Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học

Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
Bài thực tập 1: Phát hiện nhanh và bán định lượng AND bằng
phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch kết hợp nhuộm bằng
Ethidium bromide.
1 Giới thiệu
AND phản ứng với Ethidium bromide tạo nên phức có khả năng phát huỳnh quang dưới ánh
sang tử ngoại. Các lượng ADN khác nhau khi được chấm lên nền thạch hay agarose có chứa
Ethidium bromide sẽ tạo nên các vòng sang có cường độ sang khác nhau. Trên cơ sở xây dựng một
dãy nồng độ ADN chuẩn và chấm lên đĩa thạch, đối chiếu với AND mẫu, chúng ta có thể phát hiện
được DNA ở giới hạn rất thấp (<µg). Kết quả so sánh về đường kính và cường độ vòng sang thậm
chí còn cho phép bán định lượng DNA trong mẫu nghiên cứu. Đây là phương pháp rất đơn giản
cho phép nhanh chóng phát hiện sự có mặt DNA với lượng mẫu rất ít (1µg). Điều rất có ý nghĩa
khi lượng mẫu và hàm lượng DNA có được không đủ để định lượng bằng các phương pháp thong
thường.
2 Nội dung
2.1 Hóa chất và dụng cụ
• Các đĩa thạch hay agarose 1,7% có chứa 50µg/ml Ethidium bromide đã được chuẩn bị từ
trước và đã được ủ ở 37ºC dạng lật úp ít nhất 10h.
• Dung dich DNA gốc 2µg/ml.
• Dung dịch DNA cần định lượng.
• Đệm TE (Tris-HCl 10mM, pH 8,0 có chứa EDTA 1mM).
• Ống eppendorf 1,5µl .
• Pipetman loại 20µl.
• Máy soi UV.
• Bút đánh dấu.
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 1
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
2.2 Phương pháp tiến hành
 Bước 1: Chuẩn bị dãy 8 ống của DNA chuẩn có nồng độ chênh lệch nhau 2 lần:
• Đầu tiên cho vào mỗi ống 5µl đệm TE.
• Ống 8 cho thêm vào 5µl DNA chuẩn nồng độ 2µg/µl rồi trộn đều.

• Hút 5µl từ ống 8 cho vào ống 7 trộn đều…làm tương tự đến ống 2.
• Ông 1 để nguyên.
8 7 6 5 4 3 2 1


8 7 6 5 4 3 2 1
5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 2
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
 Bước 2: Chuẩn bị 8 ống (được đánh dấu từ 916) chứa mẫu DNA cần xác địch làm
tương tự như trên. Chỉ khác là ống số 9 chứa mẫu có nồng độ gốc.
16 15 14 13 12 11 10 9

16 15 14 13 12 11 10 9
5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl
 Bước 3: Lấy 3µl trong mỗi ống nhỏ lần lượt vào 16 ô trên đĩa thạch đã chuẩn bị sẵn.
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 3
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
3µl


 Bước 4: Cho đĩa peptri vào tủ ủ ở 37ºC Bước 5: Lấy đĩa thạch cho vào máy soi UV

 Bước 6: So màu bằng mắt thường và xác định kết quả.
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 4
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
3 Kết quả
• Ta thấy ô số 8 với ô 16 và ô số 7 với ô 15 có màu tương đồng. Tức là ta có
nồng độ của mẫu bằng nồng độ của DNA chuẩn. Hay nồng độ của mẫu
cần xác định xấp xỉ 2µg/µl.

Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 5