ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MỨC TANNIN TRONG CÂY MAI DƯƠNG (Mimosa pigra L.) LÊN QUÁ TRÌNH SINH KHÍ, SỰ LÊN MEN VÀ VI SINH VẬT DẠ CỎ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ THU HỒNG

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MỨC TANNIN TRONG
CÂY MAI DƯƠNG (Mimosa pigra L.) LÊN
QUÁ TRÌNH SINH KHÍ, SỰ LÊN MEN
VÀ VI SINH VẬT DẠ CỎ

CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH: CHĂN NUÔI
2014


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ THU HỒNG

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MỨC TANNIN TRONG
CÂY MAI DƯƠNG (Mimosa pigra L.) LÊN
QUÁ TRÌNH SINH KHÍ, SỰ LÊN MEN
VÀ VI SINH VẬT DẠ CỎ

CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT
MÃ SỐ : 62.62.01.05

Cán bộ hướng dẫn
Ts. HỒ QUẢNG ĐỒ

2014


MỤC LỤC

1. Giới thiệu

1

2. Tổng quan tài liệu

2

2.1. Tổng quan về tannin

2

2.1.1. Hợp chất tannin

2

2.1.2. Tannin ảnh hưởng trên tiêu hóa in vitro

3

2.1.2.1. Tannin ảnh hưởng trên pH dạ cỏ

4

2.1.2.2. Tannin ảnh hưởng trên NH3

6

2.1.2.3. Tannin ảnh hưởng trên sự sinh khí mêtan

7

2.1.2.4. Tannin ảnh hưởng trên số lượng Protozoa

8

2.1.3. Các phương pháp định lượng tannin

9

2.2. Các thực liệu trong thí nghiệm

10

2.2.1. Cây Mai dương

10

2.2.2. Rau muống

11

2.2.3. Cỏ lông para

12

3. Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

12

4. Kết quả và thảo luận

20

4.1. Thành phần hóa học của các thực liệu thí nghiệm

20

4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của bổ sung các mức độ tannin trong 22
khẩu phần lên sự sinh khí, sự lên men và vi sinh vật dạ cỏ với khẩu phần
cơ bản là cỏ lông para
4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của bổ sung các mức độ tannin trong 26
khẩu phần lên sự sinh khí, sự lên men và vi sinh vật dạ cỏ với khẩu phần
cơ bản là rau muống
5. Kết luận và đề nghị

31

6. Tài liệu tham khảo

32

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1. Tỉ lệ tiêu hóa In vitro của vật chất khô (IVDMD), chất hữu cơ

i

4


(IVOMD) và protein thô (IVCPD) của khẩu phần với các mức tannin khác
nhau
Bảng 2. Thành phần thực liệu của thí nghiệm 1 (Tỉ lệ % tính trên vật chất
khô)
Bảng 3. Thành phần thực liệu của thí nghiệm 2 (Tỉ lệ % tính trên vật chất
khô)
Bảng 4. Lượng cân các hóa chất có trong 1 lít dung dịch đệm
Bảng 5. Thành phần hóa học của các thực liệu thí nghiệm
Bảng 6. Giá trị pH, hàm lượng NH 3, số lượng Protozoa và tỉ lệ tiêu hóa vật
chất khô của các khẩu phần thí nghiệm 1
Bảng 7. Thể tích khí tổng số, tỉ lệ CH 4 , CH4 (ml) và tỉ lệ CO2 của các khẩu
phần thí nghiệm 1
Bảng 8. Giá trị pH, hàm lượng NH 3, số lượng Protozoa và tỉ lệ tiêu hóa vật
chất khô của các khẩu phần thí nghiệm 2
Bảng 9. Bảng Thể tích khí tổng số, tỉ lệ CH 4 và tỉ lệ CO2 của các khẩu phần
thí nghiệm 2

14
14
16
21
23
24
27
29

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Hàm lượng Protein thô lá cọng mai dương tại các thời điểm thu
cắt, % trên vật chất khô
Hình 2: Hàm lượng tannin lá mai dương tại các thời điểm thu cắt, % trên vật
chất khô
Hình 3. Chai thủy tinh đựng mẫu ủ
Hình 4. Các chai đựng ủ đặt trong water-bath được kiểm soát nhiệt độ 38 oC
Hình 5. Tương quan giữa mức bổ sung tannin trong khẩu phần với tổng
lượng khí sinh ra sau 24 giờ ủ
Hình 6. Tương quan giữa mức bổ sung tannin trong khẩu phần với lượng khí
mêtan sinh ra sau 24 giờ ủ
Hình 7. Tương quan giữa mức bổ sung tannin trong khẩu phần với tổng
lượng khí sinh ra sau 24 giờ ủ
Hình 8. Tương quan giữa mức bổ sung tannin trong khẩu phần với lượng khí
mêtan sinh ra sau 24 giờ ủ
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
VCK

VFA
CHC
IVDMD
IVOMD
IVCPD
CT

Vật chất khô
Axit béo dễ bay hơi
Chất hữu cơ

Tỉ lệ tiêu hóa In vitro của vật chất khô
Tỉ lệ tiêu hóa In vitro của chất hữu cơ
Tỉ lệ tiêu hóa In vitro của protein thô
tannin cô đặc (condensed tannins)
ii

11
11
15
16
25
26
30
30


iii


1. Giới thiệu
Đặc điểm nổi bật về tiêu hóa của gia súc nhai lại là sự lên men thức ăn ở dạ
cỏ nhờ vào hoạt động của hệ vi sinh vật dạ cỏ. Quá trình lên men thức ăn và các
sản phẩm cuối cùng từ quá trình lên men là những yếu tố quan trọng trong việc cải
thiện dinh dưỡng cho gia súc nhai lại. Hệ vi sinh vật của gia súc nhai lại có khả
năng sử dụng nguồn thức ăn thô xơ mà con người và gia súc khác không sử dụng
được để tạo ra những sản phẩm giá trị cao. Điều này cho phép chăn nuôi gia súc
nhai lại dựa trên nguồn thức ăn ít bị cạnh tranh và phát triển bền vững.
Nhờ có protein vi sinh vật dạ cỏ mà gia súc nhai lại nói chung ít phụ thuộc
vào chất lượng protein thô của thức ăn hơn động vật dạ dày đơn bởi vì chúng có
khả năng biến đổi các hợp chất chứa nitơ đơn giản như urê thành protein có giá trị

sinh học cao, giảm nhu cầu axit amin không thay thế. Khả năng này của vi sinh vật
có ý nghĩa kinh tế rất lớn vì giảm chi phí cho các thức ăn chứa protein thật với
mức giá cao.
Quần thể vi sinh vật ở dạ cỏ phong phú và phức tạp, có nhiều chức năng tiêu
hóa khác nhau, có độ mẫn cảm thấp đối với các chất kháng dinh dưỡng trong thức
ăn, có khả năng sử dụng các chất khoáng vô cơ và có khả năng tổng hợp một số
vitamin. Bên cạnh đó vấn đề khí mêtan do chăn nuôi gia súc nhai lại gây ra là vấn
đề rất được quan tâm với cơ chế đã được làm rõ. Giảm thiểu thải khí mêtan từ gia
súc nhai lại đạt được hai mục đích giảm khí nhà kính toàn cầu, nâng cao hiệu quả
sử dụng thức ăn. Có nhiều cách để giảm thải khí mêtan từ gia súc nhai lại như thay
đổi con đường trao đổi chất, thay đổi tổ hợp vi sinh vật dạ cỏ hay tác động để thay
đổi sinh lý tiêu hóa dạ cỏ (Martin và ctv, 2008).
Chiến lược giảm CH4 ở dạ cỏ vì thế là tìm cách giảm tạo ra hydro, ngăn chăn
và hạn chế quá trình hình thành CH 4, đưa hydro vào các sản phẩm trao đổi chất
khác hoặc tạo ra các bể chứa H 2 khác. Chiến lược dinh dưỡng giảm thiểu mêtan là
dựa trên cơ sở các nguyên lý này (O’Mara và ctv, 2008).
Sử dụng các hợp chất thứ cấp và chất tách chiết từ thực vật như tannin và
saponin. Đối với các thức ăn chứa Tannin, việc ức chế quá trình sinh mêtan chủ
yếu là do tannin cô đặc (Martin và ctv, 2008).

1


Mặc dù tannin chung được coi là chất kháng dinh dưỡng, ở nồng độ tannin
thấp nhất định làm thay đổi quá trình lên men dạ cỏ (Bhatta và ctv, 2002) và tổng
hợp protein của vi sinh vật (Bhatta và ctv, 2001). Tannin cũng làm giảm sản xuất
CH4 dạ cỏ khi bao gồm cả các loại đậu như ôn đới hoặc chất chiết xuất tanin như
tinh khiết (Roth và ctv, 2002).
Do đó đề tài được thực hiện nhằm mục đích là xác định tỉ lệ tiêu hóa và sinh khí
mêtan của khẩu phần với các mức tannin của cây mai dương trong điều kiện In

vitro.
2. Tổng quan tài liệu
2.1. Tổng quan về tannin
2.1.1. Hợp chất tannin
Tannin là một nhóm phức hợp của các hợp chất polyphenolic được tìm thấy
trong một loạt các loài thực vật thường tiêu thụ bởi động vật nhai lại. Các tannin
được phân bố rộng khắp các loài thực vật, đặc biệt là giữa các cây bụi và cây họ
đậu thân thảo. Tannin có nhiều trong các bộ phận của cây trồng nhất là các bộ
phận có giá trị ví dụ như lá non và hoa (Terril và ctv, 1992).
Tannin được coi là có tác dụng bất lợi và có lợi tùy thuộc vào nồng độ, bản
chất của chúng, loài động vật, trạng thái sinh lý của động vật và thành phần thực
liệu của khẩu phần. Loài dê có khả năng tiêu thụ một lượng lớn các cây giàu
tannin mà không biểu hiện triệu chứng ngộ độc, do hiện diện của proline có trong
nước bọt có khả năng phân hủy hàm lượng tannin đáng kể, mà điều này không có
đối với các loài động vật nhai lại khác. Tác động tiêu cực của tannin làm giảm
mức ăn vào, trực tiếp do các tính chất làm se thức ăn của tannin và gián tiếp bằng
cách giảm khả năng tiêu hoá thức ăn (Makkar, 2003).
Tác dụng có lợi của tannin khi thức ăn thô xanh có chứa hàm lượng thấp
tannin ăn vào, có thể là do việc bảo vệ các protein từ sự phân hủy của vi sinh vật
(VSV) do đó tăng số lượng protein không bị phân hủy vào ruột non (Barry và ctv,
1986). Ngoài ra, một số lượng lớn sinh khối vi sinh vật xuống ruột non là hiệu quả
của tổng hợp protein của vi sinh vật (Getachew và ctv, 2000). Tuy nhiên, nồng độ
tannin cao trong khẩu phần có liên quan giảm khả năng tiêu hóa chất hữu cơ
(Silanikove và ctv, 1997).
Polyphenol hay cây có chứa chất tannin giảm CH4, do đó có thể sử dụng
chiến lược trong khẩu phần giảm mêtan (CH4)phát thải từ động vật nhai lại. Tổng

2

phenol và tổng tannin cũng là yếu tố dự báo tốt về tiềm năng giảm CH 4. Mêtan
giảm bằng cách bổ sung axit phenolic là tương đối nhỏ (lên đến 6,3%) và ảnh
hưởng của axit phenolic trên giảm CH 4 phụ thuộc vào nguồn gốc và nồng độ áp
dụng. Thứ tự của phenol đơn giản để giảm CH 4 là axit caffeic > p - coumaric >
ferulic > cinnamic. Đối với các thức ăn chứa tanin, việc ức chế quá trình sinh
mêtan chủ yếu là do tannin cô đặc (CT: condensed tannins) (Martin và ctv, 2008).
Có hai cơ chế về hoạt động của tannin (Tavendale và ctv, 2005) tannin ảnh hưởng
trực tiếp đến hình thành mêtan và ảnh hưởng gián tiếp đến giảm tạo ra hydro do tỷ
lệ phân giải thức ăn ở dạ cỏ thấp hơn.
2.1.2. Tannin ảnh hưởng trên tiêu hóa In vitro
Trong báo cáo của Tan và ctv (2011) thí nghiệm với các mức độ khác nhau của
tannin cô đặc tinh khiết chiết xuất từ Leucaena leucocephala để đánh giá ảnh hưởng của
chúng trên sản sinh CH4, quá trình lên men dạ cỏ các thông số như pH, tiêu hóa vật chất
khô (VCK) và nồng độ axit béo dễ bay hơi (VFA ) cũng như trên các quần thể của vi
khuẩn sinh mêtan dạ cỏ và động vật nguyên sinh trong điều kiện In vitro. Nồng độ tannin
cô đặc là 0 (đối chứng), 10, 15, 20, 25 và 30 mg với 500 mg cỏ guinea khô (Panicum
maximum) với 40 ml dịch dạ cỏ được ủ trong 24 giờ bằng cách sử dụng một hệ thống ống
nghiệm sản xuất khí. Kết quả cho thấy tổng khí (ml/g VCK) giảm với tốc độ giảm (tuyến
tính P <0,01, bậc hai P <0,05) với mức tăng của tannin cô đặc. CH4 sản sinh (ml/g VCK)
giảm với mức độ tăng của tannin cô đặc.

Trong một nghiên cứu của Barman và Rai (2008), sử dụng hỗn hợp chứa các
mức tannin trong vỏ quả Accacia nilotica từ 0, 4, 6, 8, 10, 12% trong thí nghiệm In
vitro, kết quả cho thấy khả năng tiêu hóa vật chất khô giảm theo mức tăng của tannin
trong hỗn hợp (P<0,05). Không có sự khác biệt đáng kể về tiêu hóa vật chất khô và chất
hữu cơ (CHC) trong hỗn hợp chứa 6, 8 và 10% tannin, trong đó chỉ ra con dê có thể sử
dụng các chất dinh dưỡng từ khẩu phần có chứa tannin 6% cũng như từ 8 và 10%. Khả
năng tiêu hóa đạm thô trong ống nghiệm (IVCPD) giảm (P <0,05) với tăng nồng độ
tannin trong hỗn hợp, thể hiện ở Bảng 1.

3


Bảng 1. Tỉ lệ tiêu hóa In vitro của vật chất khô (IVDMD), chất hữu cơ (IVOMD)
và protein thô (IVCPD) của khẩu phần với các mức tannin khác nhau

Chỉ tiêu

0%
tannin

4%
tannin

6%
tannin

8%
tannin

10%
tannin

12%
tannin

IVDMD

67,04a

67,17a

61,15b

60,47b

61,04b

58,24c

IVOMD

66,76a

67,06a

59,63b

59,97b

60,33b

57,08c

IVCPD

84,93a

72,77b

70,05c

66,15d

63,19e

63,04ef

Thể tích khí sinh ra (ml)
Tổng số

87,50

84,83

85,33

88,33

85,67

81,50

0-24 h

55,17a

53,50a

49,67b

48,17b

43,67c

42,50

24-48 h

32,33e

31,33f

35,66d

40,16b

42,00a

39,00c

Nguồn Barman và Rai (2008)
Ghi chú: a,b... là các số cùng hàng mang chữ số phụ khác nhau thì sai số khác biệt có ý nghĩa thống kê ở
mức 5%

2.1.2.1. Tannin ảnh hưởng trên pH dạ cỏ
Trong dịch dạ cỏ của loài nhai lại pH thuộc loại trung tính, có giá trị từ 6 7. Các axít béo bay hơi tạo ra trong quá trình lên men được hòa tan bởi các muối
kiềm của nước bọt, dung dịch đệm bicarbonat và phosphat natri, kali có pH = 8,2.
Các axít còn được trung hòa bởi NH 3 tạo ra trong quá trình các vi sinh vật phân
giải chất protein. Mặt khác một phần các axít béo bay hơi tạo ra được hấp thu qua

màng nhầy của dạ cỏ, do đó hạn chế sự thay đổi độ pH trong dạ cỏ (Preston and
Leng, 1991). pH dạ cỏ được điều chỉnh liên tục bởi các quá trình lên men. Các
acid béo bay hơi tạo ra trong quá trình lên men được hòa tan bởi các muối kiềm
của nước bọt, dung dịch đệm bicacbonat và phosphate Na, K có pH > 8,2. Ngoài
ra, các acid béo còn được trung hòa bởi NH 3 tạo ra do quá trình các vi sinh vật
phân giải protein. Mặt khác, phần lớn các acid béo bay hơi tạo ra được hấp thu qua
màng nhầy của dạ cỏ do đó hạn chế sự thay đổi pH trong dạ cỏ. Khi pH dạ cỏ thấp
dẫn đến thay đổi số lượng vi khuẩn phân hủy cellulose, amylase và thường
protozoa cũng bị mất theo. Giá trị pH dạ cỏ còn phụ thuộc vào thời gian sau khi
ăn. Nước bọt có dung dịch đệm bicarbonate, pH = 8 chứa nồng độ ion Natri và
photphate cao. Nước bọt và sự di chuyển các ion bicarbonate qua biểu mô dạ cỏ
4


giúp cho sự ổn định độ pH. Dịch đệm dạ cỏ là môi trường thích hợp cho sự phát
triển của vi khuẩn, nấm và protozoa yếm khí và cho phép acid béo bay hơi tích tụ
trong dạ cỏ. Môi trường trung tính ở dạ cỏ luôn được duy trì do pH của dạ cỏ được
điều chỉnh liên tục bởi các quá trình trên; và việc hấp thụ acid béo bay hơi đã đảm
bảo cho quá trình lên men liên tục.
Chenost và Kayouli (1997) giải thích rằng độ pH trong dạ cỏ còn tác động
đến tương tác giữa vi khuẩn phân giải bột đường và vi khuẩn phân giải xơ. Trong
quá trình phân giải chất xơ của khẩu phần diễn ra trong dạ cỏ có hiệu quả cao nhất
khi pH dịch dạ cỏ >6,2, ngược lại quá trình phân giải tinh bột trong dạ cỏ đạt hiệu
quả cao nhất khi pH<6,0. Khi tỉ lệ thức ăn tinh quá cao trong khẩu phần sẽ làm
acid béo bay hơi sản sinh nhanh làm giảm pH dịch dạ cỏ và do đó ức chế hoạt
động của vi khuẩn phân giải xơ.
Khối lượng vi sinh vật trong dạ cỏ được duy trì ở mức ổn định bằng di
chuyển số lượng vi sinh vật xuống dạ dưới, chết và phân hủy các vi sinh vật ngay
trong dạ cỏ. Mêtan và carbonic (CO2) cũng là sản phẩm cuối cùng của quá trình
lên men. Khi độ pH dạ cỏ thấp, CO 2 tách khỏi dung dịch và tích tụ ở túi vùng lưng,

CO2 và CH4 được thải ra qua ợ hơi (Hugate và ctv, 1952). Khi độ pH dạ cỏ cao,
hầu hết CO2 sản sinh ra trong quá trình lên men hay từ nước bọt xuống được hấp
thu và thải ra qua phổi.
Trong một nghiên cứu với mức tannin 0; 5; 10; 15; 20 và 25% (tính trên
trạng thái khô cơ bản) từ quebracho trên khẩu phần cơ bản là cỏ khô, bắp và khô
dầu đậu nành (Bhatta và ctv, 2009) đã báo cáo rằng pH trong thí nghiệm In vitro
của các nghiệm thức không có sự khác biệt (P>0,05) với các giá trị 6,32; 6,32;
6,35; 6,37; 6;34 và 6,33 tương ứng với các mức bổ sung tannin. Tuy nhiên, trong
một thí nghiệm khác cũng với các mức bổ sung như trên nhưng nguồn tannin là từ
mimosa giá trị pH có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P=0,038) với các giá trị
6,28; 6,25; 6,32; 6,29; 6,31 và 6,33 tương ứng với các mức bổ sung tannin 0; 5;
10; 15; 20 và 25% (tính trên trạng thái khô cơ bản). Các giá trị này có khuynh
hướng tăng theo mức tăng của tannin. Kết quả trên có thể giải thích do kết quả các
axit béo bay hơi sản xuất có khuynh hướng giảm theo mức tăng của tannin bổ
sung trong khẩu phần.
Trong nghiên cứu ở dê được cung cấp một thức ăn thô mỗi ngày một lần
vào buổi sáng, Silanikove và ctv (1993) tìm thấy sau khi ăn có sự giảm giá trị pH
dịch dạ cỏ và sự gia tăng nồng độ của các axit béo dễ bay hơi. Mặt khác, không có
sự thay đổi ngày đêm ở pH hay nồng độ của các axit béo dễ bay hơi đã được ghi
5


nhận ở dê ăn một khẩu phần giàu tannin. Các giá trị pH và axit béo dễ bay hơi vẫn
ở ngưỡng sinh lý bình thường, các thông số này vẫn ở xa ngưỡng có thể gây tác
động tiêu cực trên các chỉ tiêu cận lâm sàng của dê thí nghiệm (Silanikove và ctv,
1996).
2.1.2.2. Tannin ảnh hưởng trên NH3
Các hợp chất chứa nitơ, bao gồm cả protein và phi protein, khi được ăn vào
dạ cỏ sẽ bị vi sinh vật dạ cỏ phân giải. Mức độ phân giải của chúng phụ thuộc
nhiều yếu tố, đặc biệt là độ hòa tan. Các nguồn nitơ phi protein trong thức ăn như

urea hòa tan hoàn toàn và nhanh chóng phân giải thành NH 3. Một phần nhiều hay
ít tùy thuộc vào bản chất thức ăn, protein khẩu phần cũng được vi sinh vật dạ cỏ
phân giải thành NH3. NH3 sinh ra trong dạ cỏ được vi sinh vật dạ cỏ tổng hợp nên
sinh khối protein của chúng (Nguyễn Xuân Trạch, 2003).
Sau khi ăn vào NPN nhanh chóng được phân giải thành NH 3 còn một phần
(nhiều hay ít tùy thuộc bản chất thức ăn và khẩu phần) protein có thể phân giải
được VSV thủy phân thành peptide và axít amin. Một số axít amin tiếp tục được
lên men sinh ra axít hữu cơ, NH 3 và khí CO2. Cả vi khuẩn, protozoa và nấm dạ cỏ
đều tham gia vào quá trình phân giải các hợp chất chứa nitơ. Tuy vậy, vi khuẩn là
thành phần quan trọng nhất trong quá trình này. Quá trình phân giải protein thô
trong dạ cỏ sinh ra một hỗn hợp gồm peptide, axít amin, NH 3 và các axít hữu cơ,
trong đó có cả một số axít mạch nhánh sinh ra từ sự lên men các axít mạch nhánh.
NH3 sinh ra cùng với các peptide mạch ngắn và axít amin tự do được vi sinh vật dạ
cỏ sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng (protozoa không sử dụng được
NH3). Một số protein VSV bị phân giải ngay trong dạ cỏ và nguồn nitơ của chúng
cũng được tái sử dụng bởi VSV dạ cỏ (Vũ Duy Giảng và ctv, 2008).
Theo Leng and Nolan (1984), các khẩu phần thức ăn khác nhau có ảnh
hưởng đến mức NH3 thích hợp và nồng độ NH3 cao nhất có thể đạt mức 150–200
mg/lít. Thiếu NH3 dẫn đến giảm hiệu quả hệ thống vi sinh vật dạ cỏ. Khi thay đổi
khẩu phần từ loại thức ăn tạo nồng độ NH3 cao thành loại thức ăn nồng độ NH3 thấp
đến mức tới hạn.
Trong một nghiên cứu với mức tannin 0; 5; 10; 15; 20 và 25% (tính trên
trạng thái khô cơ bản) từ quebracho trên khẩu phần cơ bản là cỏ khô, bắp và khô
dầu đậu nành (Bhatta và ctv, 2009) NH3 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
(P=0.001) với các giá trị giảm theo mức tăng của tannin trong khẩu phần (8,18;
6,63; 6,13; 5,49 và 5,53 mg/dL, tương ứng). Đây cũng là khuynh hướng của các

6

mức tannin trên với nguồn tannin từ mimosa với các giá trị NH 3 là 8,48; 7,96;
7,34; 6,62 và 6,36 mg/dL, tương ứng với các mức bổ sung tannin 0; 5; 10; 15; 20
và 25% (tính trên trạng thái khô cơ bản).
2.1.2.3. Tannin ảnh hưởng trên sự sinh khí mêtan
Vi khuẩn tạo mêtan ở dạ cỏ của loài động vật nhai lại gồm
Methanobacterium formicicum, Methanobacterium bryanti, Methanobrevibacter
ruminantium, Methanobrevibacter smithii, Methanomicrobium mobile,
Methanosarcina barkeri và Methanoculleus olentangyi. Methanogens có mặt trong
dạ cỏ với số lượng lớn khác nhau 107-109 tế bào / ml dung dịch dạ cỏ, phụ thuộc
vào loại chế độ ăn uống cho gia súc, đặc biệt là hàm lượng chất xơ trong khẩu
phần ăn (Kamra, 2005). Trong điều kiện yếm khí ở dạ cỏ phản ứng oxy hóa để lấy
năng lượng ở dạng ATP (Adenosine triphosphat) giải phóng ra hydro. Tích lũy ion
hydro trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật dạ cỏ chỉ có thể tránh đuợc bằng
quá trình sinh tổng hợp CH4 bởi những vi khuẩn sinh mêtan (O’Mara và ctv,
2008). Hydro tự do ức chế enzym khử hydro và ảnh hưởng đến quá trình lên men.
Sử dụng H2 và CO2 để tạo ra CH4 là một đặc tính đặc biệt của nhóm vi khuấn
sinh mêtan. Đây là quy trình bình thường trong quá trình lên men ở dạ cỏ. Lượng
H2 giải phóng phụ thuộc chủ yếu vào khẩu phần và loại hình vi sinh vật dạ cỏ vì
lên men vi sinh vật thức ăn tạo ra các sản phẩm cuối cùng khác nhau và không
tương đương với lượng H2 tạo ra (Martin và ctv, 2008).
Tannin cô đặc giảm sản xuất CH4 bởi động vật nhai lại cả trong ống
nghiệm (Huang và ctv, 2011) và In vivo (Animut và ctv, 2008; Kongvongxay và
ctv, 2011; Puchala và ctv, 2012). Cơ chế hoạt động của CT trên khí mêtan chưa
thống nhất. Có ý kiến cho rằng tùy thuộc vào loại và liều, CT trực tiếp có thể ức
chế sự phát triển của vi sinh vật trong dạ cỏ của methanogen (Patra và Saxena,
2010; Williams và ctv, 2011). Ức chế gián tiếp của metan có thể xảy ra bằng cách
giảm sự sẵn có của chất dinh dưỡng cho các vi sinh vật trong dạ cỏ (Harley và ctv,
2013)
Khi được bổ sung ở mức trung bình 30 mg / g chất khô, trọng lượng phân
tử Leucaena thấp hơn dẫn đến giảm cả nitơ (N) tiêu hóa và sản xuất khí metan

trong ống nghiệm. Kết quả này đồng ý với Tharayil và ctv (2011) và cho rằng các
yếu tố khác hơn trọng lượng phân tử có thể ảnh hưởng đến liên kết protein của CT
(Huang và ctv, 2010).

7


Ức chế khí mêtan, tannin cũng có thể kết quả giảm acetate dẫn đến tăng tỷ
lệ propionate, kết quả từ tăng hydro tạo propionate (Dschaak và ctv, 2011). Một
khả năng khác là tannin là chất nhận hydro và làm giảm lượng hydro có sẵn trong
dạ cỏ để tạo thành CH4 (Harley và ctv, 2013)
Kongvongxay ctv (2011) cho ăn Mimosa pigra, một thực vật có chứa nồng
độ khác nhau, CT 40-80 g / kg DM, dê ở mức 25, 50, và 75% trong khẩu phần.
Kết quả cho thấy giảm lượng khí CH4 ở tất cả các mức bổ sung mai dương và
mức giảm lớn nhất quan sát thấy ở 50% mai dương trong khẩu phần.
Tannin cô đặc từ các nguồn thực vật khác nhau có thể ảnh hưởng đến sản
xuất CH4 bằng nhiều cách khác nhau. Thay đổi nồng độ của CT cũng sẽ ảnh
hưởng đến lượng sản xuất CH4, nhưng nồng độ lớn nhất của CT sẽ không luôn
luôn dẫn đến việc giảm lớn nhất CH 4. Việc giảm sản xuất CH 4 quan sát thấy khi
thức ăn thô xanh cho ăn có chứa CT có thể xảy ra như yếu tố kháng dinh dưỡng
như giảm lượng VCK ăn vào, cũng như N và VCK tiêu hóa (Harley và ctv, 2013)
Trong nghiên cứu của Hassanat và Benchaar (2013) kiểm tra tác động của các
nguồn tannin và nồng độ ( 20, 50, 100, 150 và 200 g /kg vật chất khô) của tannin cô đặc
(cây acacia và quebracho) và tannin thủy phân (cây chestnut và valonea) khác nhau trên
sự lên men vi khuẩn trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy sản xuất khí tổng trong ống
nghiệm và tổng số axit béo bay hơi giảm với mức tăng của nồng độ tanin. Đối với cây
acacia, chestnut hoặc valonea tại mức tannin ≥ 50 g /kg vật chất khô hoặc tannin của
quebracho ở ≥ 100 g /kg vật chất khô dẫn đến giảm (lên đến 40%) khí mêtan sản xuất so
với nghiệm thức đối chứng. Nguồn tannin từ Valonea chỉ có giảm (11%) khí CH 4 sinh ra
ở mức 50 g /kg mà không ảnh hưởng nồng độ VFA. Kết luận của nghiên cứu là cung cấp

tannin từ cây acacia, chestnut hoặc valonea với mức 50 g /kg vật chất khô có khả năng
làm giảm sản xuất CH4 và sự phân hủy protein dạ cỏ với các hiệu ứng bất lợi tối thiểu
trên hiệu quả của quá trình lên men dạ cỏ.

2.1.2.4. Tannin ảnh hưởng trên số lượng Protozoa
Loại bỏ protozoa làm giảm nồng độ NH 3 trong dạ cỏ đến 50 mg / l
(Demeyer, 1982). Do đó cần phải cung cấp nitơ hòa tan hoặc nitơ phân giải vào
thức ăn động vật nhai lại loại bỏ protozoa. Isotrichidae và Ophryoscolecidae có
peptidase, khi được giải phóng có thể thủy phân tốt các peptid trong những hạt
thức ăn để tạo thành các amino axít tự do (Ueda và ctv, 1975). Jouany và ctv
(1981), cho thấy mêtan của gia súc loại bỏ protozoa thì thấp hơn từ 30-45%.
Trong thí nghiệm của Tan và ctv (2011) với các mức độ khác nhau của tannin cô đặc
tinh khiết chiết xuất từ Leucaena leucocephala để đánh giá ảnh hưởng của chúng trên
8


trên các quần thể động vật nguyên sinh trong điều kiện In vitro. Nồng độ tannin cô đặc là
0 (đối chứng), 10, 15, 20, 25 và 30 mg với 500 mg cỏ guinea khô (Panicum maximum)
với 40 ml dịch dạ cỏ được ủ trong 24 giờ bằng cách sử dụng một hệ thống ống nghiệm
sản xuất khí. Đối với phương pháp truyền thống là đếm cho kết quả khuynh hướng giảm
số lượng với mức tăng tannin trong khẩu phần với các biến động từ 1,37 đến 4,38 so với
đối chứng là 9,8 x 106 tế bào /ml dịch dạ cỏ. Trong báo cáo của Bhatta và ctv (2009) số

lượng protozoa giảm với mức tăng của tannin bổ sung trong khẩu phần với các
nguồn tannin khác nhau (P<0,05). Tuy nhiên, trong báo cáo của Bhatta và ctv
(2009) số lượng protozoa thấp hơn nhiều so với báo cáo của Tan và ctv (2011), với
các giá trị 9,28; 8,56; 7,38; 6,09; 6,21 và 6,17 x 10 4 tế bào /ml dịch dạ cỏ tương ứng với

mức tannin 0; 5; 10; 15; 20 và 25% (tính trên trạng thái khô cơ bản) từ quebracho.
Thêm vào đó, trong báo cáo của Bhatta và ctv (2009) số lượng protozoa trong thí

nghiệm In vitro với nguồn tannin từ mimosa thì không theo qui luật trên với các
giá trị 9,29; 10,0; 6,76; 11,7; 7,85 và 8,48 x 104 tế bào /ml dịch dạ cỏ tương ứng với
mức tannin 0; 5; 10; 15; 20 và 25% (tính trên trạng thái khô cơ bản).
2.1.3. Các phương pháp định lượng tannin
Theo Nguyễn Hoàng Tuấn (2012) có nhiều phương pháp định lượng tannin như:
2.1.3.1. Phương pháp bột da: nguyên tắc của phương pháp là chiết tannin trong
thực liệu bằng cách đun với nước cất nhiều lần cho đến khi âm tính với thuốc thử
sắt ba rồi chia nước chiết thành 2 mẫu. Một mẫu trích một thể tích chính xác đem
bốc hơi sấy khô và cân. Mẫu còn lại cho thêm bột da, quấy lọc, phần dịch lọc một
thể tích như trên đem bốc hơi rồi cân. Chênh lệch giữa 2 lần cho phép ta tính được
hàm lượng tannin.
2.1.3.2. Phương pháp oxy hóa: chiết tannin trong thực liệu bằng phương pháp như
trên, pha loãng rồi chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0,0N chỉ thị màu là dung dịch
Indigo carmin.
2.1.3.3. Phương pháp tạo tủa với đồng acetat: chiết tannin trong thực liệu bằng cồn
60o, thêm dung dịch đồng acetat 15%, lọc tủa, sấy và cân. Nung tủa sẽ thu được
đồng oxit. Lấy hiệu số giữa đồng tanat và đồng oxit rồi qui về phần trăm.
2.1.3.4. Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin: thuốc thử là dung dịch
phospowolframic (10g natri wolframat đun 3 giờ với 8ml H 3PO4 85% + 15ml
nước, gạn lấy dung dịch). Dịch chiết nước cho tác dụng với thuốc thử trên trong

9


môi trường kiềm natri carbonat. Sau đó xác định mật độ quang của dung dịch màu
xanh tạo thành sau 120 giây.
2.2. Các thực liệu trong thí nghiệm
2.2.1. Cây Mai dương
Cây Mai dương còn có các tên khác: Ngưu ma vương, Trinh nữ nhọn, Mắc cỡ
Mỹ, tên khoa học là Mimosa pigra L, thuộc họ Mimosaceae, có nguồn gốc từ

Trung Mỹ. Cây Mai dương hiện được xem là một trong những loài cỏ dại nguy
hiểm nhất đối với các vùng đất ngập nước nhiệt đới. Ở Vườn quốc gia Tràm Chim,
Mai dương hiện đang là mối đe dọa nghiêm trọng đến đời sống của nhiều loài thực
vật, động vật bản địa. Mức độ lây lan của chúng đang ở ngưỡng báo động , chiếm
hơn 1 phần bảy diện tích vườn quốc gia (Tran Triet và ctv, 2007).
Một thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức (tương
ứng với 4 thời điểm thu cắt 30; 45; 60 và 90 ngày) và 6 lần lập lại, để xác định
sinh khối của cây mai dương. Cây Mai dương trong điều kiện tự nhiên được cắt
bỏ, cách gốc 10 cm trước khi tiến hành thí nghiệm. Cây được theo dõi trong điều
kiện tự nhiên không có bổ sung nước tưới cũng như phân bón. Thí nghiệm được
tiến hành tại khu A4 vườn Quốc gia Tràm Chim, tỉnh Đồng Tháp.
Kết quả cho thấy lượng vật chất khô của lá và cọng thu được tăng dần, đạt cao
nhất ở thời điểm 60 ngày và sau đó bắt đầu xuống thấp ở thời điểm 90 ngày. Năng
suất protein thô của lá và cọng mai dương cũng theo khuynh hướng của vật chất
khô (Hình 1 và 2). Hàm lượng protein thô của lá cọng giảm dần trong khi hàm
lượng tannin trong lá có khuynh hướng tăng dần. Do đó thời điểm thu cắt phù hợp
để có năng suất và dinh dưỡng tốt nhất cho gia súc là từ 45 ngày với 14% protein
thô và 4% tannin (tính trên vật chất khô) (Nguyen Thi Thu Hong và ctv, 2008).
Kết quả cũng cho thấy mức tannin cao trong lá (5- 9% tính trên vật chất khô) sẽ
trở thành nguồn protein “bypass” đối với gia súc nhai lại. Kết quả phân tích hàm
lương protein thô lá chét của cây mai dương biến động từ 17,9% đến 21,21% tính
trên vật chất khô điều này cho thấy cây mai dương thực sự là nguồn cung cấp
protein cho gia súc nhai lại.

10


Hình 1: Hàm lượng Protein thô lá cọng Hình 2: Hàm lượng tannin lá mai dương tại
mai dương tại các thời điểm thu cắt, % trên các thời điểm thu cắt, % trên vật chất khô
vật chất khô

Nguồn: Nguyen Thi Thu Hong và ctv (2008)
Các nghiên cứu sử dụng phương pháp In vitro mới được tiến hành để xác định
ảnh hưởng của lá mai dương hoặc lá khoai mì là nguồn cung cấp đạm kết hợp với
calcium nitrat hoặc urea trên sự sản sinh khí của gia súc nhai lại. Tác giả kết luận
rằng sau 9 giờ lên men, lá mai dương kết hợp với nitrat và lá khoai mì kết hợp với
nitrat giảm sản xuất khí mêtan là 53% và 48%, so với urê, tương ứng (Inthapanya
và ctv, 2011). Cây mai dương cũng được nghiên cứu trong khẩu phần của dê thịt
với vai trò tác nhân ảnh hưởng đến sự sản sinh khí mêtan của gia súc nhai lại. Với
72% nitơ trong khẩu phần được cung cấp từ cây mai dương cho kết quả giảm 42%
CH4 so với khẩu phần đối chứng (Kongvongxay, 2011).
2.2.2. Rau muống (Ipomoea aquatica)
Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích mặt nước rộng lớn, những cây
hoang dại hoặc những cây trồng dưới nước có quanh năm, đặc biệt là rau muống
nước. Rau muống luôn có sẵn dưới nước hoặc những vùng đất thấp. Rau muống
sử dụng làm thức ăn cho heo và bò ở vùng Đông Nam Á. Rau muống có tên khoa
học là Ipomoea aquatica, là loại cây thân thảo sống nhiều năm, là loại cây thủy
sinh và sống nổi trên mặt nước, cũng có những giống rau muống có thể trồng ở
trên cạn được. Thân hình trụ rỗng ruột và được phân thành nhiều đốt, có rễ mọc ở
những đốt tiếp xúc với đất, lá màu lục hình tam giác thuôn dài hay lá nhọn như
mũi tên (Đặng Tuấn Hưng và ctv, 2004). Hoa màu trắng hoặc tím lợt hình phễu.
Quả nang tròn có đường kính từ 8 – 9 mm, chứa 4 hạt có lông màu hung bao phủ
(Võ Văn Chi, 2004). Năng suất xanh của rau muống trồng trong môi trường nước
11


đạt 12,4 tấn/ha với điều kiện cung cấp 84 kg N/ha và nguồn đạm được sử dụng để
cung cấp cho rau muống là urê (Ly Thi Luyen, 2003).
2.2.3. Cỏ lông para (Brachiaria mutica)
Là loài cỏ lâu năm, rễ nhiều. Thân dài 0,60-2,00m, phân nhánh, mềm, bò

trên mặt đấ, mọc rễ và đâm chồi ở các đốt, sau đó vươn thẳng lên cao có thể tới
2m, đốt có lông mềm trắng. Lá hình mũi mác dài, nhọn đầu, gần hình tim ở gốc,
dài 10-20cm, rộng 1-1.5cm, phẳng, có ít lông ở mặt dưới; mép lá sắc; bẹ lá dẹt,
khía rãnh, có lông trắng mềm; lưỡi bẹ ngắn, có nhiều lông. Cụm hoa hình chùy,
dài 8-20cm, thẳng đứng, gồm 8-20 bông đơn hay kép ở gốc, dài 5-10cm (Dương
Hữu Thời và Nguyễn Đăng Khôi, 1981).
Cỏ para là cây cỏ nửa nước, nửa cạn và có thể sống được cả ở những nơi
nước chảy (Nguyễn Thiện, 2002). Có thể sử dụng cỏ lông Para cho gia súc ăn dưới
dạng tươi, ủ xanh, hoặc phơi khô (Dương Hữu Thời và Nguyễn Đăng Khôi, 1981).

3. Phương tiện và phương pháp nghiên cứu
3.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm E103 thuộc Bộ môn Chăn nuôi,
Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian tiến hành thí nghiệm: từ tháng 09/2013 đến tháng 11/2013
3.2. Thể Thức thống kê
Chuyên đề gồm 2 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên
với 6 nghiệm thức và 4 lần lặp lại.
3.2.1.Thí nghiệm 1 với khẩu phần cơ bản là cỏ tự nhiên. Các nghiệm thức bao
gồm các mức bổ sung tannin của cây mai dương trong khẩu phần bao gồm 0; 10;
20; 30; 40 và 50 g/kg vật chất khô.
3.2.2. Thí nghiệm 2 với khẩu phần cơ bản là rau muống. Các nghiệm thức bao
gồm các mức bổ sung tannin của cây mai dương trong khẩu phần bao gồm 0; 10;
20; 30; 40 và 50 g/kg vật chất khô.

3.3. Các thực liệu và khẩu phần thí nghiệm
-

Thân và lá cây mai dương

-

Cỏ tự nhiên
12


-

Rau muống

-

Thức ăn hỗn hợp

Thức ăn hỗn hợp bao gồm cám mịn, bánh dầu đậu nành, premix và muối cân đối
với mức protein thô 18%.
Các khẩu phần thí nghiệm
- Thí nghiệm 1 với khẩu phần cơ bản là cỏ lông para
1. Khẩu phần CMD 00: đối chứng, không bổ sung mai dương
2. Khẩu phần CMD 10 bổ sung mai dương với mức tannin 10 g/kg VCK
3. Khẩu phần CMD 20 bổ sung mai dương với mức tannin 20 g/kg VCK
4. Khẩu phần CMD 30 bổ sung mai dương với mức tannin 30 g/kg VCK
5. Khẩu phần CMD 40 bổ sung mai dương với mức tannin 40 g/kg VCK
6. Khẩu phần CMD 50 bổ sung mai dương với mức tannin 50 g/kg VCK
- Thí nghiệm 2 với khẩu phần cơ bản là rau muống
1. Khẩu phần RMD 00: đối chứng, không bổ sung mai dương
2. Khẩu phần RMD 10 bổ sung mai dương với mức tannin 10 g/kg VCK
3. Khẩu phần RMD 20 bổ sung mai dương với mức tannin 20 g/kg VCK
4. Khẩu phần RMD 30 bổ sung mai dương với mức tannin 30 g/kg VCK
5. Khẩu phần RMD 40 bổ sung mai dương với mức tannin 40 g/kg VCK

6. Khẩu phần RMD 50 bổ sung mai dương với mức tannin 50 g/kg VCK

Bảng 2. Thành phần thực liệu của thí nghiệm 1 (Tỉ lệ % tính trên vật chất khô)
Thực liệu

Nghiệm thức
CMD
00

CMD
10

CMD
20

13

CMD
30

CMD
40

CMD
50


Mai dương

0

11,2

22,5

33,8

45,0

56,4

Cỏ

74,6

63,4

52,1

40,8

29,6

18,2

Thức ăn hỗn hợp

25,4

25,4

25,4

25,4

25,4

25,4

Ghi chú: CMD đối chứng; CMD 10 bổ sung mai dương với mức tannin 10 g/kg VCK; CMD 20 bổ sung
mai dương với mức tannin 20 g/kg VCK; CMD 30 bổ sung mai dương với mức tannin 30 g/kg VCK; CMD
40 bổ sung mai dương với mức tannin 40 g/kg VCK; CMD 50 bổ sung mai dương với mức tannin 50 g/kg
VCK;

Bảng 3. Thành phần thực liệu của thí nghiệm 2 (Tỉ lệ % tính trên vật chất khô)
Thực liệu

Nghiệm thức
RMD
00

RMD
10

RMD
20

RMD
30

RMD
40

RMD
50

Mai dương

0

11,2

22,5

33,8

45,0

56,4

Rau muống

74,6

63,4

52,1

40,8

29,6

18,2

Thức ăn hỗn hợp

25,4

25,4

25,4

25,4

25,4

25,4

Ghi chú: RMD đối chứng; RMD 10 bổ sung mai dương với mức tannin 10 g/kg VCK; RMD 20 bổ sung
mai dương với mức tannin 20 g/kg VCK; RMD 30 bổ sung mai dương với mức tannin 30 g/kg VCK; RMD
40 bổ sung mai dương với mức tannin 40 g/kg VCK; RMD 50 bổ sung mai dương với mức tannin 50 g/kg
VCK;

3.4. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
- Bình cách nhiệt dùng để giữ ấm dịch dạ cỏ của bò khi lấy sẽ được trữ trong keo
nhựa, keo nhựa được đựng trong bình cách nhiệt đảm bảo nhiệt độ của dịch dạ cỏ
không bị thay đổi đáng kể khi di chuyển về phòng thí nghiệm.
Bộ thiết bị water-bath và máy khuấy nước
- Chai thủy tinh dùng để ủ thực liệu khảo sát trong 48 giờ.

14


Hình 3. Chai thủy tinh đựng mẫu ủ
3.5. Tiến hành thí nghiệm
Bước 1: Cân 0,5g vật chất khô mẫu thức ăn đã có công thức khẩu phần theo từng
nghiệm thức, mẫu thức ăn cần 40ml dung dịch đệm và 10ml dịch dạ cỏ, cho mẫu
thức ăn, dung dịch đệm, dịch dạ cỏ vào keo ủ tối màu 100ml. Các chai thủy tinh
sau khi cho hoàn tất mẫu, dung dịch dạ cỏ và dung dịch đệm được đóng nút chai
bằng dụng cụ bấm nút.
Các chai mẫu được đặt vào water-bath có dụng cụ khuấy nước mục đích là tạo
những rung động đến các chai giống như sự co bóp của dạ cỏ và tạo nhiệt độ đồng
đều cho tất cả các vị trí trong water-bath. .
Ủ mẫu trong water-bath ủ với nhiệt độ 38 0C ủ yếm khí sau đó thu thập mẫu và
phân tích.

15


Hình 4. Các chai đựng ủ đặt trong water-bath được kiểm soát nhiệt độ 38 oC
Bước 2: Pha dung dịch đệm.
Dung dịch đệm được sử dụng trong thí nghiệm là theo mô tả của Tilley và Terry
(1963).
Bảng 4. Lượng cân các hóa chất có trong 1 lít dung dịch đệm
STT

Hóa chất

Lượng cân (g/lít)

1

NaHCO3

9,80

2

KCl

0,57

3

CaCl2

0,04

4

Na2HPO4.12H2O

9,30

5

NaCl

0,47

6

MgSO4.7H2O

0,12

7

Cystein

0,25

Dung dịch sau khi pha xong được sục khí CO 2 cho đến khi chuyển từ đục sang
trong suốt. Chúng ta có thể làm ấm dung dịch đệm bằng cách cho thùng chứa dung
dịch vào bồn ủ khoảng 15 phút, nhiệt độ nước trong bồn ủ được kiểm soát ở 38ºC

16


trước khi sử dụng để tạo điều kiện nhiệt độ tốt, tránh sốc nhiệt cho vi sinh vật dạ
cỏ.
Bước 3: Thu thập dịch dạ cỏ: dịch dạ cỏ được thu thập và được giữ ấm trong
bình cách nhiệt sau đó nhanh chóng chuyển lên phòng thí nghiệm. Tại đây dịch dạ
cỏ được lọc qua vải muslin vào lọ, bơm khí CO 2 rồi đậy kín tạo yếm khí và ủ ấm ở
nhiệt độ 38ºC trước khi dùng để thực hiện thí nghiệm. Dựa vào số lượng đơn vị thí
nghiệm và lượng thực liệu khi đem ủ là bao nhiêu từ đó ta cũng tính được lượng
dung dịch dạ cỏ cần thí nghiệm là bao nhiêu.
Bước 4: Trộn dịch dạ cỏ đã lấy vào dung dịch đệm tạo hỗn hợp dung dịch đệm và
dịch dạ cỏ, khuấy đều cho lượng vi sinh vật trong dịch dạ cỏ phân bố đều trước khi
chia ra từng chai ủ. Dùng ống đong, đong 50 ml hỗn hợp dịch dạ cỏ và dung dịch

đệm cho vào chai thủy tinh ủ đã có sẵn 0,5 g vật chất khô thực liệu, dùng đũa thủy
tinh khuấy đều cho thực liệu thấm ướt hoàn toàn, bơm khí CO 2 vào để đuổi khí
oxy trước đóng nắp chai ủ nhằm ngăn không cho không khí đi vào.
Sắp xếp tất cả các chai ủ thực liệu vào khung inox cho vào bồn ủ, nhiệt độ ủ ở
38ºC, tiến hành ủ và theo dõi lượng khí sinh ra.
3.6. Các chỉ tiêu theo dõi
- Thành phần hóa học của thức ăn: vật chất khô (VCK), khoáng tổng số theo
(AOAC, 1990) và xơ trung tính (NDF) theo phương pháp của Goering và Van
Soest (1970).
- Hàm lượng tannin trong cây Mai dương
- Tổng lượng khí sinh ra ở thời điểm 24 giờ (Gas volume)
- Nồng độ khí (% CH4, %CO2) Hệ thống sắc ký khí (GC – Gas Chromatography),
ở thời điểm 24 giờ
- Gía trị pH ở thời điểm 48 giờ
- Hàm lượng Amoniac (NH3_ mg/l) ở thời điểm 48 giờ
- Tỷ lệ tiêu hóa vật chất khô ở thời điểm 48 giờ
- Số lượng Protozoa sau 48 giờ ủ
3.7. Cách thu thập số liệu
- Thành phần hóa học của thức ăn: Xác định vật chất khô và đạm thô bằng phương
pháp phân tích phỏng định của Weende, protein thô được xác định bằng phương

17


pháp Kjeldahl (N*6,25) và hàm lượng tro được xác định bằng cách đốt mẫu ở
600oC theo AOAC (1990)
- Xác định hàm lượng amoniac (NH3) bằng phương pháp Kjeldalh.
- Đo lượng khí sinh ra trong các chai ủ bằng kim tiêm nhựa với dung tích 20 ml và
50 ml.
Lượng khí mêtan (CH4) sinh ra được tính bằng cách:

CH4 (ml) = Nồng độ khí mêtan (%) x lượng khí tổng số sinh ra

- Tỷ lệ tiêu hóa vật chất khô

vật chất khô trước khi ủ - vật chất khô sau khi ủ
Tỷ lệ tiêu hóa vật chất khô (%) =

x 100
vật chất khô trước khi ủ

- Định lượng tannin thu được trong dịch chiết bằng phương pháp Lowenthal:
oxi hoá khử bằng chất oxi hoá là KMnO4 với chất chỉ thị inđigocarmin theo mô tả
của Vũ Thy Thư và ctv (2001)
Tannin là hợp chất khử khi bị oxy hóa bởi KMnO 4 trong môi trường acid với chất
chỉ thị indigocarmin sẽ tạo thành khí carbonic và nước đồng thời làm mất màu
xanh của indigocarmin theo phản ứng
Tannin + KMnO4 => H2O + CO2
Hóa chất
Indigocarmin 1%: Cân chính xác 1 g Indigocarmin cho vào cốc nhỏ, rót thêm
25ml axit H2SO4 đậm đặc để vào chỗ tối sau 1 đêm để hòa tan hết indigocarmin,
sau đó cho vào bình định mức 1000 ml đã có sẵn một ít nước cất. Dùng nước cất
tráng rửa cốc nhiều lần và thêm nước cất đến vạch. Bảo quản lọ màu nâu và nơi
mát. Dung dịch chuẩn: dùng ống chuẩn KMnO4 0,1N
Phương pháp tiến hành
Cân chính xác 2 g mẫu khô đã nghiền nhỏ, cho vào bình cầu cao đáy bằng hoặc
bình tam giác chịu nhiệt thể tích 250 ml. Thêm vào 100ml nước cất đun sôi đặt
18


vào trong nồi cách thủy, chiết suất trong thời gian 45 phút, để yên vài phút rồi lọc

qua vải lọc. Tiếp tục chiết như trên nhiều lần cho đến khi dung dịch chiết không
còn phản ứng của tannin (thứ với FeCl3 hoặc phèn sắt ammonium)
Làm nguội dung dịch chiết và thêm nước cất đến vạch 250. Thí nghiệm được tiến
hành song song ở 2 bình, bình thí nghiệm và đối chứng.
Bình thí nghiệm: dùng pipet lấy 10ml dung dịch chiết cho vào bình tam giác 250
ml đã có sẵn 75ml nước cất và 25ml dung dịch indigocarmin 0,1% trong môi
trường acid. Sau đó chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N, nhỏ từng giọt một đều đặn, dùng
đũa thủy tinh khuấy đều hoặc lắc đều cho đến khi mất màu xanh và xuất hiện màu
vàng rơm là được.
Ở bình đối chứng, cho 10ml dung dịch chiết vào bình tam giác 250 ml, thêm 1
muỗng nhỏ than hoạt tính, lắc đều đun trên bếp cách thủy khoảng 15 phút. Sau đó
lọc qua giấy lọc. dung 75 ml nước cất nóng chia làm 3 lần để tráng bình và giấy
lọc. Nếu thấy giấy lọc trong và không có màu vàng là được. Sau đó chuẩn độ bằng
KMnO4 0,1N, nhỏ từng giọt một đều đặn, dùng đũa thủy tinh khuấy đều hoặc lắc
đều cho đến khi mất màu xanh và xuất hiện màu vàng rơm là được.
Tính kết quả
(a-b).V.k.100
X=
v.m
Với
X: hàm lượng tannin tính theo vật chất khô
a. số ml KMnO4 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm
b. số ml KMnO4 0,1N chuẩn độ mẫu đối chứng
v: thể tích dung dịch lấy ra để phân tích (10ml)
V thể tích dung dịch chiết từ 2 g mẫu nghiên cứu
m số g mẫu khô nghiên cứu (2g)
k: hệ số tannin 0,00582
Vậy cứ 1 ml KMnO4 0,1N oxy hóa 0,00582 g hợp chất tannin

19

- Phương pháp xác định số lượng protozoa: Lắc đều dịch dạ cỏ trong chai, hút
1ml dịch dạ cỏ cho vào cốc 50ml. Sau đó dùng 1ml dịch dạ cỏ pha với 4ml dung
dịch xanh methylen và dùng buồng đếm Malasser để đếm. Protozoa được đếm với
kính hiển vi có vật kính x10 (Dehority, 1984). Số lượng protozoa được tính theo
công thức:
Số protozoa đếm được * độ pha loãng*1.000
Số protozoa/ml =
Độ dày buồng đếm* số ô đếm

3.8 Xử lý thống kê
Số liệu thô được tính sơ bộ bằng bảng tính Microsoft Excel 2003. Sau đó được xử
lý thống kê bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) theo mô hình
tuyến tính tổng quát (General Linear Model) trên phần mềm Minitab 16. Khi có sự
khác biệt giữa các nghiệm thức sẽ dùng phép thử Tukey để tìm sự khác biệt từng
cặp nghiệm thức.

4. Kết quả và thảo luận
4.1. Thành phần hóa học của các thực liệu thí nghiệm
Các thực liệu thí nghiệm được phân tích thành phần hóa học và kết quả
được thể hiện ở bảng 5.
Trong báo cáo của Nguyễn Thị Thu Hồng và Võ Ái Quấc (2011) khi sử
dụng cây Mai dương trong thí nghiệm trên đối tượng là dê thịt, mai dương được sử
dụng nguyên và treo cho dê ăn. Kết quả cho thấy phần dê ăn là những lá chét, hoa,
thân non và một ít trái non nằm ở phần thân non. Phần dê không ăn là sóng lá chét,
trái già và cành già. Thành phần của Mai Dương được phân tích hoá học là những
thành phần dê ăn được của cây.
Cây Mai dương sử dụng trong thí nghiệm đang trong giai đoạn ra hoa và
thành phân đem phân tích là các lá chét và thân non. Hàm lượng vật chất khô

34,8% tương đương với các báo cáo 36,0% của Nguyễn Thị Thu Hồng và Võ Ái
Quấc (2011) và giá trị 36,2% báo cáo của Nguyen Thi Thu Hong và Preston
(2013).
Mimosa pigra thuộc bộ đậu (Leguminosae) (IUCN, 2003) nên hàm lượng
protein thô tương đối cao chiếm 19,8% tính trên VCK. Hàm lượng protein thô của
20