kỹ thuật DNA trong công nghệ sinh học

KỸ THUẬT DNA & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1


Các thuật ngữ và khái niệm
Trình tự bộ gene người được hoàn tất vào – 2007.
2007
Trình tự bộ gene của hơn 7000 loài đang tiến hành
((từ -2010).
)
Kỹ thuật giải trình tự DNA phụ thuộc vào các tiến
bộ công nghệ, bắt đầu với kỹ thuật tái tổ hợp DNA.
 Kỹ thuật tái tổ hợp DNA: các trình tự nucleotide
từ 2 sinh vật khác nhau, thường 2 loài khác nhau,
được tổổ hợp với nhau trong ống
ố nghiệm (in vitro)
trong cùng 1 phân tử DNA.
Kỹ thuật
h ậ tái
ái tổổ hợp
h DNA là then
h chốt
hố của
ủ kỹ thuật
h ậ
gene (genetic engineering), kỹ thuật thao tác trên
gene (manipulation
(
i l ti off gene)) nhằm
hằ phục

h vụ cho
h các
á
mục đích thực tiễn.

2


Các thuật ngữ và khái niệm
 Công nghệ sinh học: thao tác trên sinh vật hay các
thành phần của chúng để làm nên các sản phẩm hữu
ích.
Ví dụ:
ụ kỹỹ thuật
ậ microarray:
y sự
ự đo mức độộ biểu hiện
ệ
của hàng ngàn gene khác nhau.

3


Genomics: khoa học về bộ gen, xác định trình tự
nucleotide của DNA bộ gen, và chức năng của chúng,
bao gồm giải trình tự, sự tổ chức các gen, các đột
biế ở mức
biến
ứ độ DNA vàà nghiên
hiê cứu

ứ dòng
dò chảy
hả thông
thô
tin từ DNA đến protein của 1 tế bào, của 1 mô hay 1
cơ thể.
thể
Proteomics: khoa học nghiên cứu chức năng của tất cả
các protein được biểu hiện, bao gồm: nghiên cứu
cấu hình (conformation), vị trí (localization), các
biến đổi (modification), các tương tác (interaction),
vàà chức
hứ năng
ă (function).
(f
i )
Dựa trên cấu trúc của protein + sự hổ trợ của máy tính
→ thiết kế thuốc
4


Proteomics is the study of the function of all
expressed proteins.
(Tyers, M., & Mann, M. (2003). From genomics to
proteomics.
i Nature,
N
422(6928) 193-197
422(6928),
193 197.))

Nếu như genomics giúp cho việc chẩn đoán sớm thì
việc ngan
ngăn ngưa
ngừa va
và chưa
chữa trò nhieu
nhiều bệnh se
sẽ nhơ
nhờ
các kết quả của proteomics. Các nghiên cứu
proteomics cho thay
thấy ơ
ở một so
số bệnh,
h phan
phân tư
tử
protein ở người bình thường và người bệnh
không khac
khong
khác nhau, nhưng protein ngươi
người bệnh
thiếu biến đổi sau dòch mã

55


What is Bioinformatics?

6


Sử dụng Bioinformatics:
• Lưu trữ/ truy xuất các thông tin sinh học (database)
• Truy xuất/ so sánh các trình tự gen
• Dự đoán chức năng của các gen/protein chưa biết
ế
• Tìm kiếm các chức năngg đã được
ợ nghiên
g
cứu của một
ộ
gen
• So sánh dữ liệu với các nghiên cứu khác
• Soạn thảo, đóng góp dữ liệu
7


Chương trình truy xuất trình tự
National Center for Biotechnology
Information
GenBank and other genome databases
Ch
Chương
t ì h so sánh
trình
á h trình
t ì h tự
t

BLAST

GCG

MacVector

Chương trình cấu trúc protein
3D modeling programs –
RasMol, Protein Explorer
8


Tìm kiếm sự tương
g đồng:
g BLAST
(Basic Local Alignmet Search Tool)
Tìm kiếm dữ liệu về trình tự gen/protein quan tâm
Gióng hàng và so sánh giữa trình tự truy vấn và trình
tự trong ngân hàng dữ liệu,
liệu cho phép tìm kiếm các trình
tự không bắt cặp, các khoảng trống (gap), xác định độ
tương đồng.
→Có thể xác định cấu trúc,
trúc chức năng và tiến hóa của 1
gen

9


Ví dụ

% identity

CATTATGATA

70%

GTTTATGATT

MRCKTETGAR
90%

Amino acids

Symbols

Amino
acids

Symbols

Alanine

Ala

A

Methionine

Met

M

Cysteine

Cys

C

Asparagine

Asn

N

Aspartic acid

Asp

D

Proline

Pro

P

Glutamic acid

Glu

E

Glutamine

Gln

Q

Phenylalanine

Phe

F

Arginine

Arg

R

Glycine

Gly

G

Serine

Ser

S

Hi tidi
Histidine

Hi
His

H

Th
Threonine
i

Th
Thr

T

Isoleucine

Ile

I

Valine

Val

V

Lysine

Lys

K

Tryptophan

Trp

W

Leucine

Leu

L

Tyrosine

Tyr

Y

MRCGTETGAR
10

DỰ ÁN BỘ GEN NGƯỜI (HUMAN GENOME PROJECT)

-Được bắt
bắ đầu
đầ vào
à - 1990,
1990 được
đ
tổổ chức
hứ bởi liên
liê hiệp
hiệ các
á
nhà khoa học trên thế giới: 20 trung tâm giải trình tự ở 6
nước,, và một
ộ số lượng
ợ g lớn các pphòngg thí nghiệm.
g ệ
-Mục đích dự án: xác định toàn bộ trình tự của mỗi
chromosome (3,2 tỉ cặp base của bộ gen đơn bội),
- 2003,
2003 hầu như toàn bộ bộ gen người đã được giải trình tự.
tự
-2006, phần cuối cùng của chromosome 1 được công bố.
- Sự p
phát triển
ể vượ
vượt bậc trong
o g ggiải trình tự
ự bộ ge

gen ngừơi:
gừơ :
Bộ gen người đầu tiên được công bố: 13 năm; 100 triệu
USD
-Bộ
Bộ gen của James Watson được giải trình tự trong 4 tháng
(2007), ~ 1 triệu USD.
-Hiện tại, bộ gen của 1 người có thể được giải trong thời
gian
i cực ngắn
ắ (tính
( í h bằng
bằ giờ):
iờ) 1000 USD
S
11


Molecular
Interactions
Cellular
Function

Functional
end products
Metabolites
(~2500 small
molecules)

Genomics

Transcriptomics

Proteomics

Metabolomics

Dòng thông tin trong tế bào và các kỹ thuật -omics
13


Giải trình tự DNA và nhân dòng DNA - công cụ
quan trọng
t
của
ủ kỹ thuật
th ật di truyền
t
ề
Phương pháp giải trình tự (DNA sequencing) được xây
d trên
dựa
t ê nguyên
ê tắc
tắ bắt cặp
ặ bổ sung.
Qui trình giải trình tự tự động thế hệ đầu tiên là phương
pháp của Sanger: phương pháp Dideoxy (phương pháp
gián đoạn chuỗi: chain determination method)

một
một chuỗi DNA mới được tổng hợp dựa vào thông
tin từ một DNA khuôn thông qua enzyme DNA
polymerase III
III.
Các nucleotide được biến đổi (dideoxyribonuceotides:
ddNTP) nối vào chuỗi DNA đang được tổng hợp với các
chiều dài khác nhau
14


15


Nếu như một ddNTPs nào đó gắn vào chuỗi đang
được tổng hợp thì quá trình tổng hợp sẽ bị gián đoạn,
do đó phương pháp này còn được gọi là phương pháp
gián đoạn chuỗi( chain determination method).
Mỗi
ỗ một ddNTP được đánh dấu
ấ hùynh quang nhằm
ằ
xác định nucleotide tại mỗi điểm cuối của mỗi đọan
DNA.
DNA
Trình tự của mỗi đoạn DNA sẽ được đọc từ kết quả
của spectrogram (thanh phổ)

16

Dideoxyy Chain
Termination
Method for
Sequencing DNA

17


Nhân dòng DNA
-Tạo
Tạo ra nnhiều bản copy của 1 gene đích.
đích
-Đóng vai trò quan trọng trong tạo sản phẩm protein.
-Các phương pháp:
Sử dụng vi khuẩn và plasmid
Phản ứng PCR (polymer chain reaction)

21


Phương
pháp nhân
dòngg ggene
sử dụng
plasmid và
vi khuẩn

22

Enzyme cắt giới hạn để tạo DNA tái tổ hợp

Enzyme cắt DNA thành các đọan giới hạn (retriction
fragment)
Cá enzyme cắt
Các
ắ giới
iới hạn
h tạo đầu
đầ dính
dí h (sticky
( i k ends-đầu
d đầ
đính của đọan này bổ sung với đầu dính của DNA khác)
hay đẩu bằng (blunt)
Phần lớn các enzyme cắt giới hạn có nguồn gốc tử vi
khuẩn.
Enzyme ligase hàn các nối (bond) của các đoạn giới
23
hạn lại với nhau


Enzyme cắt hạn chế (Restriction
endonuclease
d
l
- RE)

Các dạng đầu mút tạo ra bởi các loại enzyme giới hạn

24


25


Kỹ thuật điện di trên gel (Gel Electrophoresis)
Kỹ thuật phân tích và so sánh nhanh chóng bộ gene.
Sử dụng
ụ g ggel để tách các đọan
ọ acid nucleic hayy pprotein
theo kích cỡ.
Một dòng điện được áp dụng gây ra sự di chuyển của
các đoạn DNA trong gel: DNA/protein có kích thứớc
nhỏ di chuyển trong gel dễ dàng và nhanh hơn các
đọan có kích thước lớn.

26


27


Southern Blotting (Edwin Southern)
Kỹ thuật nối các đọan DNA với sự lai acid nucleic.
Sử dụng mẫu dò (probe) lai với các đọan DNA đã
được phân tách sau khi đã chuyển
ể các đọan này lên
màng (paper –like

like membrane).

28


29