LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thiết bị, hóa chất, vật liệu
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
-

Máy điện biến nạp (BTX ECM 399)

-

Máy gel doc (Biorad)

-

Máy ủ heat block techne (Dri-block DB-2D)

-

Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf)

-

Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5415R (Rppendorf) 13200 max

-

Máy PCR (MasterCycler gradient) (Eppendorf)

-

Vortex (Vortex-2genie, Jencons-PLS)

-

Bộ điện di DNA Power Pac200 (Biorad)

-

Máy đo quang phổ

-

Tủ ủ 37 oC

-

Tủ ủ lắc

-

Bể điều nhiệt

-

Tủ đông sâu -80 oC

-

Tủ lạnh -20 oC

-

Tủ mát 4oC

-

Cân phân tích

-

Eppendorf 1.5 ml; 0.2 ml

-

Cuvette 2 ml; 0,2 ml

-

Và các dụng cụ chuyên dùng khác

2.1.2. Hóa chất
2.1.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết plasmid
-

Bộ kít tách chiết plasmid của Qiagen

2.1.2.2. Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm PCR

Trang 15


Trần Thị Thanh Thanh

-

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR của Qiagen

2.1.2.3. Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose
-

Bộ kít tách chiết DNA từ gel agarose của Qiagen

2.1.2.4. Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn
Các enzyme cắt giới hạn được cung cấp bởi Biolab: SalI, EcoRI,
BamHI, XbaI, BglII. Các thành phần của phản ứng cắt được sử dụng theo
hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.1.2.5. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR
Các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR được cung cấp bởi
Fermentas: Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X. Thành
phần phản ứng PCR được liệt kê trong Bảng 2.1
Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR.
Thể tích cho 1 phản ứng

Thành phần

Nồng độ cuối

Taq buffer 10X

1X

2,5 l

MgCl2 25 mM

1 mM

1 l

dNTPs 25 mM

0.2 mM

0,2 l

Taq polymerase 5 U/l

0.04 U

0,2 l

Mồi xuôi 10 mM

0.2 mM

0,5 l

Mồi ngược 10 mM

0.2 mM

0,5 l

(V = 25 µl)

19,1 l

H2 O
2.1.2.6. Hóa chất dùng cho điện di DNA

Agarose (BioLab), Tris base (Promega), Acid acetic (Merck), Bromophenol
blue (Merck), Ethidium Bromide (Merck).

Trang 16


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.1.2.7. Thang DNA
Thang DNA được cung cấp bởi Fermentas bao gồm:
-

Thang DNA 100 bp

-

Thang DNA 1 kb

-

Thang DNA 1 kb plus

(a)

(b)

(c)

Hình 2.1. Thang DNA
(a): Thang DNA 100 bp; (b): Thang DNA 1 kb; (c): Thang DNA 1 kb plus
2.1.2.8. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp hóa
biến nạp
- Glycerol 10%
- CaCl2 1M
2.1.2.9. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp điện
biến nạp
- Glycerol 10%
- Nước cất vô trùng

Trang 17


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.1.3. Môi trường
2.1.3.1. Môi trường LB (Luria Bertami)
Trypton

10 g

Yeast extract

5g

NaCl

10 g

Nước cất đủ

1000 ml

2.1.3.2. Môi trường BHI (Brain Heart Infusion)
BHI (Merk)

37 g

Nước cất đủ

1000 ml

Môi trường thạch có thành phần như môi trường lỏng bổ sung thêm 1,5%

agar. Các loại kháng sinh dùng để chọn lọc gồm: colistin, ampicillin,
kanamycin được bổ sung vào môi trường với nồng độ cuối là 50 µg/ml. X gal được sử dụng ở nồng độ cuối là 40 µg/ml.
2.1.4. Chủng vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài được cung cấp bởi Trung
tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm:
-

Chủng Edwardseilla ictaluri hoang dại S7

-

Chủng Escherichia coli: E.coli DH5α; E. coli DH5α λpir; E. coli SM10
λpir

2.1.5. plasmid
2.1.5.1. Plasmid pKD4
-

Kích thước 3267 bp.

-

Mang trình tự khởi đầu sao chép ori6K gamma.

-

Mang gen kháng ampicillin và gen kháng kanamycin nằm giữa hai trình
tự FRT.

-

Được sử dụng để tạo cassette 1 STEP.

Trang 18


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 2.2. Plasmid pKD4
2.1.5.2. Plasmid pCAMBIA 1300
-

Kích thước 8958 bp.

-

Mang gen kháng kanamycin.

-

Được sử dụng làm bản mẫu để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin
dùng trong thiết kế cassette.

Hình 2.3. Plasmid pCAMBIA 1300

Trang 19

Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.1.5.3. Plasmid pGEM-T Easy
-

Kích thước 3015 bp.

-

Có gắn thêm T ở vị trí nối gen chèn giúp tăng hiệu quả nối.

-

Mang gen kháng ampicillin và trình tự khởi đầu sao chép f1 ori.

-

Mang gen lacZ mã hóa cho tiểu phần α của β galactosidase giúp chọn
lọc những khuẩn lạc có gen chèn dựa trên sự chọn lọc màu sắc trắng/
xanh của khuẩn lạc.

-

Plasmid pGEM-T Easy được sử dụng để nhân dòng.

Hình 2.4. Plasmid pGEM-T Easy
2.1.5.4. Plasmid pJET1.2/blunt
-

Kích thước 2974 bp.

-

Mang gen kháng ampicillin giúp cho sự chọn lọc khuẩn lạc chứa
plasmid.

-

Mang gen gây độc eco47IR giúp cho sự chọn lọc những khuẩn lạc có
gen chèn.

-

Plasmid đầu bằng cho phép gắn chèn đoạn DNA dạng đầu bằng.

-

Plasmid pJET1.2/blunt được sử dụng để nhân dòng.

Trang 20


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 2.5. Plasmid pJET1.2/blunt
2.1.5.5. Plasmid pKD46

-

Kích thước 6329 bp.

-

Mang gen kháng kanamycin.

-

Mang hai trình tự khởi đầu sao chép repA101ts và oriR101. Sự khởi
đầu sao chép repA101ts nhạy cảm với nhiệt độ, do đó plasmid không
nhân lên được ở 37oC – 42oC.

-

Mang các gen exo, bet và gam mã hóa cho hệ thống tái tổ hợp λ Red
được điều khiển bởi promoter ParaB. Promoter ParaB tăng cường sản xuất
λ Red khi có arabinose.

-

Mang gen kháng ampicillin.

-

Sử dụng plasmid pKD46 biến nạp vào E. ictaluri để tận dụng hệ thống
tái tổ hợp λ Red.

Trang 21

Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 2.6. Plasmid pKD46.
2.1.5.6. Plasmid pGP704
-

Kích thước 3705 bp.

-

Mang trình tự khởi đầu sao chép oriR6K, cần phải có protein π do gen
pir mã hóa mới nhân lên được. Do đó, plasmid chỉ được duy trì trong
những chủng có gen pir như E. coli DH5α λpir; E. coli SM10 λ pir.

-

Mang gen kháng ampicillin.

Hình 2.7. Plasmid pGP704

Trang 22


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen wzz của E. ictaluri
2.2.1.1. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự gen wzz của E. ictaluri (NC_012779) từ ngân hàng gen
NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi WF1/WR1 để khuyếch đại gen wzz kích thước
1038 bp. Mồi WF1 mang trình tự nhận biết của SalI, mồi WR1 mang trình tự nhận
biết của EcoRI và có trình tự như sau:
WF1: 5’-GTCGACATGGTGAGTCAAAATCCGATGC-3’
WR1: 5’-GAATTCTCAGATCCGTGCACGACG-3’
2.2.1.2. Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E. ictaluri
Ly trích DNA bộ gen E. ictaluri theo quy trình sau:
-

Cấy 1 khuẩn lạc E. ictaluri vào 5 ml môi trường BHI colistin, nuôi cấy lắc
250 vòng/phút, 28oC, 16 giờ.

-

Li tâm 3 ml dịch nuôi cấy ở 6000 vòng/phút, 5 phút.

-

Bỏ dịch nổi, lấy cặn.

-

Hòa tan cặn vào 1 ml nước cất vô trùng.

-

Ly tâm 6000 vòng/phút, 5 phút.

-

Bỏ dịch nổi, thu cặn.

-

Bổ sung 200 µl TE 1X vô trùng, hòa tan cặn.

-

Ủ 950C, 10 phút.

-

Ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút.

-

Thu dịch nổi, bảo quản - 20oC.
DNA bộ gen E. ictaluri được sử dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR

khuếch đại đoạn gen wzz bằng cặp mồi WF1/WR1. Sản phẩm PCR được tinh sạch
qua cột để dòng hóa.

Trang 23

Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.2.1.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy mang đoạn
gen wzz (pGEMT::wzz)
Taq

DNA

polymerase

có

hoạt

tính

terminal

transferase,

thêm

deoxyadenosine (A) vào đầu 3’ của sản phẩm PCR. Hệ thống vector pGEM-T Easy
được thiết kế mang một thymidine (T) ở đầu 3’của cả hai bên. T nhô ra ở vị trí gắn
tăng hiệu quả của quá trình nối bằng cách ngăn chặn việc tự đóng vòng của vector
và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR. Nhờ vậy, phản
ứng nối xảy ra dễ dàng. Thành phần phản ứng nối như sau:
2X buffer

5l

Sản phẩm PCR

3l

pGEM-T Easy

1l

DNA T4 ligase

1l

Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
2.2.1.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp hóa
biến nạp
Các tế bào E. coli được phát triển ở pha log. Tế bào thu được bằng cách li
tâm và huyền phù tế bào trong dung dịch có chứa CaCl2, tế bào có khả năng kết
dính DNA (khả nạp). Trộn DNA vào dung dịch đệm phosphate với CaCl2 tạo ra
phức hợp calcium-phosphate-DNA dính chặt vào màng tế bào và đi vào tế bào chất
nhờ hiện tượng thực bào. Các tế bào phát triển trên môi trường không chọn lọc, cho
phép tổng hợp protein kháng kháng sinh, sau đó được nuôi trên môi trường chứa
kháng sinh cho phép xác định các khuẩn lạc chứa plasmid.
Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp được tiến hành như sau:
-

Cấy 1 khuẩn lạc E. coli vào 5 ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy qua đêm ở
điều kiện lắc 250 vòng/phút, 37oC.

-

Cấy chuyền 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy
lắc 250 vòng/phút, 37oC cho đến khi giá trị OD590 của dịch nuôi cấy đạt
khoảng 0.375 (không được để OD590 quá 0.4).

Trang 24


Trần Thị Thanh Thanh

-

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh. Ngâm trong nước đá 5 - 10
phút.

Tất cả các bước tiếp theo phải thực hiện trong đá lạnh.
-

Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 3000 vòng/phút, 7 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.

-

Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Ly tâm
2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.

-

Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Để trên
đá trong 30 phút. Ly tâm 2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.

-

Huyền phù sinh khối trong 2 ml dung dịch CaCl2 0,1 M. Bổ sung 2 ml
glycerol lạnh 50% để đạt nồng độ glycerol cuối cùng là 10%.

-

Chia lượng nhỏ 100 µl vào tube 1,5 ml và làm lạnh nhanh trong ethanol 100o
ở - 80oC.
2.2.1.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz vào E. coli DH5α

-

Trộn đều, nhẹ nhàng 10 l phản ứng nối (ở bước 2.2.1.3) vào 100 µl tế bào
E. coli khả nạp. Giữ trong bể đá 10 phút.

-

Chuyển nhanh dịch tế bào trên vào bể ổn nhiệt 42oC trong 2 phút.

-

Nhanh chóng chuyển dịch tế bào vào bể đá trong 1 – 2 phút.

-

Cho vào 250 µl môi trường LB. Nuôi cấy lắc ở 37oC, 1 giờ.

-

Lấy 100 µl trãi trên môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và X – gal
(40 µg/ml).

-

Ủ ở 37oC, qua đêm.
2.2.1.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
Vector pGEM-T Easy chứa gen lacZα mã hóa cho tiểu phẩn α của enzyme β-

galactosidase. Vùng MCS nằm trong gen lacZα giúp chọn lọc vector có gen chèn
dựa vào màu sắc trắng/xanh của khuẩn lạc. Các tế bào E. coli biến nạp được sàng
lọc trên môi trường LB – amp – Xgal. Khuẩn lạc chứa vector có gen chèn có màu
trắng. Khuẩn lạc chứa vector không có gen chèn có màu xanh.

Trang 25


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Lựa chọn các khuẩn lạc có màu trắng để kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen
wzz bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi M13F/M13R. Cặp mồi
M13F/M13R nằm hai bên MCS của vector pGEM-T Easy cho phép xác định đoạn
gen wzz có được chèn vào hay không. Cặp mồi có trình tự như sau:
M13F: 5’- GTTTTCCCAGTCACGAC - 3’

M13R: 5’ – AACAGCTATGACCATG - 3’
2.2.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽ được nuôi cấy để
tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
-

Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.

-

Phản ứng cắt giới hạn với SalI và EcoRI để kiểm tra sự hiện diện của gen wzz
trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau:
Plasmid pGEM-T::wzz

10 µl

NE Buffer 2 (10 X)

3 µl

SalI (20 U/µl)

1 µl

EcoRI (20 U/µl)

1 µl

H2 O

15 µl

2.2.1.8. Giải trình tự gen wzz
Plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz sau khi đã kiểm tra bằng phản ứng PCR và
phản ứng cắt được dùng để giải trình tự gen wzz bằng các cặp mồi M13F/M13R;
WFsq/WRsq. Cặp mồi WFsq/WRsq có trình tự như sau:
WFsq: 5’-CTGCGTAGCCCCTATTATCAGC-3’
WRsq: 5’-TGAAACGCCGCGTCCAAAACC-3’

Trang 26


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.2.2. Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46
2.2.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri bằng phương pháp điện biến nạp
Sử dụng điện trường mạnh trong một thời gian ngắn sẽ làm tạm thời mất tính
ổn định của màng tế bào. Khi đó, màng tế bào có khả năng thấm cao đối với các
phân tử hiện diện trong môi trường xung quanh. Nhờ vậy mà DNA hoặc RNA có
thể được chuyển vào tế bào.
Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri được tiến hành như sau:
-

Cấy 1 khuẩn lạc E. ictaluri vào 5 ml môi trường BHI lỏng. Nuôi cấy qua
đêm ở điều kiện lắc 250 vòng/phút, 28oC.

-

Cấy chuyền 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trường BHI lỏng. Nuôi cấy
lắc 250 vòng/phút, 28oC cho đến khi OD600 đạt khoảng 0,8 – 1.0.

-

Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh. Ngâm trong nước đá 10
phút.

Các thao thác tiếp theo được thực hiện trong đá lạnh
-

Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 4000 vòng/phút, 15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi.

-

Huyền phù sinh khối tế bào trong trong 50 ml nước lạnh. Ly tâm 4000
vòng/phút, 15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi.

-

Huyền phù sinh khối trong 50 ml glycerol lạnh 10%. Ly tâm 4000 vòng/phút,
15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi. (bước này được lặp lại 2 lần).

-

Huyền phù sinh khối trong 2 ml glycerol lạnh 10% . Sau đó, chia 100 µl dịch
tế bào vào mỗi tube 1,5 ml. Sử dụng để biến nạp ngay hoặc làm lạnh nhanh
trong ethanol 100o và bảo quản ở - 80 oC.
2.2.2.2. Biến nạp plasmid pKD46 vào E. ictaluri.

-

Trộn 100 ng plasmid pKD46 vào 100 µl tế bào E. ictaluri khả nạp. Khuấy
nhẹ bằng đầu tip. Ủ trên đá 20 phút.

-

Chuyển toàn bộ dịch tế bào vào cuvette lạnh, lắc nhẹ để các tế bào lắng
xuống dưới đáy.

Trang 27


Trần Thị Thanh Thanh

-

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Đặt cuvette vào máy điện biến nạp. Chỉnh máy điện biến nạp ở mức 2500V.
Nhấn nút start và giữ 5 ms.

-

Sau đó cho ngay 1ml môi trường BHI vào cuvette, trộn đều và chuyển dịch
tế bào sang 1 tube mới.

-

Nuôi cấy lắc 100 vòng/phút, 28oC, 45 phút.

-

Trãi dịch tế bào lên môi trường BHI chứa ampicillin (50 µg/ml), colistin (50
µg/ml). Ủ ở 28oC trong 48 – 72 giờ.
2.2.2.3. Kiểm tra dòng tế bào E. ictaluri mang pKD6 bằng phản ứng cắt
giới hạn
Các khuẩn lạc mọc trên môi trường BHI – ampcillin – colistin được nuôi cấy

để tách plamid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn với EcoRI.
Thành phần phản ứng cắt như sau:
Plasmid kiểm tra

10 µl

NE Buffer 2 (10 X)

3 µl

EcoRI (20 U/µl)

1 µl

H2 O

16 µl

Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ.
2.2.2.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri mang plasmid pKD46 bằng
phương pháp điện biến nạp

Plasmid pKD46 sản xuất enzyme tái tổ hợp λ Red. Quá trình sản xuất λ Red
được tăng cường khi có L – arabinose. Do đó, trong quá trình chuẩn bị tế bào khả
nạp E. ictaluri::pKD46, L – arabinose được bổ sung để tăng cường sự sản xuất
enzyme tái tổ hợp.
Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp giống như trong mục 2.2.2.1. Tuy nhiên,
trong quá trình nuôi cấy thu sinh khối có bổ sung L – arabinose đến nồng độ cuối là
10 mM. Tế bào khả nạp được sử dụng liền để không mất hoạt tính của enyme tái tổ
hợp λ red.

Trang 28


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.2.3. Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP
Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP được tiến hành như trong
Sơ đồ 2.1.

Sơ đồ 2.1. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP
2.2.3.1. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự plasmid pKD4 (AY048743.1) và trình tự 2 bên đoạn gen
wzz của E. ictaluri trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi F1/R1 để
tạo cassette 1 STEP chứa gen kháng kamamycin ở giữa với hai đầu là 2 trình tự
tương đồng trên E. ictaluri. Mồi F1 bao gồm đoạn P1 là priming site 1 của pKD4 và
đoạn H1 (50 bp) nằm bên trái gen wzz. Mồi R1 bao gồm đoạn P2 là priming site 2

Trang 29

Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

của pKD4 và đoạn H2 (50 bp) nằm bên phải gen wzz. Cặp mồi F1/R1 có trình tự
như sau:
F1: 5’CGACAGGCATACATGTCTAACGGCCCTAGTCGGCCATAA
AGGGAAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’
R1: 5’GCCCGCTGGCACGGATCGGCCAATTCCCTGTTAAGCGTT
AACGCTGGCGCATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’
2.2.3.2. Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP
Thực hiện phản ứng PCR trên bản mẫu là pKD4 với cặp mồi F1/R1để tạo
cassette 1 STEP. Sản phẩm PCR có kích thước 1595 bp được điện di kiểm tra trên
gel agarose 1%. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch qua cột và sử dụng để biến
nạp vào E. ictaluri::pKD46.
2.2.3.3. Biến nạp cassette 1 STEP vào E. ictaluri mang pKD46
-

Trộn 100 ng sản phẩm PCR vào 100 µl tế bào E. ictaluri::pKD46 khả nạp
vừa mới chuẩn bị. Khuấy nhẹ bằng đầu tip. Ủ trên đá 20 phút.

-

Chuyển toàn bộ dịch tế bào vào cuvette lạnh, lắc nhẹ để các tế bào lắng
xuống dưới đáy.

-

Đặt cuvette vào máy điện biến nạp. Chỉnh máy điện biến nạp ở mức 2500V.

Nhấn nút start và giữ 5 ms.

-

Sau đó cho ngay 1ml môi trường BHI vào cuvette, trộn đều và chuyển dịch
tế bào sang 1 tube mới.

-

Nuôi cấy lắc ở 100 vòng/phút, 28oC, 45 phút.

-

Trãi dịch tế bào lên môi trường BHI chứa colistin (50 µg/ml), kanamycin (50
µg/ml). Ủ ở 28oC trong 36 – 48 giờ.

2.2.4. Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP
Độ dài trình tự tương đồng cần thiết để xảy ra tái tổ hợp là khác nhau ở mỗi
loài vi khuẩn. Đối với E. coli, Shigella, Yersinia …chỉ cần trình tự 50 nucleotide
tương đồng là đủ để xảy ra sự tái tổ hợp. Tuy nhiên, nhiều loài vi khuẩn khác như
Y.pseudomonas, Vibrio cholerae… đòi hỏi phải có trình tự đoạn tương đồng dài hơn

Trang 30


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

mới có thể xảy ra tái tổ hợp tương đồng. Do đó, bên cạnh cassette 1 STEP có đoạn

tương đồng 50 nucleotide, chúng tôi thiết kế cassette 2 STEP với trình tự tương đồng
dài hơn (400 nucleotide). Sử dụng phương pháp 2 STEP PCR để tạo cassette 2 STEP.
Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP được tiến hành như
trong Sơ đồ 2.2.

Sơ đồ 2.2. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 2 STEP

Trang 31


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.2.4.1. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự gen wzz trên ngân hàng gen, chúng tôi thiết kế cặp mồi
WF1/WR2 để khuếch đại đoạn đầu của gen wzz (W1, kích thước 388 bp) và cặp
mồi WF2/WR1 để khuếch đại đoạn cuối của gen wzz (W2, kích thước 405 bp).
WF2 và WR2 được thiết kế gắn thêm trình tự FRT 34 nucleotide giúp loại bỏ gen
kháng kanamycin ở những bước tiếp theo của đề tài. Cặp mồi có trình tự như sau:
WF2: 5’GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGG
CACAGGCGATCTATCAGC-3’
WR2: 5’GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGC
ACTCCCCTCTTTATGACG-3’
Dựa vào trình tự gen kháng kanamycin của pKD4 trên ngân hàng gen, chúng
tôi thiết kế cặp mồi KF/KR để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin. KF và KR
cũng được gắn thêm trình tự FRT như trên. Sản phẩm PCR (Km) có kích thước 863
bp. Cặp mồi có trình tự như sau:
KF: 5’-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCATGATTG
AACAAGATGGATTGC-3’

KR: 5’- GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTCAGAA
GAACTCGTCAAGAAGG-3’
2.2.4.2. Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP
Để tạo cassette 2 STEP, chúng tôi tiến hành 2 bước phản ứng PCR (2 step
PCR). Đầu tiên chúng tôi tiến hành 3 phản ứng PCR để thu các đoạn W1, W2 và
Km.
-

Phản ứng PCR sử dụng DNA E. ictaluri làm bản mẫu với cặp mồi
WF1/WR2 để khuếch đại đoạn W1.

-

Phản ứng PCR sử dụng DNA E. ictaluri làm bản mẫu với cặp mồi
WF2/WR1 để khuếch đại đoạn W2.

-

Phản ứng PCR sử dụng pKD4 làm bản mẫu với cặp mồi KF, KR để khuếch
đại đoạn Km.

Trang 32


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Sau khi thu được các sản phẩm PCR lần 1, tiến hành đo nồng độ và trộn
chung 3 đoạn (0,3 pmol mỗi đoạn) để làm bản mẫu cho phản ứng PCR lần 2. Phản

ứng PCR lần 2 sử dụng cặp mồi WF1/WR1 cho sản phẩm 2 STEP kích thước 1668
bp.
2.2.4.3. Biến nạp cassette 2 STEP vào E. ictaluri mang pKD46
Các bước biến nạp cassette 2 STEP được thực hiện như đối với cassette 1 STEP
trong mục 2.2.3.3.

Trang 33


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.2.5. Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704
Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704
được tiến hành như trong Sơ đồ 2.3.

Sơ đồ 2.3. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp sử dụng
suicide plasmid pGP704

Trang 34


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.2.5.1. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn
đầu của gen wzz
a. Thiết kế mồi

Dựa vào trình tự của gen wzz trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế
cặp mồi FHwzz/RHwzz để khuếch đại đoạn đầu của gen wzz (Hwzz, kích thước 388
bp). FHwzz có trình tự cắt của SalI, RHwzz có trình tự cắt của BamHI và có trình tự
như sau:
FHwzz: 5’-AAGTCGACATGGTGAGTCAAAATCCGATGC-3’
RHwzz: 5’-AAGGATCCGTGCACTCCCCTCTTTATGACG-3’
b. Khuếch đại và thu nhận đoạn Hwzz của E. ictaluri
DNA bộ gen E. ictaluri được ly trích như trong mục 2.2.1.2. và được sử
dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn Hwzz bằng cặp mồi
FHwzz/RHwzz. Sản phẩm PCR có kích thước 404 bp được tinh sạch qua cột để
dòng hóa.
c. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Hwzz
(pJET::Hwzz)
Vector pJET1.2/blunt là vector mạch thẳng đầu bằng. Vì vậy đoạn Hwzz
được chèn vào phải đầu bằng. Do đó, trước khi nối, phải thực hiện phản ứng cắt
đuôi A của sản phẩm PCR do Taq DNA polymerase thêm vào. Thành phần phản
ứng như sau:
2X buffer

10 l

Sản phẩm PCR

1 l

H2 O

6 l

DNA blunting enzyme

1 l

Trộn đều, nhẹ nhàng trong khoảng 30 giây và ủ ở 70oC trong 5 phút để bất
hoạt enzyme. Sau đó, để trên đá 1 phút và bổ sung các thành phần sau để tiếp tục
phản ứng nối:

Trang 35


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

pJET1.2/blunt

1 l

T4 ligase

1 l

Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
d. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp
Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 2.2.1.4.
e. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz vào E. coli DH5α
Biến nạp được thực hiện như trong mục 2.2.1.5. Tế bào biến nạp được trãi
trên môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và ủ ở 37oC trong 16 giờ.
f. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
Vector pJET1.2/blunt tự đóng vòng sẽ biểu hiện enzyme giới hạn gây chết

sau khi biến nạp và không nhân lên được. Kết quả là chỉ có các dòng tái tổ hợp xuất
hiện trên đĩa nuôi cấy (khuẩn lạc trắng). PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi
FpJET/RpJET để kiểm tra sự hiện diện của đoạn chèn Hwzz. Cặp mồi được thiết kế
hai bên trình tự MCS của pJET1.2/blunt và có trình tự như sau:
FpJET : 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3'
RpJET : 5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3'
g. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽ được nuôi cấy để
tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
-

Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.

-

Phản ứng cắt giới hạn với SalI và BamHI để kiểm tra sự hiện diện của Hwzz
trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau:
Plasmid pJET::Hwzz

10 µl

NE Buffer 2 (10 X)

3 µl

BamHI (20 U/µl)

1 µl

SalI (20 U/µl)

1 µl

H2 O

15 µl

Trang 36


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ.
h. Giải trình tự đoạn Hwzz
Plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz sau khi đã kiểm tra bằng phản ứng PCR và
phản ứng cắt được dùng để giải trình tự đoạn Hwzz bằng cặp mồi FpJET/RpJET.
2.2.5.2. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn
cuối của gen wzz
a. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự của gen wzz trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế
cặp mồi FTwzz/RTwzz để khuếch đại đoạn cuối của gen wzz (Twzz, kích thước 405
bp). FTwzz có trình tự cắt của BamHI, RTwzz có trình tự cắt của XbaI và có trình tự
như sau:
FTwzz : 5’-AAGGATCCGTGGCACAGGCGATCTATCAGC-3’
RTwzz : 5’-AATCTAGATCAGATCCGTGCACGACG-3’
b. Khuếch đại và thu nhận đoạn Twzz của E. ictaluri
DNA bộ gen E. ictaluri được ly trích như trong mục 2.2.1.2. và được sử
dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn Twzz bằng cặp mồi

FTwzz/RTwzz. Sản phẩm PCR có kích thước 421 bp được tinh sạch qua cột để dòng
hóa.
c. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Twzz
(pJET::Twzz)
Phản ứng nối được thực hiện như đối với đoạn Hwzz trong phần c của mục 2.2.5.1.
d. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp
Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 2.2.1.4.
e. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::Twzz vào E. coli DH5α
Biến nạp được thực hiện như trong mục 2.2.1.5. Tế bào biến nạp được trãi trên môi
trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và ủ ở 370C trong 16 giờ.
f. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc

Trang 37


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra đoạn Twzz chèn
vào vector.
g. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽ được nuôi cấy để
tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
-

Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.

-

Phản ứng cắt giới hạn với BamHI và XbaI để kiểm tra sự hiện diện của đoạn
Twzz trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau:
Plasmid pJET::Twzz

10 µl

NE Buffer 2 (10 X)

3 µl

BamHI (20 U/µl)

1 µl

XbaI (20 U/µl)

1 µl

H2 O

15 µl

Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ.
h. Giải trình tự đoạn Twzz
Plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz sau khi đã kiểm tra bằng phản ứng PCR và
phản ứng cắt được dùng để giải trình tự đoạn Hwzz bằng cặp mồi FpJET/RpJET.
2.2.5.3. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn
đầu (Hwzz) và đoạn cuối (Twzz) của gen wzz
a. Phản ứng cắt giới hạn
Phản ứng cắt giới hạn được thực hiện nhằm chuẩn bị DNA cho phản ứng nối

tạo plasmid tái tổ hợp pJET mang cả hai đoạn Hwzz và Twzz. Đầu tiên là phản ứng
cắt mở vòng plasmid pJET::Hwzz bằng enzyme BamHI và XbaI. Phản ứng cắt có
thành phần như sau:
Plasmid JET::Hwzz

10 µl

NE Buffer 2 (10 X)

3 µl

BamHI (20 U/µl)

1 µl

XbaI (20 U/µl)

1 µl

H2 O

15 µl

Trang 38


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ. Sau đó, sản phẩm cắt được
tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol 100o để chuẩn bị cho phản ứng nối.Tiếp
theo là phản ứng cắt plasmid pJET::Twzz cũng bằng enzyme BamHI và XbaI để thu
đoạn Twzz. Thành phần phản ứng cắt như sau:
Plasmid JET::Twzz

15 µl

1 X NE Buffer 2 (10 X)

5 µl

BamHI (20 U/ µl)

2 µl

XbaI (20 U/ µl)

2 µl

H2 O

26 µl

Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ. Đoạn Twzz được tinh sạch qua
gel agarose để chuẩn bị cho phản ứng nối.
b. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Hwzz
và Twzz (pJET::HTwzz)
Các sản phẩm cắt sau khi thu nhận được nối với nhau để tạo plasmid tái tổ
hợp pJET::HTwzz. Phản ứng nối có thành phần như sau:

Plasmid pJET::Hwzz mở vòng

3µl

Đoạn Twzz

10µl

T4 DNA ligase buffer (10X)

2µl

T4 DNA ligase (400 U/µl)

1µl

H2 O

4 µl

Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 45 phút.
c. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp
Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 2.2.1.4.
d. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::HTwzz vào E. coli DH5α
Biến nạp được thực hiện như trong mục 2.2.1.5. Tế bào biến nạp được trãi
trên môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và ủ ở 370C trong 16 giờ.
e. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc

Trang 39