, quả còn non đã úa vàng vỏ,
nước cam nhạt không mùi, vị.
Bệnh virus còn nguy hiểm ở chỗ virus ký sinh bắt buộc trong tế bào cây
ký chủ vì vậy khi tế bào bị huỷ hoại, chết, virus mới bị mất hoạt tính. Khi tế
bào non phát triển mạnh, virus cũng phát triển mạnh, tạo ra những triệu
chứng rất điển hình trên cây non hay bộ phận non của một cây. Chúng khó
phát hiện và khó loại trừ. Khi nhân giống vô tính bằng invitro, virus có khả
năng lây lan rất lớn trong việc phát triển công nghệ sinh học và các vùng
trồng trọt công nghệ cao. Chính vì vậy, chúng trở thành một kẻ thù nguy
hiểm của công nghệ sinh học.
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, cây trồng và thảm thực vật Việt
Nam bốn mùa xanh tươi. Đây là điều kiện để bệnh virus ở Việt Nam rất
phong phú về số lượng và chủng loại. Bệnh đã gây ra rất nhiều thiệt hại nặng
nề cho sản xuất. Ví dụ: bệnh vàng lụi đã tàn phá hàng trăm ngàn ha lúa ở
miền núi, trung du và đồng bằng hai miền Bắc, Nam; bệnh vàng lá cam, quýt
đã huỷ diệt nhiều vườn cam, nhiều vườn khác ở trong tình trạng thoái hoá,
giảm năng suất nghiêm trọng. Các cây bông, hồ tiêu, ca cao, thuốc lá, cà
chua, khoai tây, các loại rau bầu, bí, các cây họ đậu như đậu tương, đậu xanh,
đậu đen… các cây ăn quả như chuối, dứa, đu đủ…đều bị bệnh virus gây hại.


Ngoài cây lương thực, cây công nghiệp, cây ăn quả virus còn hại các loại cây
thuốc, cây hoa, cây cảnh…
Có thể nói virus là một loại dịch nguy hiểm, phá hoại hầu hết các loại
cây trồng, gây nên sự thoái hoá dẫn đến tàn lụi cây trồng, làm giảm năng suất
và giảm phẩm cấp của sản phẩm. Vì vậy, bệnh virus là một loại bệnh gây hại
toàn diện và rất nguy hiểm cho ngành trồng trọt ở nước ta cũng như trên thế
giới. Ở nhiều nước, việc tiêu diệt bệnh hại, loại trừ bệnh hại, tạo cây sạch và
cây chống chịu virus, phytoplasma, viroide… là một công việc quan trọng

trong sản xuất nông nghiệp.
Đậu tương là loại cây trồng dễ bị tổn thương do tác hại của sâu, bệnh, cỏ
dại và điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Cây đậu tương bị bệnh có thể do tác nhân
là vi khuẩn, virus, nấm và tuyến trùng.
Trong khoảng 67 loài virus có thể lây nhiễm vào cây đậu tương, 27 loài
virus được coi là mối đe dọa cho ngành sản xuất đậu tương [31], [28]. Nhìn
chung khi cây đậu tương bị nhiễm một loại virus nào đó thì sẽ có những biểu
hiện bên ngoài khác với những cây không bị bệnh. Những biểu hiện bên ngoài
đó thường được chia làm ba dạng chính là: biến màu, khảm lá và biến hình.
(i) Biến màu: là nhóm bệnh hại gây ra triệu chứng biến vàng, lá không có hiện
tượng héo. Nhóm này thường có nồng độ thấp và luôn cư trú trong các bó
mạch dẫn của cây.
(ii) Khảm lá: virus thường xâm nhiễm vào lá cây gây ra hiện tượng khảm lá,
loang lổ, chỗ xanh đậm, chỗ xanh nhạt, chỗ biến vàng... Đây là triệu chứng phổ
biến nhất ở trên cây đậu tương.
(iii) Biến hình: nhóm virus này thường có hiện tượng mất triệu chứng (ẩn triệu
chứng) khi mà nhiệt độ lên cao hay cây đậu già. Triệu chứng bệnh có nhiều
hình dạng khác nhau nên trong thực tế rất dễ nhầm lẫn vì một cây có thể có
nhiều bệnh.


Ngoài ra, cây đậu tương bị nhiễm virus còn còi cọc, hạt có đốm. Một số
triệu chứng có thể dùng để chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, hầu hết các triệu chứng
chồng chéo lên nhau và thường đòi hỏi các kỹ thuật phòng thí nghiệm chẳng
hạn như phương pháp ELISA hoặc phương pháp PCR để xác định.
Bảng 1.2. Một số virus gây bệnh trên đậu tương [26]
STT

Tên virus

Chi

1

Alfalfa mosaic virus (AMV)

Alfamovirus

2

Bean pod mottle virus (BPMV)

Comovirus

3

Bean yellow mosaic virus (BYMV)

Potyvirus

4

Tobacco streak virus (TSV)

Ilarvirus

5

Cowpea chlorotic mottle virus (CCMV)

Bromovirus

6

Mung bean yellow mosaic virus (MYMV)

Begomovirus

7

Peanut mottle virus (PeMoV)

Potyvirus

8

Peanut stripe virus (PStV)

Potyvirus

9

Peanut stunt virus (PSV)

Cucumovirus

10

Soybean chlorotic mottle (SbCMV)

Caulimovirus

11

Soybean crinkle leaf viruss (SCLV)

Begomovirus

12

Soybean dwarf virus (SbDV)

Luteovirus

13

Soybean mosaic virus (SMV)

Potyvirus

14

Soybean severe stunt virus (SSSV)

Nepovirus

15

Tobacco ringspot virus (TRSV)

Nepovirus

1.2.2

,

cơ chế truyền bệnh

SMV (Soybean mosaic virus) là tác nhân gây bệnh khảm lá đậu tương, là
một trong những loại virus phổ biến, gây thiệt hại lớn cho ngành sản xuất đậu
tương trên toàn thế giới. Các triệu chứng đặc trưng của bệnh khảm lá đậu
tương được mô tả lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1915 (Clinton, 1916). Cho đến


năm 1921, Gardner và Kendrick xác định được tác nhân gây bệnh và đặt tên
cho Soybean mosaic virus (SMV) [19]. Kể từ đó, SMV được tìm thấy ở Trung
Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Canada, Bazil, Australia và nhiều quốc gia khác.
Đến nay, SMV được tìm thấy ở bất cứ nơi nào trồng đậu tương trên thế giới.
Sau khi nhiễm SMV, đậu tương sẽ giảm cả năng suất và chất lượng hạt
[23]. SMV có thể làm suy giảm năng suất đậu tương tới 40% khi cây bị nhiễm
trong lúc hoặc trước khi ra hoa, trong một số trường hợp có thể gây hiệt hại lên
tới 94% tổng sản lượng. SMV cũng làm giảm kích thước và trọng lượng hạt, gia
tăng những vết đốm trên vỏ hạt và giảm chất lượng hạt giống. Nếu cây nhiễm
virus ở giai đoạn sớm, 91% hạt đậu tương có vết lốm đốm.
Soybean mosaic virus (SMV) thuộc Chi Potyvirus, Họ Potyviridae. Họ
Potyviridae có số lượng lớn nhất với 198 loài virus, chiếm hơn 30% trong số
các loại virus thực vật được biết đến [12], [29]. Potyvirus là chi lớn nhất, có
khoảng 180 loài virus, gây ảnh hưởng lớn nhất đến sự sinh trưởng, phát triển
của cây trồng trong số các virus gây bệnh ở thực vật.
Dựa vào phản ứng của cây đậu tương khi được nhiễm SMV, bao gồm:

khảm hay mô nhăn nheo (S), hoại tử (R) và không có triệu chứng (R). Cho và
Goodman (1979, 1982) đã phân loại các chủng SMV khác nhau. Các chủng
được đặt tên từ G1 đến G7, với số trong tên chủng thấp nhất là số giống đậu
tương có triệu chứng bệnh trong tập hợp các giống đậu tương được sử dụng
[Essex, Davis (York), Kwangyo, Marshall, Ogden và Buffalo (PI 96983)] [14],
[15]. Hiện nay, nhiều chủng SMV đã được phân lập và công bố trên thế giới.
Phạm vi kí chủ
So với các potyvirus khác, SMV có phạm vi kí chủ tương đối hẹp. Nó lây
nhiễm cho 6 họ là họ Đậu (Fabaceae hay Leguminosae), họ Dền
(Amaranthaceae),

họ Chenopodiaceae, họ Lạc tiên (Passifloraceae),

họ

Schropulariaceae và họ Cà hay họ Khoai tây (Solanaceae). Tuy nhiên, SMV


gây hại chủ yếu trên họ Đậu bao gồm cả đậu tương và các loài đậu khác [18],
[23].


Cơ chế truyền bệnh
Trên đồng ruộng, virus không thể tự lan truyền, chúng luôn phải nhờ một
sự trợ giúp để có thể lây lan. SMV xâm nhập vào tế bào thực vật theo hai cách:
Một là do tiếp xúc cơ giới như thông qua các vết thương trong quá trình canh
tác của con người vô ý tạo ra, do mưa gió, động vật gây xây xát. Hai là do côn
trùng môi giới chủ yếu là các loài rệp thuộc họ Aphididae. Có đến hơn 32 loài
rệp khác nhau thuộc 15 chi là môi giới truyền SMV từ cây bệnh sang cây khỏe
[15], [11], như Acyrthosiphom pisum, Aphis craccivora, A.fabae, A.glycine, A

gossypii, Myzus persicae, Rhopalosiphum maidis… Rệp càng nhiều thì tỉ lệ
nhiễm bệnh càng lớn.
Bệnh khảm lá đậu tương có thể truyền qua nhiều vụ chủ yếu thông qua hạt
giống bị nhiễm SMV, mặc dù cỏ dại và cây trồng khác cũng có thể là nơi chứa
SMV. Có đến trên 30% các hạt giống từ cây đậu tương nhiễm SMV mang SMV
theo tùy thuộc vào giống và thời gian bị nhiễm trước khi ra hoa [13].
1.2.3. Triệu chứng của bệnh

do SMV

SMV có thể tồn tại trên hạt, những hạt nhiễm bệnh có thể mất sức nẩy
mầm hoặc phát triển thành cây con nhiễm bệnh. Cây con nhiễm bệnh thường
có biểu hiện mảnh khảnh, lá nhăn nheo hoặc lá đơn thuỳ cong queo, hình dạng
các lá có thể bình thường nhưng bị đốm lá hoặc mép dọc của lá có thể bị uốn
cong xuống phía dưới. Hậu quả là các lá chét bị biến màu sớm và sinh trưởng
kém, lá bị đốm và nhăn nheo.
Phản ứng của cây bị SMV xâm nhiễm tuỳ thuộc vào kiểu gen của cây
chủ, chủng virus, tuổi cây khi bị nhiễm và điều kiện môi trường. Những cây
bị nhiễm bệnh sớm trong vụ gieo trồng thường bị còi cọc, đốt thân và cuống
lá bị ngắn lại. Các cây bị nhiễm SMV chín sớm hơn các cây không bị nhiễm.
Các giống nhiễm thể hiện triệu chứng trung gian và khoảng 14 ngày sau khi
lây nhiễm cơ giới, ở các lá non gân sáng màu vàng xuất hiện dọ c theo các
gân nhánh nhỏ. Các triệu chứng hại phát triển nặng hơn ở các lá ra sau, kết


quả là phần thịt lá dọc theo thân chính có màu xanh tối, làm cho các mép lá
bị uốn cong xuống dưới. Đối với một số giống đậu tương, cây nhiễm bệnh
có thể phát triển triệu chứng chết thối. Mức độ nhăn lá thường rất nặng nếu
0

các cây bị nhiễm bệnh đang sinh trưởng ở nhiệt độ khoảng 18 C. Triệu
0

chứng biểu hiện sẽ nhẹ hơn khi ở nhiệt độ từ 24 - 25 C và nó sẽ không biểu
0

hiện bệnh khi nhiệt độ lên trên 30 C. Nhiệt độ có ảnh hưởng đến thời gian từ
khi xâm nhiễm đến khi biểu hiện triệu chứng bệnh khoảng 4 ngày ở nhiệt độ
0

0

29 C đến 14 ngày ở nhiệt độ 18,5 C.
Biểu hiện triệu chứng bệnh trên quả tuỳ thuộc vào mức độ nhiễm của
giống, thời gian lây nhiễm, chủng virus và nhiệt độ không khí. Những quả bị
bệnh thường dẹt, ngắn và ít lông, chúng thường cong queo hơn hẳn những quả
trên cây khoẻ.
Trên đồng ruộng, những cây bị nhiễm virus SMV cũng dễ bị nhiễm
những loại virus khác như Bean Pod Mottle Virus. Ảnh hưởng của việc nhiễm
cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ dẫn tới năng suất có thể bị giảm từ 66
80%. Cây bị còi cọc nặng, lá biến thành màu vàng và có hiện tượng hoại tử, trên
lá có dạng mấu. Các mấu nhú bắt nguồn từ các vùng lục lạp ở phần cuối gân
giữa của mặt trên của lá. Chúng có dạng như một sợi chỉ đến dạng như một đám
lông, có chiều dài từ 5 - 25mm, ở gốc lông có bề rộng khoảng 1mm và thon dần
về phía ngọn. Các tế bào của cây bị nhiễm SMV, nhất là trong các vùng mạch
dẫn, có chứa các thể vùi trong bó mạch. Số lượng của các thể vùi tăng lên vào
khoảng từ
2 - 3 tuần sau khi bị lây nhiễm. Những cây bị nhiễm các chủng có độc tính
mạnh có thể vùi nhiều hơn so với khi nhiễm các chủng có độc tính nhẹ hơn.
1.2.4. Biện pháp phòng trừ

Do tính chất gây hại chủ yếu trong hệ mạch dẫn, khả năn g phát tán
nhanh chóng qua con đường trao đổi giống và sự truyền lan của côn trùng
môi giới nên bệnh có mức độ phát triển mạnh, dễ gây thành dịch. Bệnh


khảm lá đậu tương là một trong những bệnh khó phòng trừ, biện pháp hóa
học ít có tác dụng.
Trên thế giới nhiều biện pháp phòng trừ bệnh virus hại thực vật đã được
áp dụng như:
- Loại bỏ nguồn bệnh bằng cách chọn hạt giống sạch bệnh từ các cây
khỏe, sạch bệnh; xử lý hạt giống (bằng nhiệt, hóa chất…)
- Theo dõi và tiêu hủy cây bệnh tránh lây lan sang cây khỏe .
- Phòng trừ côn trùng môi giới.
- Luân canh cây trồng; vệ sinh đồng ruộng, diệt cỏ dại,…
Tuy nhiên, các biện pháp kể trên không mang lại hiệu quả cao trong
phòng trừ bệnh mà lại tốn nhiều công sức. Hiện nay, biện pháp hiệu quả nhất
để phòng bệnh do virus cho cây trồng là sử dụng giống kháng, nhưng nguồn
kháng bệnh tự nhiên đối với các virus lại không nhiều. Phương pháp chuyển
gen để tạo cây kháng đặc biệt tỏ ra hữu ích cho các loài thực vật mà trong tự
nhiên không có nguồn kháng bệnh.
1.3.

SMV
Các hạt SMV có hình que, dài khoảng 750 nm, có đường kính là 11-15

nm, gồm vỏ protein bố trí đối xứng xoắn ốc xung quanh sợi RNA đơn .
Vỏ protein (capsid) gồm khoảng 2000 tiểu phần nhỏ là protein vỏ (coat
protein - CP), mỗi tiểu phần có kích thước 30 - 36 KD. Hệ gen của SMV là 1

sợi RNA đơn dương, được liên kết với protein viron (VPg) ở đầu 5’ và có đuôi
poly(A) ở đầu 3’.
Viêc hoàn thành giải trình tự 45 chủng SMV phân lập được cho thấy hệ
gen của SMV có khoảng 9600 nucleotide mã hóa cho một polyprotein với 3066
amino acid. Polyprotein này gồm 10 chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1),
Helper component proteinase (HC-pro), Protein P3 (P3), 6 kDa protein 1(6K1),
Cytoplasmic inclusion protein (CI), 6 kDa protein 2 (6K2), Viral genome-


linked protein (VPg), Nuclear inclusion protein A (NIa), Nuclear inclusion
protein B (NIb), Coat protein (CP) (Hình 1.1).

Hình 1.1. Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV
(Jayaram và cs (1992)) [25]
Hệ gen của SMV có vùng bảo thủ (NTRs) ở đầu 5’ và đầu 3’. Chiều dài
của 5’NTR trong khoảng 131 - 205 bp, trong khi 3’NTR của các potyvirus
khác nhau là hoàn toàn không đồng nhất về kích thước và trình tự.
Jayaram và cs (1992) đã lập bản đồ và xác định trình tự nucleotide của
các chủng G2 và G7, so sánh với các potyvirus khác. Bộ gen RNA của hai
chủng SMV-G2 và SMV-G7 đã được sắp xếp theo một trật tự và tổng số
nucleotide của cả hai chủng G2 và G7 là 9588 nucleotide (không tính đuôi poly
A), mã hóa cho các phân tử protein có 3066 amino acid. Dựa trên sự so sánh
trình tự nucleotide của Tobacco etch virus, Tobacco vein mottling virus, Potato
virus Y, Plum pox virus, SMV - G2 và SMV - G7, Jayaram và cs nhận thấy các
khu vực được bảo tồn nhất trong genome của potyvirrus là các gen mã hóa
protein như gen CI, gen NIb, gen CP. Gen CP của SMV giống nhất với gen CP
của Potato virus Y và Tobacco etch virus, nhưng về tổng thể hệ gen của SMV
tương tự như Plum pox virus [25].
Won-Seok Lim và cs (2003) đã phân tích trình tự nucleotide hoàn chỉnh
của RNA genome của SMV chủng G5 (SMV-G5) và G7H (SMV-G7H) và so

sánh với trình tự của các chủng SMV khác. Mỗi RNA của SMV dài 9588
nucleotides (chưa kể đuôi poly A), chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa cho
một polyprotein mà sau đó được phân cắt thành 10 protein chức năng. So sánh