Hướng dẫn thực hành vi sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

THỰC HÀNH
VI SINH VẬT HỌC
Biên soạn:
Th.S Huỳnh Nguyễn Anh Khoa
Th.S Vũ Thị Phương Mai

www.hutech.edu.vn


THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC
Ấn bản 2018
Các ý kiến đóng góp về tài liệu học tập này, xin gửi về e-mail của ban biên tập:



Error! No text of specified style in document.

I

MỤC LỤC
MỤC LỤC ...................................................................................................................I
HƯỚNG DẪN .......................................................................................................... IV
BÀI 1: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG THỰC HÀNH VI SINH .............................................. 6
1.1 SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI ..................................................................................... 6
1.1.1 Các bộ phận của kính hiển vi quang học ............................................................. 6
1.1.2 Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi ................................................................ 9
1.1.3 Nguyên tắc sử dụng và bảo quản kính hiển vi ................................................... 10

1.1.4 Thao tác sử dụng kính hiển vi ......................................................................... 10
1.2 KỸ THUẬT CẤY VÀ PHÂN LẬP ........................................................................... 13
1.2.1 Cấy vi khuẩn ................................................................................................ 13
1.2.2 Phân lập vi khuẩn .......................................................................................... 13
1.2.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập ......................................................................... 14
1.2.4 Kỹ thuật cấy và phân lập ................................................................................ 15
1.3 KỸ THUẬT TIỆT TRÙNG .................................................................................... 18
1.3.1 Phương pháp nhiệt ẩm ................................................................................... 18
1.3.2 Phương pháp nhiệt khô .................................................................................. 19
1.3.3 Phương pháp Tyndall ..................................................................................... 19
1.3.4 Phương pháp lọc tiệt trùng ............................................................................. 19
1.4 THỰC HÀNH ..................................................................................................... 19
BÀI 2: NHẬN ĐỊNH VI KHUẨN DỰA VÀO KHẢO SÁT HÌNH THÁIError!
defined.

Bookmark

not

2.1 CÁC BƯỚC CHUNG ĐỂ KHẢO SÁT VI KHUẨN ................ Error! Bookmark not defined.
2.2 LẤY MẪU ..................................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.1 Nguồn cung cấp mẫu ........................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2 Làm phong phú và phân lập ................................. Error! Bookmark not defined.
2.2.3 Giữ gốc và di chuyển ........................................... Error! Bookmark not defined.
2.3 PHƯƠNG PHÁP NHẬN ĐỊNH VI KHUẨN ....................... Error! Bookmark not defined.
2.4 KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM KHUẨN LẠC (ĐẠI THỂ) .............. Error! Bookmark not defined.
2.4.1 Khảo sát trên môi trường đặc ............................... Error! Bookmark not defined.
2.4.2 Khảo sát trong môi trường lỏng ............................. Error! Bookmark not defined.
2.5 KHẢO SÁT TẾ BÀO VI KHUẨN (VI THỂ) ....................... Error! Bookmark not defined.
2.5.1 Khảo sát tính di động của vi khuẩn sống ................ Error! Bookmark not defined.

2.5.2 Khảo sát hình dạng vi khuẩn sau khi nhuộm ........... Error! Bookmark not defined.
2.6 THỰC HÀNH ................................................................ Error! Bookmark not defined.
BÀI 3: NHẬN ĐỊNH VI KHUẨN DỰA VÀO KHẢO SÁT TÍNH CHẤT SINH HÓA, SINH LÝ
................................................................................................. Error! Bookmark not defined.
3.1 CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA .......................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.1 .Khảo sát khả năng dụng carbohydrate ................... Error! Bookmark not defined.


Error! No text of specified style in document.

3.1.2 Khảo sát khả năng sử dụng acid amin chứa lưu huỳnhError!
defined.

Bookmark

II
not

3.1.3 Môi trường KIA (KLIGLER IRON AGAR) ................... Error! Bookmark not defined.
3.1.4 Khảo sát cơ chế lên men đường ............................ Error! Bookmark not defined.
3.1.5 Khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhấtError!
defined.

Bookmark

not

3.1.6 Khảo sát khả năng sử dụng acid amin có nhân indol Error! Bookmark not defined.
3.1.7 Khảo sát khả năng sử dụng protein ....................... Error! Bookmark not defined.
3.1.8 Khảo sát khả năng sử dụng urea ........................... Error! Bookmark not defined.

3.1.9 Khảo sát sự hiện diện catalase .............................. Error! Bookmark not defined.
3.1.10 Phản ứng sinh hóa của một số vi khuẩn ............... Error! Bookmark not defined.
3.2 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA YẾU TỐ LÝ-HÓA ................. Error! Bookmark not defined.
3.2.1 Khảo sát các tác động vật lý ................................. Error! Bookmark not defined.
3.2.2 Tác động của các yếu tố hóa học ........................... Error! Bookmark not defined.
3.3 THỰC HÀNH ................................................................ Error! Bookmark not defined.
BÀI 4: KHẢO SÁT VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT ......... Error! Bookmark not defined.
4.1 CÁC VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT ..................... Error! Bookmark not defined.
4.2 CÁCH TRÍCH LY BỆNH PHẨM ....................................... Error! Bookmark not defined.
4.3 MÔI TRƯỜNG KHẢO SÁT ............................................. Error! Bookmark not defined.
4.3.1 Thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar-NA) .................... Error! Bookmark not defined.
4.3.2 Môi trường phong phú .......................................... Error! Bookmark not defined.
4.3.3 Môi trường phân biệt ........................................... Error! Bookmark not defined.
4.3.4 Môi trường chọn lọc ............................................. Error! Bookmark not defined.
4.4 THỰC HÀNH ................................................................ Error! Bookmark not defined.
4.4.1 Phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm .................... Error! Bookmark not defined.
4.4.2 Nhận định vi khuẩn gây bệnh................................ Error! Bookmark not defined.
4.4.3 Sơ đồ phân lập vi khuẩn gây bệnh đường ruột ........ Error! Bookmark not defined.
BÀI 5: KHẢO SÁT VI KHUẨN GÂY BỆNH Ở CỔ HỌNG ............. Error! Bookmark not defined.
5.1 ĐẠI CƯƠNG ................................................................. Error! Bookmark not defined.
5.2 MÔI TRƯỜNG KHẢO SÁT VÀ SỰ HUYẾT GIẢI ............... Error! Bookmark not defined.
5.3 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM ....................................... Error! Bookmark not defined.
5.3.1 Lấy bệnh phẩm ................................................... Error! Bookmark not defined.
5.3.2 Tìm vi khuẩn gây bệnh ở cổ họng .......................... Error! Bookmark not defined.
5.4 THỰC HÀNH ................................................................ Error! Bookmark not defined.
BÀI 6: CÁC THỬ NGHIỆM VỀ KHÁNG SINH ............................ Error! Bookmark not defined.
6.1 CÁC KHÁI NIỆM .......................................................... Error! Bookmark not defined.
6.2 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU ..................... Error! Bookmark not defined.
6.2.1 Định nghĩa ......................................................... Error! Bookmark not defined.
6.2.2 Nguyên tắc ......................................................... Error! Bookmark not defined.

6.2.3 Phương pháp ...................................................... Error! Bookmark not defined.
6.2.4 Tiến hành ........................................................... Error! Bookmark not defined.


Error! No text of specified style in document.

III

6.3 KHÁNG SINH ĐỒ ......................................................... Error! Bookmark not defined.
6.3.1 Nguyên tắc ......................................................... Error! Bookmark not defined.
6.3.2 Phương pháp khuếch tán Kirby – Bauer .................. Error! Bookmark not defined.
6.3.3 Phối hợp kháng sinh ............................................ Error! Bookmark not defined.
6.3.4 Hậu quả của sự phối hợp ...................................... Error! Bookmark not defined.
6.3.5 Phương pháp thăm dò phối hợp kháng sinh – phương pháp khuếch tán trong môi
trường rắn ....................................................................... Error! Bookmark not defined.
6.4 BẢNG BIỆN GIẢI KHÁNG SINH ĐỒ .............................. Error! Bookmark not defined.
BÀI 7: ĐỊNH LƯỢNG MẬT ĐỘ VI SINH VẬT ........................... Error! Bookmark not defined.
7.1 ĐẠI CƯƠNG ................................................................. Error! Bookmark not defined.
7.2 PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ KHUẨN LẠC ............................ Error! Bookmark not defined.
7.2.1 Nguyên tắc ......................................................... Error! Bookmark not defined.
7.2.2 Cách thực hiện .................................................... Error! Bookmark not defined.
7.3 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG TỚI HẠN .......................... Error! Bookmark not defined.
7.3.1 Nguyên tắc ......................................................... Error! Bookmark not defined.
7.3.2 Cách thực hiện .................................................... Error! Bookmark not defined.
7.4 THỰC HÀNH ................................................................ Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................... Error! Bookmark not defined.


Error! No text of specified style in document.

IV

HƯỚNG DẪN
MÔ TẢ MÔN HỌC
Giáo trình “Thực hành vi sinh vật học” dành cho sinh viên năm thứ nhất ngành Dược,
trường Đại học Công Nghệ TP.HCM. Cùng với môn Vi sinh – Ký sinh, đây là một phần
quan trọng trong toàn bộ khối kiến thức cơ sở ngành, giúp sinh viên có cơ hội thực hành
về các quá trình, thao tác làm việc với vi sinh vật, ứng dụng vào trong nghiên cứu hoặc
kiểm nghiệm vi sinh. Qua đó, giúp cho sinh viên hiểu sâu hơn về lý thuyết đã học.

NỘI DUNG MÔN HỌC
Bài 1: Các kỹ thuật cơ bản trong phòng thí nghiệm vi sinh.
Bài 2: Nhận định vi khuẩn dựa vào khảo sát hình thái.
Bài 3: Nhận định vi khuẩn dựa vào khảo sát tính chất sinh hóa, sinh lý.
Bài 4: Khảo sát vi khuẩn gây bệnh đường ruột.
Bài 5: Khảo sát vi khuẩn gây bệnh ở cổ họng.
Bài 6: Các thử nghiệm về kháng sinh.
Bài 7: Định lượng mật độ vi sinh vật.

KIẾN THỨC TIỀN ĐỀ
Môn học thực hành vi sinh vật học yêu cầu sinh viên đã học môn lý thuyết Vi sinh
vật học, đã làm quen với cách sử dụng các dụng cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm.

YÊU CẦU MÔN HỌC
Người học phải dự học đầy đủ các buổi lên lớp và làm bài báo cáo thực hành.

CÁCH TIẾP NHẬN NỘI DUNG MÔN HỌC
Để học tốt môn này, người học cần đọc trước bài thực hành ở nhà để nắm kỹ phần
lý thuyết và thao tác thực hành. Trong khi học, người học phải quan sát, ghi nhận và
mô tả các hiện tượng xảy ra khi tiến hành thí nghiệm. Người học cần phải tập tính tỉ

Error! No text of specified style in document.

V

mĩ, chu đáo và có khả năng dự trù trước những diễn biến có thể xảy ra đối với mẫu vi
sinh vật, cũng như để chuẩn bị cho các thí nghiệm được tiến hành một cách suôn sẻ.

PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ MÔN HỌC
Hình thức và nội dung đánh giá môn học do bộ môn quyết định, phù hợp với quy
chế đào tạo và tình hình thực tế tại nơi tổ chức học tập.

YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN
Để làm thí nghiệm được tốt, sinh viên phải chuẩn bị bài ở nhà: tính toán các số liệu
cần thiết khi làm bài thí nghiệm, xem lại phần lý thuyết và các tài liệu tham khảo có
liên quan, sắp xếp một cách khoa học kế hoạch tiến hành các thí nghiệm trong mỗi
buổi thực hành.
Khi làm việc trong phòng thí nghiệm phải tuân thủ nghiêm nội quy phòng thí nghiệm.
Tuyệt đối không ăn, uống trong phòng thí nghiệm. Hạn chế đeo trang sức (đồng hồ,
vòng đeo tay…) vì phải thường xuyên sát trùng tay bằng cồn.
Trong quá trình làm việc, nếu bị thương thì phải nhanh chóng sát trùng vết thương
và băng bó cẩn thận trước khi tiếp xúc trở lại với vi sinh vật nhằm tránh nhiễm trùng.
Khi thí nghiệm xong, dọn dẹp các dụng cụ, mẫu vật và xử lý theo đúng quy trình
được hướng dẫn. Các mẫu có chứa vi sinh vật còn sống phải được hấp bỏ theo đúng
quy trình trước khi rửa.
Rửa sạch tay bằng xà phòng trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm.


Error! No text of specified style in document.

VI

KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG
THỰC HÀNH VI SINH
Sau khi học xong bài này, sinh viên có thể:
-

Biết sử dụng kính hiển vi cho các mục đích khác nhau

-

Biết cách chuẩn bị dụng cụ để thực hành vi sinh

Tiến hành được kỹ thuật cấy và phân lập
-

Trình bày được nguyên tắc, cách vận hành thiết bị và phạm vi áp dụng của
một số phương pháp tiệt trùng hay dùng.

SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI
Sử dụng kính hiển vi để:
Khảo sát sự di động của vi khuẩn
Quan sát hình dạng, cách sắp xếp, kích thước của tế bào vi khuẩn
Quan sát các bộ phận của tế bào vi khuẩn: màng, tiêm mao, bào tử…

Các bộ phận của kính hiển vi quang học
1. Phần quang học
a. Bộ phận chiếu sáng
Nguồn sáng: Các kính hiển vi quang học hiện đại có nguồn sáng là đèn Halogen

hoặc đèn LED. Các kính hiển vi loại cũ không có đèn chiếu sáng riêng nên được
trang bị 1 gương lấy sáng để đưa nguồn sáng bên ngoài cung cấp cho kính.


Error! No text of specified style in document.

VII

Tụ quang: Tụ quang là một hệ thấu kính có nhiệm vụ hội tụ các tia sáng từ nguồn
sáng vào vị trí tiêu bản cần quan sát. Trong tụ quang có 1 màn chắn sáng có
thể điều chỉnh mức độ đóng/mở để điều chỉnh lượng ánh sáng chiếu vào tiêu
bản.
b. Vật kính
Vật kính là bộ phận quan trọng nhất của kính hiển vi. Vật kính được cấu tạo
từ 1 hệ thấu kính, trong đó thấu kính ngoài cùng là quan trọng nhất, quyết định
độ phóng đại của kính, các thấu kính còn lại có nhiệm vụ loại trừ các quang sai
giúp cho hình ảnh quan sát được rõ nét. Độ phóng đại của vật kính luôn được ghi
trên thân của vật kính (Ví dụ: 40X nghĩa là độ phóng đại 40 lần).
Một kính hiển vi quang học thông thường thường có 4 vật kính:
Vật kính 4X, 10X: thường dùng để quan sát tổng thể và định vị vị trí quan sát.
Vật kính 40X: thường dùng để quan sát hình dạng vi khuẩn, quan sát sự di động
của vi khuẩn
Vật kính 100X: thường dùng để quan sát các bộ phận của tế bào vi khuẩn. Để
hình ảnh quan sát được rõ, khi sử dụng, vật kính 100X phải được nhúng chìm
trong dầu cèdre. Dầu cèdre có chiết suất lớn hơn so với không khí, có tác dụng
hạn chế các tia sáng bị lạc hướng ra khỏi vật kính.
c. Thị kính
Thị kính cũng là một hệ thống thấu kính giúp phóng đại một lần nữa các hình
ảnh do vật kính cung cấp. Thị kính thường có độ phóng đại 5X, 10X, 20X. Độ
phóng đại cũng được ghi trên thân thị kính. Ngoài ra, thị kính còn giúp điều chỉnh

tiêu cự phù hợp với những người có tật khúc xạ ở mắt (cận thị, viễn thị).
2. Phần cơ học
Gồm có: Thân kính, đế kính, bàn kính và các ốc điều chỉnh.
a. Thân kính


Error! No text of specified style in document.

VII
I

Thân kính mang toàn bộ hệ thống quang học của kính, cũng là bộ phận giúp
cầm nắm khi di chuyển kính. Trên thân kính còn có bàn xoay để lắp vật kính, có
vị trí lắp thị kính, vị trí gắn bàn kính và các ốc điều chỉnh.
b. Bàn kính
Bàn kính là nơi đặt vật cần quan sát. Trên bàn kính có bộ phận kẹp giữ tiêu
bản. Bàn kính có thể di chuyển lên - xuống, qua trái – qua phải và tới – lui để
đưa vật vào đúng vị trí quan sát.
c. Đế kính
Nối liền với thân kính giúp nâng đỡ toàn bộ kính. Đế kính có vị trí lắp nguồn
sáng.
d. Ốc điều chỉnh
Ốc điều chỉnh cường độ ánh sáng (có ở các kính dùng nguồn sáng là đèn): thường
nằm ở đế kính, dùng để điều chỉnh công suất đèn chiếu sáng.
Ốc điều chỉnh cao độ của bàn kính: gồm có ốc sơ cấp (nâng hoặc hạ bàn kính một
khoảng cách lớn) và ốc vi cấp (nâng hoặc hạ bàn kính một khoảng cách nhỏ)
Ốc điều chỉnh vị trí bàn kính theo phương ngang: Gồm ốc điều chỉnh qua trái –
qua phải và ốc điều chỉnh tới – lui
Ốc điều chỉnh vị trí tụ quang: thường được gắn liền với tụ quang, giúp nâng hoặc
hạ cao độ của tụ quang

Ốc bảo vệ: Gồm có ốc bảo vệ vật kính (giúp giới hạn cao độ của bàn kính để ngăn
cản bàn kính làm hỏng vật kính) và ốc bảo vệ thị kính (cố định vị trí thị kính,
giúp thị kính không bị xoay khi quan sát).


Error! No text of specified style in document.

IX

Các bộ phận của kính hiển vi

Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi
Thực chất, kính hiển vi là một hệ thấu kính giúp phóng đại vật quan sát.
Độ phóng đại của kính hiển vi là tích số độ phóng đại của vật kính và độ phóng
đại của thị kính.
Độ rõ nét của ảnh quan sát được quyết định bởi năng suất phân ly. Kính có
năng suất phân ly càng lớn sẽ phân biệt được 2 điểm có khoảng cách càng gần
và cho ảnh càng rõ nét.
Độ tương phản là khả năng phân biệt giữa vật cần quan sát và môi trường
chứa vật quan sát. Đa số tế bào gần như trong suốt nên khi quan sát dưới cường
độ ánh sáng quá cao sẽ không nhìn thấy rõ tế bào. Lúc này, cần giảm công suất
đèn hoặc giảm độ mở của màn chắn sáng để làm tăng độ tương phản.


Error! No text of specified style in document.

X

Nguyên tắc sử dụng và bảo quản kính hiển vi
Cầm và di chuyển kính bằng hai tay. Chú ý cầm gọn dây nguồn cấp điện, không

để vướng vật khác khi di chuyển.
Đặt kính trên mặt phẳng tĩnh, không bị rung động, không để kính bị ngã.
Chú ý không để gần kính các vật dễ gây hư tổn kính như: đèn cồn, hóa chất có
tính ăn mòn cao…
Tối thiểu hóa thời gian bật đèn nguồn (tắt đèn nguồn khi không sử dụng)
Chỉnh cao độ bàn kính về mức thấp nhất khi đặt vào hoặc lấy tiêu bản ra khỏi
bàn kính (tránh va chạm với vật kính).
Phải luôn thận trọng khi điều chỉnh ốc sơ cấp khi sử dụng vật kính 40X và 100X,
không để tiêu bản chạm vào làm hỏng vật kính. Khi chuyển từ vật kính 40X
sang vật kính 100X, chỉ được chỉnh ốc vi cấp, không được chỉnh ốc sơ cấp.
Chỉ dùng vải chuyên dụng để lau vật kính và thị kính (Sinh viên không tự ý lau
vật kính và thị kính).

Thao tác sử dụng kính hiển vi
a. Sử dụng vật kính X4 hoặc X10
Thực hiện từng bước theo thứ tự sau:
Cắm điện, kiểm tra nguồn sáng.
Hạ bàn kính về cao độ thấp nhất.
Xoay mâm gắn vật kính về vị trí vật kính 4X hoặc 10X
Đặt tiêu bản vào bàn kính, điều chỉnh kẹp tiêu bản cho chắc chắn.
Nhìn vào tiêu bản và điều chỉnh vị trí bàn kính sao cho đốm sáng chiếu vào vị trí
có mẫu vật.


Error! No text of specified style in document.

XI

Nhìn vào thị kính, điều chỉnh khoảng cách hai ống thị kính sao cho 2 thị trường
nhập lại với nhau. Chú ý: phải nhìn bằng cả 2 mắt.

Vừa nhìn vào thị kính, vừa xoay ốc sơ cấp để điều chỉnh cao độ bàn kính đến khi
thị trường thoáng xuất hiện ảnh của mẫu vật thì dừng lại.
Điều chỉnh ốc vi cấp để thấy được rõ nét ảnh của mẫu vật.
Sau khi quan sát xong, hạ bàn kính xuống vị trí thấp nhất, lấy mẫu vật ra. Nếu
không còn sử dụng nữa thì tắt nguồn sáng.
b. Sử dụng vật kính X40
Thực hiện từng bước theo thứ tự sau:
Thực hiện các thao tác để thấy được ảnh rõ nét dưới vật kính 10X.
Giữ nguyên vị trí bàn kính, xoay mâm gắn vật kính về vị trí vật kính 40X.
Vừa nhìn vào thị kính, dùng 2 tay xoay từ từ ống sơ cấp (xoay từng nấc) sao cho
thoáng thấy ảnh của mẫu vật. Chú ý: Lúc này bàn kính đã ở rất sát vật kính,
nếu không cẩn thận có thể làm cho tiêu bản cấn vào vật kính, làm bể tiêu bản
và hư hỏng vật kính.
Khi thoáng thấy ảnh của mẫu vật thì dừng lại ngay và điều chỉnh ốc vi cấp để
nhìn rõ mẫu vật.
Sau khi quan sát xong, hạ bàn kính xuống vị trí thấp nhất, lấy mẫu vật ra. Nếu
không còn sử dụng nữa thì tắt nguồn sáng.
c. Sử dụng vật kính X100
Thực hiện từng bước theo thứ tự sau:
Thực hiện các thao tác để thấy được ảnh rõ nét dưới vật kính 40X.
Giữ nguyên vị trí bàn kính, xoay mâm gắn vật kính đến vị trí giữa vật kính 40X
và vật kính 100X (lúc này phía trên mẫu vật là 1 khoảng trống).
Nhỏ 1 giọt dầu cèdre lên phía trên mẫu vật.


Error! No text of specified style in document.

XII

Khi dầu vẫn còn đọng thành giọt, nhanh chóng xoay mâm gắn vật kính về vị trí vật

kính 100X. Lúc này, đầu chóp vật kính 100X sẽ được nhúng ngập trong giọt dầu.
Vừa nhìn vào thị kính và điều chỉnh ốc vi cấp sao cho thấy ảnh rõ nét (thông
thường, chỉ cần điều chỉnh ốc vi cấp 1-2 vòng theo hướng hạ bàn kính xuống
thấp hơn thì sẽ thấy được rõ ảnh).
Lưu ý: Sau khi đã nhỏ dầu lên mẫu vật thì không dùng lại vật kính 40X
để tránh vật kính 40X bị dính dầu.
Sau khi quan sát xong, xoay mâm gắn vật kính về vị trí vật kính 4X (để tránh
việc nâng hạ bàn kính làm va chạm vật kính 100X), hạ bàn kính xuống vị trí
thấp nhất, lấy mẫu vật ra. Nếu không còn sử dụng nữa thì tắt nguồn sáng.
Trong trường hợp cần quan sát lại tiêu bản đã nhỏ dầu, tiến hành theo các
bước:
Đảm bảo mâm gắn vật kính đang ở vị trí 4X, bàn kính ở vị trí thấp nhất.
Đặt tiêu bản (đang có giọt dầu) vào bàn kính, điều chỉnh kẹp tiêu bản cho chắc
chắn. Nếu giọt dầu còn đọng lại quá ít, không đủ để nhúng ngập vật kính thì
phải bổ sung thêm dầu.
Xoay mâm vật kính về vị trí 100X. Chú ý: nên xoay theo chiều từ vật kính 4X
sang 100X, tránh trường hợp xoay ngang qua vật kính 40X vì có thể làm dính
dầu vào vật kính 40X.
Nhìn vào khoảng cách giữa tiêu bản và vật kính 100X, dùng hai tay, từ từ điều
chỉnh ốc sơ cấp theo chiều nâng bàn kính lên đến khi đầu vật kính chuẩn bị
chạm vào tiêu bản, đồng thời, vật kính được nhúng ngập trong giọt dầu. Chú
ý: thao tác này phải được thực hiện một cách cẩn thận, vì có thể làm cấn bể
tiêu bản và hỏng vật kính.
Nhìn vào thị kính, điều chỉnh ốc vi cấp để thấy được hình ảnh rõ nét. Chú ý: Khi
xoay ốc vi cấp theo hướng nâng bàn kính lên phải cẩn thận vì cũng có thể làm
bể tiêu bản và gây hỏng vật kính.


Error! No text of specified style in document.

XII
I

KỸ THUẬT CẤY VÀ PHÂN LẬP
Cấy vi khuẩn
Cấy vi khuẩn là chuyển vi khuẩn từ môi trường hiện tại sang một môi trường
khác. Cây vi khuẩn nhằm các mục đích:
Chuyển gốc vi khuẩn thuần chủng từ môi trường cũ sang môi trường mới để giữ
giống, gọi là cấy chuyền. Cấy chuyền thường được tiến hành định kỳ, thời
gian dài ngắn tùy theo chủng.
Cấy vi khuẩn cần khảo sát lên các môi trường nhằm để khảo sát hình thái, tính
chất sinh lý, sinh hóa...
Cấy vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy để thu hoạch số lượng lớn vi khuẩn.

Phân lập vi khuẩn
a. Khái niệm vi khuẩn thuần chủng
Vi khuẩn thuần chủng (giống thuần chủng, chủng thuần): là tập hợp các vi
khuẩn phát triển từ chỉ một tế bào vi khuẩn ban đầu. Như vậy, vi khuẩn thuần
chủng là tập hợp các vi khuẩn giống nhau về đặc điểm sinh lý và sinh hóa.
Trong nghiên cứu cũng như thực hành về sinh sinh vật, người ta chỉ tiến hành
trên vi sinh vật đã được thuần chủng.
b. Phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là kỹ thuật được sử dụng để thu giống thuần chủng từ hỗn
hợp các vi khuẩn ban đầu.
Nguyên tắc thực hiện: Trải vi khuẩn trên môi trường để làm cho mật độ vi
khuẩn giảm dần đến khi các tế bào trong hỗn hợp ban đầu tách rời khỏi nhau
thành từng tế bào riêng lẻ và nằm xa nhau. Sau thời gian ủ, các tế bào vi khuẩn
rời rạc sẽ phát triển thành 1 khuẩn lạc vi khuẩn (còn gọi là khóm), đây chính là

Error! No text of specified style in document.

XIV

vi khuẩn thuần chủng. Khi đó, có thể cấy chuyền 1 khuẩn lạc vi khuẩn sang môi
trường khác để lưu giữ chủng vi khuẩn đã thuần chủng.

Môi trường nuôi cấy, phân lập
a. Môi trường nuôi cấy, phân lập
Môi trường nuôi cấy được xem là “phương tiện” để cung cấp dinh dưỡng cho vi
khuẩn sinh sống và phát triển. Môi trường thường được pha chế thành các thể rắn
hoặc lỏng.
Môi trường lỏng thường được dùng để nuôi và thu hoạch một số lượng lớn vi
khuẩn (ví dụ: quá trình nhân giống, hoạt hóa giống…), khảo sát khả năng lên
men,…
Môi trường rắn được pha chế bằng cách bổ sung chất làm đông vào môi trường
lỏng. Agar là chất làm đông thông dụng nhất. Môi trường rắn được dùng để phân
lập, giữ giống, khảo sát tính chất sinh hóa…Tùy vào dụng cụ chứa và hình dạng
khối môi trường sau khi đông lại mà môi trường rắn được gọi bằng các tên khác
nhau như thạch nghiêng, thạch đĩa, thạch đứng…
Trường hợp cần thiết, có thể giảm nồng độ chất làm đông để tạo thành dạng
môi trường có tính mềm, là trung gian giữa dạng rắn và dạng lỏng, thường dùng
trong khảo sát khả năng di động của vi khuẩn.
Tùy vào thành phần môi trường, mỗi chủng vi khuẩn được cấy trên các môi
trường khác nhau nhưng chung quy có 4 loại môi trường:
Môi trường cơ bản: phần lớn các chủng đều có thể sinh sản và phát triển trên môi
trường này. Ví dụ:
Môi trường canh thang dinh dưỡng

Môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrient

(Nutrient Broth) chứa: Pepton 5g;

Agar) chứa: Pepton 5g; Cao thịt bò 3g;

Cao thịt bò 3g; Nước cất vừa đủ 1

Agar 18g; Nước cất vừa đủ 1 lít.

lít.


Error! No text of specified style in document.

XV

Môi trường chọn lọc: chỉ cho 1 loại vi khuẩn cần phân lập sinh sản và phát triển.
Ví dụ môi trường có chứa kháng sinh, môi trường Desoxycholat Citrat Agar
(DCA), môi trường Salmonella-Shigella (SS), môi trường Bismuth Sulfite Agar
(BSA)
Môi trường phong phú: cho phép vi khuẩn cần nghiên cứu phát triển mạnh. Ví dụ
môi trường selenit F.
Môi trường phân biệt: cho phép nhiều chủng vi khuẩn phát triển nhưng mỗi chủng
sẽ cho những biểu hiện khác nhau. Ví dụ: môi trường Mac Conkey, môi trường
TCBS.

Kỹ thuật cấy và phân
lập
a. Kỹ thuật cấy chuyền
Tiến hành tuần tự theo các

bước sau:
Đốt nóng đầu que cấy sau đó
để nguội tự nhiên.
Cầm ống nghiệm giống vi
khuẩn, mở nắp, hơ miệng
ống nghiệm trên ngọn lửa.
Giữ khoảng cách miệng ống
nghiệm trong bán kính 2
cm xung quanh ngọn lửa.
Dùng đầu dây cấy lấy 1 ít vi
khuẩn. Chú ý thao tác,
tránh đưa đầu dây cấy vào
ngọn

lửa

vi khuẩn.

sau

khi

lấy
Thao tác cầy chuyền


Error! No text of specified style in document.

XVI

Đậy nắp ống nghiệm chứa giống, đặt xuống giá.
Cầm ống nghiệm chứa môi trường mới (cần cấy vào), mở nắp, hơ miệng ống
nghiệm trên ngọn lửa.
Từ từ đưa đầu que cấy đang có chứa vi khuẩn vào ống nghiệm, trải đều vi khuẩn
(nếu là môi trường thạch) hoặc lắc nhẹ đầu que cấy (nếu là môi trường lỏng)
để chuyển vi khuẩn từ đầu que cấy vào môi trường.
Lấy que cấy ra khỏi ống nghiệm.
Hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa rồi đậy nắp.
Tiệt trùng đầu que cấy.
b. Kỹ thuật cấy ria (cấy rạch, cấy phân lập)
Tiến hành như sau:
Đốt dây cấy, để nguội, lấy vi khuẩn lên vòng cấy (lượng vi khuẩn cần lấy phụ
thuộc mật độ ban đầu của chủng gốc)
Trải vi khuẩn lên đoạn A-B (khoảng 1 cm) của đĩa thạch (chú ý: mặt phẳng vòng
dây cấy gần như song song với đĩa thạch để tránh làm thủng bề mặt thạch).
Đốt bỏ vi khuẩn thừa trên dây cấy rồi làm nguội.
Trải vi khuẩn theo 1 chiều từ B sang C. Lưu ý: các đường cấy phải rời nhau khoảng
1-2 mm và theo 1 chiều. Tại vị trí B, đầu dây cấy phải chạm vào vị trí có vi
khuẩn đã được trải.
Đốt bỏ vi khuẩn thừa trên dây cấy rồi làm nguội.
Trải vi khuẩn theo 1 chiều từ C sang D. Lưu ý: các đường cấy phải rời nhau khoảng
2-3 mm và theo 1 chiều. Tại vị trí C, đầu dây cấy phải chạm vào vị trí có vi
khuẩn đã được trải.
Không đốt bỏ vi khuẩn. Tiếp tục trải vi khuẩn theo 1 chiều từ D sang E. Lưu ý:
các đường cấy phải rời nhau khoảng 3-4 mm và theo 1 chiều. Tại vị trí D, đầu
dây cấy phải chạm vào vị trí có vi khuẩn đã được trải.


Error! No text of specified style in document.

XVI
I

Trải vi khuẩn theo đường zig-zag từ E ra phần còn trống của đĩa thạch. Lưu ý:
không để dây cấy chạm vào các đường trải trước đó.
Đốt tiệt trùng dây cấy để hoàn tất.
Đường đi của đầu dây cấy khi trải có thể thay đổi theo các kỹ thuật được mô
tả trong các hình sau.

Đường đi của đầu dây cấy trong một số kỹ thuật phân lập
Những điều cần lưu ý khi cấy:
Thao tác nhanh gọn, nếu chậm sẽ làm tăng nguy cơ nhiễm.
Phải tiệt trùng kỹ dây cấy


Error! No text of specified style in document.

XVI
II

Đốt miệng ống nghiệm ngay sau khi mở nút cũng như khi đóng nút.
Trường hợp không dùng tủ cấy, dây cấy và miệng ống nghiệm phải để trong vùng
an toàn của ngọn lửa (cách ngọn lửa không quá 2cm) và không để ống nghiệm
ngay trên ngọn lửa khi cấy.
Đốt bỏ phần vi khuẩn thừa trên dây cấy trước khi đặt dây cấy xuống.

KỸ THUẬT TIỆT TRÙNG
Phương pháp nhiệt ẩm
Sử dụng hơi nước ở nhiệt độ 121oC (áp suất dư 1 atm) để tiệt trùng. Để tạo
được hơi nước nhiệt độ này phải sử dụng nồi hấp (autoclave). Tác dụng diệt khuẩn

trong phương pháp này là do nhiệt độ của hơi chứ không phải do áp suất.
Thời gian tiệt trùng thông thường là 15 phút. Tùy theo thể tích của môi trường
và tùy theo mức độ ô nhiễm (mật độ vi khuẩn có trong môi trường trước khi hấp)
mà thời gian hấp có thể tăng hoặc giảm.
Dung tích môi trường

Thời gian hấp ở 121oC

Dưới 100 ml

15 phút

Từ 500ml đến dưới 1000 ml

20 phút

Từ 1000 ml đến dưới 2000 ml

25 phút

Từ 2000 ml

Trên 35 phút

Phạm vi áp dụng: Dụng cụ, bông băng, áo quần, và các môi trường, hóa chất
chịu được nhiệt độ trên.
Hạn chế: Các đồ vật không chịu nhiệt như nhựa dẻo, túi nilon,…sẽ bị biến
dạng; thành phần môi trường không chịu được nhiệt độ như vitamin, protein,…sẽ
bị biến tính.

Error! No text of specified style in document.

XIX

Phương pháp nhiệt khô
Dùng không khí nóng 165 - 200 oC để sấy dụng cụ thủy tinh, các hóa chất chịu
nhiệt (dầu béo,…) trong khoảng 2 giờ.
Hạn chế: chỉ dùng để tiệt trùng dụng cụ vì đa số môi trường nuôi cấy không
chịu được nhiệt độ này.

Phương pháp Tyndall
Tiệt trùng 3 ngày liên tiếp, mỗi ngày 2 giờ ở nhiệt độ 70oC. Sau mỗi lần gia
nhiệt, để môi trường nguội về nhiệt độ phòng.
Nhiệt độ 70oC chỉ diệt được các dạng tế bào dạng đang phát triển (dạng dinh
dưỡng), không diệt được bào tử. Khi để ở nhiệt độ thường, bào tử phát triển thành
dạng dinh dưỡng và bị tiêu diệt trong lần gia nhiệt kế tiếp.
Phương pháp này dùng để tiệt trùng các môi trường không chịu được nhiệt độ
cao. Dụng cụ chứa môi trường thường được tiệt trùng trước bằng phương pháp
nhiệt ẩm hoặc nhiệt khô.

Phương pháp lọc tiệt trùng
Các thành phần quá nhạy cảm với nhiệt độ thường được tiệt trùng riêng bằng
phương pháp lọc rồi sau đó được bổ sung vào môi trường. Trong phòng thí
nghiệm, thường dùng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 m được tiệt trùng sẵn,
dùng 1 lần. Dịch cần lọc được bơm qua màng lọc bằng xylanh vào trong bình chứa
vô trùng. Quá trình phối trộn dịch sau khi lọc vào trong môi trường nuôi cấy cũng
phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng.

THỰC HÀNH

Mỗi sinh viên tiến hành:
Quan sát tiêu bản vi khuẩn mẫu dưới kính hiển vi quang học (dùng vật kính 10X,
40X, 100X).


Error! No text of specified style in document.

Cấy vi khuẩn trên các môi trường
Phân lập vi khuẩn.
Chuẩn bị dụng cụ, môi trường cho nhóm thực tập sau.
Báo cáo: theo mẫu quy định.

XX


Error! No text of specified style in document.

XXI