Xác định sự tương tác giữa hai protein AtMPK3 và AtMYB77 trong điều kiện in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BÙI MẠNH HÙNG

XÁC ĐỊNH SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA HAI PROTEIN
AtMYB77 VÀ AtMPK3 TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BÙI MẠNH HÙNG

XÁC ĐỊNH SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA HAI PROTEIN
AtMPK3 VÀ AtMYB77 TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN XUÂN CẢNH

HÀ NỘI, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Bùi Mạnh Hùng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn, Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và
sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Cảnh – Trưởng Bộ môn Công Nghệ Vi Sinh – Khoa
Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã tận tình hướng dẫn và
dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Học
viện Nông nghiệp Việt Nam đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
và thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp lòng biết ơn sâu
sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn
thành luận văn.

Học viên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục những từ viết tắt

v

Danh mục hình

vi

MỞ ĐẦU

0

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1Tổn 3
g
1.1 Điề 3
.1 u
1.1 Vai 5
.2 trò
1.1 Cơ 6
.3 chế
1.1 Ph 8
.4 ân
1.2Gi 9
ới
1.2 Đặ 9
.1 c
1.2 Gi 11
.2 ới
1.3Ch 13
uỗi
1.3 Vai 13
.1 trò
1.3 Cơ 13
.2 chế
1.4Cá 14
c
1.4 Ph 14

.1 ân
1.4 Mộ 15
.2 t số
1.4 MP 19
.3 K3
1.4 Cá 20
.4 c
Ch 2 22
ươ V
2.1Vật 22
liệ
2.2Hó 24
a
2.3Ph 25
ươ
2.3 Ph 25
.1 ươ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


2.3.2

Tinh sạch sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzym giới hạn bằng
phương pháp thôi gel

26

2.3.3

Phương pháp gắn hai đoạn DNA bằng enzym ligase (Ligation)

26

2.3.4

Biến nạp vector vào vi khuẩn E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt

26

2.3.5

Phương pháp tách chiết và tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E. coli

27

2.3.6
27

Phương pháp kiểm tra sự biểu hiện của các protein tái tổ hợp trong E. coli

2.3.7

Phương pháp thu nhận và tinh sạch các protein tái tổ hợp

28

2.3.8

Phương pháp thử phản ứng phosphoryl hóa trong điều kiện in vitro

29

2.3.9

Kiểm tra sự tương tác của 02 protein bằng phương pháp pull-down

29

2.3.10 Phân tích khối phổ để xác định điểm phosphoryl hóa

30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

31

3.1

Khuếch đại gen mã hóa protein AtMYB77 từ cây Arabidopsis

31

3.2

Tách dòng gen mã hóa protein AtMYB77

32

3.3

Chuyển gen mã hóa protein AtMYB77 vào vector biểu hiện pGEX-5X

33

3.4

Kiểm tra lại sự có mặt của gen mã hóa protein AtMYB77 và AtMPK3
trong vector biểu hiện

34

3.5
36

Kiểm tra sự biểu hiện protein AtMPK3 trong vi khuẩn E. coli chủng M15

3.6
37

Kiểm tra sự biểu hiện protein AtMYB77 trong vi khuẩn E. coli chủng BL21

3.7

Xác định sự tương tác giữa protein AtMYB77 và AtMPK3 bằng kỹ

3.8
C
H

4.1
Kế
4.2
Ki
TÀ
I

thuật pull-down

39

Xác định điểm tương tác trên protein AtMYB77

40

44
44
44
45

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
ATP

Adenosine triphosphate

bp

Base pair

ddNTP

Dideoxynucleoside triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid

kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria – Bertani

MAPK

Mitogen activated protein kinase

MYB

Myeloblastosis

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

TAE

Tris – acetate – EDTA

TEMED

Tetramethylethylenediamine

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


DANH MỤC HÌNH
ST
T

T
ng
n 3
h

1.1
1.2 M 7
1.3 ot
H 1
1.4 ọD 0
ẫ
n
1.5 H
o
2.1 C
2.2 ấS
ơ
2.3 Đ
o
ạ
n

2.4 tr
C
3.1 ấK

1
4
2
1
2
2
2
3

2
3
2

4
3
3.2 hK 1
i

3
3.3 ể 3
m
3.4
t

3
4

3.5 rK 3
3.6 iể
K 6
iể
m
3.7 tr
a
s
3.8 Đ
3.9 ặK
iể
m
3.1 tr
0
ac

3
8
4
4
1
4
2

4
h 3

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


MỞ ĐẦU
Trong nhiều năm gần đây, những nghiên cứu cơ bản sự điều hòa biểu hiện
của gen diễn ra mạnh mẽ trên khắp các phòng thí nghiệm trên toàn cầu để đáp ứng
nhu cầu hiểu biết cơ bản của quá trình điều hòa biểu hiện gen cũng như các ứng dụng
thực tiễn to lớn mà nó đem lại. Điều hoà hoạt động gen là quá trình điều hoà lượng
sản phẩm của gen được tạo ra qua quá trình phiên mã và dịch mã trong tế bào đảm
bảo cho hoạt động sống của tế bào phù hợp với điều hiện môi trường cũng như với sự
phát triển bình thường của cơ thể. Điều hoà hoạt động gen cũng là quá trình có sự
tham gia của rất nhiều các yếu tố tham gia. Những nhân tố trực tiếp tham gia vào
điều hòa hoạt động gen ở sinh vật nhân chuẩn là các nhân tố phiên mã (Transcription
factor - TF), có bản chất là protein. Các nhân tố này có thể hoạt động riêng lẻ hoặc
kết hợp thành phức hợp để điều hòa hoạt động của các gen ở những mức độ khác
nhau.
Tuy nhiên để thực hiện vai trò của mình thì các nhân tố phiên mã này cần được
kích hoạt bởi nhiều loại tín hiệu khác nhau trong tế bào. Tham gia vào quá trình tiếp
nhận và dẫn truyền tín hiệu bao gồm nhiều thành phần khác nhau, nhưng đóng vai trò
chủ đạo là các protein kinase (PK). Trong đó các protein kinase thuộc nhóm
mitogen- activated protein kinase (MPKs cascade) được biết đến với vai trò trung
tâm. Những protein trong nhóm này tham gia vào hầu hết các hoạt động sống như
phân hóa, biệt hóa cũng như sinh trưởng và phát triển của tế bào, dẫn truyền tín hiệu
tế bào nhằm thích nghi với các tác động của môi trường. MPKs cascades gồm ba
lớp; trên cùng là các protein thuộc nhóm MAPK kinase kinase (MPKKK,
MEKK, MAP3K), ở giữa là các protein thuộc nhóm MAPK kinase (MAPKK,
MEK, MKK, MAP2K) và dưới cùng là các protein thuộc nhóm MAPK (MPK). Việc
dẫn truyền tín hiệu thông qua MPKs cascades tương đối bảo thủ, các protein
kinase lớp trên sẽ hoạt hóa protein lớp dưới thông qua quá trình phosphoryl
hóa (phosphorylation). Sau khi được hoạt hóa bởi MPKKs, MPKs sẽ tiếp tục

phosphoryl hóa các cơ chất của mình. Nhóm các cơ chất của MPKs rất đa dạng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


bao gồm nhiều loại protein khác nhau trong đó có cả các nhân tố phiên mã
(transcription factor).
Arabidopsis thaliana được biết đến như là cây mô hình để thực hiện các

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


nghiên cứu chức năng gen ở sinh vật nhân chuẩn do có một số ưu việt như; là thực
vật bậc cao điển hình, có vòng đời ngắn và hệ gen của nó đã được giải mã hoàn
toàn. Trong số 20 loại protein nhóm MPK ở Arabidopsis thaliana, người ta thường
tập trung vào 02 protein chính là MPK3/6. Vai trò, chức năng cũng như cơ chế dẫn
truyền tín hiệu của các protein này đã được biết khá đầy đủ, nhưng các cơ chất của
nó cũng như các protein mà nó tham gia điều khiển vẫn còn là ẩn số mà các nhà
khoa học đang tìm lời giải đáp.
Để xác định được cơ chất của MPK cũng như vai trò mà nó tham gia, việc đầu
tiên là phải xác định xem MPK đó có khả năng tương tác với protein nào sau đó xác
định xem nó có phosphoryl hóa protein đó hay không. Chính vì vậy việc tìm ra mối
tương tác giữa các protein là rất cần thiết, từ đó chúng ta có thể làm chủ được quá
trình biểu hiện của một gen mong muốn, hay nói rộng hơn là chúng ta có thể tác
động một cách mạnh mẽ và chủ động lên sản phẩm mà chúng ta mong muốn ở sinh
vật quan tâm.

Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định sự
tương tác giữa hai protein AtMYB77 và AtMPK3 trong điều kiện in vitro”
Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu được mối quan hệ giữa hai protein AtMYB77 và AtMPK3 từ đó
kiểm tra và xác định xem hai protein này có tương tác với nhau trong điều kiện in
vitro hay không.
Nội dung nghiên cứu
Tách dòng gen mã hóa protein AtMYB77 ở cây Arabidopsis thaliana
Biểu hiện hai protein tái tổ hợp AtMYB77 và AtMPK3 trong vi khuẩn E. coli
Kiểm tra sự tương tác giữa hai protein AtMYB77 và AtMPK3 trong điều kiện
in vitro
Xác định cơ chế tương tác của hai protein này thông qua việc xác định điểm
tương tác trên protein AtMYB77.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về quá trình điều hòa phiên mã và nhân tố phiên mã
1.1.1. Điều hòa phiên mã
Điều hoà phiên mã gen là trung tâm của quá trình biểu hiện gen đặc hiệu và
quá trình điều hoà hoạt động của gen trong đáp ứng với các kích thích đặc trưng.
Chính vì vậy, mặc dù có một số bước điều hoà sau phiên mã, đa số các trường hợp
điều hoà hoạt động gen xảy ra ở bước phiên mã theo cơ chế quyết định một gen có
thể được phiên mã thành RNA. Khi quá trình này xảy ra, các bước tiếp theo của
biểu hiện gen, ví dụ như cắt ghép nối RNA sẽ diễn ra tự động và tạo ra các sản
phẩm protein tương ứng (Riechmann et al, 2000).

Hình 1.1. Các nhân tố ảnh hưởng lên quá trình điều
hòa hoạt động biểu hiện gen
Hệ gen của sinh vật nhân chuẩn phức tạp hơn rất nhiều so với sinh vật nhân sơ
gen và hệ gen thực vật được coi là phức tạp hơn cả so với các nhóm sinh vật nhân
chuẩn khác. Tính phức tạp của hệ gen thực vật được hình thành qua quá trình tiến
hóa kéo dài hàng triệu năm và được xác định bởi ba nhân tố chính. Thứ nhất, thực
vật không có khả năng di chuyển, do đó phải đối mặt thường xuyên, trực tiếp với
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


các điều kiện môi trường. Do không có hệ thần kinh và hệ miễn dịch, thực vật đã
hình thành nhiều cơ chế thích nghi với các hệ thống bảo vệ khác nhau ở nhiều cấp
độ để đối phó với các yếu tố bất lợi của môi trường xung quanh. Thứ hai, tế bào
thực vật tổng hợp rất nhiều các hợp chất trao đổi thứ cấp. Mỗi hợp chất lại tham gia
vào các con đường trao đổi chất phức tạp, liên quan tới hoạt động của một vài gen
khác nhau và đòi hỏi một cơ chế điều hòa biểu hiện gen đặc trưng. Yêu tố thứ ba tạo
nên tính phức tạp trong hệ gen thực vật là kích thước hệ gen. Hệ gen thực vật có
kích thước rất lớn và đa dạng nhất trong sinh giới (Mitsuda et al, 2009; Riechmann
et al, 2000a; Riechmann et al, 2000b).
Chính vì lý do đó quá trình điều hòa hoạt động gen ở sinh vật nhân chuẩn cũng
phức tạp hơn nhiều so với sinh vật nhân sơ. Ở sinh vật nhân chuẩn thường chỉ có một
chuỗi polypeptide đơn được dịch mã từ một phân tử mRNA hoàn chỉnh. mRNA đa
gen (polycistronic) chỉ có ở sinh vật nhân sơ, không có ở sinh vật nhân chuẩn.
DNA của sinh vật nhân chuẩn gắn với protein Histone tạo sợi Chromatin, và gắn với
protein phi Histone. Chỉ có một đoạn nhỏ DNA để trần. Ở prokaryote, một vài
protein có mặt trên nhiễm sắc thể bị gấp nếp, còn lại hầu hết DNA trần. Một đoạn
DNA quan trọng của sinh vật nhân chuẩn chứa trình tự nucleotide có độ lặp lại trung
bình hoặc cao. Một vài trình tự lặp lại được xếp nối tiếp thành các bản sao tiếp nối

nhau, một vài trình tự khác lại không xếp nối tiếp. Vi khuẩn chứa đoạn DNA lặp lại
nhỏ khác các gen của rRNA và tRNA nhân đoạn và một vài yếu tố di động. Phần lớn
những đoạn DNA của sinh vật nhân chuẩn không được dịch mã. Hầu hết trình tự
nucleotide không được mã hóa thành protein. Các sinh vật nhân chuẩn đơn bào,
chẳng hạn nấm men là trường hợp ngoại lệ đối với tính chất này. Một vài gen sinh
vật nhân chuẩn được biểu hiện và điều hòa nhờ cơ chế cấu trúc lại những đoạn DNA
nhất định theo một phương thức được điều khiển và để tăng số lượng các gen đặc
biệt này khi cần thiết. Các gen sinh vật nhân chuẩn là gián đoạn được phân thành các
exon và intron. Các intron được cắt bỏ trong quá trình chế biến bản phiên mã RNA
trước khi bắt đầu dịch mã. Ở hệ gensinh vật nhân chuẩn, mRNA được tổng hợp trong
nhân và được chuyển qua màng nhân, vào tế bào chất mới được sử dụng. Tế bào vi
khuẩn không có nhân được tách biệt với tế bào chất (Liu et al,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


1999; Riechmann et al, 2000a; Riechmann et al, 2000b).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


Quá trình điều hòa phiên mã ở thực vật có sự tham gia của rất nhiều các yếu tố
khác nhau, nhưng quan trọng nhất là các nhân tố điều hòa phiên mã. Nhân tố phiên
mã là những protein có vai trò kiểm soát quá trình phiên mã của gen. Tất cả các
nhân tố phiên mã đều có đặc điểm chung về cấu trúc: có một domain liên kết DNA,
một domain hoạt hóa phiên mã và một domain liên kết với các phối tử. Ở thực vật

và nhiều sinh vật nhân chuẩn khác, một số nhân tố phiên mã có vai trò quan trọng
đối với sự điều hòa phối hợp giữa các gen. Tế bào thực vật có rất nhiều đáp ứng
thích nghi với nhiều loại yếu tố gây stress của môi trường có liên quan tới sự điều
hòa phối hợp của các nhóm gen có cùng một hay một vài yếu tố đáp ứng nằm phía
trước trình tự promoter lõi (Liu et al, 1999; Riechmann et al, 2000a).
1.1.2. Vai trò của nhân tố phiên mã
Nhân tố phiên mã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong các quá trình
điều hòa biểu hiện gen ở thực vật. Các nghiên cứu về đột biến ở thực vật đã chỉ ra
một số nhân tố phiên mã với vai trò như những chất điều hòa then chốt trong nhiều
hoạt động chức năng ở thực vật. Thuật ngữ “nhân tố phiên mã” được sử dụng để chỉ
các protein có chứa các vùng bám vào DNA (DNA-binding domain), chúng có khả
năng nhận biết một trình tự DNA đặc biệt. Ngoài ra, các protein không chứa DNAbinding domain mà có thể tương tác với các protein bám DNA để tạo thành các
phức hợp phiên mã cũng được coi là các nhân tố phiên mã. Vào năm 2000, toàn bộ
trình tự hệ gen của Arabidopsis thaliana đã được xác định và người ta dự đoán rằng
bộ gen này chứa 25.498 gen mã hóa cho protein. Dựa vào các trình tự bảo thủ với
các DNA-binding domain đã đc biết đến, Riechmann và cộng sự (2000) đã báo cáo
rằng có khoảng 1.500 gen trong tổng số 25.498 gen trên mã hóa cho các nhân tố
phiên mã. Các nghiên cứu gần đây hơn đã nhận biết được khoảng trên 2.000 gen
thuộc bộ gen của Arabidopsis mã hóa cho các nhân tố phiễn mã (Liu et al, 1999;
Mitsuda, 2009; Riechmann et al, 2000a; Riechmann et al, 2000b).
Ngược lại với Arabidopsis, số lượng gen mã hóa cho nhân tố phiên mã tìm
được ở Drosophila melanogaster (ruồi giấm thường) và loài giun Caenorhabditis
elegans, những loài mà có kích thước genome tương đương với Arabidopsis, là
khoảng 600, ít hơn rất nhiều so với số lượng gen mã hóa cho nhân tố phiên mã ở

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7

Arabidopsis (Riechmann và cộng sự. 2000). Tỉ lệ gen mã hóa cho nhân tố phiên mã
trên tổng số gen ở Arabisopsis là từ 5-10% phụ thuộc vào cơ sở dữ liệu, lớn hơn ở
D. melanogaster (4.7%) và ở C. elegans (3.6%) (Riechmann và cộng sự. 2000),
mặc dù tỉ lệ này lại tương đương với tỉ lệ ở người (6%) (Riechmann et al, 2000b).
Cùng với số lượng lớn các gen mã hóa cho nhân tố phiên mã ở Arabidopsis, có một
lượng lớn các loại nhân tố phiên mã, cùng với sự đa dạng của tính bám đặc hiệu vào
DNA, so với ở D. melanogaster hay ở C. elegans. Đặc trưng này của Arabidopsis
chỉ ra rằng sự điều hòa quá trình phiên mã ở thực vật đóng vai trò quan trọng hơn so
với ở động vật. Bởi vì điều hòa quá trình phiên mã là bước đầu tiên của biểu hiện
gen và có thể ảnh hưởng tới các hệ protein, hệ trao đổi chất…; sự phân tích chức
năng của các nhân tố phiên mã cũng quan trọng và cần thiết không kém đối với các
nghiên cứu về các hệ đó và đối với việc làm sáng tỏ toàn bộ hệ thống chức năng ở
thực vật. Mặc cho rất nhiều nỗ lực đã được thực hiện xoay quanh vấn đề tìm hiểu
chức năng của các nhân tố phiên mã, nhưng phần lớn chức năng của chúng vẫn
chưa được phân loại rõ ràng.
1.1.3. Cơ chế hoạt động của nhân tố phiên mã
Phân tích chi tiết nhiều nhân tố phiên mã cho thấy các protein này có một cấu
trúc phân tử tương tự nhau, với một vùng đặc trưng đóng vai trò liên kết DNA,
trong khi các vùng khác đóng vai trò là vùng kích thích hay ức chế quá trình phiên
mã. Các nghiên cứu về vùng liên kết DNA của các nhân tố phiên mã khác nhau cho
thấy chúng có một số yếu tố cấu trúc đặc trưng, cho phép chúng liên kết với DNA.
Có rất nhiều kiểu dạng vùng (domain) của DNA khác nhau để chúng liên kết với
nhân tố phiên mã, cho phép nhân tố phiên mã có thể liên kết chính xác với trình tự
DNA hoạt hoá trong vùng promoter của gen đích. Vấn đề cần tìm hiểu tiếp theo là
bằng cách nào các nhân tố phiên mã có thể ảnh hưởng tới tốc độ phiên mã của các
gen đích sau khi liên kết với vùng promoter này.
Các nhân tố phiên mã hoạt động như các chất hoạt hóa hoặc chất ức chế quá
trình phiên mã. Đối với các sinh vật nói chung, các nhân tố phiên mã bao gồm các
vùng chứa phần lớn là các amino axit có tính axit như glutamine hoặc proline. Ví
dụ, TOC1, DREBs, ARFs và GBF1, là các chất hoạt hóa quá trình phiên mã. Mãi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


đến khi the ERF-associated amphiphilic repression (EAR) motif được phát hiện ở
ETHYLENE RESPONSIVE ELEMENT BINDING FACTOR 3 (EREBP3) trong
cây thuốc lá (Ohta và cộng sự. 2000), người ta mới làm sáng tỏ được các chất ức
chế quá trình phiên mã ở thực vật. Các chất ức chế phiên mã được chia thành chất
ức chế chủ động và thụ động. Các chất ức chế thụ động không có cả vùng hoạt hóa
lẫn vùng ức chế. Một số chất ức chế thụ động gây ức chế phiên mã bằng cách bám
vào vùng khởi động của gen đích, do đó cạnh tranh với các chất hoạt hóa gen đích
mà thường thì sẽ tương tác với vùng khởi động đó. Maize Dof 2 được biết đến như
một chất ức chế thụ động. Các chất ức chế chủ động chứa các vùng ức chế riêng
biệt để thực hiện hoạt động ức chế của các nhân tố phiên mã. EAR motif là một
vùng ức chế đặc hiệu với thực vật. Đơn vị nhỏ nhất của vùng ức chế thuộc motif
EAR chỉ gồm 6 amino axit. Bởi vì sự hợp nhất của vùng ức chế ở EAR motif có thể
biến một chất hoạt hóa phiên mã thành một chất ức chế mạnh, cho nên các nhân tố
phiên mã mà chứa motif này được gọi là các chất ức chế phiên mã (Liu et al, 1999;
Riechmann et al, 2000b).

Hình1.2. Motif EAR-RNA

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


Hoạt động của hầu hết các nhân tố phiên mã được điều khiển ở cấp độ phiên

mã bởi các nhân tố phiên mã khác, trong khi một vài nhân tố phiên mã khác lại
được điều hòa ở quá trình cải biến sau phiên mã, ví dụ như EIN3 (Yoo et al, 2008).
Các RNA nhỏ mà nhắm tới các gen mã hóa cho nhân tố phiên mã cũng là các chất
điều hòa quan trọng trong quá trình biểu hiện của gen. Các nhân tố phiên mã mà
được điều hòa ở cấp độ sau phiên mã có thể chính là các chất điều hòa hoạt động ở
giai đoạn đầu của các cascade phiên mã.
Các nghiên cứu về transcriptome, proteome, metabolome và phenonome được
thực hiện có hiệu quả nhờ vào các dòng có ích, như dòng đột biến, những dòng mà
có khả năng cung cấp thông tin về các kiểu hình. Ở thực vật, điều hòa phiên mã
đóng một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình điều khiển sự biểu hiện của gen,
và một số nhân tố phiên mã ở thực vật hoạt động như các chất điều hòa chủ yếu của
một loạt các hoạt động chức năng của cây. Các nhân tố phiên mã tạo ra sự thay đổi
về kiểu hình, làm thay đổi hệ proteome, metabolome, và phenonome cùng với
transctiptome. Bằng cách làm sáng tỏ hệ thống chức năng hoàn chỉnh của các nhân
tố phiên mã, người ta có thể dự đoán được các sự kiện của transcriptome,
metabolome và phenome gây ra bởi các thao tác trên gen mong muốn (Feilner et al,
2005; Jonak et al, 2002; Liu et al 1999; Riechmann et all, 2000b).
1.1.4. Phân loại nhân tố phiên mã
Nhân tố phiên mã thường được phân loại dựa trên domain liên kết DNA. Một
số domain liên kết DNA đã được nghiên cứu khá chi tiết bao gồm: motif HLH
(helix-turn-helix) trong nhân tố phiên mã homeobox, C2H2 ZF (two cysteine-two
histidine zinc finger), domain Ets, domain liên kết DNA cơ bản... Ngoài ra, cũng có
những nhân tố phiên mã mang domain liên kết DNA cơ bản nhưng chỉ liên kết với
DNA khi hình thành dạng dimer. Do đó, nhân tố phiên mã còn được phân loại theo
dạng dimer hoá tự nhiên của các motif chức năng (Riechmann et all, 2000a).
Theo

The

Arabidopsis

Information

Resources

(TAIR,

), có 27.235 gen mã hóa cho protein trong bộ gen của
Arabidopsis

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

(bi-

Page
10


dopsis.org/home/tair/Genes/TAIR8_genome_release/README). Bốn báo cáo độc
lập gần đây đã chỉ ra rằng có gần 2.000 gen mã hóa cho nhân tố phiên mã. Bốn cơ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page
11


sở dữ liệu đại diện cho nhân tố phiên mã thuộc Arabisdopsis đó là: RARTF
( />state.edu/AtTFDB/),

DATF

AGRIS

(o-

( />
và

PlnTFDB

( =ATH). Mỗi hệ thống cơ sở
dữ liệu chia nhân tố phiên mã thành các họ lớn dựa vào tiêu chí phân loại của mình,
và số vị trí của các alen trong mỗi họ lại khác nhau ở bốn cơ sở dữ liệu này.
Trong lần lượt 4 hệ thống cơ sở dữ liệu trên thì có 51, 51, 64 và 67 họ (tổng số
72 họ) và
1.965, 1.837, 1.914 và 1.949 vị trí (tổng số 2,620 vị trí). Những sự khác nhau này
chủ yếu là do sự định nghĩa khác nhau về nhân tố phiên mã trong mỗi cơ sở dữ liệu.
Ví dụ như, cơ sở dữ liệu AGRIS không xếp protein AUX/IAA vào loại nhân tố
phiên mã vì chúng không trực tiếp bám vào DNA nhưng chúng lại có khả năng ức
chế quá trình phiên mã của các gen liên quan tới auxin bằng cách tương tác với các
nhân tố phiên mã ARF, trong khi ba cơ sở dữ liệu kia lại phân loại chúng như
những nhân tố phiên mã thực sự.
Các nhân tố phiên mã ở Arabidopsis được đặc trưng bởi một số lượng lớn các
gen và bởi sự đa dạng trong các họ gen so với ở D. melanogaster hay ở C. elegans.
Ví dụ như, nhân tố phiên mã “ngón tay kẽm” zinc-finger chiếm hơn một nửa tổng
số nhân tố phiên mã ở D. melanogaster hay ở C. elegans, trong khi ở Arabidopsis
chúng chỉ chiếm khoảng 20%. Khoảng một nửa số nhân tố phiên mã của
Arabidopsis là đặc trưng cho thực vật và có các vùng bám DNA chỉ tìm thấy ở thực
vật. MYB, AP2-ERF, NAC, Dof, YABBY, WRKY, GARP, TCP, SBP, ABI3-VP1

(B3), EIL và LFY là các nhân tố phiên mã đặc trưng ở thực vật (Riechmann et all,
2000a).
1.2. Giới thiệu họ nhân tố phiên mã MYB
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc, chức năng và phân
loại
Protein MYB là một siêu họ các yếu tố phiên mã có vai trò trong quá trình
điều hòa phát triển và phản ứng tự vệ ở thực vật. Đã xác định được 198 gen trong
siêu họ MYB từ một phân tích trình tự bộ gen của cây Arabidopsis hoàn chỉnh. Gen
MYB đầu tiên được phát hiện là gen đột biến gây ung thư v-Myb có nguồn gốc từ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page
12


virus myeloblastosis ở loài chim. Bằng chứng thu được từ những phép so sánh trình
tự chỉ ra rằng v-Myb có thể có nguồn gốc từ gen của động vật có xương sống; các

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page
13


gen này đã bị đột biến một lần và trở thành một phần của virus. Nhiều loài động vật
có xương sống chứa 3 gen liên quan tới v-Myb: c-Myb, A-Myb và B-Myb, và các
gen tương tự khác cũng đã được phát hiện ở côn trùng, thực vật, và nấm mốc. Các
protein được mã hóa có vai trò rất quan trọng trong việc điều khiển quá trình tăng
sinh và biệt hóa của một số loại tế bào, và có chung vùng liên kết DNA (DNAbinding domain) bảo thủ MYB. Vùng bảo thủ này bao gồm tới 3 trình tự lặp lại
không hoàn chỉnh, mỗi trình tự hình thành một cấu trúc xoắn helix bởi 53 amino

axit. Cấu trúc gồm 3 tryptophan đối xứng với nhau trong không gian tạo thành một
nhóm các tryptophan chính là đặc trưng của một trình tự lặp lại MYB. Ba trình tự
lặp lại của c-Myb được gọi là R1, R2, R3; và các trình tự lặp lại của các protein
Myb được phân loại dựa vào sự tương đồng với R1, R2, hoặc R3 (Romero et al
1998; Stracke et al, 2001).

Hình 1.3. Họ protein MYB ở cây Arabidopsis
Ở thực vật, protein MYB được chia thành 3 họ phụ thuộc vào số lượng các
trình tự lặp lại đứng liền kề nhau ở vùng MYB (một, hai, hoặc ba trình tự lặp lại).
Các nhân tố MYB1R bao gồm 1 trình tự lặp lại, nhân tố MYB loại R2R3 chứa 2

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10


trình tự lặp lại, và nhân tố có 3 trình tự lặp lại được gọi là các nhân tố MYB3R.
Nhân tố MYB1R có thể hoạt động như các chất hoạt hóa phiên mã. Arabidopsis
chứa 5 gen MYB3R. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng các nhân tố MYB3R ở
thực vật giống với ở động vật có liên quan tới sự điều hòa chu kì tế bào. Các nhân
tố này có liên quan tới việc điều hòa quá trình phiên mã của gen cyclin thông qua các
yếu tố phát hiện vùng MYB ở vùng khởi động của gen cyclin. Các gen MYB loại
R2R3 chính là họ gen MYB lớn nhất ở thực vật. Trong đó, 126 gen là R2R3-MYB, 5
gen là R1R2R3-MYB, 64 gen liên quan đến MYB, và 3 gen MYB không điển hình
(Jung et al, 2008a; Jung et al, 2008b; Stracke et al, 2001; Urao et al, 1993).
Một số trình tự DNA đích của nhóm protein R2R3-MYB cũng đã được nghiên
cứu và chúng ta đã xác định được một số yếu tố hoạt hóa chung đặc trưng cho nhóm
protein MYB này. Nghiên cứu đầu tiên về trình tự nhận biết của protein R2R3MYB được thực hiện trên đối tượng protein P có liên quan tới quá trình sinh tổng
hợp flavonoid của Ngô. Thông qua các thí nghiệm sàng lọc vị trí liên kết và thí
nghiệm EMSA, trình tự liên kết đặc hiệu với protein P được xác định là

ACC(A/T)ACC(A/C/T). Trình tự này khác hoàn toàn với trình tự bảo thủ liên kết
với protein R2R3-MYB của động vật (T/C)AACG/TGA/C/TA/C/T), nhưng lại
tương đồng với một trình tự nhận biết đặc trưng của đa số các protein MYB thực
vật, bao gồm (T/CAACG/TGA/C/T(A/C/T), MBSII (AGTTAGTTA) và MBSIIG
(C/TACCA/TAA/CC). Tuy nhiên, một điều đáng lưu ý là không phải tất cả các
protein MYB, đặc biệt là phân họ R2R3-MYB, có khả năng nhận biết motif này. Có
rất nhiều nhân tố phiên mã R2R3-MYB có thể nhận biết yếu tố AC (motif DNA
giàu gốc adenosine và cytosine). Một số protein R2R3-MYB hoạt động với vai trò
là một yếu tố hoạt hóa phiên mã khi liên kết với trình tự DNA này, trong khi một số
khác lại thể hiện chức năng ức chế phiên mã (Romero et al, 1998; Stracke et al,
2001; Urao et al, 1993).
1.2.2. Giới thiệu chung về nhân tố phiên mã MYB77
1.2.2.1.
trúc

Cấu

MYB77 được tìm thấy trong thực vật và động vật và được đặc trưng bởi một
đến ba trình tự lặp lại không hoàn chỉnh của khoảng 52 amino axit và hình thành
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


cấu trúc cuộn xoắn helix-turn-helix. Các nhân tố phiên mã MYB thuộc loại R2R3,
chứa 2 trình tự lặp lại không hoàn chỉnh, được tìm thấy ở thực vật và chứa 1 họ gen
gồm 126 thành viên ở Arabidopsis thaliana. Một số lượng lớn các nhân tố phiên mã
MYB điều hòa một loạt các quá trình trong cây, bao gồm quá trình sinh tổng hợp
các chất chuyển hóa thứ cấp, các mặt khác nhau trong quá trình phát triển của cây,
các đáp ứng lại điều kiện stress vô cơ, và các quá trình khác (Shin et all, 2007).

1.2.2.2.
năng

Chức

Sự phát triển của rễ được điều khiển để đáp ứng lại những thay đổi khác nhau
của môi trường đất. Cả sự phát triển của lông rễ và rễ phụ thay đổi theo những cách
khác nhau phụ thuộc vào lượng dinh dưỡng và độ ẩm trong đất. Một trong những
chức năng chính của rễ là hút lấy các chất dinh dưỡng muối khoáng từ môi trường
đất. Để tối đa hóa khả năng hút các chất dinh dưỡng từ đất, các thay đổi trong quá
trình phát triển của rễ thường dẫn đến sự thay đổi cấu trúc toàn bộ rễ. Các rễ phụ có
thể tăng sinh và kéo dài tới các phần đất có chứa nguồn tài nguyên như ni-tơ, hoặc
phốt-pho. Mật độ rễ phụ và lông rễ cũng tăng lên đáp ứng lại điều kiện môi trường
nghèo dinh dưỡng. Ngược lại với trường hợp thiếu hụt ni-tơ và phốt- pho, sự thiếu
hụt ka-li dẫn đến sự giảm sút trong quá trình sinh trưởng ở cả rễ và ngọn. Trong
điều kiện thiếu hụt ka-li, sự sinh trưởng và phát triển của rễ phụ giảm.
Hooc-môn auxin đóng một vai trò trung tâm trong sự phát triển của rễ phụ.
Hoạt động của auxin phụ thuộc vào các thụ thể auxin đặc hiệu hoạt động trong con
đường ubiquitin-proteasome và các chất vận chuyển mà điều khiển sự hấp thụ và sự
định vị ở cực của auxin. Các nhân tố phiên mã điều hòa biểu hiện gen để đáp ứng
lại auxin cũng là một thành phần chủ chốt trong sự điều hòa vô số tác động mà
auxin thực hiện trong sự sinh trưởng và phát triển của cây. Một vài nhân tố phiên
mã được điều hòa bởi auxin, đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của rễ
phụ. Các nghiên cứu trên điều hòa gen trong đáp ứng với auxin tập trung chủ yếu
vào các lớp gen được điều hòa bởi auxin và các nhân tố đáp ứng auxin (ARFs) mà
có khả năng tương tác với các protein Aux/IAA. Cả Aux/IAAs và ARFs đóng
những vai trò quan trọng trong sự phát triển của rễ phụ .
MYB77 được chứng minh trong các nghiên cứu trước đây là bị giảm khả năng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


biểu hiện trong điều kiện thiếu hụt ka-li và khả năng biểu hiện quá mức của nhân tố
phiên mã này tạo ra kiểu hình rất xấu, giống với các cây sống trong môi trường
chứa mức IAA ngoại sinh cao. MYB77 tương tác với các nhân tố đáp ứng auxin
trong ống nghiệm và trong thực vật để thúc đẩy sự biểu hiện gen đáp ứng lại auxin
(Shin et all, 2007).
1.3. Chuỗi enzym MAP kinase (MPK cascades)
1.3.1. Vai trò
Sau khi tổng hợp, protein thường được sửa đổi bằng các cơ chế cải biến sau
dịch mã, một trong những cơ chế này là sự phosphoryl hóa bởi enzym kinase. Có
rất nhiều các loại enzym kinase khác nhau tồn tại trong tế bào sinh vật, trong số này
phải nói đến enzyme: mitogen-activated protein kinase (MPK). Chúng được biết
đến với vai trò trung tâm dẫn truyền tín hiệu ở sinh vật nhân chuẩn bao gồm cả
động vật, thực vật và nấm men. Enzym MPK tham gia vào hầu hết mọi hoạt động
sống của tế bào từ phân bào, biệt hóa tế bào đến sinh trưởng tế bào cũng như đáp
ứng với những điều kiện bất lợi từ môi trường. Chức năng của protein MPK ở thực
vật đã được tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau như lúa, ngô, đậu
tương, thuốc lá…tuy nhiên các nghiên cứu chi tiết hầu hết tập trung vào cây mô
hình Arabidopsis (Chin-Min, 2008; Colcombet, 2008; MAPK-Group, 2002;
Mizoguchi, 1997).
1.3.2. Cơ chế hoạt động
Dưới tác động của các yếu tố ngoại bào như nhân tố sinh trưởng, thay đổi của
môi trường sống…thụ thể của tế bào tiếp nhận sẽ tín hiệu này, sau đó chúng sẽ
được chuyển hóa và khuếch đại nhờ chuỗi phản ứng của enzym kinase dẫn tới việc
hoạt hóa các quá trình nội bào khác nhau. Các enzym kinase trong chuỗi phản ứng
này thường tổ chức thành ba lớp gồm MPK kinase kinase (viết tắt là MAPKKK/
MEKK/ MTK/ MAP3K), MPK kinase (viết tắt là MAPKK/ MEK/ MKK/ MAP2K)
và MPK (viết tắt là MAPK/ MPK), chúng hoạt hóa lẫn nhau thông qua quá trình

phosphoryl hóa. Điều này có nghĩa là enzym lớp MAP3K sẽ phosphoryl hóa để hoạt
hóa enzym lớp MAP2K, sau khi được hoạt hóa enzym MAP2K tiếp tục thực hiện
phản ứng phosphoryl hóa và hoạt hóa enzym lớp MAPK (Chin-Min, 2008;

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13