Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HOÀNG THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI
TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM
MANGROVEI PQ6

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2014


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH
HỌC

Hoàng Thị Lan Anh

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ
KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN
DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Đặng Diễm Hồng

Viện Công nghệ sinh học


i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đặng
Diễm Hồng, Trưởng phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam- người thầy đã định hướng, truyền dạy những kiến thức khoa học và
giúp đỡ tôi vượt qua những trở ngại và khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm
trọng điểm Công nghệ gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn
thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành PGS. TS. Vũ Mạnh Hùng- Học viện Quân Y, PGS. TS. Nguyễn
Văn Chương, Chủ nhiệm Bộ môn – Khoa Nội Thần kinh, Bệnh Viện 103, ThS. Nguyễn Thị
Hương-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 3, TS. Đoàn Lan Phương- Viện Hóa học các
Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm,
phân tích thành phần và hàm lượng các axít béo không bão hoà.
Bên cạnh đó, tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các cô chú, anh
chị, các bạn đồng nghiệp đã và đang làm việc tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Hoàng Thị Minh
Hiền, ThS. Ngô Thị Hoài Thu, ThS. Đinh Thị Ngọc Mai, KS. Lê Thị Thơm, KS. Nguyễn Cẩm Hà,
KTV. Đỗ Thị Là, ThS. Đinh Đức Hoàng, ThS. Bùi Đình Lãm, ThS. Hoàng Sỹ Nam, ThS. Nguyễn
Đình Hưng. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó.
Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam “Nghiên cứu đánh giá và khai thác hoạt chất từ tảo biển” (2007-2008) và đề
tài “Nghiên cứu xây dựng tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng, dị dưỡng của Việt
Nam và nuôi sinh khối một số loài tảo dị dưỡng làm thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản”
(20082010) thuộc chương trình công nghệ sinh học trong thủy sản của Bộ NN và PTNT do PGS.
TS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên
cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận án của mình.

Hà Nội, ngày

tháng năm 2014

Tác giả

Hoàng Thị Lan Anh


ii

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả;
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2014

Tác giả

Hoàng Thị Lan Anh


3

MỤC LỤC
Trang
1

MỞ ĐẦU

Chương I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

3
3

1.1.

Hệ thống phân loại, các kĩ thuật phân lập và định tên chi
Schizochytrium

1.1.1.

Hệ thống phân loại

1.1.2.

Kĩ thuật phân lập và định tên

1.1.2.1.

Kĩ thuật phân lập

6

1.1.2.2.

Các kĩ thuật định tên

7

1.2.

Các axít béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 (-3 PUFA)

1.2.1.
1.2.2.

Giới thiệu chung về -3 PUFA
Vai trò của -3 PUFA đối với sức khoẻ con người

8

1.2.3.

Sản xuất ω-3 PUFA từ vi tảo

12

1.3.

Đặc điểm sinh học của chi Schizochytrium

14

1.3.1.

14
Đặc điểm sinh thái
Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sinh trưởng, tích lũy lipit và -3
14
PUFA ở Schizochytrium

1.3.2.

3
6

8
9

Ảnh hưởng của nguồn C và N

14

1.3.2.2.

Ảnh hưởng của nồng độ muối

16

1.3.2.3.

Ảnh hưởng của nhiệt độ

17

1.3.3.

Con đường sinh tổng hợp DHA ở chi Schizochytrium

20

1.4.

Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng nói chung và chi
Schizochytrium nói riêng cho sản xuất -3 PUFA

23

1.4.1.

Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng cho sản xuất -3 PUFA

23

1.4.2.

Sản xuất DHA ở quy mô lớn ở chi Schizochytrium

25

1.3.2.1.


4

1.5.
1.5.1.

Những ứng dụng sinh khối của chi Schizochytrium
Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

27

1.5.2.

Sản xuất thức ăn cho gia súc, gia cầm

31

1.5.3.

Sản xuất dầu sinh học giàu omega-3

32

1.5.4.

Sản xuất nhiên liệu sinh học

33

Tình hình nghiên cứu vi tảo biển dị dưỡng ở Việt Nam

34

1.6.

27

Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

37

2.1.

Vật liệu

37

2.1.1.

Mẫu vật

37

2.1.2.

Vi sinh vật

37

2.1.3.

Các bộ sinh phẩm

37

2.1.4.

Động vật thí nghiệm

37

2.2.

Hoá chất

38

2.3.

Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

38

2.4.

Môi trường

39

2.5.

Phương pháp nghiên cứu

40

2.5.1.

Phân lập chi Schizochytrium

40

2.5.2.

Chụp ảnh hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)

40

2.5.3.

Các phương pháp sinh học phân tử

41

2.5.3.1.

Tách chiết DNA tổng số từ các chủng Schizochytrium spp.

41

2.5.3.2.

Nhân gen bằng kỹ thuật PCR

41

2.5.3.3.

Tinh sạch sản phẩm PCR

42

2.5.3.4.

Tách dòng gen

42

2.5.3.5.

Xác định trình tự gen

44

2.5.4.

Xác định sinh trưởng của các chủng Schizochytrium spp.

44


5

2.5.5.

Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng

45

Schizochytrium spp.
2.5.6.

Xác định hàm lượng lipít trong sinh khối tảo

45

2.5.7.

Phân tích thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh khối
Schizochytrium spp.

46

2.5.8.

Phương pháp nhuộm lipít b ng ile ed

46

2.5.9.

Phương pháp xác định đường khử b ng DNSA

46

2.5.10.

Nghiên cứu tính an toàn viên Algal Omega -3

47

2.5.10.1.

Nghiên cứu độc tnh cấp của Algal Omega -3

47

2.5.10.2.

Nghiên cứu độc tnh bán trường diễn

47

2.5.11.

Nghiên cứu hiệu lực của chế phẩm Algal Omega- 3

49

2.5.11.1.

Xác định phản xạ tìm kiếm thức ăn trong mê lộ

49

2.5.11.2.

Nghiên cứu trên mô hình phản xạ tránh shock chủ động có điều kiện

49

2.5.11.3.

Nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm năng lực tâm thần kinh

51

2.5.12.

Nghiên cứu sử dụng sinh khối tảo S. mangrovei PQ6 làm giàu luân
trùng (Brachionus plicatilis) và Artemia

51

2.5.12.1.

Xác định lượng tảo và thời gian làm giàu thích hợp cho luân trùng và
Artemia

51

2.5.12.2.

So sánh việc sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 tươi, khô và chất
cường hoá Golden Power trong việc làm giàu Artemia

52

2.5.12.3.

So sánh việc sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 tươi, men bánh mì
và vi tảo biển quang tự dưỡng

52

2.5.12.4.

Sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn
cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790)
Nghiên cứu sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 làm giàu Artemia

53

2.5.12.5.

56

làm thức ăn cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775)
2.6.

Xử lý số liệu

57


6

Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.

58

Đặc điểm sinh học của các đại diện thuộc chi vi tảo biển

58

Schizochytrium
3.1.1.

Phân lập các chủng Schizochytrium spp. từ các mẫu lá cây thu thập

58

ở vùng rừng ngập mặn ở Việt Nam

3.1.2.

Tuyển chọn một số chủng thuộc chi Schizochytrium tiềm năng cho

59

việc sản xuất DHA
3.1.3.

Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của một số chủng thuộc chi

61

Schizochytrium tiềm năng
3.1.3.1.

Một số đặc điểm hình thái điển hình

61

3.1.3.2.

Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng tiềm năng

63

3.1.3.3.

Phân tch hàm lượng lipít, axít béo tổng số và DHA của các chủng tiềm

68

năng
3.1.3.4.

Bảo quản giống

70

3.1.4.

Phân loại các chủng tiềm năng

72

3.1.4.1.

So sánh một số đặc điểm hình thái của các chủng tuyển chọn với một

72

số loài đại diện thuộc chi Schizochytrium
3.1.4.2.

Phân tch trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa 18S rRNA

74

3.2.

Công nghệ nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ

79

thống lên men
3.2.1.

Sinh trưởng chủng PQ6 trong bình lên men 5 và 10 lít

79

3.2.2.

Sinh trưởng chủng PQ6 trong bình lên men 30 lít tự tạo

83

3.2.3.

Xây dựng quy trình nuôi trồng chủng PQ6 trong bình lên men 30 lít

87

tự tạo
3.2.4.

Phân tích thành phần dinh dưỡng sinh khối vi tảo thu được

89

3.3.

Bước đầu sử dụng sinh khối chủng PQ6 trong sản xuất viên thực

90

phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản


vii

3.3.1.

Sản xuất viên Algal Omega- 3 từ sinh khối khô chủng PQ6

90

3.3.1.1.

Quy trình tạo viên Algal Omega-3

90

3.3.1.2.

Nghiên cứu tnh an toàn và hiệu lực của viên Algal Omega-3 (AO-3)

93

3.3.2.

Ứng dụng sinh khối chủng PQ6 trong nuôi trồng thủy sản

102

3.3.2.1.

Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm giàu Artemia và luân trùng

102

(Brachionus plicatilis)
3.3.2.2.
3.3.2.3.

Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu Artemia làm
thức
ăn sống cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775)
Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu luân trùng và
Artemia làm thức ăn sống cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer
Bloch, 1790)

Chương IV. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

117
119

121

4.1.

Đặc điểm sinh học của các chủng Schizochytrium đã phân lập

121

4.2.

Nuôi trồng chủng tềm năng PQ6 ở các hệ thống lên men

127

4.3.

Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm thực phẩm chức năng và nuôi trồng

135

thủy sản
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

139

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ

142

TÀI LIỆU THAM KHẢO

143

PHỤ LỤC


8

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tên đầy đủ

Tiếng Việt

AA

Arachidonic acid (C20:4-6)

Axít arachidonic

AO-3

Algal Omega- 3

Algal Omega- 3

ALT

Alanine aminotransferase

Alanine aminotransferase

AST

Aspartate aminotransferase

Aspartate aminotransferase

ASTM

American Society for Testng and

Hiệp hội vật liệu và thử nghiệm Hoa

Materials

Kỳ

CCT

Chuột cống trắng

Chuột cống trắng

CNT

Chuột nhắt trắng

Chuột nhắt trắng

DHA

Docosahexaenoic acid (C22:6-3)

Axít docosahexaenoic

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axít deoxyribonucleic

DO

Dissolved oxygen

Oxy hòa tan

DPA

Docosapentaeoic acid (C22:5-6)

Axít docosapentaeoic

E.coli

Escherichia coli

Vi khuẩn E.coli

EPA

Eicosapentaenoic acid (C20:5-3)

Axít eicosapentaenoic

FAME

Fatty acid methyl ester

Các axít béo dạng methyl ester

GPYc

Glucose-Polypepton- Yeast

Môi

extract- chloramphenicol

Schizochytrium

trường

polypepton-

phân
gồm

cao

lập

glucose-

nấm

IPTG

isopropylthio-β-galactoside

chloramphenicol
isopropylthio-β-galactoside

KLCT

Khối lượng cơ thể

Khối lượng cơ thể

KLK

Khối lượng khô

Khối lượng khô

men-


9

KLT

Khối lượng tươi

Khối lượng tươi

LB

Lauria Betani

Môi trường LB

LCPUFA

Long Chain Polyunsaturated Fatty

Axít béo không bão hòa mạch dài đa

Acid

nối đôi

Lethal dose

Liều gây chết 50% số động vật thực

LD50

nghiệm
MĐTB

Mật độ tế bào

Mật độ tế bào

MUFA

Mono-unsaturated fatty acid

Axít béo không bão hòa một nối đôi

NTTS

Nuôi trồng thủy sản

Nuôi trồng thủy sản

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

PUFA

Polyunsaturated fatty acid

Axít béo không bão hòa đa nối đôi

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

ARN riboxom

SEM

Scanning electron microscope

Kính hiển vi điện tử quét

SFA

Saturated fatty acid

Axít béo bão hòa

TFA

Total fatty acid

Axít béo tổng số

TLS

Tỷ lệ sống

Tỷ lệ sống

VTBDD

Vi tảo biển dị dưỡng

Vi tảo biển dị dưỡng


10

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1.

Những thay đổi trong việc phân loại một số loài thuộc chi

6

Schizochytrium
Bảng 1.2.

Hàm lượng lipit và thành phần axít béo của một số loài vi tảo

13

Bảng 1.3.

Tóm tắt một số điều kiện quan trọng cho sự tổng hợp DHA ở

18

Schizochytrium
Bảng 1.4.

Tóm tắt một số nguồn C và N đã được sử dụng để sản xuất -3

19

PUFA ở một số chủng Schizochytrium
Bảng 2.1.

Thời gian và địa điểm thu mẫu

37

Bảng 2.2.

Sơ đồ thí nghiệm nuôi và làm giàu luân trùng

53

Bảng 2.3.

Sự tương quan giữa mật độ (cá thể/ml) với thức ăn A1 DHA Selco

54

Bảng 3.1.

Một số đặc điểm của vị trí thu mẫu

58

Bảng 3.2.

Sinh trưởng và hàm lượng lipít tổng số của các chủng thuộc chi

60

Schizochytrium đã phân lập
Bảng 3.3.

Hàm lượng lipit, thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh

69

khối của 4 chủng Schizochytrium spp. tềm năng
Bảng 3.4.

So sánh một số đặc điểm sinh học của 4 chủng tiềm năng với hai loài

73

đại diện của chi Schizochytrium
Bảng 3.5.

Các loài thuộc chi Schizochytrium có trình tự đoạn gen 18S rRNA đã

76

công bố trên GenBank được sử dụng để phân loại các chủng tềm
năng
Bảng 3.6.

Lượng sinh khối khô, hàm lượng lipit và DHA trong sinh khối chủng

82

PQ6 nuôi ở các hệ thống lên men 5 và 10 lít ở thời điểm 96 giờ
Bảng 3.7.

Sự thay đổi thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh khối

85

chủng PQ6 nuôi trong bình lên men 30 lít thu tại các thời điểm khác
nhau
Bảng 3.8.

Thành phần dinh dưỡng, và kim loại nặng trong sinh khối chủng
PQ6 (% KLK)

89


11

Bảng 3.9.

Thành phần dinh dưỡng của viên Algal Omega-3 (% KLK)

91

Bảng 3.10.

Các chỉ têu lý hoá, vi sinh và kim loại nặng của viên Algal Omega-3

92

Bảng 3.11.

Ảnh hưởng của AO- 3 lên một số chỉ têu huyết học và sinh hóa máu

95

của thỏ thí nghiệm
Bảng 3.12.

Ảnh hưởng của AO-3 đối với điện tim thỏ ghi ở đạo trình DII

97

Bảng 3.13.

Thời gian đáp ứng phản xạ tìm kiếm thức ăn trong mê lộ của chuột

99

nhắt trắng (s)
Bảng 3.14.

Kết quả đo phản xạ tìm kiếm thức ăn trong mê lộ trên chuột nhắt

100

trắng non
Bảng 3.15.

Kết quả đo đáp ứng phản xạ trên mô hình tránh shock chủ động có

101

điều kiện ở chuột cống trắng
Bảng 3.16.

Thời gian đáp ứng phản xạ của chuột nhắt trắng non trong thử

101

nghiệm nhảy khỏi phiến nóng
Bảng 3.17.

Hàm lượng lipit và axít béo ở Artemia sau khi làm giàu bằng sinh

104

khối khô chủng PQ6 với các nồng độ khác nhau
Bảng 3.18.

Hàm lượng lipit và axít béo ở luân trùng sau khi làm giàu bằng sinh

107

khối khô chủng PQ6 với các nồng độ khác nhau

Bảng 3.19.

Thành phần axit béo của Artemia ở các lô thí nghiệm làm giàu bằng

111

Golden Power và sinh khối chủng PQ6 sau 15 giờ
Bảng 3.20.

Mật độ luân trùng khi nuôi bằng vi tảo biển quang tự dưỡng và men

113

bánh mì sau 7 ngày
Bảng 3.21.

Hàm lượng lipit và thành phần axít béo trong sinh khối luân trùng

115

sau quá trình nuôi và làm giàu khác nhau
Bảng 3.22.

So sánh kích thước của ấu trùng Zoea ở các lô thí nghiệm

119


xii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1.

Vị trí phân loại chi Schizochytrium

Hình 1.2.

Chu trình sống của các chi đại diện thuộc ngành Labyrinthulomycota

Hình 1.3.

Cấu trúc hoá học của DHA và EPA

Hình 1.4.

Con đường tổng hợp PUFA ở động vật có vú, thực vật và chi

3
4
9
22

Schizochytrium
Hình 3.1.

Khuẩn lạc nuôi cấy trên đĩa thạch (A) và chụp dưới kính hiển vi

59

quang học (B, độ phóng đại 100 X) của chủng Schizochytrium sp.
PQ6, PQ7, TH16 và TB17
Hình 3.2A.

Hình thái tế bào chụp dưới kính hiển vi điện tử quét- SEM (A) và

62

kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần (B)
Hình 3.2B.

Một số giai đoạn trong chu trình sống của chủng PQ6

62

Hình 3.3.

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng

63

Hình 3.4.

Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng

63

Hình 3.5.

Ảnh hưởng của nguồn cácbon lên sinh trưởng

65

Hình 3.6.

Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng

65

Hình 3.7.

Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng

66

Hình 3.8.

Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng

Hình 3.9.

Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng

Hình 3.10.

Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số và PCR nhân một phần gen 18S

67
68
74

rRNA của 4 chủng tềm năng
Hình 3.11.

Plasmid sau khi tách chiết và cắt kiểm tra bởi enzyme giới hạn

76

Hình 3.12.

Cây phát sinh chủng loại của 4 chủng Schizochytrium spp. nghiên cứu

78

với một số loài thuộc chi Schizochytrium đã công bố trên GenBank
Hình 3.13.

Sinh trưởng của chủng PQ6, sự thay đổi pH và hàm lượng glucose

80

còn dư trong môi trường nuôi trong bình lên men 5 lít
Hình 3.14.

Sinh trưởng của chủng PQ6, sự thay đổi pH và hàm lượng glucose
còn dư trong môi trường nuôi trong bình lên men 10 lít

81

xiii

Hình 3.15.

Hình thái tế bào chủng PQ6 trong bình lên men 5 lít (A), 10 lít (B) ở

82

các giai đoạn nuôi cấy khác nhau
Hình 3.16.

Sinh trưởng của chủng PQ6, sự thay đổi pH và hàm lượng glucose

83

còn lại trong môi trường nuôi trong bình lên men 30 lít
Hình 3.17.

Ảnh chụp tế bào chủng PQ6 nuôi ở bình 30 lít tự tạo ở các thời điểm

84

khác nhau dưới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi huỳnh
quang (B) sau khi nhuộm Nile Red
Hình 3.18.

Sơ đồ quy trình nuôi theo mẻ chủng PQ6 trong bình lên men 30 lít

87

Hình 3.19.

Quy trình tạo viên Algal Omega-3 từ sinh khối chủng PQ6

91

Hình 3.20.

Ảnh hưởng của AO-3 lên sự tăng khối lượng cơ thể thỏ

94

Hình 3.21.

Ảnh chụp hình thái của gan, lách, thận thỏ trước và sau khi uống AO-

98

3 dưới kính hiển vi huỳnh quang
Hình 3.22.

Tỷ lệ sống (%) (A) và thời gian chuyển giai đoạn (B) của ấu trùng cua

118

xanh ở các giai đoạn khi ăn Artemia được và không được làm giàu
bằng sinh khối tươi chủng PQ6
Hình 3.23.

Tỷ lệ sống của cá Chẽm giai đoạn 1 tháng tuổi khi ăn bằng luân trùng

120

và Artemia được làm giàu bằng sinh khối chủng PQ6 và A1 DHA
Selco
Hình 3.24.

Tăng trưởng về chiều dài của cá Chẽm giai đoạn 3 ngày tuổi đến 1
tháng tuổi khi ăn bằng luân trùng và Artemia làm giàu bằng sinh khối
chủng PQ6 và A1 DHA Selco

120


1

MỞ ĐẦU
Được coi là nền công nghiệp mang lại hàng tỷ đô la hàng năm, công nghệ sinh
học vi tảo ngày càng mở ra nhiều lĩnh vực nghiên cứu mới. Mặc dù vậy, việc sử dụng
vi tảo nhằm tăng cường giá trị dinh dưỡng của thực phẩm cho con người và thức ăn
cho động vật vẫn là những lĩnh vực chiếm ưu thế, mang lại lợi nhuận cao và có một
lịch sử phát triển tương đối lâu dài.
Schizochytrium là một chi vi tảo biển dị dưỡng phân bố rộng rãi trong hệ sinh
thái biển và rừng ngập mặn. Chúng đóng vai trò là những sinh vật phân huỷ, mắt
xích đầu tên trong chuỗi thức ăn ở những hệ sinh thái nói trên. Loại vi tảo này có
khả năng tích lũy hàm lượng cao lipit (có thể lên tới 70% khối lượng khô) và các axít
béo không bão hoà thuộc nhóm omega-3 (-3 PUFA) như axít eicosapentaenoic
(EPA, C20: 5-3), axít docosahexaenoic (DHA, C22: 6-3). Những tác động tích cực
cũng như tầm quan trọng của các -3 PUFA này đã được chứng minh ở nhiều khía
cạnh như sự phát triển toàn diện của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tm mạch, hệ

thần kinh, và trong nhiều liệu pháp điều trị các bệnh ung thư, mất trí nhớ,
trầm
cảm…. Hiện nay, loại vi tảo này được coi là ứng cử viên tềm năng thay thế nguồn
sản xuất -3 PUFA truyền thống từ dầu cá. Việc nuôi cấy chúng có thể được thực
hiện ở quy mô lớn bằng những hệ thống lên men thông thường với hiệu quả cao.
Nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ loại vi tảo này dành cho con người, và động vật đã
có mặt trên thị trường quốc tế và dần trở nên quen thuộc với người tiêu dùng ở
khắp nơi trên thế giới.
Việt Nam đang sở hữu một khu hệ động thực vật biển rất đa dạng về thành
phần loài/chủng và giàu các hợp chất tự nhiên có thể dùng trong công nghiệp, thực
phẩm, nông nghiệp, y dược trong đó có vi tảo. Vi tảo biển quang tự dưỡng là một
trong những đối tượng truyền thống đã được các nhà nghiên cứu trong nước
quan tâm cho nhiều mục đích khác nhau trong đó có nuôi trồng thuỷ
sản (Nannochloropsis, Isochrysis, Chaetoceros…). Tuy nhiên, những nghiên cứu
nhằm khai thác và ứng dụng các chi vi tảo biển dị dưỡng, đặc biệt là chi
Schizochytrium vẫn còn là rất mới, hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tễn
cho đời sống con


2

người. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh
học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium
mangrovei PQ6”.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
 Có được bộ sưu tập chủng vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi Schizochytrium
phân lập từ một số vùng biển, vùng rừng ngập mặn của Việt Nam và sàng
lọc các
chủng tiềm năng cho việc sản xuất -3 PUFA.
 Lựa chọn được một chủng tềm năng để nuôi thu sinh khối tạo viên thực

phẩm
chức năng và thử nghiệm trên một số đối tượng thuỷ hải sản.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
 Phân lập các chủng Schizochytrium spp. từ các mẫu lá cây thu thập ở ven
bờ biển, vùng rừng ngập mặn ở Việt Nam;
 Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của một số chủng tềm năng đã
phân lập;
 Nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ thống lên men khác
nhau (5, 10 và 30 lít);
 Sản xuất viên Algal Omega- 3 từ sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6,
đánh giá tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm này trên động vật
thực nghiệm;
 Sử dụng sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6 làm giàu Artemia và luân
trùng (Brachionus plicatilis) để ương nuôi ấu trùng cua xanh (Scylla serrate
Forskal, 1775) và cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790).
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
 Bổ sung thêm chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mới vào danh sách các
chi vi tảo biển có nguồn gốc từ Việt Nam;
 Có được những dẫn liệu khoa học về các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
của một số loài/chủng tiềm năng thuộc chi Schizochytrium đã được phân lập;
 Chứng minh được khả năng ứng dụng chủng vi tảo Schizochytrium mangrovei
PQ6 trong lĩnh vực sản xuất thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản.


3

Chương I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Hệ thống phân loại, các kĩ thuật phân lập và định tên chi Schizochytrium
1.1.1. Hệ thống phân loại
Trong những nghiên cứu trước đây, chi Schizochytrium được xếp vào bộ

Saprolegniales thuộc ngành Oomycota do có nhiều nét tương đồng với nấm động
bào tử. Tuy nhiên, ngày nay với những bằng chứng về siêu cấu trúc và trình tự
nucleott của đoạn gen 18S rRNA thu được, các nhà khoa học đã xếp chúng vào
một giới riêng - giới Chromista. Chi Schizochytrium được xếp vào ngành
Labyrinthulomycota, lớp Labyrinthulea, bộ Labyrinthulida, họ Thraustochytriidae
(Porter, 1990; Cavalier- Smith, 1998). Sơ đồ phân loại chi Schizochytrium được chỉ
ra trên hình 1.1.
Ngành
Labyrinthulomycota
Lớp
Labyrinthulea
Bộ
Labyrinthulida

Họ
Labyrinthulidae
Thraustochytriidae

Chi
Labyrinthula
Thraustochytrium
Schizochytrium
Ukenia
Labyrinthuloides
…

Hình 1.1. Vị trí phân loại chi Schizochytrium (Porter, 1990)
Chi Schizochytrium được đặc trưng bởi tế bào hình cầu, mạng lưới ngoại
chất rất phát triển, khuẩn lạc sinh dưỡng lớn, động bào tử có dạng ovan hoặc dạng
trứng, sinh trưởng bằng hình thức tế bào sinh dưỡng phân đôi liên tiếp tạo thành

4,
8 hoặc một cụm tế bào (có thể lên tới 100 tế bào). Cũng như nhiều chi thuộc ngành
Heterokontophyta, trong chu trình sống của tế bào có giai đoạn hình thành động
bào


4

tử có hai roi lệch. Hình 1.2 là hình mô tả chu trình sống của một số chi đại diện
(Porter, 1990).

Hình 1.2. Chu trình sống của các chi đại diện thuộc ngành Labyrinthulomycota

(Porter, 1990)
Chú thích: chi Schizochytrium: tế bào non với mạng lưới ngoại chất (a) phân chia liên tiếp
tạo thành 4 tế bào (b) và tạo thành một khối các tế bào (c); Mỗi tế bào phát triển thành
túi động bào tử (d) và giải phóng động bào tử (e), động bào tử biệt hóa thành tế bào
non.

Thành tế bào có chứa sulphate polysacharide với thành phần chủ yếu là
galactose hoặc fructose và protein (Chamberlain, 1980). Hệ thống mạng lưới ngoại
chất (EN) được sinh ra từ một hoặc nhiều điểm trên thành tế bào. EN hình
thành nên một mạng lưới nhánh của màng sinh chất kéo dài, liên quan đến một
bào quan gọi là bothrosome hoặc sagenogenetosome (sagenogen) ở phía bề mặt
ngoài tế bào (Porter, 1990). EN góp phần làm tăng vùng bề mặt tế bào, có chứa
enzyme thủy


5

phân gắn trên bề mặt hoặc nằm chìm trong môi trường xung quanh đã giúp cho
việc têu hóa dễ dàng các vật liệu hữu cơ. EN cũng gắn tế bào với môi trường và
tến hành phân hủy các cơ chất hữu cơ. Tế bào hầu như không sản xuất EN khi
phát triển trên môi trường lỏng giàu dinh dưỡng, đặc biệt là trong điều kiện nuôi
lắc (Raghukumar, 2008).
Hiện có 5 loài thuộc chi Schizochytrium đã được mô tả bao gồm S.
mangrovei Raghukumar, S. aggretatum Goldstein & Belsky, S. octosporum
Raghukumar, S. minutum Gaertner và S. limacinum Honda & Yokochi (Raghukumar,
1988; Honda và cs, 1998). Trong cả một thời gian dài sự phân loại của chi
Schizochytrium nói riêng và lớp Labyrinthulea nói chung chỉ dựa vào duy nhất các
đặc điểm hình thái và hình thức giải phóng động bào tử. Khóa phân loại chi tết của
các họ và chi thuộc lớp Labyrinthulea dựa trên các đặc điểm hình thái (hình dạng tế
bào, mạng lưới ngoại chất, tế bào amip), sự hình thành động bào tử và tổng hợp
sắc tố (chủ yếu là beta-caroten) đã được Yokoyama và cộng sự đưa ra năm
2007 (Yokohama và cs., 2007; Jones & Pang, 2012). Ngày nay, các công cụ sinh
học phân tử hiện đại đã hỗ trợ đắc lực trong việc phân loại chính xác hơn các loài
thuộc các chi khác nhau. Mặc dù còn là lĩnh vực khá non trẻ, hệ gen của các sinh
vật đơn bào ở biển giúp chúng ta hiểu biết nhiều hơn về sinh vật nhân chuẩn
(Worden & Allen, 2010). Hệ gen này có thể là những công cụ vô giá cho việc khai
thác mối quan hệ tến hóa, chức năng gen, trao đổi chất và sự phát triển của các
đặc điểm phức tạp giữa các nhóm vi sinh vật (McGrath & Katz, 2004) và sẽ tếp tục
làm sáng tỏ những điểm còn đang tranh cãi. Nhìn chung, các sinh vật biển đơn
bào có độ đa dạng cao do chúng là kết quả của các hiện tượng nội cộng sinh
khác nhau diễn ra từ xa xưa (Worden & Allen, 2010).
Yokoyama và cộng sự đã đề xuất bổ sung thêm 5 chi mới nâng tổng số lên
12 chi thuộc họ Thraustochytriidae (Yokoyama & Honda, 2007; Yokoyama và cs,
2007). Điều này dẫn đến sự sắp xếp lại một số loài trong đó có 4 loài thuộc chi
Schizochytrium (bảng 1.1). Tuy nhiên, đây vẫn còn là vấn đề đang gây tranh cãi đối
với các nhà khoa học.

6

Bảng 1.1. Những thay đổi trong việc phân loại một số loài thuộc chi
Schizochytrium (Jones & Pang, 2012)
Chi

Tên mới

Oblongichytrium

Tên gốc

Oblongichytrium minutum

Schizochytrium

minutum

(A. Gaertn.) R. Yokoyama và D. Honda

Gaertn.

Oblongichytrium octosporum

Schizochytrium octosporum

(Raghuk.) R Yokoyama và D. Honda

Raghuk.

Aurantiochytrium limacinum (D. Honda và Schizochytrium limacinum
Aurantiochytrium

Yokochi) R. Yokoyama và D. Honda

D. Honda và Yokochi

Aurantiochytrium mangrovei

Schizochytrium mangrovei

(Raghuk.) R. Yokoyama và D. Honda

Raghuk.

1.1.2. Kĩ thuật phân lập và định tên
1.1.2.1. Kĩ thuật phân lập
Phương pháp dùng mồi là phấn thông (pine pollen baitng) và trải trực tếp
trên đĩa (direct platng) là phương pháp hiệu quả, được sử dụng để phân lập các
loài thuộc họ Thraustochytriidae nói chung và chi Schizochytrium nói riêng
(Bremer,
2000; Burja và cs, 2006; Jakobsen và cs, 2007). Các hạt phấn thông được khử trùng
được rải trên bề mặt mẫu nước biển có chứa kháng sinh, chất kháng nấm và được
ủ
1–2 tuần. Khi quan sát thấy các tế bào phát triển trên bề mặt phấn thông, chúng
sẽ được trải trên đĩa thạch để thu nhận các khuẩn lạc đặc trưng trước khi đưa vào
môi trường lỏng nuôi cấy nhằm thu chủng sạch (Wilkens & Maas, 2012).
Nhiệt độ có thể ảnh hưởng lên quá trình phân lập thành công hay không
o

vì khi tến hành phân lập ở 18-30 C cũng là nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của
cả các vi sinh vật tạp nhiễm như nấm và vi khuẩn. Các chất kháng sinh như
penicillin và streptomycin (Burja và cs, 2006; Quilodran và cs, 2010), rifampicin và
các thuốc kháng nấm như nystatn (Jakobsen và cs, 2007; Wilkens & Maas,
2012) và
amphotericin B (Taoka và cs, 2010) đã được bổ sung vào môi trường thạch và lỏng


7

để hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và các khuẩn lạc sợi
nấm.


8

1.1.2.2. Các kĩ thuật định tên
* Kĩ thuật hóa sinh
Kĩ thuật nhuộm huỳnh quang đã được phát triển nhằm xác định số lượng tế
bào nhờ phản ứng giữa fluorochrome (acriflavine), thành tế bào và nhân. Khi đó,
thành tế bào bắt màu đỏ, nhân bắt màu xanh. Tuy nhiên, kĩ thuật này trong một
số trường hợp không thể phát hiện được các tế bào Schizochytrium ở giai đoạn
động bào tử (do hầu hết các loài không có thành tế bào) hoặc khi các tế bào có
thành mỏng (Gupta và cs, 2012). Một phương pháp đặc hiệu để phát hiện họ
Thraustochytriidae là lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) đã được thiết lập với việc sử
dụng một đầu dò ThrFL1 đối với rRNA đích đã cho phép giải quyết được những
hạn chế nêu trên (Takao và cs, 2007). Trong kĩ thuật FISH có quá trình lai giữa đầu
dò ThrFL1 với rRNA sẽ cho phép phát hiện các động bào tử và các tế bào sinh
dưỡng còn non. Phương pháp nhuộm bằng Sudan Black cũng đã được sử dụng để

phát hiện ra các tế bào thuộc họ Thraustochytriidae nói chung (Wong và cs, 2008;
Gupta và cs, 2012).
* Định tên bằng kĩ thuật sinh học phân tử
Kĩ thuật định tên bằng sinh học phân tử dựa trên việc đọc và phân tích
trình tự của gen hoặc đoạn gen 18S rRNA đã được sử dụng để xác định mối quan
hệ di truyền của các chủng phân lập chưa biết và những chủng đã được biết thuộc
họ Thraustochytriidae. Phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen 18S rRNA cần một
cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên các trình tự gen đã biết của các chủng
nghiên cứu. Sau đó việc so sánh và phân tích mối quan hệ di truyền sẽ được tến
hành để tìm ra loài mới (Mo và cs, 2002; Yokoyama & Honda, 2007). Đây là công cụ
tương đối chính xác cho phép xác định hoặc thiết lập các mối quan hệ giữa các loài
thuộc họ Thraustochytriidae.
* Phân tch siêu cấu trúc
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) đã cho phép phát hiện nhiều
thể lipit trong phần tế bào chất của tế bào thuộc họ Thraustochytriidae. Các thể
lipit này sau đó được xác định lại bằng phương pháp nhuộm với Sudan
Black B


9

(Subramaniam & Chaubal, 1990). Nghiên cứu siêu cấu trúc tế bào bằng TEM đã
cho phép dựng nên những nét chung về cấu tạo tế bào thraustochytrid với
kích thước rất khác nhau, đường kính xấp xỉ 6–21 μm, phần tế bào chất dạng hạt có
chứa các hạt dầu hình cầu. Dưới kính hiển vi TEM có thể quan sát thấy một thể lipit
liên kết với các cấu trúc mảnh, rỗng có chứa các băng sáng, tối. Dạng cấu trúc mảnh
này đã được mô tả như là tỷ lệ của các axít béo bão hòa, không bão hòa một nối
đôi trên các axít béo không bão hòa đa nối đôi (Wong và cs, 2008). Người ta cũng
đã quan sát thấy có một mối liên hệ giữa sự hình thành thể lipit và mạng lưới nội
chất (ER) ở S. limacinum SR21 (Morita và cs, 2006). Các thể lipit bao quanh bởi ER

đã được nghiên cứu rộng rãi ở nấm Mortierella ramanniana (Kamisaka và cs,
1999) trong khi những nghiên cứu tương tự thì chưa được thực hiện đối với họ
Thraustochytriidae.
1.2. Các axít béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 (-3 PUFA)
1.2.1. Giới thiệu chung về -3 PUFA
Trong những thập niên gần đây, các axít béo không bão hoà đa nối đôi
(polyunsaturated fatty acid - PUFA) đã được đặc biệt quan tâm nghiên cứu và ứng
dụng trong dinh dưỡng và dược phẩm. PUFA là các axít béo mạch dài (18 - 22
nguyên tử cácbon) có chứa hai hoặc nhiều hơn các liên kết cácbon đôi. Chúng
được phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tên được tính từ đầu methyl. Để chỉ
vị trí nối đôi đầu tên trên mạch cacbon, người ta có thể sử dụng ký hiệu “n”
hay “ω”.
Hiện PUFA được phân thành hai nhóm chính là -3 (liên kết đôi đầu tên tại vị trí
cácbon thứ 3) và -6 (liên kết đôi đầu tên tại vị trí cácbon thứ 6). Các liên kết đôi
trong PUFA có thể cũng được tính từ nhóm carboxyl và khi đó được ký hiệu là “Δ”.
Axít docosahexaenoic (DHA, 22:6 Δ 4,7,10,13,16,19) và axít eicosapentaenoic
(EPA, 20:5 Δ 5,8,11,14,17) là hai thành viên thuộc họ ω-3 PUFA được quan tâm
nghiên cứu nhiều nhất bởi vai trò đặc biệt quan trọng của chúng đối với con
người và động vật. Cấu trúc hoá học của hai ω-3 PUFA này được chỉ ra trên hình
1.3 (Sijtsma & de Swaaf, 2004).


10

Hình 1.3. Cấu trúc hoá học của DHA và EPA (Sijtsma & de Swaaf, 2004)
1.2.2. Vai trò của -3 PUFA đối với sức khoẻ con người
Các PUFA có ba vai trò sinh học chủ yếu. Đầu tên phải kể tới việc tham gia
vào sự điều hòa quá trình trao đổi lipít, vận chuyển và hướng tới các mô. Ví dụ các
hoạt động bao gồm sự ức chế quá trình sinh tổng hợp triacylglycerol ở gan bởi
các

-3 PUFA. Bên cạnh đó, các PUFA còn tham gia vào thành phần cấu trúc nên
thành tế bào. Sự có mặt của chúng trong thành phần phospholipit góp phần tạo
nên tính linh động của màng. Điều này góp phần quan trọng trong việc điều chỉnh
hoạt động của các protein màng. Màng phospholipit cũng là nguồn các phân tử
thông tn thứ hai như diacylglycerol, phosphatdic, inositol–1, 4, 5- trisphosphate,
ceramide và AA (axít arachidonic) - những phân tử chịu trách nhiệm cho các hoạt
động tín hiệu của màng tới vùng nguyên sinh chất và nhân để điều chỉnh tương
ứng các phản ứng đáp lại; và các phân tử tín hiệu ngoại bào như yếu tố hoạt hoá
tiểu cầu. Ngoài ra, một số PUFA còn đóng vai trò là cơ chất cho việc tổng hợp các
phân tử có hoạt tính sinh học như prostaglandin (PG), thromboxan (TX) và
leukotrien (LT) (Calder,
2003).
Trong thập niên 80, những hiểu biết của con người về PUFA nói chung đã
được mở rộng, đặc biệt là các -3 PUFA. Con người không tự tổng hợp được -3
và -6 PUFA do thiếu enzyme delta-12 và delta-15 desaturase và vì vậy, chúng
phải được lấy từ ngoài vào thông qua chế độ ăn (Calder, 2003). Việc têu thụ EPA
và DHA đã được chứng minh là có thể ngăn ngừa bệnh tim mạch, hệ thần kinh và
tình trạng viêm. Do liên quan đến sức khỏe tim mạch nên nếu thường xuyên têu
thụ