Nghiên cứu thiết kế vector và biểu hiện gen AtCBF1 trên cây thuốc lá (nicotiana tabacum l )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG THỊ TƯƠI

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR VÀ BIỂU
HIỆN GEN AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ
(Nicotiana tabacum L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG THỊ TƯƠI

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR VÀ BIỂU HIỆN
GEN AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ
(Nicotinana tabacum L.)
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành: 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Tiến Dũng
CHỮ KÝ PHÒNG QLĐTSĐH CHỮ KÝ KHOA CHUYÊN MÔN

CHỮ KÝ GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Thái Nguyên – 2018


i
LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã
nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và
các cá nhân.
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Nguyễn Tiến
Dũng đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện
và hoàn thành luận văn này.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến các cán bộ, giảng viên khoa Công nghệ
sinh học, Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã
tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia
đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học
tập và thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018
Học Viên

Hoàng Thị Tươi


ii
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii

DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ........................................ vii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề.................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................. 2
1.3. Ý nghĩa của luận văn.................................................................................. 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ..................................................................................... 2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 3
1.1.Giới thiệu chung về cây thuốc lá................................................................. 3
1.1.1. Phân loại học .......................................................................................... 3
1.1.2. Các đặc điểm thực vật học của cây thuốc lá .......................................... 4
1.2. Giới thiệu về gen CBF1 ............................................................................. 5
1.3. Tính chống chịu của thực vật ..................................................................... 8
1.3.1.Tính chịu hạn............................................................................................ 8
1.3.2. Tính chịu nóng....................................................................................... 11
1.3.3 Tính chịu lạnh ........................................................................................ 13
1.4. Ảnh hưởng của stress nóng, hạn, lạnh đến cây trồng .............................. 14
1.4.1. Ảnh hưởng của stress nóng ................................................................... 14
1.4.2. Ảnh hưởng của hạn ............................................................................... 15
1.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lạnh ................................................................ 16
1.5. Nghiên cứu nâng cao tính chống chịu ở thực vật..................................... 17
1.6. Phương pháp chuyển gen ở thực vật qua Agrobacterium........................ 20
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 23


3

2.1. Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu ................................................. 23

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu:GenAtCBF1 ...................................................... 23
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu............................................................................... 23
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 23
2.2.1 Địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 23
2.2.2 Thời gian nghiên cứu ............................................................................. 23
2.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu ..................................................... 23
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 23
2.3.3. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 25
2.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 25
2.4.1. Nội dung 1: Phân lập gen AtCBF1 ....................................................... 25
2.4.2. Nội dung 2: Thiết kế vector chuyển gen................................................ 25
2.4.3. Nội dung 3: Chuyển gen trên cây thuốc lá ........................................... 26
2.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 26
2.5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số ................................................... 26
2.5.2. Phương pháp tạo cDNA từ mRNA tổng số ........................................... 27
2.5.3. Phương pháp nhân gen AtCBF1 bằng kỹ thuật PCR .................................
27
2.5.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ................................................ 28
2.5.5. Phương pháp thiết kế vector tách dòng gen AtCBF1 ........................... 28
2.5.6. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến .............. 29
2.5.7. Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp ...................................... 29
2.5.8. Phương pháp tách chiết plasmid........................................................... 30
2.5.10. Phương pháp xác định trình tự ........................................................... 32
2.5.11. Thiết kế vector biểu hiện AtCBF1 ....................................................... 32
2.5.12. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium ...............................
33
2.4.13. Phương pháp chuyển gen trên cây thuốc lá........................................ 33
2.5.14. Phương pháp chọn lọc và phân tích cây chuyển gen.......................... 35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................... 39
3.1. Phân lập gen AtCBF1 ............................................................................... 39

3.1.1. Phân tích gen AtCBF1 trên cơ sở dữ liệu database ............................. 39


4

3.1.2. Tách dòng gen AtCBF1 ......................................................................... 40
3.2. Thiết kế vector chuyển gen ...................................................................... 45
3.3. Chuyển gen AtCBF1 vào cây thuốc lá thông qua A.tumerfaciens ........... 45
3.4. Chọn lọc và phân tích hiệu quả chuyển gen ............................................ 47
3.5. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển AtCBF1 trên cây thuốc lá .......... 49
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 53
4.1. Kết luận .................................................................................................... 53
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 54


5

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu.......................................... 24
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .......................................... 27
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR ...................................................... 27
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .................................................... 28
Bảng 2.5. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid......................................... 30
Bảng 2.6. Thành phần môi trường sử dụng trong chuyển gen........................ 35
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR............................................................. 37
Bảng 2.8: Chương trình thực hiện phản ứng PCR .......................................... 38
Bảng 3.2. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen trên môi trường bổ sung
Kanamycin 25mg/l. ......................................................................................... 47

6

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. Biểu hiện của gen AtCBF1 ở cây Arabidopsis thaliana ................. 40
Hình 3.2. Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng và vector chuyển gen
AtCBF1............................................................................................ 42
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gen AtCBF1 bằng PCR và
enzyme cắt giới hạn. ....................................................................... 43
Hình 3.4. Kết quả giải trình tự gen tách dòng AtCBF1 với cặp mồi ngược ... 44
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự gen tách dòng AtCBF1 với cặp mồi ngược ... 44
Hình 3.6. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây thuốc lá
chuyển gen. ..................................................................................... 48


vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
A
D
A
s
A
A
T
B
A
B
p

B
S
C
N
C
T
A
D
dN
N
E
D
K
kb
D
L
B
L
M
A
M
C
M
S
N
A
N
A
D
N

O
D
P
C
R
Q
T
L
R
M
R
N
R
O
S
D
T
A
TD
T
E
Ti
U
V
Vi
r

A
de
A

ce
to
A
de
Be
nz
Ba
se
pa
ir
C
ôn
Ce
tyl
tri
D
eo
D
eo
Et
hy
Ki
lo
Ki
lo
Lu
ria
và
M
ak

M
ult
M
ur
αN
Ni
co
tin
a
O
pti
Po
ly
m
Q
ua
nti
Re
ge
Ri
bo
Re
ac
tiv
So
di
Tr
is
Tr
an

Tr
is
Tu
m
Ul
tra
Vi
rul


1

MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng, sinh
sản và năng suất cây trồng. Nhiệt độ thấp dẫn đến những thay đổi về hình
thái, sinh hóa hay các cơ chế phân tử trong cây từ đó làm giảm khả năng sinh
trưởng, năng suất của cây thập trí gây chết hoặc thất thu hoàn toàn. Ở cây
chịu lạnh khi gặp nhiệt độ thấp cây thay đổi cấu trúc tế bào và vai trò của các
enzyme tham gia quá trính trao đổi chất của tế bào để thích ứng với ngoại
cảnh.
Nghiên cứu tạo cây chịu lạnh được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới
và mang lại hiệu quả cao trong công tác chọn tạo giống. Bằng các kỹ thuật
sinh học phân tử nhiều gene liên quan đến khả năng chịu lạnh đã được sàng
lọc và phân tích trên cây trồng như COR15a (Artus và cộng sự, 1996),
WCS120 (Houde và cộng sự, 1992), COR78/RD29, COR47 (Thomashow,
1999), CBF (Hsieh và cộng sự, 2002; Dubouzet và cộng sự, 2003; Ito và cộng
sự, 2006).
CBF (C-repeat binding factor) là một nhóm gene có mặt trong nhiều loại
thực vật như Arabidopsis, lúa mì, cà chua, cây cải. Ở cây Arabidopsis, CBF

được xác định bao gồm 3 gene: CBF1, CBF2 và CBF3 nằm trên nhiễm sắc
thể số 4, là yếu tố cảm ứng chịu lạnh (El Kayal và cộng sự, 2006) đã được
chứng minh vai trò nâng cao tính chịu lạnh ở cây thông qua cơ chế bảo vệ tế
bào khi gặp điều kiện bất lợi (Kasuga và cộng sự, 1999; Gilmour và cộng sự,
2004). Ở nước ta phần lớn các cây trồng đều có khả năng chịu lạnh kém. Với
đặc điểm khí hậu có mùa đông lạnh ở Miền Bắc, các loại cây trồng này
thường gặp bất lợi, ngừng sinh trưởng hoặc thập chí bị chết. Tuy nhiên công
tác chọn tạo giống chịu lạnh ở nước ta chưa được quan tâm nhiều. Trong bối


2

cảnh khí hậu toàn cầu đang biến đổi theo hướng bất lợi như hiện nay: mùa
đông kéo dài hơn, nhiệt độ xuống thấp hơn thường lệ, sản xuất nông nghiệp ở
nước ta sẽ gặp những thách thức không nhỏ trong tương lai. Để phục vụ công
tác chọn tạo giống cây trồng chịu lạnh thích ứng với sự biến đổi khí hậu, việc
ứng dụng các kỹ thuật hiện đại như công nghệ gene là rất cần thiết. Vì vậy,
xuất phát từ nhu cầu thực tiễn chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu thiết kế vector và biểu hiện gen AtCBF1 trên cây thuốc lá (Nicotiana
tabacum L.)”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
- Thiết kế vector chuyển gen AtCBF1;
- Chuyển gen AtCBF1 vào cây thuốc lá.
1.3. Ý nghĩa của luận văn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của luận văn cung cấp dẫn liệu khoa học về ứng
dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm phục vụ việc cải thiện tính chịu lạnh ở
cây trồng.
Cung cấp thông tin về gen AtCBF1. Khả năng chịu lạnh ở cây thuốc lá
và vai trò của gen AtCBF1 trong đáp ứng với nhiệt độ lạnh từ môi trường.

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả đánh giá khả năng tính chịu lạnh ở cây thuốc lá được sử dụng
làm cơ sở để đánh giá và ứng dụng biện pháp cải thiện khả năng chịu lạnh của
cây trồng.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây thuốc lá
1.1.1. Phân loại học
Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana.sp thuộc ngành hạt kín
Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotyledones, chi Nicotiana. Trong chi
Nicotiana có 50 – 70 loài, đa số dạng cỏ, một số dạng thân đứng, hầu hết là
dạng dại phụ. Căn cứ vào hình thái, màu sắc của hoa người ta chia thành 4
loại chính [13]:
- Loài Nicotiana tabacum L.: có hoa màu hồng hay đỏ tươi. Đây là loại
phổ biến nhất, chiếm 90% diện tích trồng thuốc lá trên thế giới [13].
- Loài Nicotiana rustica L.: có hoa màu vàng, chiếm 10% diện tích
thuốc lá trên thế giới [13].
- Loài Nicotiana petunioide L.: có hoa màu trắng, phớt hồng hay tím,
thường chỉ có trong vườn thực vật phục vụ nguồn dự trữ gen cho lai tạo, ít
được dùng trong sản xuất [13].
- Loài Nicotiana polideiede L.: có hoa màu trắng. Loài này cũng ít
được dùng trong sản xuất, chủ yếu chỉ có trong vườn thực vật học của một số
quốc gia [13].
Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị kinh tế vừa là cây
mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng nhờ khả
năng dễ dàng tiến hành nuôi cấy mô và tiến hành chuyển gen. Vì vậy, thuốc lá

là một trong những đối tượng được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu
cơ bản và ứng dụng đặc biệt là đối tượng chuyển gen.


4

1.1.2. Các đặc điểm thực vật học của cây thuốc lá
1.1.2.1. Rễ
Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm: rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên)
và rễ hấp thu. Ngoài ra, thuốc lá còn có rễ bất định mọc ở cổ rễ, phần trên sát
mặt đất. Rễ trụ được hình thành từ phôi rễ. Rễ nhánh được phát sinh từ trục
của rễ cái, thường có độ xiên 30 – 40o. Rễ hấp thu được phát triển trên các rễ
nhánh, có nhiệm vụ cung cấp nước và chất dinh dưỡng cho cây. Rễ bất định
mọc từ thân, những rễ bất định ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi độ
ẩm không khí cao. Rễ thuốc lá tập trung dày đặc ở lớp đất 0 – 30cm, phát
triển theo các hướng. Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp nicotin. Nicotin
được vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá [13].
1.1.2.2. Thân
Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân cứng, tiết diện thân tròn, chiều
cao thân cây có thể đạt từ 1 – 3m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá.
Đường kính thân đạt 2 -4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là chồi
nách. Có hai loại chồi nách: chồi nách chính và chồi nách phụ [13].
1.1.2.3. Lá
Thể thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá. Số lượng lá trên cây thay
đổi tùy giống. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu: hình trứng, hình tim,
hình elip, hình mũi mác. Độ dày, màu sắc lá thay đổi.
Lớp ngoài của biểu bì có tầng cutin trong suốt và có lớp phấn sáp khi lá
bắt đầu chín kỹ thuật. Lớp tế bào mô dậu và tế bào mô khuyết trong cấu trúc
lá quyết định độ dày, mỏng, độ đàn hồi của lá thuốc. Ở trên mặt lá còn có
nhiều tuyến lông đa bào, có hình dạng và kích thước khác nhau. Các tuyến

này chứa nhựa, hợp chất thơm tự nhiên và tích lũy nhiều khi lá chín kỹ thuật.
Trên mặt lá có gân chính và nhiều gân phụ [13].


5

1.1.2.4. Hoa
Hoa thuốc lá là hoa đơn, lưỡng tính, năm cánh, nhị cái ở giữa, xung
quanh có 5 nhị đực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn,
được hình thành do sự phân hóa của đỉnh sinh trưởng thân. Chính giữa
chùm hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của
chùm hoa [14].
Phương thức thụ phấn của thuốc lá là tự phối, còn lại có thể do thụ
phấn chéo do gió, côn trùng,...
1.1.2.5. Quả và hạt
Quả thuốc lá được hình thành trên đài hoa. Mỗi cây có 100- 150 quả
trên mỗi chùm hoa có những cây hoặc những giống có tới 400 – 500 quả trên
chùm hoa.
Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng
sấy lò là khoảng 0,07 – 0,1gam. Trong mỗi gam hạt có từ 10.000 – 15.0000
hạt [14].
1.2. Giới thiệu về gen CBF1
Đặc điểm: Gen CBF1 hoạt chất phiên mã liên kết với yếu tố điều hòa
DRE/CRT và gây ra sự biểu hiện gen COR (lạnh được điều hòa) làm tăng khả
năng chịu lạnh của cây trồng. Nó mã hóa một thành viên của phân họ DREB
A-1 của họ hệ số phiên mã ERF/AP2 (CBF1). Protein chứa một tên miền
AP2. Có bốn thành viên của họ CBF, đáp ứng với stress phi sinh học của cây.
Ba gen đầu tiên là CBF1 CBF2 và CBF3, rất cần thiết cho phản ứng với nhiệt
độ lạnh, trong khi gen CBF4 rất cần thiết cho phản ứng khi có khô hạn xảy ra.
Gen CBF1 này liên quan đến phản ứng với nhiệt độ thấp và axit abscisic [48].

Các nghiên cứu về gene CBF1: Để khai thác tốt chức năng khác nhau
giữa CBF1 (StCBF1) của khoai tây trồng và CBF1 (ScCBF1) của khoai tây
hoang dại Commerson, nhóm nghiên cứu của Jian Li thuộc Đại học Nông


6

nghiệp Sơn Đông đã cho thể hiện thành công hai gen này trong cây
Arabidopsis với hai dòng khác nhau. Tất cả cây chuyển gen ấy đều thể hiện
kiểu hình lùn, trổ bông muộn, lá dầy hơn và điểm những chấm hồng. Tuy
nhiên, dòng chuyển gen ScCBF1 thể hiện sự chống chịu đáng kể đối với lạnh
giá và khô hạn hơn dòng chuyển gen StCBF1. Mức độ thể hiện của nhiều gen
liên quan đến chịu lạnh và phát triển, bao gồm các gen ức chế cây tăng trưởng
và trổ bông muộn, cũng cao hơn trong tất cả các cây chuyển gen.
Kết quả cho thấy hai gen CBF1 có vai trò quan trọng trong phản ứng
của cây đối với stress phi sinh học, tăng trưởng và phát triển. Tuy nhiên,
ScCBF1 có chức năng rõ hơn StCBF1 [40].
+ Nhóm tác giả: Li Y, Song Y, Xu B, Xie J, Zhang D, Cooke J thuộc
trường đại học khoa học và công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp Bắc
Kinh, Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu: “Hoạt động đặc biệt của gen
CBF1 cây dương trong một mạng lưới điều hòa lạnh tích hợp”. Các yếu tố
liên kết C-repeat (CBFs), cũng được gọi là thành viên nhóm protein yếu tố
phản ứng mất nước (DREB1), đóng vai trò quan trọng trong việc thu nhận
khả năng chịu stress, nhưng trong cây, các cơ chế cơ bản của khả năng chịu
stress vẫn còn khó nắm bắt. Để hiểu rõ hơn về các cơ chế này, nhóm nghiên
cứu đã phân lập năm orthologs CBF1 từ bốn phần cây dương (Populus spp).
Và đánh giá biểu hiện của chúng trong điều kiện hạn hán, lạnh, nhiệt và
muối. Biểu hiện trên toàn phần gây ra trong phản ứng với lạnh gợi ý một mối
tương quan giữa biểu hiện CBF1 dương tính và việc thu nhận khả năng chịu
lạnh. Các phản hồi thay đổi giữa các phần có thể phản ánh các cơ chế chịu

ứng suất theo từng phần cụ thể, cho thấy ảnh hưởng của bối cảnh sinh thái đối
với sự phát triển khả năng chịu ứng suất trung gian CBF1 trong cây
dương. Sau đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng chiến lược tìm kiếm toàn bộ bộ
gen trong Populus trichocarpa để dự đoán 2263 gen mục tiêu CBF giả


7

định; các gen được xác định tham gia vào nhiều quá trình và con đường sinh
học. Hầu như tất cả các gen mục tiêu giả định có chứa nhiều yếu tố tác động
cis mà trung gian phản ứng với các tín hiệu môi trường và nội sinh khác nhau,
phù hợp với vai trò quan trọng của CBF1 trong một mạng lưới điều hòa lạnh
tích hợp. Cuối cùng, phân tích 528 cá thể của Populus simonii đã xác định sáu
đa hình đơn nucleotide (tỷ lệ phát hiện sai Q <0,10) đáng kể (P <0,005) kết
hợp với sản xuất malondialdehyde và rò điện phân, cho thấy tầm quan trọng
tiềm năng của PsCBF1 trong quy định một số chức năng liên quan đến màng
tế bào. Phát hiện của nhóm nghiên cứu cung cấp những hiểu biết mới về chức
năng của PsCBF1 và làm sáng tỏ mạng lưới quy định trung gian CBF trong
cây dương [28].
+ Nghiên cứu: “Biểu hiện cảm ứng ectopic của At-CBF1 trong cà chua
chuyển gen không có marker làm tăng khả năng chịu lạnh “Trong một nỗ lực
để cải thiện khả năng chịu đựng lạnh của stress, một gen yếu tố liên kết C-lặp
lại Arabidopsis C (At-CBF1) được thúc đẩy bởi promoter cảm ứng RD29A
được đồng chuyển vào cà chua var. Shalimar. Marker (NPTII) - chuyển gen
miễn phí thu được trong thế hệ T (1) vì sự tích hợp không liên kết của các gen
CBF1 và NPTII. Phản ứng chuỗi sao chép ngược polymerase đã khẳng định
sự biểu hiện của CBF1 trong các dòng chuyển gen T (1). Nghiên cứu mô hình
biểu hiện trong T (1) dòng biến đổi gen cho thấy sự gia tăng dần dần với thời
gian làm lạnh kéo dài và cũng khẳng định sự đảo ngược của biểu hiện về loại
bỏ stress. Cây chuyển gen không có sự khác biệt về hình thái và nông học so

với cây không biến đổi. Khi cây chuyển gen non bị phơi nhiễm với stress lạnh
(4°C) trong 3 ngày, tăng tỷ lệ sống (50%) ở các dòng chuyển gen so với cây
không biến đổi (10%). Cây chuyển gen chịu áp lực làm lạnh cho thấy sự giảm
đáng kể chỉ số tổn thương màng và peroxid hóa lipid và cũng làm tăng hàm
lượng proline tự do đáng kể trong các mô lá so với cây không biến đổi. Vì


8

vậy, những phát hiện này chỉ ra rằng cây cà chua chuyển gen không có
marker không biểu hiện gen Arabidopsis CBF1 cung cấp khả năng bảo vệ và
có khả năng chịu lạnh đối với cà chua biến đổi gen mà không có bất kỳ biến
đổi kiểu hình nào [40].
1.3. Tính chống chịu của thực vật
1.3.1.Tính chịu hạn
Hạn đối với thực vật là khái niệm đựợc dùng để chỉ trạng thái thiếu
nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai
đoạn sống, làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực
vật. Môi trường khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật
ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển.
Hạn là một trong nhiều yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng
và năng suất cây trồng.
Để đối phó với điều kiện hạn hán, thực vật sẽ khởi động cơ chế phòng
vệ chống lại sự thiếu hụt nước, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp độ
khác nhau. Đáp ứng chống chịu stress hạn của thực vật được thực hiện thông
qua một chuỗi các quá trình rất phức tạp với sự tham gia của hàng loạt các
yếu tố và có thể chia thành 3 giai đoạn: nhận tín hiệu – dẫn truyền tín hiệu –
đáp ứng chống chịu khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu [4].
Tính chịu hạn của những thực vật ở cạn hạn sinh có bản chất di truyền,
thể hiện ra ở các thích nghi về hình thái và sinh lý. Một số giảm thiểu sự thoát

hơi nước nhờ có lớp cutin dày, khí khổng nằm sâu, thân mọng nước, lá có thể
tiêu giảm, sử dụng nước hiệu quả bằng cách tiến hành quang hợp theo con
đường CAM. Một số ngừng sinh trưởng cho đến khi điều kiện trở lại bình
thường. Một số có chu kỳ sinh dưỡng ngắn, chỉ trong vài tuần. Khi có mưa,
đất ẩm, hạt giống của chúng nảy mầm. Chúng sinh trưởng và phát triển thật
nhanh chóng, hình thành hạt trước khi mùa khô hạn đến [3].


9

Hai cơ chế chủ yếu liên quan đến khả năng chịu hạn của thực vật là sự
điều chỉnh áp suất thẩm thấu và sự phát triển mạnh của bộ rễ. Bộ rễ là một
trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nước cung
cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Cơ chế chịu hạn
liên quan mật thiết với sự phát triển của bộ rễ. Cơ thể thực vật thích ứng với
hạn bằng cách phát triển rễ cọc theo chiều dài vươn tới các lớp đất sâu hơn để
hút nước dễ dàng hơn, đồng thời hệ thống rễ con phát triển mở rộng theo bề
ngang có thể thích ứng tốt với việc tìm kiếm dinh dưỡng khoáng và nước
trong lòng đất [31]. Kaspar và cộng sự khi đánh giá 105 giống đậu tương
trong điều kiện khô hạn đã nhận thấy, cây đậu tương không được tưới nước
thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn cây đậu tương được tưới nước, ngoài ra các nhà
khoa học cũng nhận thấy mối tương quan chặt chẽ đối với nhiều tính trạng rễ
như trọng lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ con ở các
giống chịu hạn. Các tính trạng này thường được dùng như các chỉ tiêu quan
trọng để đánh giá và nhận dạng các giống đậu tương có tính chịu hạn [29].
Hệ thống xử lý hạn cho cây mô hình A. thaliana đã được Amal Harb và
cộng sự (2010) thiết kế để nghiên cứu những thay đổi của cây khi bị hạn. Kết
quả nghiên cứu cho thấy, thực vật đáp ứng với yếu tố bất lợi qua ba giai đoạn:
giai đoạn ban đầu là giai đoạn đánh giá điều kiện, tiếp đó thực vật đáp ứng
chống chịu và cuối cùng sẽ hình thành một cân bằng mới [2]. Thực vật đáp

ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường: phụ thuộc ABA và
không phụ thuộc ABA. Theo các con đường đó các tín hiệu bất lợi từ môi
trường được tế bào tiếp nhận và được dẫn truyền đến nhân theo hai con đường
hoặc thông qua ABA hoặc không thông qua ABA. Các tín hiệu được dẫn
truyền đến nhân gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa yếu tố
phiên mã. Các yếu tố phiên mã gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gen
liên quan đến tính chống chịu. Các đáp ứng này sẽ bị mất dần khi điều kiện


10

bất lợi mất đi [11], [42]. Thực vật cảm nhận các yếu tố bất lợi, hay các tác
nhân từ môi trường nói chung thông qua hàng loạt các thụ thể bề mặt tế bào
như các serine/threonine-like receptor kinase, được gọi chung là các receptorlike kinase (RLKs), các thụ thể liên kết với kênh ion (ion chanel-linked
receptor), các G-protein-couple receptor (GPCRs) và các thụ thể histidine
kinase. Các kênh Ca2+ cho phép Ca2+ được chuyển vào tế bào chất khi được
kích hoạt bởi các yếu tố bất lợi [45]. Vì vậy các kênh này hoạt động như các
các thụ thể liên kết với kênh ion của yếu tố bất lợi. GPCRs là một nhóm thụ
thể màng khác. Trong điều kiện bất lợi, chúng kích hoạt các enzyme
phospholipase C hoặc D và chuyển hóa thành các tín hiệu [43]. Các thụ thể
nội bào ABA, PYR/RCAR, là các tín hiệu của yếu tố bất lợi gây ra bởi hạn,
thông qua kích hoạt serine/threonine kinase SnRK2 trong đáp ứng với ABA
[38]. Do sự tổng hợp ABA dẫn đến tăng cường đáp ứng với điều kiện bất lợi,
thụ thể ABA có thể được coi là một thiết bị cảm biến yếu tố bất lợi.
Một số lượng lớn các gen được tìm ra liên quan đến các đáp ứng với
điều kiện bất lợi [35]. Microarray DNA cung cấp thông tin có ý nghĩa lớn
trong việc phân tích biểu hiện của toàn bộ hệ gen và đã được sử dụng để
nghiên cứu các mô hình biểu hiện gen ở các đáp ứng với hạn hoặc mặn ở một
số loài thực vật [26], [38], [23], [30]. Các gen tăng cường biểu hiện trong điều
kiện hạn bao gồm các gen liên quan đến tổng hợp các chất điều hòa thẩm

thấu, các gen mã hóa cho các protein LEA, aquaporin, các phân tử tín hiệu và
các yếu tố phiên mã. Trong đó, các gen mã hóa cho các yếu tố phiên mã được
quan tâm nhiều bởi các yếu tố phiên mã hoạt động như những công tắc tác
động đến hàng loạt các gen đáp ứng với điều kiện bất lợi [11]. Có hơn 100
yếu tố phiên mã mà sự biểu hiện của chúng được tăng cường khi tiếp xúc với
điều kiện hạn, chúng đã được tìm ra bằng phân tích toàn bộ hệ phiên mã ở cây
A.thaliana tiếp xúc với hạn [36]. Hạn làm tăng cường mức độ biểu hiện của


11

các gen, được điều khiển bởi các yếu tố phiên mã thuộc họ bZIP, AP2/ERF,
HD-ZIP, MYB, Bhlh, NAC, NFY, EAR và ZPT2 [46]. Những yếu tố phiên
mã này được kích hoạt bởi các tín hiệu hạn. Do hạn xảy ra cùng với sự tăng
lên về hàm lượng ABA, một vài yếu tố phiên mã được kích hoạt bởi ABA.
Những các yếu tố phiên mã đáp ứng ABA (ABFs) chủ yếu thuộc họ bZIP và
kết hợp với các yếu tố đáp ứng ABA (ABRE) trong các promoter của các gen
đáp ứng hạn [26], [46]. Trong khi đó, sự hoạt động của một số gen mã hóa
yếu tố phiên mã họ CBF/DRE, NAC và ZF-HD lại không phụ thuộc ABA.
Tuy nhiên, một vài nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt động của các gen mã hóa yếu
tố phiên mã thuộc họ AP2/ERF được điều khiển qua cả 2 con đường phụ
thuộc ABA và không phụ thuộc ABA. APETALA2/ethylene response
element - binding protein (AP2/EREBP) là họ yếu tố phiên mã chính trong
các họ yếu tố phiên mã ở A.thaliana, gồm 147 gen, chiếm 9% các yếu tố
phiên mã [17]. Ở thực vật bậc cao, có gần 200 gen yếu tố phiên mã AP2 đã
được báo cáo. Các AP2/EREBP được đặc trưng bởi sự có mặt của
DNAbinding domain, được gọi là AP2 domain, chứa khoảng 68 amino acid
[21], [35]. Dựa vào sự có mặt của một hoặc hai AP2 – DNA - binding
domain, họ gen này được chia thành 4 phân họ: AP2, DREB, ERF, RAV.
Phân họ AP2 mã hóa cho các protein có hai AP2 domain và các protein này

liên quan đến các quá trình sinh trưởng như phát triển các mô phân sinh, các
bào quan và sự phát triển hoa. Các phân họ DREB (dehydration - responsive
element binding), ERF (ethylene - responsive factor) và RAV (related to
ABI3/VP1) mã hóa cho các protein chứa một AP2 domain và các thành viên
trong phân họ gen này liên quan đến hệ thống truyền tín hiệu [20], [39].
1.3.2. Tính chịu nóng
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng chống chịu của
thực vật trước các điều kiện phi sinh học. Nhiệt độ cao, hạn và nồng độ muối


12

cao là những yếu tố gây hại lớn nhất, ảnh hưởng nghiêm trọng đến thực vật.
Nhiệt độ cao ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc protein, màng sinh chất và làm
ngừng các quá trình quang hợp, hô hấp nội bào và thậm chí có thể gây chết tế
bào hàng loạt [16].
Khi gặp điều kiện nhiệt độ cao sẽ gây nên sự đông kết protein dẫn đến
sự tổn hại nguyên sinh chất. Trước hết nhiệt độ cao phá hủy cấu trúc của các
bào quan của tế bào và các cơ quan của cây. Ty thể, lục lạp đều bị tổn thương
nặng ảnh hưởng đến chức năng hô hấp và quang hợp. Lá bị cháy làm giảm
khả năng quang hợp. Trên ngưỡng nhiệt sinh lý quang hợp không thể bù đủ
lượng cơ chất cho hô hấp, dẫn đến dự trữ gluxit giảm. Do vậy, sự mất cân
bằng giữa hô hấp và quang hợp là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây
hại cây trong điều kiện nhiệt độ cao [19].
Nhiệt độ cao làm giảm tính bền vững của protein. Khi nhiệt độ cao tính
lỏng quá cao làm thay đổi cấu trúc của màng, làm cho màng mất chức năng
sinh lý để ngoại thấm các ion ra ngoại bào. Nhiệt độ cao kích thích quá trình
phân hủy các chất, đặc biệt là protein. Khi protein bị phân hủy mạnh, sản
phẩm tích tụ nhiều trong tế bào là NH3 gây độc cho tế bào. Nhiệt độ cao cũng
làm giảm axit hữu cơ và nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng khác do bị phân

hủy. Đặc biệt, nhiệt độ cao làm cho hô hấp mạnh nhưng sự tích lũy ATP
qua quá trình photphoryl hóa bị hạn chế nên phần lớn nhiệt thải ra trong hô
hấp ở dạng nhiệt làm tăng nhiệt đô nội bào làm cho tế bào bị tổn thương và
có thể bị chết [19].
Có nhiều kiểu phản ứng tự vệ đặc trưng của thực vật thích nghi với
điều kiện nhiệt độ cao. Đối với thực vật hạn sinh chịu nóng thì hình thực phổ
biến là tăng cường thoát hơi nước kèm theo đó tăng hút nước để điều hòa nội
nhiệt của cơ thể. Với cây mọng nước chịu nóng nhờ thay đổi đặc tính về cấu
trúc nguyên sinh chất. Các nhóm cây có hàm lượng các phức hợp


13

nucleoprotein, lipoprotein cao và bền vững giúp cây chịu được nhiệt độ cao.
Đặc biệt ở nhóm cây này có khả năng tổng hợp protein sốc nhiệt (SHPs)
mạnh hàm lượng SHPs cao nên khả năng chịu nhiệt rất cao do các loại protein
này có thể chịu được nhiệt độ cao [1].
1.3.3 Tính chịu lạnh
Đối với thực vật, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hình thái, chức năng sinh
lý và khả năng sinh sản. Nhiệt độ thấp có ảnh hưởng đến hình thái củacây.
Parlovscaia

(1948)

đã

làm

thí

nghiệm

với

cây

Cốc-xa-ghi

(Taraxacumkoksaghyz) thấy rằng trong điều kiện ánh sáng và độ ẩm
giống nhau, nếu để cây ở nhiệt độ 6oC lá xẻ thuỳ sâu, ở nhiệt độ 15 -18oC
lá không xẻ thuỳ sâu nhưng mép lá có răng cưa nhỏ. Những thí nghiệm đối
với một số cây ăn quả vùng ôn đới như táo, lê cho thấy khi nhiệt độ xuống
thấp rễ cây có màu trắng, ít hóa gỗ, mô sơ cấp phân hóa chậm, ở nhiệt độ cực
thích rễ có màu, tầng phát sinh hoạt động mạnh tạo nhiều gỗ, bó mạch dài
[42].
Ở những vùng ôn đới về mùa đông cây có hiện tượng rụng lá nhờ đó
hạn chế diện tích tiếp xúc với không khí lạnh; cây hình thành nên các vảy bảo
vệ chồi, các lớp bần phát triển để cách nhiệt.
Ở nhiệt độ 0oC cây nhiệt đới ngừng quang hợp vì diệp lục bị biến dạng.
Các cây ôn đới có khả năng hoạt động trong điều kiện nhiệt độ thấp hơn 0oC,
một số loài tùng, bách mầm cây vẫn hô hấp khi nhiệt độ xuống -22oC. Khi
nhiệt độ thấp, độ nhớt của nguyên sinh chất tăng lên, áp suất thấm lọc giảm
nên rễ hút nước khó khăn không đủ cung cấp cho cây, để thích nghi trong
điều kiện này cây tiến hành rụng lá. Những cây chịu được nhiệt độ thấp có độ
nhớt giảm, trao đổi chất mạnh, các quá trình tổng hợp, nhất là tổng hợp
protein xảy ra mạnh hơn cây không chịu nhiệt độ thấp [36].
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình sống của thực vật.Trong những
giai đoạn phát triển cá thể khác nhau, nhu cầu nhiệt độ cũng khác nhau.

14

Chẳng hạn như ở giai đoạn nảy mầm, hạt cần nhiệt độ thấp hơn thời kỳ nở
hoa, vào thời kỳ quả chín đòi hỏi nhiệt độ cao hơn cả. Khả năng chịu đựng
nhiệt độ bất lợi ở các bộ phận của thực vật không giống nhau. Lá là cơ quan
tiếp xúc nhiều và trực tiếp với không khí, do đó chịu đựng được sự thay đổi
về nhiệt độ thấp [38].
1.4. Ảnh hưởng của stress nóng, hạn, lạnh đến cây trồng
1.4.1. Ảnh hưởng của stress nóng
Sự có mặt và phồn thịnh của thực vật ở một nơi nào đó, thường phụ
thuộc vào cả tổ hợp các điều kiện. Nhiệt độ và độ ẩm là 2 yếu tố giới hạn, tùy
thuộc vào khả năng năng chống chịu của sinh vật mà biên bộ giới hạn rộng
hay hẹp [22].
Trong tự nhiên thực vật chỉ tồn tại trong giới hạn nhiệt độ nhất định,
giới hạn nhiệt độ thích hợp với đa số thực vật thay đổi từ 1oC đến 45oC. Tuy
nhiên cũng có những loài thực vật có khả năng duy trì hoạt động sống của
mình vượt qua giới hạn nhiệt độ bình thường nhưng số này không nhiều.
Nhiệt độ cao gây nên sự đông kết protein dẫn đến sự tổn hại nguyên sinh chất.
Đa số cây không chịu được nhiệt độ trên 50oC kéo dài. Trước hết nhiệt độ cao
phá hủy các cấu trúc của các bào quan của tế bào và của các cơ quan của cây.
Ty thể, lục lạp đều bị tổn thương nặng ảnh hưởng đến chức năng hô hấp và
quang hợp. Lá cây bị cháy sém giảm khả năng quang hợp và thoát hơi nước.
Khi gặp nhiệt độ cao cả quang hợp lẫn hô hấp đều bị ảnh hưởng. Khi nhiệt độ
tăng mạnh cường độ quang hợp giảm mạnh hơn tốc độ hô hấp. Trên ngưỡng
nhiệt sinh lý quang hợp không thể bù đủ lượng cơ chất cho hô hấp, do vậy dự
trữ gluxit sẽ giảm. Do vậy, sự mất cân bằng giữa hô hấp và quang hợp là một
trong những nguyên nhân chủ yếu gây hại cho cây của nhiệt độ cao. Nhiệt độ
cao làm giảm tính bền vững của màng và protein. Khi nhiệt độ cao tính lỏng
quá cao làm thay đổi cấu trúc của màng, làm cho màng mất các chức năng

15

sinh lý, để ngoại thấm các ion ra ngoại bào. Nhiệt độ cao kích thích quá trình
phân hủy mạnh sản phẩm tích tụ nhiều trong tế bào là NH3 gây độc cho tế
bào. Nhiệt độ cao cũng làm giảm axit hữu cơ và nhiều hợp chất hữu cơ quan
trọng khác do bị phân hủy. Đặc biệt, nhiệt độ cao làm cho hô hấp mạnh nhưng
sự tích lũy năng lượng vào ATP qua quá trình photphoryl hóa bị hạn chế nên
phần lớn nhiệt thải ra trong hô hấp ở dạng nhiệt làm tăng nhiệt nội bào làm
cho tế bài bị tổn thương và có thể bị chết [26].
1.4.2. Ảnh hưởng của hạn
Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và hấp thu nước: Đáp ứng đầu tiên
của thực vật đối với điều kiện bất lợi gây ra bởi hạn là ngừng sinh trưởng. Sự
hạn chế sinh trưởng của chồi trong điều kiện hạn làm giảm nhu cầu trao đổi
chất của thực vật và kích thích các quá trình sinh tổng hợp các hợp chất bảo
vệ, điều chỉnh thẩm thấu [22]. Ngoài ra, để đáp ứng với điều kiện hạn hán,
thực vật hạn chế sự phát triển rễ bên, thúc đẩy sự sinh trưởng của rễ chính,
giúp tăng cường khả năng hấp thu nước từ các tầng đất sâu hơn [45].
Nước trong tế bào bị giảm do thiếu hụt nước từ rễ lên lá, gây ra bởi sự
đóng khí khổng. Quá trình dẫn truyền nước trong cây giảm làm giảm nhu cầu
dinh dưỡng của chồi, nó cũng cản trở sự dẫn truyền trong mạch gỗ và có thể
hình thành một đáp ứng thích nghi. Điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một cách
đối phó với hạn của thực vật. Sự tổng hợp các chất tan như polyol và proline
trong điều kiện bất lợi giúp thực vật ngăn chặn sự mất nước và các chất này
đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sức trương của tế bào [11]. Sự thay
đổi trong sinh trưởng cùng với việc giảm hoạt động của cơ quan quang hợp
do sự tiếp xúc với điều kiện bất lợi trước đó dẫn đến sự biến đổi trong sự phân
chia nguồn carbon giữa các tế bào/mô sản xuất và tế bào/mô tích trữ (source
and sink tissue) [12]. Vì vậy, các phân tử carbohydrate cung cấp cho quá trình
sinh trưởng trong điều kiện bình thường bây giờ được dùng cho sinh trưởng rễ

hoặc để tổng hợp các chất điều chỉnh thẩm thấu [45].


16

Ảnh hưởng của hạn đến hô hấp nội bào: Sinh trưởng của thực vật được
xác định bởi hệ số hô hấp, là tỷ lệ giữa CO2 được đồng hóa trong quang hợp
và CO2thải ra trong quá trình hô hấp. Hệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các
quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp – ATP, nước và các chất tan
được hấp thu bởi rễ, sự vận chuyển của các sản phẩm đến các mô dự trữ,
NADH và chu kỳ TCA trung gian (quá trình sinh tổng hợp trong quá trình
phát triển của thực vật). Trong điều kiện hạn, các quá trình này bị ảnh hưởng
và dẫn đến sự tăng cường hô hấp. Bên cạnh đó, sự tăng cường hô hấp cũng là
do sự kích hoạt các quá trình đòi hỏi nhiều năng lượng như tổng hợp các chất
điều chỉnh thẩm thấu và chống oxi hóa xảy ra trong điều kiện hạn [10].
Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp: Sự thiếu hụt nước làm khí khổng
đóng lại. Điều này làm giảm hàm lượng carbon dioxide trong mô lá và cản trở
quá trình quang hợp. Sự hạn chế carbon dioxide do kéo dài thời gian đóng khí
khổng trong điều kiện bất lợi dẫn đến sự tích lũy các hợp chất làm giảm khả
năng vận chuyển electron, điều này có thể làm giảm các phân tử oxy và tăng
cường các dạng ROS (reactive oxygen species). ROS là các phân tử hóa học
chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp vỏ ngoài cùng như superoxide,
hydropeoxide, hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gây tác
động trực tiếp đến các phân tử lớn như axit nucleic (DNA và RNA), protein
và lipid. Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu trúc và cơ chế
tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai hỏng
hoặc mất chức năng, thậm chí gây chết tế bào [31].
1.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lạnh
Nhiệt độ thấp ức chế sự hút nước của hệ rễ và sự vận chuyển nước của
hệ mạch. Đồng thời nhiệt độ thấp cũng gây ức chế quang hợp của lá, làm

giảm hô hấp, ức chế các quá trình tổng hợp nhất là tổng hợp protein do các
enzim hoạt động yếu. Ở nhiệt độ thấp màng nguyên sinh chất bị tổn hại làm