Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protein vỏ

Kho¸ luËn tèt nghiÖp NguyÔn ThÞ Loan
MỞ ĐẦU
Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) là cây rau được gieo trồng rộng rãi ở
nhiều nơi trên thế giới và có giá trị kinh tế cao. Quả cà chua ngoài tác dụng làm các
món ăn, làm quả tươi tráng miệng, nước giải khát và những dạng thực phẩm chế biến
cung cấp dinh dưỡng, vitamin, và chất khoáng, còn có tác dụng chữa bệnh thiếu
vitamin C, bệnh về tim mạch, ung thư. Diện tích trồng cà chua liên tục tăng lên trong
những năm gần đây. Từ năm 1990 đến 2002 diện tích cà chua trên thế giới từ 2,8
triệu ha tăng lên 3,7 triệu ha và sản lượng từ 76 triệu tấn tăng lên 100 triệu tấn. Ở
Việt Nam, năm 1996 diện tích trồng cà chua khoảng 8 nghìn ha thì đến năm 2001 lên
đến 18 nghìn ha, đóng góp hàng trăm tỉ đồng vào nền kinh tế quốc dân [1].
Năng suất cà chua bị giảm sút đáng kể do nhiều nguyên nhân như: giống, điều
kiện canh tác, chế độ chăm sóc, bệnh do nấm, vi khuẩn, tuyến trùng. Trong đó bệnh
do vi rút được xác định là tác nhân gây hại nghiêm trọng. Bệnh do vi rút không
những làm giảm năng xuất mà còn làm giảm chất lượng của sản phẩm. Xoăn lá cà
chua do vi rút (Tomato yellow leaf curl virus-TYLCV) gây ra là bệnh phổ biến và gây
thiệt hại nặng nề nhất ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới [24].
Việc sử dụng các biện pháp canh tác, cách li vùng bị bệnh, loại bỏ cây bị
bệnh, phun thuốc trừ sâu để phòng trừ bệnh vi rút vừa hiệu quả thấp vừa gây ảnh
hưởng đến cây trồng, môi trường và cả con người. Những biện pháp này chỉ làm
giảm sự lan truyền của bệnh và mang tính chất phòng chứ không thể ngăn chặn bệnh
một cách triệt để. Hiện nay, cùng với sự tiến bộ của Công nghệ sinh học, tạo cây
chuyển gen kháng lại vi rút được coi là một biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặn và
hạn chế tác hại do vi rút gây ra đồng thời đáp ứng yêu cầu phát triển một nền nông
nghiệp sạch và bền vững. Vấn đề đặt ra là các giống cây chuyển gen thường có tính
kháng đặc hiệu. Các giống cây chuyển gen được tạo ra bằng cách sử dụng các vật
liệu di truyền từ các vi rút gây bệnh (gen CP, gen mã hoá replicase...) chỉ kháng lại
được các dòng vi rút gây bệnh có gen được sử dụng để tạo cây chuyển gen hoặc là
các dòng vi rút có quan hệ di truyền gần gũi. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã
tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan
lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn

gen mã hóa cho protein vỏ” với mục đích thu được hiểu biết sâu sắc ở mức độ di
truyền phân tử của các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua của Việt Nam từ đó làm cơ sở
cho việc hoạch định các chiến lược thích hợp cho nghiên cứu tạo cây chuyển gen
kháng bệnh xoăn lá cà chua ở Việt Nam.
1
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Đặc điểm phân loại, nguồn gốc, sự phân bố và giá trị sử dụng
của cây Cà chua
1.1.1. Phân loại
Cà chua thuộc họ Cà (Solanaceae), chi Lycopersicon. Chi này gồm 12 loài, tất
cả đều có nguồn gốc từ châu Mĩ. Đã có nhiều tác giả đa ra các hệ thống phân loại
cho cà chua, nhng cho đến nay hệ thống phân loại của Breznep (1955) đợc sử dụng
rộng rãi và đơn giản nhất [21]. Chi Lycopersicon có 2 chi phụ:
- Chi phụ Eriopersicon: quả luôn xanh, có sọc tía, có lông, hạt nhỏ. Chi này có
5 loài hoang dại:
Lycopersicon hisrutum Humb
Lycopersicon peruviarum Mill
Lycopersicon cheesmanii
Lycopersicon chilense
Lycopersicon glandulosum
- Chi phụ Eulycopersicon: quả chín đỏ hoặc vàng, hoa to. Chi này có 2 loài:
Lycopersicon esculentum: cà chua thông thờng
Lycopersicon pimpinellifolium: cà chua bán hoang dại.
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Tổ tiên của cà chua trồng ngày nay là cà chua anh đào (L. esculentum var.
cerrasiforme) đợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới châu Mĩ. Từ châu Mĩ, cà
chua đợc các thơng gia Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha đa sang trồng ở châu Âu, châu
á. Từ châu Âu, cà chua đợc chuyển sang châu Phi nhờ những thực dân đi khai phá
thuộc địa. ở Việt Nam, một số nhà nghiên cứu cho rằng cà chua đợc ngời Pháp du

nhập vào và nó đã nhanh chóng trở thành một loại rau quả phổ biến và đợc a
chuộng. Hiện nay, cà chua đợc trồng ở hầu hết các tỉnh, trong đó diện tích trồng tập
trung chủ yếu ở các tỉnh Hng Yên, Hải Dơng, Bắc Ninh, Hà Tây, Nam Định, v.v
[1].
2
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
1.1.3. Giá trị sử dụng
Cà chua rất dễ trồng. ở Việt Nam, do điền kiện thời tiết thuận lợi, có thể
trồng cà chua ở hầu hết các tỉnh và đợc trồng gần nh quanh năm. Vụ sớm từ tháng 7
đến tháng 12, vụ chính từ tháng 9 đến tháng 2 năm sau, vụ muộn từ tháng 11 đến
tháng 4 năm sau, vụ xuân hè từ tháng 1 đến tháng 6 [6].
Trong quả cà chua chín có nhiều chất dinh dỡng nh: đờng, vitamin A, vitamin
C và các chất khoáng quan trọng nh: canxi, sắt, phospho, kali, magiê, v.v . Thành
phần hoá học trong quả cà chua chín gồm có: nớc (94-95%), chất khô (5-6%), trong
đó: 55% đờng, 21% chất không hoà tan trong rợu (nh protein, xenlulôzơ, pectin,
polisaccarit), 12% axit hữu cơ (nh xitric, malic, galacturonic, pirolidoncacboxilic),
7% chất vô cơ và 5% các chất khác (nh carotenoit, axit ascorbic, chất dễ bay hơi,
amino axit, v.v ) [1].
Cà chua không những đợc dùng nh rau cung cấp vitamin, chất khoáng mà
còn có nhiều tác dụng về mặt y học. Trong cà chua có chất licopen (thành phần tạo
màu đỏ của cà chua) có khả năng giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Theo Võ
Văn Chi (1997), quả cà chua có vị ngọt, tính mát, có tác dụng tạo năng lợng, làm
cân bằng tế bào, khai vị, giải nhiệt, chống hoại huyết . Hàng ngày, mỗi ng ời sử
dụng 100-200 g cà chua sẽ thỏa mãn nhu cầu vitamin và chất khoáng cần thiết [3].
1.2. Bệnh xoăn lá cà chua do vi rút
1.2.1. Đặc điểm của bệnh xoăn lá cà chua do vi rút
Bệnh xoăn lá cà chua do vi rút (Tomato yellow leaf curl) rất phổ biến ở khu
vực Đông Nam châu á, các nớc Trung Cận Đông và Đông Phi. Đây là một trong
những bệnh do vi rút gây thiệt hại nặng nề nhất cho cà chua. Theo thống kê của
Polston và Anderson (1997), từ năm 1988 đến năm 1995, bệnh đã làm giảm 5% đến

95% sản lợng cà chua ở nớc Cộng hòa Dominica, Venezuela và một số nớc ở Trung
Mĩ, làm thiệt hại cho nền kinh tế tổng cộng 140 triệu đô la Mĩ [28]. Bệnh lan truyền
qua vật truyền trung gian là loài bọ phấn (Bemisia tabaci).
Bọ phấn chích hút nhựa cây chủ yếu ở ngọn và lá non, mang TYLCV [4].
Cây bị bệnh có triệu chứng xoăn ngọn lá, làm cho lá co quắt, cây thấp nhỏ, hoa phát
triển kém, dễ bị rụng. Cây còn nhỏ nếu bị nhiễm bệnh sẽ còi cọc, không thể phát
triển [8].
3
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
ở Việt Nam, bệnh xoăn lá cà chua do vi rút phát triển mạnh trong vụ cà chua
sớm và vụ xuân hè. Khi nhiệt độ không khí từ 25-30
0
C, độ ẩm hơn 70%, bọ phấn nở
rộ, mật độ bọ phấn trên một cây tăng dẫn đến tăng khả năng truyền bệnh [8].
1.2.2. Vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua
1.2.2.1. Đặc điểm phân loại
4
b)
c)
Hình 1. Bọ phấn Bemisia tabaci [34]
Hình 2. Biểu hiện hình thái của bệnh xoăn lá trên cây cà chua
a) Cây đối chứng không bị bệnh; b) Cây bị nhiễm bệnh xoăn lá; c) Ruộng cà chua bị
bệnh xoăn lá
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
Vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)
thuộc họ Geminiviridae, chi Begomovirus. Dựa vào sự tơng đồng về trình tự
nucleotit, tác nhân truyền bệnh và phổ vật chủ, họ Geminiviridae đợc chia thành bốn
chi: Mastrevirus, Begomovirus, Curtovirus và Topocuvirus [37]. Trong đó
Begomovirus là chi có số lợng loài lớn nhất trong họ, tác nhân truyền bệnh là bọ
phấn (Bemisia tabaci), vật chủ là cây 2 lá mầm nh: đậu, da hấu, bông, hồ tiêu, thuốc

lá, khoai tây và cà chua [25]. Khác với các chi khác trong họ đều có hệ gen gồm
một vòng ADN sợi đơn, hệ gen của các loài trong chi Begomovirus tìm thấy ở châu
Mĩ có thể gồm hai vòng ADN sợi đơn. Trong khi đó, hệ gen của những loài tìm thấy
ở châu á, châu âu và châu Phi có thể có một vòng hoặc hai vòng ADN sợi đơn [36].
1.2.2.2. Đặc điểm cấu tạo
Geminivirus đợc Goodman mô tả lần đầu tiên vào năm 1977. TYLCV có
dạng hình chày, kích thớc khoảng 18 nm x 30 nm. Lớp protein vỏ có trọng lợng
khoảng 28-34 x 10
3
đvc gồm 22 capsom giống nhau, mỗi capsom gồm 5 phân tử
protein vỏ [25].
TYLCV lần đầu tiên đợc phân lập hoàn chỉnh vào năm 1991 ở Sardinia [19]
và Israel [26]. Hệ gen gồm một vòng ADN sợi đơn, có kích thớc khoảng 2,8 Kb,
gồm sáu gen nằm trong hai vùng dịch mã ngợc chiều, ngăn cách bởi một vùng liên
gen có khoảng 300 nucleotit. Họ Geminiviridae có vùng khởi đầu sao chép nằm
trong vùng liên gen đều có trình tự là TAATATTAC (vùng có dấu chấm đen) [25], [37].
5
Hình 3. ảnh chụp vi rút xoăn lá cà chua dới kính hiển vi điện tử [17]
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
Bốn gen: C1, C2, C3, C4, có chiều dịch mã ngợc chiều với hai gen V1 và V2.
Trong đó gen V1 mã hóa loại protein cần thiết cho sự tạo vỏ ngoài genom, sự lan
truyền và nhận ra vectơ truyền nhiễm ; gen C1 mã hóa loại protein cần thiết cho quá
trình sao chép của cả hai vùng dịch mã ; gen C2 mã hóa protein có vai trò hoạt hóa
quá trình phiên mã gen V1 và V2 ; gen C3 mã hóa loại protein có tác dụng hoạt hóa
quá trình sao mã và cùng với gen C1 tăng cờng khả năng phân chia hệ gen của vi
rút ; gen C4, V2 mã hóa protein liên quan đến sự gây bệnh đối với thực vật và sự vận
chuyển của vi rút [37].
1.2.2.3. Sự đa dạng về hệ gen của các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua
Bởi những thiệt hại nghiêm trọng do TYLCV gây ra, nghiên cứu về TYLCV
đợc nhiều nớc quan tâm nh: Thái Lan, Australia, Trung quốc, Brazil, Mĩ, ấn Độ, Đài

Loan, Nhật Bản . Hiện nay, ngoài loại vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua có một vòng
ADN sợi đơn ngời ta còn phát hiện ra loại vi rút có hai vòng ADN sợi đơn kí hiệu là
vòng ADN-A và vòng ADN-B [15], [27]. Trong đó, vòng ADN-A gồm các gen mã
hoá protein cần thiết cho sự sao chép và lắp ráp của vi rút, còn vòng ADN-B gồm
các gen mã hoá protein cần thiết cho sự lan truyền của vi rút [36].
6
Hình 4. Cấu trúc hệ gen của TYLCV có một vòng ADN sợi đơn [25]
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
Có loại vi rút cũng có hai vòng ADN sợi đơn, một là vòng ADN-A còn vòng
thứ hai không phải là vòng ADN-B mà vòng ADN-B đợc thay thế bằng một vòng
ADN vệ tinh, gọi là vòng ADN-beta [20]. Trình tự nucleotit của vòng ADN-beta đợc
phân lập ở những vùng khác nhau có sự khác nhau rõ rệt. Ngời ta còn thấy rằng, với
những cây cà chua bị nhiễm TYLCV có vòng ADN-beta thì biểu hiện bệnh nặng
hơn cây nhiễm TYLCV không mang vòng ADN-beta [40]. Chowda Reddy và cộng
sự (2005) đã tiến hành thí nghiệm với 103 mẫu cà chua từ những vùng trồng cà chua
chính ở ấn độ, có 81 mẫu cho kết quả dơng tính với vi rút TYLCV. Trong đó 65
mẫu, hệ gen vi rút gồm hai vòng ADN sợi đơn, một vòng là ADN-A, vòng thứ hai
hoặc là vòng ADN-B hoặc là vòng ADN-beta [13]. Li và cộng sự (2004) đã tiến
hành thí nghiệm với 14 mẫu cà chua thu từ ba huyện trong tỉnh Vân Nam, Trung
Quốc. Cả 14 mẫu đều cho kết quả dơng tính với TYLCV và những chủng TYLCV
này thuộc vào bốn nhóm khác nhau. Nhóm I và III hệ gen đều có vòng ADN-beta.
Khi phân lập hoàn chỉnh trình tự nucleotit vòng ADN-beta với ba mẫu ở nhóm III,
thì ngời ta thu đợc những trình tự ADN-beta khác với những vòng ADN-beta công
bố trớc đó [23]. ở Nhật Bản Shimizu và Ikeami (1999) đã tiến hành phân lập hệ gen
của chủng vi rút TYLCV có một vòng ADN sợi đơn. Qua kết quả so sánh cho thấy
trình tự nucleotit của chủng vi rút phân lập giống nhất là với TYLCTwV (TYLCV ở
Đài Loan) (76%), so với các chủng vi rút khác thì chúng có sự khác nhau tơng đối
[32]. Trình tự các gen cấu trúc của vi rút nh gen C1, C2, C3, C4, V1, V2 mã hoá các
protein chức năng tơng ứng của vi rút cũng có sự khác nhau ở những loại vi rút xâm
nhiễm ở cây trồng khác vùng. Có loại vi rút có vùng trình tự các nucleotit hoàn toàn

không giống với những vùng tơng ứng của những loại vi rút đã phát hiện trớc đó
[39]. Xie và Zhou (2003) ở Trung Quốc đã phân lập hoàn chỉnh vòng ADN-A của
7
Hình 5. Cấu trúc hệ gen của TYLCV gồm hai vòng ADN sợi đơn [30]
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
TYLCV thì kết qủa cho thấy ADN-A giống nhất với TYLCThV (TYLCV ở Thái
Lan) giống 84%. Vòng ADN-A của chủng vi rút phân lập có vùng từ nucleotit
74-2071 là giống 95% với TYLCThV, vùng nucleotit 2071-2457 giống 91% với
PeLCBDV (Pepper leaf curl virus from Bangladesh), và vùng còn lại thì rất khác với
những chủng vi rút đợc công bố trình tự trớc đó [39]. Qua những nghiên cứu trên
chúng ta có thể thấy rằng các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua có độ đa dạng rất lớn
về bộ gen. Ngoài ra các nghiên cứu này còn cho thấy có xảy ra sự tái tổ hợp của các
chủng TYLCV để hình thành các chủng mới.
1.2.2.4. Cơ chế lây truyền của vi rút
TYLCV xâm nhập vào cây trồng qua bọ phấn trắng (Bemisia tabaci). Khi
nhiễm vào tế bào thực vật, phần ADN vòng đơn của vi rút sẽ xâm nhập vào nhân của
tế bào chủ và sử dụng những nguyên liệu của vật chủ để sao chép và tổng hợp ra
protein vỏ, hoàn thiện cấu trúc vi rút. Theo Revington và cộng sự (1989), sự sao
chép hệ gen của vi rút bắt đầu từ một vị trí đặc biệt trong vùng mở đầu gồm khoảng
30 nucleotit và diễn ra theo 2 hớng quanh phân tử, tạo thành hai vòng khép kín [28].
Một nuclease cắt một trong hai vòng và đầu 3-OH của sợi bị cắt sẽ làm mồi để gắn
thêm các nucleotit. Sợi nguyên vẹn bổ sung đợc làm khuôn. Nh vậy, đầu 5-OH bị
thay thế và sau đó đợc sao chép. Theo cách này phân tử sợi kép đợc tổng hợp có thể
dài gấp nhiều lần NST của vi rút, sau đó bị cắt thành những NST của hạt vi rút. Các
NST này sẽ đợc dịch mã để tạo các protein cần thiết cho vi rút [35].
8
Hình 6. Sơ đồ minh họa cơ chế phiên mã ADN sợi đơn dạng vòng [35]
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
1.3. cây chuyển gen kháng vi rút và một số thành tựu đ đạt đã ợc
trong cải tiến giống cây trồng bằng công nghệ gen

1.3.1. Cơ chế kháng bệnh vi rút của cây chuyển gen
Cây trồng có tính kháng khác nhau với các loại vi rút khác nhau, nó có thể là
vật chủ hoặc không là vật chủ của những loại vi rút xác định. Vi rút có thể xâm
nhiễm vào cây chủ, lan truyền gây bệnh làm cây chủ giảm hay mất khả năng sinh tr-
ởng, phát triển, sinh sản. Trong quá trình tiến hóa, vi rút dần hình thành những cơ
chế bảo vệ khỏi tính kháng tự nhiên của vật chủ để dễ dàng xâm nhập và gây bệnh [5].
Với cây chuyển gen, chúng ta đã tạo ra tính kháng tích cực và hiệu quả cho
cây trồng chống lại vi rút. Có nhiều cách giải thích về tính kháng của cây chuyển
gen, theo Baulcombe (1996) tính kháng của cây chuyển gen gọi là tính kháng có đ-
ợc nhờ chính yếu tố gây bệnh-PDR (pathogen-derived resistance) [12]. Gen đợc
chuyển vào cây là những gen có chức năng khác nhau của vi rút nh: gen mã hóa
protein vỏ, gen mã hóa protein vận chuyển , hay gen đ ợc thiết kế có đầu là những
đoạn lặp lại ngợc chiều. PDR có thể có cơ chế thông qua protein (post translation),
sản phẩm của những gen đợc chuyển vào sẽ cản trở quá trình tạo lớp protein vỏ, làm
quá trình lắp ráp không xảy ra đợc và cản trở sự lan truyền của vi rút trong cây. PDR
có thể có cơ chế thông qua ARN (post transcription). Mặc dù cơ chế của nó cha đợc
xác định rõ, xong có thể là liên quan đến ARN sợi đôi và những sợi ARN đơn ngắn,
RdRps, ARN helicases và RNase [16]. Khi vi rút TYLCV xâm nhập, trong tế bào
xuất hiện tín hiệu bảo vệ, sợi ARN đôi đợc tạo thành từ những ARN của vi rút và
ARN của những gen chức năng của vi rút TYLCV đã đợc chuyển vào cây trớc đó d-
ới tác dụng của RdRp. Sợi ARN này sẽ bị cắt thành những đoạn ARN đôi ngắn, với
hai đầu có 2-3 nucleotit nhô ra, dới tác dụng của Dicer (một nuclease). Những đoạn
ARN ngắn này có tác dụng làm mồi để tổng hợp nên những sợi ARN đôi, dựa vào
những ARN lạ làm khuôn (chính là những ARN của vi rút), và nó còn tạo phức
RNase, khi kết hợp với protein elF2C (nhân tố khởi đầu), ARN helicase, Dicer (một
loại nuclease). Phức này có thể cắt những ARN đôi tiếp tục lại tạo thành những
ARN đôi ngắn với hai đầu có 2-3 nucleotit nhô ra, ARN này lại làm mổi, để loại bỏ
dần những ARN lạ. Nh vậy theo mô hình kháng này thì hiệu quả của nó phụ thuộc
vào độ tơng đồng của những đoạn ARN làm mồi với ARN lạ.
9

Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
1.3.2. Một số thành tựu đã đạt đợc trong cải tiến giống cây trồng bằng công
nghệ gen
Việc chuyển gen vào cây trồng cho đến nay không là vấn đề còn phải tranh
cãi nữa mà đã trở thành kĩ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng. Đã có hơn 50
loại gen đã đợc chuyển nạp vào cây trồng và ít nhất có khoảng 400 loại cây mang
gen biến nạp đợc trồng thử ở điều kiện đồng ruộng nh cà chua, bông, cải dầu, ngô,
khoai tây [2], với các đặc tính nh : kháng vi rút, kháng côn trùng, chín chậm, chống
chịu chất diệt cỏ, tăng hàm lợng chất dinh dỡng [10]. Đến hết năm 2002 đã có trên
52,6 triệu ha cây trồng chuyển gen đợc canh tác trên thế giới [18]. Các quốc gia hiện
nay trồng các cây chuyển gen nh: Achentina, úc, Bungary, Canada, Trung Quốc,
Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Tây Ban Nha, Nam Phi, Urugoay, Brazil và Mỹ [10].
Bên cạnh những vấn đề cha rõ về cây chuyển gen nh: mối nguy cơ trong việc vô tình
đa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dỡng sản phẩm, khả năng phát tán
những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng hoang dại , thì chúng ta không
thể phủ nhận những giá trị kinh tế của nó đem lại. Do các đặc tính u việt của nó, cây
chuyển gen ngày càng đợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi.
1.4. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu
bệnh vi rút
1.4.1. Kĩ thuật PCR
Kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction-chuỗi phản ứng trùng hợp nhờ
Polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Đây là kĩ thuật nhân
nhanh một đoạn ADN, dựa vào một ADN khuôn (là một đoạn ADN mang đoạn
ADN ngắn cần nhân) và cặp mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả
năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ enzym ADN polimerase
(ngày nay sử dụng phổ biến loại enzym bền với nhiệt nh Taq polimerase) xúc tác nối
dài mồi để thành mạch mới, trong sự có mặt của các nucleotit tự do (dNTP), Mg
2+
.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp. Mỗi chu kì gồm ba bớc:

+ Bớc 1 -Biến tính ADN- ADN đợc biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ Tm
của phân tử, thờng khoảng 94-95
0
C trong vòng từ 30 giây đến 1 phút, để tạo ADN
sợi đơn.
+ Bớc 2 -Bắt cặp- Mồi bắt cặp với ADN, ở nhiệt độ từ 40-70
0
C, tùy thuộc vào
tỉ lệ và số lợng từng loại nucleotit của đoạn mồi và kéo dài khoảng 30 giây-1 phút.
10
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
+ Bớc 3 -Tổng hợp chuỗi ADN- Nhiệt độ đợc tăng lên 72
0
C, giúp cho enzym
Taq polimerase hoạt động tốt nhất, để tổng hợp mạch ADN mới bổ sung theo chiều
5-3 bắt đầu từ vị trí gắn mồi, thời gian tổng hợp tùy thuộc vào độ dài của trình tự
ADN cần khuếch đại, từ 30 giây đến vài phút.
Số lợng ADN sau mỗi một chu kì tăng lên gấp đôi. Vậy sau n chu kì thì số l-
ợng chuỗi ADN sẽ là 2
n
[7].
1.4.2. Kỹ thuật tách dòng
Tách dòng thực chất là nhằm thu một gen hay một trình tự ADN với số lợng
lớn. Đầu tiên, là gắn một gen mong muốn vào vectơ tách dòng để tạo nên vectơ tái
tổ hợp sau đó chuyển vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ. Trong các tế bào chủ, các
vectơ tách dòng đợc nhân lên một số lợng lớn bản sao của gen ban đầu. Ta sẽ thu đ-
ợc ADN qua các bớc tách chiết. Tách dòng gồm 5 bớc:
+ Chọn và xử lí vectơ: Vectơ tách dòng là các phân tử ADN có kích thớc nhỏ
cho phép gắn các gen, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế
bào. Vectơ đợc xử lí bằng các enzym giới hạn, và hai đầu chỗ mối cắt đợc xử lí để

không thể nối lại với nhau.
+ Xử lí ADN cần đợc tạo dòng: Chọn những đoạn ADN có kích thớc gần
giống nhau và tơng ứng với vectơ đã chọn, sau đó ADN đợc xử lí để có hai đầu tơng
ứng với vectơ (bằng cách xử lí với cùng loại enzym với vectơ).
+ Tạo vectơ tái tổ hợp: Trộn vectơ tách dòng và các đoạn ADN cần gắn với
một tỉ lệ xác định, có sự tham gia của ADN ligase để tạo vectơ tái tổ hợp. ADN sẽ
gắn vào vectơ ở hai đầu tơng ứng.
+ Chuyển vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ: Chuyển bằng phơng pháp biến nạp,
với mục đích qua tế bào chủ các vectơ tái tổ hợp sẽ đợc nhân lên với số lợng lớn các
bản sao. Các tế bào chủ đợc chọn phù hợp với vectơ tái tổ hợp, thờng là tế bào
E.coli.
+ Chọn và sàng lọc ra các thể tái tổ hợp: Nuôi cấy vi khuẩn có vectơ tái tổ
hợp trong môi trờng thích hợp. Sử dụng các gen chỉ thị để tiến hành chọn lọc các
khuẩn mang gen tái tổ hợp [4].
1.4.3. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)
Hiện nay, có rất nhiều phơng pháp để xác định tế bào vi khuẩn có plasmit
mang gen mong muốn, nh phơng pháp colony-PCR, cắt plasmit bằng các enzym hạn
chế, hoặc PCR từ plasmit. Trong đó phơng pháp colony-PCR cho phép phát hiện
11
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
nhanh khuẩn lạc mang plasmit tái tổ hợp mong muốn. Phơng pháp này có u điểm là
nhanh, ít tốn kém và đơn giản. Hiện nay, kỹ thuật này đợc ứng dụng rất rộng rãi
trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR dựa trên nguyên tắc kỹ thuật PCR, chỉ khác
ở chỗ mẫu ADN đợc thay bằng ADN plasmit giải phóng từ khuẩn lạc. ở nhiệt độ
cao (94-95
0
C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmit tái tổ hợp. Plasmit
tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu.
1.4.4. Kỹ thuật xác định trình tự ADN

Hiện nay có nhiều phơng pháp xác định trình tự ADN. Chúng tôi sử dụng ph-
ơng pháp enzym học của Sanger và cộng sự (1977) [32]. Phơng pháp này tiến hành
phản ứng tổng hợp các phân tử ADN, dới xúc tác của enzym ADN polymerase, với
khuôn là đoạn ADN cần xác định trình tự, trong sự có mặt của một hàm lợng nhỏ
dẫn xuất dideoxy của các nucleotit (ddNTP). Nhóm 3OH của nucleotit đợc thay
bằng H. Điều này khiến cho các dideoxynucleotit không còn khả năng hình thành
các cầu nối phosphodiester và do đó ngừng quá trình tổng hợp. Trong kỹ thuật đọc
trình tự nucleotit tự động, mỗi dideoxynucleotit đợc đánh dấu bằng một fluochrome
có màu khác nhau. Nh vậy, tất cả oligonucleotit cùng chấm dứt tại một loại
dideoxynucleotit sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trong ống vi mao quản, tạo ra
một dãy các phân đoạn ADN hơn kém nhau một nucleotit. Thiết bị phát hiện huỳnh
quang (detector) phát hiện các băng theo thời gian, băng nào xa nhất đợc phát hiện trớc.
Detector phát tín hiệu lên máy tính. Detector là một thiết bị khuếch đại tín hiệu. Kết
quả xác định trình tự sẽ đợc xử lý bằng phần mềm máy tính chuyên dụng.
12
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
Chơng 2. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
2.1.Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Các mẫu lá cà chua bị nghi nhiễm bệnh xoăn lá đợc chúng tôi thu thập tại
những vùng chuyên canh cây cà chua thuộc các các tỉnh: Hà Nội, Bắc Ninh, Hng
Yên, Thái Bình, Hải Dơng, Quảng Ninh. Do điều kiện thời gian không cho phép nên
chúng tôi mới chỉ tiến hành thí nghiệm với 6 tỉnh trên (bảng 1).
Bảng 1. Danh sách các mẫu lá cà chua nhiễm TYLCV đợc sử dụng
trong nghiên cứu
STT Tên vùng thu mẫu Ký hiệu
1 Hà Nội HN
2 Bắc Ninh BN
3 Hng Yên HY
4 Thái Bình TB

5 Hải Dơng HD
6 Quảng Ninh QN
Bảng 2. Mã số các trình tự gen CP trong Ngân hàng gen quốc tế đợc sử dụng trong
nghiên cứu
STT Mã số trong NCBI Vùng phân lập Viết tắt
1 AY594174 Ai Cập TLCV-Egy-AY594174
2 U38239 ấn Độ TLCV-IND-U38239
3 Z48182 ấn Độ TLCV-IND-Z48182
4 AJ865337 Bangladesh TYLCV-BLD-AJ865337
5 AF105975 Bồ Đào Nha TLCV-Port-AF105975
6 AJ223505 Cuba TLCV-CUB-AJ223505
7 AF024715 Dominica TLCV-DR-AF024715
8 U88692 Đài Loan TLCV-TW-U88692
9 AJ132711 Iran TLCV-Iran-AJ132711
10 X15656 Israel TLCV-IS-X15656
11 AF195782 Lào TLCV-LAO-AF195782
12 AF414287 Malaysia PeLCV-MAL-AF414287
13 K02029 Mexico TGMV-MEX-K02029
14 AY044138 Mỹ TYLCV-USA-AY044138
15 AF206674 Myanma TLCV-MM-AF206674
16 AB116633 Nhật Bản TLCV-JP-AB116633
17 AB116635 Nhật Bản TLCV-JP-AB116635
18 AB116634 Nhật Bản TLCV-JP-AB116634
19 AB116636 Nhật Bản TLCV-JP-AB116636
20 AB116632 Nhật Bản TLCV-JP-AB116632
21 AB116629 Nhật Bản TLCV-JP-AB116629
13
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
22 AB116630 Nhật Bản TLCV-JP-AB116630
23 AB116631 Nhật Bản TLCV-JP-AB16631

24 AB192965 Nhật Bản TLCV-JP-AB192965
25 AB192966 Nhật Bản TLCV-JP-AB192966
26 AB050597 Philippin TLCV-PHL-AB050597
27 AY134494 Puertorico TLCV-PR-AY134494
28 AJ519441 Tây Ban Nha TLCV-SP-AJ519441
29 X61153 Tây Ban Nha TYLCV-X61153
30 NC004569 Tây Ban Nha TYLCV-NC004569
31 AY514630 Thái Lan TLCV-THL-AY514630
32 AJ495812 Thái Lan TLCV-THL-AJ495812
33 AY514632 Thái Lan TLCV-THL-AY514632
34 AY514631 Thái Lan TLCV-THL-AY514631
35 NC000869 Thái Lan TLCV-THL-NC000869
36 AJ558125 Trung Quốc PLCV-CHN-AJ558125
37 AY602165 Trung Quốc TLCV-CHN-AY602165
38 AY602166 Trung Quốc TLCV-CHN-AY602166
39 AJ566744 Trung Quốc TLCV-CHN-AJ566744
40 AF311734 Trung Quốc TLCV-CHN-AF311734
41 AJ457985 Trung Quốc TLCV-CHN-AJ457985
42 AJ457986 Trung Quốc ToCSV-CHN-AJ457986
43 S53251
úc
TLCV-AUS-S53251
2.1.2. Hoá chất, môi trờng nuôi cấy vi khuẩn và thiết bị sử dụng
+ Hoá chất
- Thang ADN chuẩn của hãng MBI Fermentas (Đức).
- Kit thôi gen, Kit tách plasmit của Qiagen (Đức).
- Kit tinh sạch ADN plasmit.
- Bộ hoá chất sử dụng cho phản ứng PCR của Applied Biosystem (Mỹ).
- Các hoá chất thông dụng khác đợc mua của các hãng Merck (Đức), Sigma
(Mỹ), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển).

+ Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật
Bảng 3. Thành phần môi trờng nuôi cấy vi sinh vật
Môi trờng Thành phần
LB lỏng 10 g/l Bacto-tryptone; 5 g/l Yeast extract; 10 g/l NaCl.
LB đặc LB lỏng + 15 g/l Bacto- agar.
14
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
+ Thiết bị
Máy ly tâm, bàn soi gel, bộ điện di, tủ nuôi cấy vi sinh vật, máy chụp ảnh,
pipet man, máy làm khô ADN, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và
các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm
trọng điểm về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số
ADN tổng số của lá cà chua nhiễm bệnh đợc tách chiết theo phơng pháp của
Accotto và cộng sự (2000).
- Nghiền 0,15 g lá cà chua nhiễm bệnh trong nitơ lỏng.
- Bổ sung 500 àl Extraction buffer, đảo đều. ủ hỗn hợp ở 65
o
C trong 5 phút.
- Bổ sung thêm 500 àl Kaliacetat 5 M. ủ 0
0
C trong 10 phút. Li tâm 13.000 v/
p trong 5 phút.
- Chuyển khoảng 500 àl dịch nổi sang ống mới.
- Loại protein bằng cách bổ sung 500 àl Phenol:Chloroform:Isoamin
(25:24:1). Đảo đều hỗn hợp, li tâm 13.000 v/p trong 15 phút. Chuyển 350 àl
pha nớc trên sang ống mới.
15
Thu thập mẫu TYLCV

Hình 7. Sơ đồ thí nghiệm
Tách ADN tổng số
Nhân gen CP bằng PCR
Khai thác trình tự trong NCBI
Thiết kế mồi
Tách dòng gen
Xác định và so sánh trình tự
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan
- Bổ sung thêm 350 àl Isopropanol lạnh, đảo đều. Li tâm 13.000 v/p trong 5
phút.
- Rửa ADN bằng 500 àl ethanol 70%.
- Để khô tủa và hoà tan trong 100 àl TE (có bổ sung RNase).
Extraction bufer: 100 mM Tris HCL, pH=8 ; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl;
1% SDS; 10 mM -mercaptoethanol, hoặc axit xitric 10 mM.
2.2.2. Nhân gen đặc hiệu bằng phơng pháp PCR
Trên cơ sở trình tự gen CP đã đợc công bố trong ngân hành gen
thế giới, chúng tôi thiết kế cặp mồi, để nhân gen CP của vi rút thông qua
phản ứng PCR.
Bảng 4. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần
Thể tích (àl)
Nớc cất hai lần
Buffer PCR (10X)
dNTP
MgCl
2
prC324N
prV889N
ADN mẫu
Taq ADN polymerase

14
2,5
2
2
1
1
2
0,5
Tổng 25
Bảng 5. Chu trình thực hiện phản ứng PCR
2.2.3. Điện di phân tích ADN trên gel Agarose
Nguyên tắc: Phơng pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc tích điện âm của axit
nucleic. ADN với những kích thớc và khối lợng khác nhau, sẽ di chuyển với tốc độ
khác nhau trong điện trờng từ cực âm sang cực dơng tạo thành các băng khác nhau.
stt Phản ứng Nhiệt độ (
O
C) Thời gian Chu kỳ
1
2
3
4
5
6
Biến tính
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài
Hoàn tất kéo dài
Kết thúc phản ứng
94

94
58
72
72
4
2 phút
30 giây
30 giây
45 giây
10 phút

1


1
16
x 30