Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ giống meloidogyne ở tây nguyên
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (7.8 MB, 273 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
LÊ THỊ MAI LINH
NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH
GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN
LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
HÀ NỘI – 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
LÊ THỊ MAI LINH
NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH
GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN
LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
Chuyên ngành: Tuyến trùng học
Mã số: Thí điểm
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. TS. Trịnh Quang Pháp
2. PGS. TS. Phan Kế Long
Hà Nội – 2019
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan :
Luận án „NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY SẦN RỄ
Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN‟‟là công trình do bản thân tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn khoa học của TS. Trịnh Quang Pháp và PGS.TS. Phan Kế Long. Các trích
dẫn trong luận án theo các nguồn công bố đầy đủ. Số liệu, kết quả nêu trong Luận
án là trung thực và chưa công bố hoặc công bố trong các bài báo khoa học mà tôi là
tác giả hoặc đồng tác giả.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả luận án
Lê Thị Mai Linh
22
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này trước tên, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS.
Trịnh Quang Pháp và PGS.TS. Phan Kế Long đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn TS. Vũ Thị Thanh Tâm, ThS. Nguyễn Thị Duyên, ThS.
Nguyễn Hữu Tiền, TS. Nguyễn Thị Ánh Dương đã hỗ trợ tôi trong quá trình hoàn
thiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh
vật, phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, phòng Tuyến trùng học, Học
viện Khoa học và Công nghệ cùng các đồng nghiệp, Thầy Cô trong Viện Sinh thái
và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận án.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia
(NAFOTED) trong đề tài mã số:106–NN.03–2013.56; Viện sinh thái và Tài nguyên
sinh vật (IEBR) trong đề tài mã số: IEBR.ĐT/04/17-18, IEBR.ĐT/04/G2-18 đã hỗ trợ
kinh phí để tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu.
Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả luận án
Lê Thị Mai Linh
33
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. vi
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. ix
MỞ
ĐẦU
....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................5
1.1.Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới...5
1.1.1.
Lịch
sử
cứu......................................................................................................... 5
nghiên
1.1.2. Đặc điểm sinh học, vòng đời của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne
............... 7
1.1.3.
Khả
năng
gây
hại
...................................................................... 9
trên
một
số
cây
trồng
1.1.4. Nghiên cứu phân loại các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne
...... 11
1.1.4.1. Phương pháp phân tích hình thái ..............................................................................
11
1.1.4.2. Phương pháp phân tích phân tử ................................................................................
13
1.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Việt Nam
...............................................................................................................................
....16
1.2.1.
Tình
hình
nghiên
cứu
............................................................... 16
chung
tại
Việt
Nam
1.2.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ Meloidogyne tại Tây Nguyên
.............. 18
1.2.2.1. Tổng quan Tây Nguyên ..............................................................................................
19
1.2.2.2. Tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Tây Nguyên..........................................
21
1.3.
Biện
pháp
phòng
trừ
Meloidogyne.................................... 22
sinh
học
tuyến
trùng
sần
rễ
CHƢƠNG 2 NỘI DUNG, ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................27
2.1. Nội dung, đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu .................27
2.1.1.
Nội
dung
nghiên
................................................................................................... 27
cứu
44
2.1.2.
Đối
tượng
nghiên
.................................................................................................. 27
cứu
2.1.3.
Vật
liệu
nghiên
...................................................................................................... 27
cứu
2.1.4.
Thời
gian,
địa
cứu.................................................................................. 27
điểm
nghiên
2.2.
Phƣơng
pháp
cứu.................................................................................28
2.2.1.
Khảo
sát
thực
địa
............................................................. 28
và
phương
pháp
thu
mẫu
tuyến
trùng
từ
đất
trùng
từ
2.2.2.
Phương
pháp
tách
lọc
.................................................................. 29
2.2.3
Phương
pháp
tách
rễ..................................................................... 30
2.2.4.
Nhân
nuôi
tuyến
spp....................................................... 30
lọc
trùng
nghiên
tuyến
sần
rễ
Meloidogyne
2.2.5. Phương pháp xử lý làm trong và làm tiêu bản tuyến trùng
.................................... 31
2.2.6.
Nghiên
cứu
hình
................................................................................................... 33
thái
55
2.2.7. Nghiên cứu đa dạng di
truyền.................................................................................... 35
2.2.7.1. Tách chiết DNA .......................................................................................................... 35
2.2.7.2. Phản ứng PCR ............................................................................................................ 36
2.2.7.3. Điện di sản phẩm........................................................................................................
37
2.2.7.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và đọc trình tự DNA........................................................
38
2.2.7.5. Phân tích trình tự DNA ..............................................................................................
38
2.2.7.6. Thiết lập cây phát sinh chủng loại.............................................................................
38
2.2.8. Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng
........................................... 38
2.2.8.1. Nấm Paecylomyces javanicus....................................................................................
38
2.2.8.2. Vi khuẩn Lysobacter antbiotcus HS124..................................................................
39
2.2.8.3. Ảnh hưởng của hợp chất 4-HydroxyphenylacetcAcid (4-HPAA) đến tuyến
trùng
M. incognita.............................................................................................................................. 39
2.2.8.4. Phân tích số
liệu.......................................................................................................... 40
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...............................41
3.1. Tần suất xuất hiện, đặc điểm phân bố, khả năng gây hại của các loài tuyến
trùng sần rễ giống Meloidogyne
.............................................................................41
3.1.1. Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên
một số
cây trồng ở Tây Nguyên
......................................................................................................... 41
3.1.2. Phân bố, mật độ của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne bắt gặp
trên các vùng thu mẫu và cây chủ
................................................................................................ 43
3.2. Đặc điểm hình thái các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên
................................................................................................................................
...49
3.2.1. Loài Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949 .................
49
3.2.1.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng......................................................................
49
66
3.2.1.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại .................................................................
50
3.2.2. Loài Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949.....................................
61
3.2.2.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng......................................................................
61
3.2.2.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại .................................................................
68
3.2.3. Loài Meloidogyne arenaria (Neal, 1889) Chitwood, 1949......................................
69
3.2.3.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng......................................................................
70
3.2.3.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại .................................................................
70
3.2.4. Loài Meloidogyne enterolobii Yang, Eisenback., 1983 ...........................................
80
3.2.4.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng......................................................................
80
3.2.4.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại .................................................................
87
3.2.5. Loài Meloidogyne graminicola Golden & Birchfield 1965 .....................................
90
3.2.5.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng......................................................................
90
3.2.5.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại .................................................................
91
77
3.2.6. Loài Meloidogyne daklakensis Trinh, Le, Nguyen, Nguyen, Liebanas & Nguyen,
2018.........................................................................................................................................
.. 97
3.2.7. Loài Meloidogyne sp...................................................................................................
106
3.3. Đa dạng hình thái, hình thái lƣợng các loài Meloidogyne ..........................113
3.3.1. Phân tích đa dạng hình thái lượng giữa các loài Meloidogyne............................
113
3.3.2. So sánh hình thái giữa các loài Meloidogyne spp. .................................................
118
3.4 . Phân tích đa dạng di truyền các loài Meloidogyne spp. .............................127
3.4.1. Phản ứng Multiplex-PCR..........................................................................................
127
3.4.2. Phân tích đa dạng di truyền ......................................................................................
128
3.4.2.1 Vùng gen ITS.............................................................................................................. 129
3.4.2.2 Vùng gen D2D3 ......................................................................................................... 133
3.4.2.3. Vùng gen COI ........................................................................................................... 137
3.4.2.4. Vùng gen COII-16S .................................................................................................. 141
3.4.2.5. Vùng gen NAD5........................................................................................................ 146
3.5. Đánh giá ảnh hƣởng của một số vi sinh vật đối kháng ...............................150
3.5.1. Nấm Paecylomyces javanicus ..................................................................................
150
3.5.1.1. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ nở của trứng của
tuyến trùng M.
incognita.................................................................................................................. 150
3.5.1.2. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ chết của ấu trùng
M. incognita..................................................................................................................................
151
3.5.2. Vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 ..............................................................
154
3.5.2.1. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antbiotcus HS124 đến sự nở trứng
của tuyến trùng M.
incognita........................................................................................................ 154
3.5.2.2. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antbiotcus HS124 đến ấu trùng
M. incognita..................................................................................................................................
155
3.5.3. Ảnh hưởng của 4-HPAA tới tuyến trùng Meloidogyne incognita .....................
158
CHƢƠNG
4............................................................................................................161
88
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................161
4.1. KẾT LUẬN
.....................................................................................................161
4.2. KIẾN NGHỊ
....................................................................................................162
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...........................................163
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................164
66
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
Diễn giải
16S-rRNA 16S Ribosomal Axit Ribonucleic
ADF
Actn depolymerizing factor
ANOVA
One-way analysis of variance (Phân tích phương sai một yếu tố)
CDA
Canonical discriminant analysis (Phân tích chỉ số khác biệt)
COI
Cytochrome c oxidase subunit 1
COII
Cytochrome c oxidase subunit 2
ĐC
Đối chứng
DMSO
Dimethyl sulphoxide
DNA
Deoxyribonucleic acid (Axit Deoxyribonucleic)
EDTA
Ethylenediamine tetraacetc acid (Axit ethylenediamine tetraacetc )
ETS
E26 transformaton-specific
GA
Gallic acid (Axit galic)
HPAA
Hydroxyphenylacetic acid (Axit hydroxyphenylacetc)
IGS
Intergenic spacer
ITS
Internal transcribed spacer
MIG
Meloidogyne incognita group
NAD5
Nicotnamide adenine dinucleotde dehydrogenase subunit 5
NCBI
Natonal Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông
tn công nghệ sinh học quốc gia)
PCR
Polymerase Chain Reacton (Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase)
RAPD
Random Amplificaton of Polymorphic DNA (Đa hình DNA nhân
bản ngẫu nhiên)
SCAR
Sequence Characterized Amplified Region (Nhân bản chuỗi DNA
được mô tả)
SEM
Scanning Electron Microscope (Hiển vi điện tử quét)
STT
Số thứ tự
TAE
Tris-acetate-EDTA
TAF
Triethanolamine formalin
VSV
Vi sinh vật
WLB
Worm lysis bufer
77
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu
....................................................... 37
Bảng 3.1. Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng Meloidogyne spp. trên một số
cây trồng ở Tây nguyên
.................................................................................................................. 43
Bảng 3.2. Phân bố của các loài Meloidogyne bắt gặp trên các vùng thu mẫu, cây chủ
...... 45
Bảng 3.3. Danh sách mẫu và mật độ các loài tuyến trùng Meloidogyne ghi nhận được
... 47
Bảng 3.4. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và
các
nghiên cứu trước ......................................................................................................................
53
Bảng 3.5. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và
các
nghiên cứu trước ......................................................................................................................
54
Bảng 3.6. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và
các
nghiên cứu trước ......................................................................................................................
57
Bảng 3.7. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và nghiên
cứu
trước ..........................................................................................................................................
62
Bảng 3.8. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và
các
nghiên cứu trước ......................................................................................................................
63
Bảng 3.9. Số đo con đực quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và nghiên
cứu
trước. .........................................................................................................................................
65
Bảng 3.10. Số đo con cái các quần thể tuyến trùng loài Meloidogyne arenaria (số đo
theo
µm) và nghiên cứu trước .........................................................................................................
73
Bảng 3.11. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và
nghiên
cứu trước...................................................................................................................................
74
88
Bảng 3.12. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và
nghiên
cứu trước...................................................................................................................................
76
Bảng 3.13. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và
các
nghiên cứu trước ......................................................................................................................
81
Bảng 3.14. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và
các
nghiên cứu trước đó .................................................................................................................
82
Bảng 3.15. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và
các
nghiên cứu trước đó .................................................................................................................
84
Bảng 3.16. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và
các
nghiên cứu trước ......................................................................................................................
92
Bảng 3.17. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và
các
nghiên cứu trước ......................................................................................................................
93
Bảng 3.18. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và
các
nghiên cứu trước ......................................................................................................................
94
Bảng 3.19. Số đo các quần thể Meloidogyne daklakensis n. sp..........................................
102
Bảng 3.20. Số đo các quần thể tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp
................................... 110
Bảng 3.21. Bảng chỉ số CDA giữa các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne....................
114
viii
9
Bảng 3.22. Đặc điểm so sánh hình thái lượng của các loài tuyến trùng
Meloidogyne...... 119
Bảng 3.23. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen ITS...........................................
130
Bảng 3.24. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự vùng gen D2D3 giữa các loài
Meloidogyne spp. ................................................................................................................... 134
Bảng 3.25. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen COI giữa các loài
Meloidogyne
spp. .......................................................................................................................................... 138
Bảng 3.26. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen COII-16S giữa các loài
Meloidogyne spp. ................................................................................................................... 142
Bảng 3.27. Tỷ lệ % các loại nucleotde trong trình tự gen NAD5 giữa các loài
Meloidogyne spp. ................................................................................................................... 146
Bảng 3.28. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ (%) trứng nở của
tuyến trùng M.
incognita.................................................................................................................. 151
Bảng 3.29. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ chết (%) của ấu
trùng
Meloidogyne incognita .......................................................................................................... 152
Bảng 3.30. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antibioticus HS124 đến tỷ lệ nở
trứng của tuyến trùng M
.incognita................................................................................................. 155
Bảng 3.31. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antbioticus HS124 đến tỷ lệ chết
của
ấu trùng tuổi 2 loài M. incognita ...........................................................................................
156
Bảng 3.32. Ảnh hưởng của hợp chất 4-HPAA đến tỷ lệ nở trứng của M. incognita ........
158
Bảng 3.33. Ảnh hưởng của hợp chất 4-HPAA đến tỷ lệ chết của ấu trùng tuổi 2
tuyến trùng Meloidogyne incognita
................................................................................................ 159
viii
1
0
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh tuyến trùng sần rễ lần đầu tên được công
bố.......................................... 6
Hình 1.2. Hình ảnh chi tiết tuyến trùng sần rễ Meloidogyne exigua trên cà phê
................... 6
Hình 1.3. Chu kỳ vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp.,
.................................. 7
Hình 1.4. Các đặc điểm chung để xác định các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne
........ 12
Hình 1.5. Hồ têu bị bệnh chết nhanh, chết chậm. .................................................................
18
Hình 1.6. Vị trí 5 tỉnh Tây Nguyên trên bản đồ Việt Nam....................................................
20
Hình 2.1. Sơ đồ khu vực nghiên cứu (Google map)..............................................................
28
Hình 2.2. Mẫu đất và rễ sau khi thu mẫu................................................................................
29
Hình 2.3. Nhân nuôi thuần tuyến trùng sần rễ Meloidogyne
spp.,........................................ 30
Hình 2.4. Phương pháp cắt tấm cutin vùng chậu con cái tuyến trùng Meloidogyne
spp., .. 30
Hình 2.5. Hình thái giải phẫu của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., sử dụng cho
nghiên cứu hình thái
............................................................................................................................. 30
Hình 2.6. Cấu trúc tấm cutn vùng chậu .................................................................................
35
Hình 2.7. Cấu trúc vùng gen trong hệ gen nhân được sử dụng trong nghiên cứu
............... 36
Hình 2.8. Cấu trúc hệ gen ty thể sử dụng trong nghiên
cứu.................................................. 37
Hình 3.1. Đặc điểm rễ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne trên một số cây trồng
.............. 42
Hình 3.2. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne incognita .................................
59
Hình 3.3. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne incognita...........
60
Hình 3.4. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne javanica ..................................
66
Hình 3.5. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne javanica
............. 67
viii
1
1
Hình 3.6. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne arenaria ..................................
78
Hình 3.7. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne arenaria.............
79
Hình 3.8. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne enterolobii...............................
86
Hình 3.9. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne enterolobii
......... 87
Hình 3.10. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne graminicola ..........................
96
Hình 3.11. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne
graminicola..... 97
Hình 3.12. Ảnh vẽ loài Meloidogyne daklakensis .................................................................
97
Hình 3.13. Ảnh chụp kính hiển vi loài Meloidogyne daklakensis ......................................
100
Hình 3.14. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (SEM) loài Meloidogyne daklakensis............
101
Hình 3.15. Ảnh vẽ loài Meloidogyne sp ...............................................................................
107
Hình 3.16. Ảnh chụp kính hiển vi loài Meloidogyne sp......................................................
108
Hình 3.17. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (SEM) Meloidogyne sp ...................................
109
Hình 3.18. Hình phân tích CDA ấu trùng các quần thể Meloidogyne spp.........................
116
Hình 3.19. Hình phân tích CDA con đực các quần thể Meloidogyne spp .........................
116
Hình 3.20. Hình phân tích CDA con cái các quần thể Meloidogyne spp...........................
117
1x
2
Hình 3.21. Đặc điểm so sánh tấm cutin vùng chậu con cái các loài Meloidogyne
spp..... 122
Hình 3.22. Đặc điểm so sánh vùng đầu con đực giữa các loài tuyến trùng sần
rễ
Meloidogyne spp., .................................................................................................................. 124
Hình 3.23. Đặc điểm so sánh phần đuôi ấu trùng tuổi 2 giữa các loài tuyến trùng sần
rễ
Meloidogyne spp., .................................................................................................................. 125
Hình 3.24. Hình điện di sản phẩm Multiplex-PCR các mẫu nghiên cứu...........................
140
Hình 3.25. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen ITS
140
Hình 3.26. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen
D2D3
................................................................................................................................................. 140
Hình 3.27. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen
COI140
Hình 3.28. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen
COII16S .......................................................................................................................................... 140
Hình 3.29. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen
NAD5
................................................................................................................................................. 140
Hình 3.30. Nấm Paecylomyces javanicus ký sinh trên trứng loài M. incognita................
153
Hình 3.31. Nấm Paecylomyces javanicus ký sinh trên ấu trùng M.incognita ...................
153
Hình 3.32. Trứng và ấu trùng M. incognita chết do vi khuẩn L. antibioticus HS124 .......
156
Hình 3.33. Hợp chất 4-HPAA gây chết trứng và ấu trùng Meloidogyne incognita ..........
160
1x
3
MỞ ĐẦU
Tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne là nhóm tuyến trùng nội ký sinh
cố định gây sần rễ [1]. Sau khi xâm nhập vào rễ, ấu trùng tuổi 2 sẽ di chuyển và cư
trú tại mô phân sinh, tấn công vào đỉnh sinh trưởng của chóp rễ, làm phân hóa
tế bào đỉnh sinh trưởng, đồng thời tiết ra enzyme làm thay đổi mô rễ và hình thành
các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng. Rễ cây bị nhiễm tuyến trùng sần rễ sẽ bị tổn
thương, trên bề mặt có dạng sần sùi hoặc tạo thành các u cục, cây bị còi cọc, vàng
lá và gây chết. Các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả năng ký sinh trên
nhiều loại cây chủ khác nhau và phân bố rộng trên toàn cầu, làm suy giảm năng
suất và sản lượng của các loại cây trồng, đặc biệt là các vùng Nam, Trung Mỹ, Châu
Phi và Châu Á trong đó có Việt Nam [1], [2], [3], [4]. Vì vậy, tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne trở thành mối quan tâm trong sản xuất nông nghiệp. Tính đến
năm
2006, có 111 loài Meloidogyne được mô tả, trong số đó có 18 loài ký sinh trên cây
cà phê, chứng tỏ rằng các loài Meloidogyne có tính đa dạng cao [5].
Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ ghi nhận được 5 loài tuyến trùng sần
rễ Meloidogyne, trong đó Tây Nguyên được biết đến có mặt cả 5 loài này [6]. Các
nghiên cứu sau này cho thấy hiện nay tại khu vực Tây Nguyên, sự hiện diện và gây
hại của nhóm tuyến trùng này rất lớn đặc biệt trên cà phê và hồ têu. Sự gây hại
của các loài Meloidogyne spp. làm hàng trăm hecta cà phê, hồ têu đã phải loại bỏ
để thay thế trồng những cây trồng khác [6], [7], [8], [9].
Biến đổi hình thái của mỗi loài tuyến trùng sần rễ chịu sự ảnh hưởng của cây
chủ cũng như phân bố của các quần thể ở sinh thái khác nhau. Những têu
chuẩn chủ yếu trong phân loại bằng hình thái của tuyến trùng sần rễ thường sử
dụng tấm cắt cutn vùng chậu (hậu môn-sinh dục) của con cái, ngoài ra các đặc
điểm hình thái vùng đầu con đực, vùng đuôi của ấu trùng; các đặc điểm hình thái
lượng của con cái, con đực, ấu trùng cũng được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng
hình thái giữa các loài [10], [11], [12], [2]. Tuy nhiên, sự chồng lấn các đặc điểm
hình thái của các quần thể trong cùng một loài, giữa các loài gần gũi, hay trên các
cây chủ khác nhau hoặc giữa các vùng địa lý khác nhau thường có sự dao động lớn
1x
4
nên gặp nhiều khó khăn trong chẩn loại bằng các đặc điểm hình thái [13], [14]. Vì
vậy, để hỗ trợ cho phương pháp phân loại dựa trên hình thái, kỹ thuật phân tử
đã được sử dụng hiệu
2
quả trong phân loại các loài Meloidogyne spp.. Nghiên cứu về di truyền trong phân
tích trình tự các vùng gen trong hệ gen nhân (18S, ITS, và 28S) [15], [16], [17],
[18], [19], [20] và các vùng gen trong hệ gen ty thể COI và COII và đoạn không mã
hóa giữa 2 vùng gen COII-16S-rRNA [21], [22], [23], [24] đã hỗ trợ rất nhiều cho
các nghiên cứu phân loại và phát sinh chủng loại của các loài tuyến trùng sần rễ
thuộc giống Meloidogyne được nhanh chóng và chính xác, góp phần phục vụ cho
biện pháp đánh giá tác hại và phòng trừ tuyến trùng sần rễ.
Với tác hại và phân bố rộng của tuyến trùng sần rễ trên cây trồng, việc ngăn
chặn và phòng trừ nhóm tuyến trùng này luôn được quan tâm và định hướng tới
nền nông nghiệp an toàn. Biện pháp phòng trừ tuyến trùng hiện nay chủ yếu sử
dụng thuốc hóa học với hàm lượng cao đã gây nên hiện tượng kháng thuốc cũng
như ảnh hưởng đến môi trường đất, làm suy giảm sự đa dạng của các sinh vật có
ích, suy thoái đất, ảnh hưởng trực tếp đến sức khỏe của con người và vật nuôi
[25]. Do đó, các biện pháp phòng trừ sinh học hiện được chú trọng hơn khi sử
dụng các vi sinh vật để chống lại các loài tuyến trùng ký sinh thực vật, được xem là
một trong những biện pháp rất tềm năng [26], [27]. Nhiều loại vi sinh vật có khả
năng làm tăng sinh trưởng của cây, tạo ra các chất kháng sinh và độc tố làm ngăn
cản sự sinh sản, nở trứng và khả năng sống sót của ấu trùng tuổi 2 tuyến trùng
sần rễ do vậy có thể được đưa vào ứng dụng trong phòng trừ tuyến trùng [28],
[29].
Xuất phát từ thực tễn về đa dạng cây trồng và địa hình ở Tây Nguyên, cũng
như đa dạng của loài tuyến trùng sần rễ và khả năng gây hại, chúng tôi thực hiện
đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp.
ở Tây Nguyên’’
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne gây hại trên các cây
trồng chính ở khu vực Tây Nguyên.
Đánh giá mức độ đa dạng hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne ở khu vực Tây Nguyên.
Đánh giá khả năng sử dụng một số vi sinh vật trong việc hạn chế sự phát
triển của tuyến trùng sần rễ M. incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm.
3
Phạm vi nghiên cứu
Đặc điểm hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne ghi nhận trên một số cây trồng ở khu vực Tây Nguyên.
Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng lên khả năng nở
trứng và sống sót của ấu trùng Meloidogyne incognita.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Bổ sung mới thành phần loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên,
trong đó ghi nhận thêm nhiều cây ký chủ bị nhiễm tuyến trùng
Meloidogyne cũng như sự phân bố của chúng. Mô tả và ghi nhận loài
mới loài Meloidogyne daklakensis ký sinh trên cà phê tại tỉnh Đắk Lắk.
Các chỉ têu hình thái của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở các cây
chủ và địa điểm khác nhau được đánh giá, so sánh đưa ra sự biến đổi
hình thái trong loài và các loài khác nhau đã xác định được những chỉ tiêu
quan trọng ít thay đổi trong phân loại loài như các đặc điểm hình thái, hình
thái lượng của vân cutn vùng chậu con cái, vùng đầu con đực và phần đuôi
ấu trùng.
Đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần thể trong một loài và giữa các loài
Meloidogyne ở Tây Nguyên được phân tích đưa ra các đoạn gen bảo thủ và
tến hóa cũng như phát sinh loài. Từ đó góp phần đưa ra chọn lựa tốt nhất
trong phân loại từng nhóm loài Meloidogyne bằng sinh học phân tử.
Bên cạnh đó, lần đầu tên đóng góp cơ sở dữ liệu các vùng gen nhân (ITS,
D2D3) và gen ty thể (COI, COII-16S, NAD5) của các loài Meloidogyne có mặt
ở Việt Nam trên Genbank.
Luận án khẳng định vai trò ký sinh và gây chết của vi sinh vật có lợi trong
điều kiện phòng thí nghiệm của nấm Paecilomyces javanicus, vi khuẩn
Lysobacter antbiotcus HS124 trong phòng trừ loài Meloidogyne incognita
phổ biến trên nhiều cây trồng.
Ý nghĩa thực tiễn
4
Xác định thành phần loài, mật độ tuyến trùng sần rễ hại cây trồng là
têu chuẩn trong phòng trừ hiệu quả. Cung cấp số liệu về khả năng ký
sinh, ký chủ, gây hại và phân bố của các loài tuyến trùng ký sinh gây sần rễ
góp phần ngăn chặn chúng phát tán trong điều kiện tự nhiên bảo vệ cây
trồng tránh bị lây nhiễm. Từ đó lựa chọn phương thức canh tác phù hợp đối
với từng cây trồng nhất là đối với cà phê và hồ têu cũng như những cây
trồng xen và luân canh.
Luận án cung cấp cơ sở dữ liệu về hình thái và phân tử của các loài
Meloidogyne phục vụ cho tra cứu, tham
khảo.
Đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bởi nấm
Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antbiotcus HS124, kháng sinh
4-HPAA làm cơ sở cho việc lựa chọn các tác nhân trong phòng trừ, qua đó
góp phần giảm lượng thuốc hóa học trong phòng trừ, giữ được cân bằng
sinh thái để phát triển bền vững các cây trồng chủ lực ở Tây Nguyên.
Những đóng góp mới của luận án
Luận án lần đầu tên đưa ra dữ liệu đầy đủ về phân bố, cây chủ và đặc
trưng hình thái, phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ trên cà phê, hồ têu
và các cây trồng xen ở Tây Nguyên. Đã xác định thêm nhiều cây chủ mới
nhiễm tuyến trùng Meloidogyne ở Tây Nguyên cũng như cho Việt Nam.
Bổ sung
145 trình tự các vùng gen ITS, D2D3, COI, COII-16S, NAD5 của các loài tuyến
trùng sần rễ ở Tây Nguyên trên Genbank.
Đã ghi nhận 01 loài tuyến trùng sần rễ mới cho khoa học ký sinh trên cà phê
đã được mô tả, công bố và đặt tên Meloidogyne daklakensis n. sp. và 01
loài còn lại đã được gửi công bố.
Lần đâu tên tại Việt Nam đã đánh giá khả năng ký sinh và gây chết của nấm
Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antbiotcus HS124 và chất
kháng sinh 4-HPAA đối với tuyến trùng sần rễ M. incognita trong điều kiện
phòng thí nghiệm.
5
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Berkeley (1855) là nhà khoa học đầu tên công bố sự xuất hiện của tuyến
trùng sần rễ trên rễ cây dưa chuột trồng tại khu vườn Nuneham, Vương Quốc Anh
với các mô tả triệu chứng như: các nốt sần có màu kem đục, gần như hình cầu, có
vảy mờ, có hiện tượng phình to ở rễ (hình 1.1). Jobert (1878) đã ghi nhận sự hiện
diện trong rễ cà phê các cá thể hình giun được nở ra từ trứng có trong rễ cây,và
ông đã đưa ra các mô tả cơ bản về tuyến trùng này. Sau đó, nhóm tuyến trùng này
lần lượt được đặt tên là Anguillula marioni (Cornu, 1879); Heterodera radicicola
(Carl Muller, 1884), Heterodera javanica Treub (Melchior, 1885) [30]. Năm 1887
tên tuyến trùng sần rễ Meloidogyne (Meloidogyne theo tiếng latn có nghĩa là
„con cái có hình quả táo‟) đã được đề xuất bởi Göldi khi mô tả chi tết loài M.
exigua trên rễ cà phê ở Braxil [1] (hình 1.2). Đến năm 1949, Chitwood thống
nhất tách giống tuyến trùng Meloidogyne Göldi, 1887 dựa trên loài chuẩn M.
exigua (Goldi, 1887) tách khỏi tuyến trùng bào nang Heterodera. Vị trí phân loại
của giống Meloidogyne hiện tại được theo hệ thống Karsen et al. (2013) [30].
Ngành: Nematoda Potts, 1932
Lớp: Chromadorea Inglis, 1983
Phân lớp: Chromadoria Pearse, 1942
Bộ: Rhabditda Chitwood, 1933
Phân bộ: Tylenchina Thorne, 1949
Họ: Meloidogynidae Skarbilovich, 1959
Phân họ: Meloidogyninae Skarbilovich, 1959
Giống: Meloidogyne Göldi, 1887
6
Hình 1.1. Hình ảnh tuyến trùng
sần rễ lần đầu tên được công
bố
A: Rễ cây bị sần, B: trứng, tuyến
trùng trong mô rễ [30].
Hình 1.2. Hình ảnh chi tiết tuyến trùng M. exigua trên cà phê Göldi (1887) [30].
7
1.1.2. Đặc điểm sinh học, vòng đời của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne
Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm 5 giai đoạn phát
triển bao gồm: trứng; ấu trùng tuổi 1(J1); ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễmJ2); ấu trùng tuổi 3, 4 (J3, J4) và giai đoạn trưởng thành với con cái và con đực
(hình
1.3) [31]. Trứng sau khi thụ tnh sẽ hình thành giai đoạn đầu tên của ấu trùng J1
nằm trong trứng. Khi đạt điều kiện thuận lợi trứng chứa J1 sẽ nở ra thành ấu trùng
tuổi 2(J2). Ấu trùng tuổi 2 khi chưa xâm nhập vào rễ cây chúng sử dụng dinh dưỡng
được dự trữ trong ruột cho đến khi tìm được ký chủ phù hợp [32], khi đó J2 sẽ bắt
đầu giai đoạn xâm nhiễm và xâm nhập vào các mô rễ, J2 thường tấn công vào các
mô phần sinh trưởng ở đỉnh rễ; nơi các rễ phụ mọc ra tạo điểm xâm nhập cho các
J2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương. Khi J2 tiếp xúc với bề mặt của rễ,
chúng dùng kim hút châm chích và xâm nhập vào bên trong rễ ở bất kỳ phía nào
của rễ.
Sau khi xâm nhập vào trong rễ, tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ,
tách dọc tế bào và định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ bắt đầu quá trình dinh
dưỡng. Trong quá trình dinh dưỡng, J2 cố định phần đầu vào các tế bào mô mạch
của rễ, tết men têu hóa làm thay đổi quá trình sinh lý sinh hóa của tế bào rễ và
hình thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng. Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng
lồ (tế bào đa nhân) được tạo thành trong vùng nhu mô hoặc hoặc mô libe. Đây là
sự thích nghi chuyên hóa cao của tế bào thực vật, được tạo ra và duy trì bằng sự
ký sinh của tuyến trùng. Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ
xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng bị phình to ra và tạo thành các nốt sần
rễ (gall hoặc rootknot).
Sự hình thành các tế bào khổng lồ này có liên quan đến sự thay đổi điều tết
và biểu hiện của gen chẳng hạn như gen ADF mã hóa cho protein ADF2 trong tế
bào thực vật chịu trách nhiệm cho sự phát triển các tế bào bình thường [33]. Các
tác động từ Meloidogyne sau khi xâm nhiễm sẽ làm kích hoạt các protein ADF2
này làm cho các tế bào thực vật phát triển mạnh hơn và bất thường hơn. Trung
