Bước đầu nghiên cứu thủy phân rong lục (ulva lactuca) tại vịnh nha trang bằng bacillus subtilis và aspergillus oryzae bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

.

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

.

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN RONG LỤC
(ULVA LACTUCA) TẠI VỊNH NHA TRANG BẰNG
BACILLUS SUBTILIS VÀ ASPERGILLUS ORYZAE BỔ
SUNG VÀO THỨC ĂN CHĂN NUÔI

GVHD: TS. Thái Văn Đức
SVTH: Trương Văn Đông
MSSV: 56130833

Khánh Hòa, tháng 7/2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Khoa/viện: Công nghệ thực phẩm

PHIẾU THEO DÕI TIẾN ĐỘ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỀ TÀI / KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
(Dùng cho CBHD và nộp cùng báo cáo ĐA/KLTN của sinh viên)
Tên đề tài: Bước đầu nghiên cứu thủy phân rong lục (ulva lactuca) tại vịnh nha trang
bằng Bacillus subtilis và Aspergillus oryzae bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

Giảng viên hướng dẫn:TS Thái Văn Đức
Sinh viên được hướng dẫn: Trương Văn Đông

MSSV: 56130833
Ngành: .Công nghệ thực phẩm

Khóa:2014-2018
Lần KT
1
2
3
4

Ngày

Ngày kiềm tra:
……………...………
8
9
10
11
12

Nội dung

Nhận xét của GVHD

Kiểm tra giữa tiến độ của Trưởng BM
Đánh giá công việc hoàn thành:……%:
Được tiếp tục:Không tiếp tục:

Ký tên
………………………….

Nhận xét chung (sau khi sinh viên hoàn thành ĐA/KL):
…………………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………….………
…………………………………………………………………………………………….…
Điểm hình thức:……/10
Điểm nội dung:......./10
Điểm tổng kết:………/10
Đồng ý cho sinh viên:

Được bảo vệ:

Không được bảo vệ:

Khánh Hòa, ngày…….tháng…….năm………
Cán bộ hướng dẫn
(Ký và ghi rõ họ tên)

TS: THÁI VĂN ĐỨC


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả
nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong các công trình khác.

Sinh viên

Trương Văn Đông


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này, trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu và Ban Chủ nhiệm
Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại
Trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin được dành cho thầy Thái Văn Đức và cô Nguyễn Thị
Thanh Hải đã tận tình hướng dẫn và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đồ án.
Xin cám ơn và các cán bộ Phòng Nghiên cứu Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm
- Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời
gian thực hiện đồ án vừa qua. Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ, động viên
của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng em trong quá trình nghiên cứu.
Trong quá trình làm đề tài, mặc dù em đã cố gắng hết sức nhưng hạn chế về kiến thức
bản thân cũng như về thời gian nên không tránh khỏi có những sai sót.
Về phần mình, em xin hứa sẽ hết sức cố gắng mang những kiến thức đã được học để
vận dụng vào thực tế góp phần công sức nhỏ bé của mình vào công cuộc xây dựng và đổi
mới của ngành công nghệ thực phẩm nước nhà.
Em xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 05 tháng 7 năm 2018
Tác giả đồ án


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... iii
DẠNH MỤC SƠ ĐỒ ......................................................................................................... ix
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1

1. Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1
2. Ý nghĩa thực tiễn, mục đích và phạm vi ứng dụng .................................................. 2
2.1. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................... 2
2.2 Mục đích của đề tài ................................................................................................... 2
2.3 Phạm vi ứng dụng .................................................................................................. 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 4
1.1. Giới thiệu chung về rong lục ................................................................................... 4
1.2. Chủng Bacillus subtilis và Aspergillus oryzae ........................................................ 6
1.2.1. Bacillus subtilis ................................................................................................... 6
1.2.2. Aspergillus oryzae .............................................................................................. 8
1.3. Tổng quan về Cellulose ............................................................................................ 9
1.4. Enzym Cellulase ..................................................................................................... 11
1.4.1. Định nghĩa và phân loại .................................................................................. 11
1.4.2. Tính chất ........................................................................................................... 13
1.4.3. Cơ chế thủy phân cellulose.............................................................................. 13
1.4.4. Cơ chế tác dụng của cellulase ........................................................................ 14
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 16
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................. 16
2.1.1. Rong lục (Ulva lactuca ) ................................................................................... 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 17
2.3. Bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................................................... 20
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................... 34
Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................... 35
3.1. Kiểm tra khả năng sinh và hoạt tính cenlulase ................................................... 35
3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả năng thủy phân .............. 36


3.3. Khảo sát thành phần dinh dưỡng cơ bản của rong lục nguyên liệu.................. 37
3.4 Xác định khả năng thủy phân của vsv trên rong lục ........................................... 38
3.5. Kết quả thăm dò vùng ảnh hưởng các yếu tố chính ảnh hưởng quá trình thủy

phân ................................................................................................................................ 39
3.5.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ..................................................... 39
3.5.2. Kết quá thí nghiệm khảo sát thời gian thủy phân ........................................ 41
3.4. Tối ưu hóa quá trình thủy phân ........................................................................... 42
Model Terms ................................................................................................................ 44
ANOVA for Quadratic model ..................................................................................... 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 54
DANH MỤC PHỤ LỤC ..................................................................................................... 1


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC
CMC
DNS
K-Na
TCVN
TCN
Nxb
STT
VSV

Association of Official Analytical Chemists
Carbonyl-methyl cellulose
Dinitrosalicylic axit
Potassium sodium tartrate tetrahydrate
Tiêu chuẩn Việt Nam
Tiêu chuẩn ngành
Nhà xuất bản

Số thứ tự
Vi sinh vật


DANH MỤC BẢNG

BẢNG 3. 1. KẾT QUẢ ĐO VÒNG PHÂN GIẢI CELLULOSE ...................................... 36
BẢNG 3. 2. THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG CƠ BẢN CỦA RONG LỤC ULVA
LACTUCA .................................................................................................................... 37
BẢNG 3.3. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM CỦA MÔ HÌNH BOX-BEHNKEN ..................... 43
BẢNG 3.4. CÁC ĐIỂM TIÊN ĐOÁN DO PHẦN MỀM DX6......................................... 51
BẢNG 3.5. KẾT QUẢ KIỂM TRA THỰC NGHIỆM ĐIỂM TIÊN ĐOÁN .................... 51


DANH MỤC HÌNH

HÌNH 1. 1. VI KHUẨN B.SUBTILIS DƯỚI KÍNH HIỂN VI .......................................... 7
HÌNH 1. 2. HÌNH VẼ SỢI NẤM A.ORYZAE .................................................................... 8
HÌNH 1. 3. CẤU TRÚC CELLULOSE VÀ MẠNG LƯỚI LIÊN KẾT HYDROGEN ...... 9
HÌNH 1. 4. SỰ SẮP XẾP CÁC CHUỖI CELLULOSE TRONG THÀNH TẾ BÀO
THỰC VẬT ................................................................................................................. 10
HÌNH 1. 5. CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA ENZYM CELLULASE .................................... 14
HÌNH 1. 6. CƠ CHẾ THỦY PHÂN CELLULOSE........................................................... 15

HÌNH 2. 1. RONG LỤC ULVA LACTUC........................................................................ 16
HÌNH 2. 2. KHUẨN LẠC B.SUBTILIS ........................................................................... 16
HÌNH 2. 3. KHUẨN LẠC CỦA A.ORYZAE ................................................................... 17
HÌNH 2. 4. SỰ TẠO PHỨC MÀU CỦA THUỐC THỬ................................................... 23
HÌNH 2. 5. TỐI ƯU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN ............................................................ 29

HÌNH 3. 1 KHUẨN LẠC VÀ VÒNG PHÂN GIẢI CELLULOSE CỦA B.SUBTILIS.... 35
HÌNH 3. 2 KHUẨN LẠC VÀ VÒNG PHÂN GIẢI CELLULOSE CỦA A.ORYASE...... 35


DẠNH MỤC SƠ ĐỒ

SƠ ĐỒ 2. 1 SƠ ĐỒ TỔNG QUAN THỦY PHÂN RONG LỤC ...................................... 20
SƠ ĐỒ 2. 2. ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSE ...................................................................... 24
SƠ ĐỒ 2. 3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ
NACL ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA VSV ................................................ 27
SƠ ĐỒ 2. 4 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA VSV TRÊN RONG LỤC ... 29
SƠ ĐỒ 2. 5. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY
PHÂN RONG LỤC ..................................................................................................... 30
SƠ ĐỒ 2. 6. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TỚI QUÁ TRÌNH THỦY
PHÂN RONG LỤC ..................................................................................................... 31


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

BIỂU ĐỒ 3. 1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG MẬT ĐỘ NACL ĐẾN KHẢ
NĂNG THỦY PHÂN .................................................................................................. 36
BIỂU ĐỒ 3. 2. KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA VSV TRÊN RONG LỤC .................. 38
BIỂU ĐỒ 3. 3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN KHẢ
NĂNG THỦY PHÂN RONG LỤC ............................................................................ 39
BIỂU ĐỒ 3. 4. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN THỦY PHÂN ĐẾN HÀM LƯỢNG
ĐƯỜNG KHỬ . ........................................................................................................... 41
BIỂU ĐỒ 3. 5. KHẢO SÁT MẬT ĐỘ VSV DÙNG ĐỂ THỦY PHÂN RONG LỤC ..... 42
BIỂU ĐỒ 3. 6. BIỂU DIỄN ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN THỦY PHÂN ĐẾN
HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ ................................................................................... 45
BIỂU ĐỒ 3. 7. BIỂU ĐỒ ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ THỦY PHÂN ĐẾN HÀM

LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ.............................................................................................. 46
BIỂU ĐỒ 3. 8. ẢNH HƯỞNG CỦA MẬT ĐỘ VSV ĐẾN HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG
KHỬ............................................................................................................................. 47
BIỂU ĐỒ 3. 9 ĐƯỜNG ĐỒNG MỨC HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ ........................... 49
BIỂU ĐỒ 3. 10 BỀ MẶT ĐÁP ỨNG CỦA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN........................ 50


MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Từ lâu con người đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho nhiều ngành công
nghiệp như dệt may, mỹ phẩm, dược phẩm và thực phẩm. Hàng năm, theo ước tính sản
lượng rong biển của thế giới đạt 15 triệu tấn và dự tính khoảng 22 triệu tấn vào năm 2020.
Polysaccharide là các polymer sinh học được tìm thấy trong tự nhiên trên cả thực vật và
động vật, cả trên cạn và dưới nước, trong đó rong biển được xem là một nguồn cung cấp
polysaccharide rất phong phú và đa dạng. Trên thế giới, các nhà khoa học đã xác định được
khoảng 10.000 loài rong biển, chia làm 03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là
rong lục (Chlorophyte), rong nâu (Pheophyte) và rong đỏ (Rhodophyte).
Rong lục được biết đến như là nguồn nguyên liệu để tách chiết các chất có hoạt tinh
sinh học như lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, hợp chất phenolic,
alkaloid… trong đó polysaccharide được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất do khả năng ứng
dụng đa dạng của nó. Việt Nam là đất nước có một vùng biển nhiệt đới rộng với bờ biển
dài hơn 3000 km, là nguồn cung cấp các loài rong biển phong phú và đa dạng, rong lục với
trữ lượng rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về các chi Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha,
Enteromorpha, trong đó chi Ulva gồm 69 loài với hai loài phổ biến nhất là Ulva reticulata
và Ulva lactuca.[38]
Với số lượng phong phú và nguồn nguyên liệu dồi dào nhưng việc khai thác và sử
dụng còn quá thô sơ chỉ dừng lại ở việc thu lượm của các ngư dân ven biển, phơi khô bán
cho thương lái, hoặc làm thức ăn cho gia súc. Với giá thành của thức ăn chăn nuôi hiện nay
là khá cao, thì việc sử dụng rong lục bổ sung vào thành phần thức ăn vật nuôi là một phương

án nên quan tâm. Vì giá thành rẻ và nhiều dưỡng chất của rong lục. Tuy nhiên với thành tế
bào là celulose việc hấp dưỡng chất từ rong đối với gia súc với còn gặp khá nhiều khó khăn.
Bên cạnh đó, ở các thời điểm trong năm rong lục phát triển mạnh nhất, việc rong lục trôi
dạt trên bãi biển là ô nhiễm môi trường.

1


Xuất phát từ các vấn đề thực tế trên, tiến hành nghiên cứu đồ án : “Bước đầu thủy
phân rong lục (ulva lactuca) tại vịnh nha trang bằng Bacillus subtilis và Aspergillus
oryzae bổ sung vào thức ăn chăn nuôi” có ý nghĩa thực tiễn trong việc nâng cao giá trị
kinh tế, đa dạng hóa mặt hàng bổ sung cho thức ăn chăn nuôi, tạo thêm công ăn việc làm
cho người lao động, hạn chế ô nhiễm môi trường biển.
2. Ý nghĩa thực tiễn, mục đích và phạm vi ứng dụng
2.1. Ý nghĩa thực tiễn
- Đa dạng hóa mục đích sử dụng của rong lục.
- Giảm gía thành và tăng chất lượng của thức ăn vật nuôi.
- Giúp hạn chế quá trình rong trôi dạt trên bãi biển.
- Phân hủy làm ô nhiễm môi trường.
- Tăng giá trị kinh tế của rong lục (Ulva lactuca).
2.2 Mục đích của đề tài
Bước đầu khảo sát khả năng thủy phân vách celulose bằng hai chủng vsv là A.ozyae
và B.subtilis và tối ưu hóa quá trình này trên cơ chất rong lục (Ulva Lactuca) qua một số
yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình thủy phân. Bên cạnh đó, đề tài sử dụng vsv thủy phân
trực tiếp trên cơ chất rong lục thay cho enzyme thông thường, sản phẩm thủy phân không
được xử lý để loại bỏ các vsv. Vậy nên đề tài sử dụng hai chủng B.subtilis và A.oryzae được
cho rằng có khả năng phân giải cellulose, nhưng không gây hại cho động vật nuôi mà còn
có lợi cho hệ tiêu hóa động vật nuôi.
2.3 Phạm vi ứng dụng
Quy mô phòng thí nghiệm và trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Việc sử dụng nguồn

nguyên liệu rong lục trong tự nhiên, giải quyết được vấn đề nguồn nguyên liệu dồi dào nếu
không xử lý sẽ gây ô nhiễm môi trường. Rong lục đưa vào làm thức ăn chăn nuôi còn giải
quyết vấn đề giá thành nguyên liệu thức ăn chăn nuôi còn khá cao, trong khi rong lục có
giá thành rẻ. Việc đa dạng hóa mục đích sử dụng và mở rộng phạm vi ứng dụng sẽ tạo công
ăn việc làm thêm cho các ngư dân vùng biển: đó là thu hoạch rong, công việc ổn định hơn,
có thêm thu nhập. Bên cạnh thu hoạch rong tự nhiên, việc ứng dụng rong lục vào thức ăn
2


chăn nuôi còn có thể mở ra một hướng mới cho ngành rong đó là nuôi trồng rong quy mô
lớn hoặc nuôi trồng cùng với một số loại thủy sản khác, tận dụng tối đa diện tích nuôi trồng,
tăng tối đa nguồn lợi kinh tế trên một đơn vị diện tích nuôi trồng.
Bên cạnh đó, việc sử dụng hai chủng vsv A.ozyae và B.subtilis là hai probiotic[31]
giúp vật nuôi tiêu hóa thức ăn tốt hơn; vừa phân giải cellulose thành đường khử, giải phóng
các dưỡng chất được bao bọc bởi thành cellulose của tế bào rong: protein, acid amin,
vitamin, khoáng chất… tạo điều kiện cho gia súc hấp thụ dưỡng chất. Vật nuôi ăn tốt, phát
triển tốt, ít bệnh, giảm chi phí điều trị bệnh cho vật nuôi hơn. Chi phí cho vật nuôi bỏ ra ít
hơn mà thu lại kinh tế nhiều hơn. Cải thiện thành tích chăn nuôi.

3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung về rong lục
Rong lục được hình thành từ các nhánh trong, chúng có hình dáng giống lá rau diếp.
Là loại cây nhất niên, có vòng đời chỉ 1 năm, loại rong lục này dùng tản hình đĩa để gắn
thân mình lên đá, lên các động vật có vỏ và cả trên các loại tảo khác. Trong thời gian gần
đây, trên thế giới, rong lục là nguồn tài nguyên tự nhiên ngày càng được quan tâm sử dụng
trong cuộc sống nhiều hơn phục vụ đời sống con người như làm thực phẩm, mỹ phẩm và

dược phẩm đặc biệt là trong lĩnh vực y học.
Rong lục là một trong ba ngành rong chính đã biết hiện nay, chúng tồn tại trong tự
nhiên với số lượng lớn và rất đa dạng về thành phần loài, bao gồm những chi chủ yếu sau:
Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Cladophora, Valonia, Boergessenia, Caulerpa, Bryopsis,
Codium... Trong đó có nhiều loài thuộc các chi rong lục là Ulva, Enteromorpha, Caulerpa,
Codium được sử dụng như là nguồn thức ăn phổ biến cho người và động vật.[26]
Ở nước ta, rong lục là ngành có trữ lượng rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về
các chi rong Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, trong đó chi Ulva gồm 69 loài
trong tổng số 100 loài đã được định danh trên thế giới.
Đặc điểm tế bào rong Lục [9]:
Tế bào tảo lục có chứa một nhân hay nhiều nhân. Đa số các trường hợp tế bào có
vách cấu tạo bằng cellulose, và pectin. Thể sắc tố của rong Lục có hình dạng rất khác biệt
thường có hình cái chuông. Thể màu của tảo Lục có cơ cấu gần giống thực vật bậc cao,
phía ngoài là một màng đôi, bên trong có một chất đệm (stroma) bằng protein không màu.
Trong chất đệm có những phiến (lamelle). Chất màu gồm chlorophyll a,b, caroten và rất
nhiều xanhthophin khác nhau. Chất dự trữ tế bào thường là tinh bột, rất ít khi là dầu. Rong
Lục được phân biệt với các ngành rong khác ở đặc điểm màu lục, màu của thực vật bậc cao.
Do trong cấu tạo tế bào của rong, sắc tố chlorophyll a,b lấn áp các sắc tố màu khác.
Chlorophyll là sắc tố quang hợp sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời thực hiện quá trình
trao đổi chất. Sản phẩm của quá trình quang hợp là tinh bột đây là nguồn carbohydrate cung
4


cấp cho hoạt động sống của tế bào rong Lục. Thành và vách tế bào rong Lục đa phần được
cấu tạo bằng cellulose. Hàm lượng cellulose chiếm tỷ trọng lớn trong tế bào rong. Do vậy
nguồn cellulose thu nhận từ rong Lục là vô cùng lớn. Rong lục là ngành lớn nhất trong các
ngành rong, hình dạng của chúng vô cùng phức tạp, có thể là đơn bào, tập đoàn hoặc đa
bào. Chúng có thể dạng monat, dạng hạt, palmella, dạng sợi dạng phiến,… khích thước
biến thiên từ vài micro đến vài ba chục cm hay phiến to cả mét. Hình dạng đa dạng để thích
nghi cao với mọi điều kiện môi trường nên rong Lục phân bố khắp mọi nơi [9]. Do vậy

rong Lục là nguồn nguyên liệu dễ tìm, dồi dào và vô cùng phong phú
Rong lục chi Ulva được cho là rất giàu protein, polysaccharide, các vitamin và các
khoáng chất, trong đó, polysaccharide ngày càng được quan tâm nhiều nhất do chúng có
những tính chất vật lý và hóa học đáng chú ý và có nhiều tiềm năng ứng dụng trong y sinh
học.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, có 4 dạng polysaccharide được tìm thấy từ rong lục
chi Ulva bao gồm: dạng tan trong nước là ulvan, dạng không tan trong nước là cellulose,
dạng tan trong kiềm là xyloglucan mạch thẳng và lượng nhỏ glucuronan. Một trong các
thành phần chính của chúng là lượng Magiê cao (khoảng 2-3%).[24]Chúng cũng chứa
lượng Vitamin cao đáng ngạc nhiên gồm Vitamin A (cao gấp 2 lần bắp cải), Vitamin E
chống oxy hóa và Vitamin C (gấp 8-10 lần quả cam, và thúc đẩy việc hấp thu sắt). Chúng
còn giàu canxi (gấp 10-20 lần sữa), sắt (gấp 10 lần cải bó xôi) và Magiê (tương đương 20g
rau diếp tươi) [37]

5


Bảng 1. 1. Thành phần dinh dưỡng của rong lục Ulva lactuca thu loại trên thế giới

1.2. Chủng Bacillus subtilis và Aspergillus oryzae
1.2.1. Bacillus subtilis
B.subtilis còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ hoặc trực khuẩn cỏ khô, là loại vi khuẩn
Gram dương, thuộc: [24]
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus

6


Hình 1. 1. Vi khuẩn B.subtilis dưới kính hiển vi
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5
– 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 –
12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8
– 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có
khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất,
chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc
duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200 – 300 năm.
Bacillus subtilis có thể hình thành bào tử trong điều kiện môi trường bất lợi như hạn
hán, bức xạ cực cao, môi trường nghèo dinh dưỡng. Các tế bào vi khuẩn có thể tự tạo ra
các chất kháng sinh hoặc giết chết đồng loại để tìm dinh dưỡng trong điều kiện môi trường
sống khắc nghiệt, trước giai đoạn hình thành bào tử.
Bởi tính ổn định cao của Bacillus subtilis trong điều kiện khắc nghiệt nên vsv này
trở thành một trong những ứng cử viên hoàn hảo với các ứng dụng chế phẩm sinh học hoặc
trong đồ uống , thực phẩm, khử trùng.
Bacillus subtilis là lợi khuẩn tự nhiên có ở hệ vi khuẩn đường ruột con người.
Bacillus subtilis bền vững ở nhiệt độ cao lên tới 100oC trong vòng 180 phút nên
không bị tác động khi bổ sung vào thực phẩm hàng ngày. Có thể bổ sung Bacillus subtilis
7


tinh khiết cùng những loại thực phẩm nướng, sữa chua, đồ uống có cồn… và không giới
hạn các kiểu phối hợp khác.
Bacillus subtilis có thể sử dụng trong men vi sinh nhờ khả năng phân tán nhanh trong
hệ tiêu hóa cũng như có thể chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt, môi trường
acid trong hệ tiêu hóa của con người và động vật.
Bacillus subtilis có hệ thống enzyme khá hoàn chỉnh, các enzyme cenlulase chuyển

đổi chất xơ thành các loại đường dễ tiêu, enzyme thủy phân lipid, glucid, protid, lecithinase
thủy phân các chất béo phức hợp, enzyme phân giải gelatin, enzyme phân giải fibrin và một
loại enzyme giống lysozyme có tác dụng trực tiếp dung giải một vài loại vi khuẩn Proteus
gây bệnh trong đường ruột.[1, 12]
1.2.2. Aspergillus oryzae
A.oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectasxales, lớp Ascomycetes. Cơ thể sinh
trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh
rất nhiều và có vách ngăn, chia sợi thành nhiều tế bào. Từ những sợi nằm ngang thành nhiều
sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào
tử thường dài 1-2mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống bào tử phồng
lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia ra nhiều tế bào nhỏ, thuôn dài gọi là những tế bào
hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi
là đính bào tử. [10, 40]

Hình 1. 2. Hình vẽ sợi nấm A.oryzae
8


Đặc điểm của A.oryzae có khả năng sinh các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào
(amylase, protease, pectinasa…) ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các
thùng chứa đựng bột gạo đã hết nhưng không được rửa sạch… Nấm Aspergillus còn gọi là
mốc tương. Nấm Aspergillus oryzae là loài mốc chính trong quá trình chế tạo tương, không
sinh ra độc tố Aflatoxin và Mycotoxins.
Được sử dụng trong các chế phẩm probiotic bởi khả năng tiết nhiều enzyme amylase
phân cắt phân tử lớn thành các phân tử nhỏ hơn dể cho động vật dễ hấp thụ; và chúng có
khả năng cộng sinh với các lợi khuẩn khác
1.3. Tổng quan về Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ chiếm tỷ lệ cao nhất trong tự nhiên, là thành phần cơ bản
cấu tạo nên thành tế bào thực vật. Năm 1838, Anselin Payen là người đầu tiên tìm ra
cellulose trong sợi bông (chiếm 98%), sau đó những nghiên cứu khác cũng cho thấy

cellulose có hàm lượng rất cao trong thực vật như ở sợi lanh (80%), gỗ (40-50%) và 50%
còn lại là phức hợp polysaccharid. [6, 7, 15, 18]

Hình 1. 3. Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydrogen
Cellulose là một polymer mạch thẳng không cuộn xoắn, được tạo nên từ các đơn vị là
D-glucose thông qua liên kết β-1,4-glucosid. Mức độ polymer hóa được đánh giá dựa vào
số phân tử glucose trong chuỗi. Đối với cellulose tự nhiên, con số này khoảng 10.00014.000 và trọng lượng phân tử của cả chuỗi là 1,5 x 106 Da, dài 5 mm [17, 21]
9


Các phân tử glucose trong chuỗi polymer có dạng ghế bành, phân tử này quay 180o
so với phân tử kia. Các nhóm β-OH glycoside đều nằm trên mặt phẳng ngang của các phân
tử glucose [28]
Liên kết β-1,4 glucoside giữa các phân tử đường trong chuỗi cellulose đóng một vai
trò quan trọng trong việc tạo nên những đặc tính riêng của cellulose và cả vi sợi. Nhờ liên
kết này mà chuỗi cellulose trở nên mở rộng, ít linh động hơn so với cấu trúc amylose của
tinh bột, điều này cần cho các chuỗi cellulose để chúng có thể kết hợp với nhau và tạo thành
cấu trúc dạng sợi. Mặt khác sự tương tác qua lại giữa các gốc đường của hai chuỗi cellulose
nằm cạnh nhau cho phép tạo nên liên kết hydrogen giữa các chuỗi. Thực tế, các nhóm -OH
ở các vị trí C2, C3, C6 và nhóm O-hemiacetal trong phân tử glucose đều có thể tạo liên kết
hydro với các gốc đường bên cạnh trong cùng chuỗi cellulose hoặc chuỗi cellulose khác.
Chính mạng lưới liên kết hydro mở rộng và liên kết β-1,4 glucoside đã làm cho cấu trúc
cellulose trở nên bền vững, chặt chẽ có thể tồn tại trong các dung dịch kiềm và acid đậm
đặc [27]
Bằng phương pháp phân tích sử dụng tia rơnghen, người ta đã tìm ra cấu trúc của
cellulose trong tế bào thực vật có dạng sợi. Đơn vị nhỏ nhất của cellulose có đường kính
vào khoảng 3 nm. Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi hay còn gọi là mixen.
Mỗi vi sợi thường có khoảng 60 phân tử cellulose, có đường kính từ 10 – 40 nm, dài
100-40.000 nm [5, 10, 22, 32]

Hình 1. 4. Sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế
bào thực vật
10


Cellulose có cấu trúc không đồng nhất gồm hai vùng:
- Vùng kết tinh có trật tự cao.
- Vùng vô định hình có cấu trúc không chặt chẽ, các mạch tập hợp với nhau nhờ lực
Van der Waals, dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng có thể hấp
thu nước và trương phồng lên, nhờ vậy enzym cellulase rất dễ tác động. Trong khi đó ở
vùng kết tinh, các mạch cellulose liên kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết
hydro nối nhóm –OH thứ nhất của mạch này với nhóm –OH ở C3 của mạch khác nên đã
ngăn cản được sự trương này. Nhờ đó mà enzym cũng như nhiều phân tử khác khó có thể
xâm nhập vào được bên trong phân tử cellulose để phân hủy. [2, 4, 14]
Cellulose là một hợp chất có cấu trúc và các đặc tính lý hóa vô cùng phức tạp chỉ bị
phân hủy khi đun nóng với kiềm hoặc acid. Tuy nhiên nó có thể bị thủy phân dưới tác dụng
của cellulase của các vsv ở điều kiện bình thường. [4]
1.4. Enzym Cellulase
1.4.1. Định nghĩa và phân loại
* Định nghĩa
Cellulase là hệ enzym xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm
hòa tan. Phức hệ enzym cellulase là enzym khá phức tạp. Một mặt chúng như enzym cảm
ứng (mà ở đây cellulose lại là chất cảm ứng không chặt chẽ). Một mặt chúng lại chịu tác
động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu sự kiểm soát bởi cơ chế dị hóa.[6,
13, 22]
Cellulose là một loại phân tử polyme với các tiểu phần là D – glucose. Các gốc D –
glucose được nối với nhau qua liên kết 1,4- ß-D-glycosid. Hệ thống enzym thủy phân
cellulose bao gồm ít nhất 3 enzym khác nhau: endoglucanase (1,4-ß-D-glucan4glucanohydrolase,

EC.3.2.1.4),

exoglucanase

(1,4-ß-D

glucan-cellobiohydrolase,

EC.3.2.1.91) và ß-glucosidase (ß-D-glucosid glucohydrolase, EC.3.2.1.21). Các enzym này
có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau. Đầu tiên, endoglucanase phá vỡ liên
kết 1,4-ß-D-glucoside trong phân tử cellulose, sau đó exoglucanase tiếp tục thủy phân

11


cellulose thành các phân tử cellobiose và sau cùng ß-glucosidase phân cắt cellobiose thành
glucose. [32]
* Phân loại [6, 33]
Theo phân loại của Hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế IUBMB, hệ thống thủy
phân cellulose gồm có enzym: endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase ký hiệu
EC 3.2.1.91 và ß-glucansidase có ký hiệu EC 3.2.1.21
• Endoglucanase EC 3.2.1.4, enzym CMCase hay Cx
Tên thường gọi: cellulase
Tên hệ thống: 1,4-(1,3:1,4)-ß-D-glucan-4-glucannohydrolase
Đôi khi người ta cũng có thể gọi enzym này bằng tên khác: endo-1,4-ß-Dglucanase;
ß-1,4-glucanase;

cellulase

A;

endoglucanase;

alkali

cellulase;

cellulase

A3;

celludetrinase…
Enzym này thường thủy phân các liên kết 1,4-ß-D- glycoside trong cellulose và các
ß-D-glucan của ngũ cốc.
• Exoglucanase –EC 3.2.1.91,Tên thường gọi: cellulose 1,4-ß-cellobiosidase
Tên hệ thống: 1,4,ß-D-glucan cellobiohydrolase
Các tên khác: exo-cellobiohydrolase; exoglucanase; CBHI; cellulase C1; exo-ß-1,4glucan cellobiohydrolase…
Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glycosid, giải phóng cellobiose
từ đầu không khử.
• ß -glucosidase-EC 3.2.1.21
Tên thường gọi: ß-glucosidase
Tên hệ thống: ß-D-glucosid glucohydrolase
Các tên khác: cellobiase; ß-glucosid glucohydrolase; ß-1,6-glucosidase; salicilinase;
arbutinase…

12


Enzym này thủy phân các gốc ß-D-glucosid.Một số trường hợp cũng thủy phân ßDgalactosidase, ß-D-fucoside; ß-D-xyloside; a-L-arabinoside.
1.4.2. Tính chất
* Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu cùa enzym thể hiện ở chỗ mỗi enzym chỉ tác dụng lên một cơ chất
nhất định. Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glucosid trong phân tử cellulose và các
ß- D- glucan của ngũ cốc còn exoglucanase tác động lên các đầu chuỗi mới tạo thành
ouyđể sản xuất chủ yếu là cellobiose, ß-glucosidase thủy phân các gốc ß-D-glucose tạo nên
phân tử D-glucose … [5, 14, 39]
* Đặc tính vật lý và hóa học
Theo nghiên cứu, hầu hết các cellulose có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần acid
amin giống nhau. Độ bền và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau.
- Nhiệt độ tối ưu: 40 – 50oC
- pH tối ưu: thường ở giữa 4 – 5
* Các chất ức chế
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm của nó như glucose, cellobiose.Thủy ngân ức
chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ.
1.4.3. Cơ chế thủy phân cellulose
Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzym đến nghiên cứu tác động hiệp đồng
của cả ba loại enzym cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzym
cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose.
Tuy nhiên, hiện nay trật tự phản ứng của các enzym vẫn chưa có sự thống nhất và có nhiều
tác giả đã trình bày cơ chế tác động của cellulase theo nhiều cách khác nhau. [5, 6, 19, 21]
* Cơ chế cải tiến của Reese (1980)
Năm 1980, dựa vào quan niệm của Erickson, Reese và các cộng sự của ông đã đưa ra
cơ chế phản ứng mới cho phức hệ enzym cellulase. Đầu tiên, C1 tác dụng lên cellulose kết
tinh phá vỡ các liên kết đồng hóa trị và tạo ra cellulose biến tính hay cellulose trương nở.
13


Sau đó endoglucanase tác dụng lên đầu chuỗi và giải phóng các cellobiose. Tiếp đó dưới
tác dụng của ba enzym: endoglucanase, cellobiohydrolase và β-1,4-glucosidase, cellulose
sẽ bị phân giải hoàn toàn và tạo thành glucose.[20, 23, 30, 31]
1.4.4. Cơ chế tác dụng của cellulase

Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzym
cellulase như endoglucanase (Cx), exoglucanase (C1) và β–glucosidase. Một trong ba loại
enzym trên không thể tự thủy phân đến cùng phân tử cellulose.
Các loài vsv chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzym trong hệ enzym cellulase.
Hoạt tính enzym này thường mạnh hơn các enzym còn lại. Chính vì thế, trong điều kiện tự
nhiên, một loài vsv không thể tham gia thủy phân triệt để cellulose được.
Từ những nghiên cứu riêng lẽ từng loại enzym đến nghiên cứu tác động tổng hợp của
cả 3 loại enzym cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzym cellulase
sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Có nhiều

Hình 1. 5. Cơ chế tác động của enzym cellulase
cách trình bày khác nhau, nhưng cách trình bày cơ chế tác động của cellulase do Erikson
đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả [2, 29]
Các loài vsv có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị
ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh,
14