Thẩm định phương pháp xét nghiệm trên máy sinh hóa tự động

THUYẾT MINH ĐỀ CƯƠNG ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ
1. Tên đề tài: Thẩm định phương pháp xét nghiệm trên máy hóa sinh tự động
Beckman Coulter AU680 tại Khoa xét nghiệm Bệnh viện 74 trung ương
2. Thời gian thực hiện:

08 tháng

3. Cấp quản lý: Cấp cơ sở

Từ tháng 3 năm 2018
đến tháng 10 năm 2018
4. Chủ nhiệm đề tài:
Họ và tên: Nguyễn Bá Vương
Chuyên môn: Cử nhân xét nghiệm
Chức vụ: Kỹ thuật viên trưởng khoa
Khoa, phòng: Xét nghiệm
Địa chỉ: Khoa xét nghiệm- Bệnh viện 74 Trung ương
Điện thoại: 0944434242

Email:

5. Các cán bộ tham gia nghiên cứu:
1. Họ tên: Ths.Trương Công Thứ. Đơn vị: khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn
2. Họ tên:BSCKI. Cao Thanh Thủy. Đơn vị: khoa Xét nghiệm
6. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Kiểm định một số đặc tính của máy AU680
Beckman Coulter đối chiếu với kết quả do nhà sản xuất đã công bố và những quy
định theo CLIA.
7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Tổng quan tình hình nghiên cứu
thuộc lĩnh vực của đề tài. Nêu được tính cấp thiết của nghiên cứu.
Ngày nay, chất lượng xét nghiệm là mục tiêu hàng đầu của các phòng xét

nghiệm. Khi một phương pháp xét nghiệm mới được áp dụng hay thiết bị xét
nghiệm mới được đưa vào hoạt động hay tại các khoảng thời gian nhất định đánh giá
hiệu năng phương pháp đang sử dụng,...Để đảm bảo chất lượng các xét nghiệm, phòng
xét nghiệm phải tiến hành thẩm định phương pháp xét nghiệm hay thẩm định giá trị sử
dụng.
Các phương pháp đo lường luôn bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên. Sai số
hệ thống luôn xảy ra theo một hướng và làm cho tất cả các kết quả xét nghiệm cao
hơn hoặc thấp hơn giá trị thực. Tổng sai số ngẫu nhiên và sai số hệ thống được cho
1


là sai số toàn bộ cho phép của phòng xét nghiệm – đây là thông số đo lường hiệu
năng phương pháp và là quan trọng nhất để đánh giá xem liệu sai số kỹ thuật của
phương pháp đó có chấp nhận được hay không. Dữ liệu độ chính xác và độ xác
thực nếu xem xét riêng rẽ là không đủ để đánh giá hiệu năng phương pháp xét
nghiệm. Chất lượng xét nghiệm được đo đạc bằng “thang đo six sigma”. Do vậy,
sigma là phương pháp tiếp cận tốt nhất cho các phòng xét nghiệm lâm sàng.
Hiện nay, Bộ Y tế đã ban hành Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/06/2017
về việc ban hành Tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học. Trong
hồ sơ của Bộ tiêu chí hay hồ sơ của tiêu chuẩn ISO15189:2012 cũng đòi hỏi phòng
xét nghiệm phải tiến hành thẩm định các phương pháp được triển khai trên các hệ
thống thiết bị xét nghiệm mới được đưa vào phân tích tại phòng xét nghiệm.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Thẩm
định phương pháp xét nghiệm trên máy hóa sinh tự động Beckman Coulter
AU680 tại Khoa xét nghiệm Bệnh viện 74 trung ương”.
7.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

7.1.1 Thẩm định phương pháp xét nghiệm:
7.1.1.1 Khái niệm thẩm định phương pháp:
Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp

bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu
cầu đặt ra. Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá
chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích.
Hiện nay nhiều thuật ngữ khác nhau được sử dụng để chỉ khái niệm trên như
định trị phương pháp, đánh giá phương pháp, xác nhận giá trị sử dụng của phương
pháp, phê duyệt phương pháp. Tất cả các thuật ngữ này đều là cách gọi khác nhau
của thẩm định phương pháp (method validation).
7.1.1.2 Thẩm định phương pháp gồm:
Thẩm định phương pháp tiêu chuẩn: Các phương pháp thử theo tiêu chuần
quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như
TCVN, ISO,....
Thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn: Các phương pháp do PXN tự xây
dựng, phương pháp theo hướng dẫn của NSX thiết bị, phương pháp theo tạp chí, tài
2


liệu chuyên ngành,....
7.1.1.3 Yêu cầu của thẩm định phương pháp:
Thẩm định phương pháp tiêu chuẩn: Phải có kết quả thẩm định của phương
pháp tiêu chuẩn và kết quả này phải phù hợp với yêu cầu của PXN. PXN cần đảm
bảo có thể đạt được các thông số được mô tả trong phương pháp tiêu chuẩn.
Thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn: Đối với phương pháp không tiêu
chuẩn thì thẩm định phương pháp là một yêu cầu bắt buộc phải thực hiện đi kèm
với việc phát triển phương pháp mới và áp dụng các phương pháp không tiêu chuẩn
vào thực hiện thành thường quy.
7.1.1.4 Các thông số cần thẩm định:
Thẩm định phương pháp là một công việc rất quan trọng, nó ảnh hưởng trực
tiếp đến độ tin cậy của kết quả xét nghiệm. Các thông số cần thẩm định bao gồm:
-

Độ đặc hiệu, tính chọn lọc (Specifility/Selectivity)
Độ nhạy (Sensitivity)
Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (Linearity and Calibration curve)
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD)
Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation – LOQ)
Độ lệch/độ đúng (Bias/Trueness)
Độ chụm (Precision)
Độ chính xác (Accuracy)
Độ ổn định của phương pháp (Robustness/Ruggedness).

Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào kỹ thuật áp dụng trong
PXN, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của PXN,…Từng trường
hợp cụ thể các thông số thẩm định có thể có sự khác nhau.
7.1.1.4.1. Đánh giá khoảng tuyến tính:
Khoảng tuyến tính (Linearity range) của một phương pháp phân tích là
khoảng nồng độ mà ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và
nồng độ chất phân tích hay chính là các kết quả xét nghiệm nhỏ nhất và lớn nhất có
thể đủ tin cậy để thông báo.
Khoảng tuyến tính còn được gọi là khoảng đo lường phân tích: là khoảng giá
trị đo của thiết bị có thể sử dụng để báo cáo trực tiếp, không đòi hỏi phải pha loãng
hay cô đặc mẫu xét nghiệm.
Đỗi với hầu hết các phương pháp định lượng, cần phải thực hiện việc xác
3


định khoảng tuyến tính. Việc xác định khoảng tuyến tính đặc biệt quan trọng với 2
điểm là giới hạn định lượng (Limit of Quantitation – điểm thấp nhất) và giới hạn
tuyến tính (upper limit of reportable range – điểm cao nhất).
Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có
nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của trị số đo được vào nồng độ. Vẽ

đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc
cho đến khi không còn tuyến tính. Khoảng tuyến tính dài hay ngắn phụ thuộc vào
nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích và phương
pháp phân tích được sử dụng. Các chất khác nhau có khoảng tuyến tính khác nhau
do sự khác nhau về tính chất lý hóa. Trong khi các phương pháp phân tích khác
nhau ảnh hưởng lớn đến độ dài ngắn của khoảng tuyến tính.
7.1.1.4.2. Đánh giá độ chính xác (độ chụm):
Độ chụm là mức độ gần đúng giữa các kết quả thực hiện độc lập trên cùng
một mẫu và trong cùng điều kiện thực hiện; được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn
(SD) và hệ số biến thiên (CV). Cho thông tin liên quan đến sai số ngẫu nhiên.
Vật liệu sử dụng: chất chuẩn, chất chứng, mẫu trộn.
Nội dung
Số lượng mẫu
Độ chụm ngắn hạn (độ lặp lại) 2 mức QC, chạy lặp lại 20

Thời gian chạy
01 ngày

lần
2 mức QC, chạy mỗi ngày

20 lần trong 20

1 lần

ngày khác nhau

Độ chụm dài hạn (độ tái lặp)

Tính toán các thông số: Mean, SD, CV.

Tiêu chuẩn chấp nhận của độ chụm (theo CLIA):
+ Độ chụm ngắn hạn ≤0.25 TEA
+ Độ chụm dài hạn ≤0.33 TEA .
7.1.1.4.3. Đánh giá độ xác thực:
Độ xác thực là mức độ gần đúng giữa kết quả một phép đo và giá trị thật của chất
đo. Cho thông tin liên quan đến lỗi hệ thống.
Vật liệu sử dụng: các mẫu đã biết trước giá trị: chất chuẩn, mẫu ngoại kiểm, QC.
Số lượng mẫu: tối thiểu 20 mẫu (xác nhận phương pháp)/40 mẫu (thẩm định
phương pháp) có giá trị nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp.
4


Mỗi mẫu chạy 2 lần với phương pháp xét nghiệm/phương pháp tham chiếu
(phương pháp so sánh).
Tiến hành phân tích trong tối thiểu là 5 ngày.
Xây dựng phương trình tương quan giữa kết quả của phương pháp cần xác nhận và
kết quả tham chiếu:
+ Kết quả tham chiếu đặt trên trục x, kết quả phương pháp cần thẩm định/
xác nhận đặt trên trục y.
+ Xác định phương trình tương quan: y = ax + b với hệ số tương quan r.
Trong đó:
y là kết quả của phương pháp xét nghiệm cần xác nhận;
x là kết quả của phương pháp tham chiếu.
a là độ dốc (slope).
b là giao điểm của đồ thị với trục tung
Sử dụng Excel (Data Analysis) để tính toán a, b và vẽ biểu đồ tương quan.
Xác định độ lệch (Bias): Bias =
True Value: Giá trị thực (giá trị đích): Từ HDSD của nhà sản xuất.
Xác định sai số tổng (TE):
TE = |Bias| + Z*SD

+ Nếu: TE = SE+RE = Bias + 1.65*SD
TE là tổng biến đổi của 95% dữ liệu của cùng quần thể so với giá trị thực.
+ Nếu: TE = SE + RE = Bias + 1.96 *SD
TE là tổng biến đổi của 97.5% dữ liệu của cùng quần thể so với giá trị thực.
TEA : Sai số toàn bộ cho phép (TEA=Total allowable error).
7.1.1.4.4. Đánh giá hiệu năng phương pháp:
Sử dụng thang đo sigma (Six – Sigma Metrics): Six sigma là phương pháp đo
lường chất lượng và cải tiến chất lượng được Motorola phát triển từ những năm
1980. Phương pháp Sigma có thể áp dụng khi kết quả của một quá trình có thể đo
lường được. Six – Sigma Metrics cung cấp thông tin nhiều hơn cho 1 phương pháp,
được đánh giá thể hiện qua các số liệu sigma từ 1 đến 6. Khi sigma tăng, tính nhất
quán và bảo đảm của các thử nghiệm được cải thiện, do đó làm giảm chi phí vận
hành.
5


Sigma = [(%TEA - % Bias)/%CV]

Hình 2: Đồ thị six – sigma biểu thị điểm hoạt động (operating point) tương
ứng với giá trị sigma của phương pháp
Đánh giá:
Tương ứng với các giá trị sigma là hiệu năng của phương pháp:
+ Sigma = 6 (hoặc cao hơn): Hiệu năng có thể coi là đẳng cấp quốc tế
(World class) (tương ứng với 34 lỗi/1 triệu xét nghiệm).
+ Sigma = 5: Hiệu năng phương pháp là tuyệt vời (excellent) (tương ứng với
230 lỗi/1 triệu xét nghiệm).
+ Sigma = 4: Hiệu năng phương pháp là tốt (good) (tương ứng với 6210 lỗi/1
triệu xét nghiệm).
+ Sigma = 3: Hiệu năng phương pháp có thể coi là chấp nhận được (tương
ứng với 66.800 lỗi/1 triệu xét nghiệm).

+ Sigma = 2: Phương pháp đó có hiệu năng kém (tương ứng với 308.000
lỗi/1 triệu xét nghiệm).
+ Sigma = 1: Phương pháp đó không chấp nhận được (tương ứng với
690.000 lỗi/1 triệu xét nghiệm).
Như vậy, công cụ sigma rất hữu ích cho việc hướng dẫn thiết lập 1 chiến
lược kiểm soát kết quả nội kiểm tương ứng với các mức giá trị sigma khác nhau.
6


7.1.2 Các phương pháp xét nghiệm hóa sinh cơ bản:
Hiện nay, các xét nghiệm hóa sinh được tiến hành trên các máy xét nghiệm hóa
sinh tự động chủ yếu sử dụng 2 phương pháp: đo quang, điện cực chọn lọc ion.
7.1.2.1. Phương pháp đo quang:
Nguyên tắc cơ bản: Khi ánh sáng đi qua dung dịch chất phân tích, các photon
trong tia sáng sẽ bị hấp thụ bởi các phân tử trong dung dịch. Sự giảm cường độ
chùm tia sáng tỉ lệ với nồng độ của dung dịch chất phân tích. Đo sự giảm cường độ
ánh sáng, từ đó xác định nồng độ của mẫu thử.
Cơ sở của phương pháp là các định luật về hấp thụ ánh sáng.
Định luật Lamber- Beer:
Tt = I0 x 10 –aCl
Một số đại lượng về hấp thụ ánh sáng:
+ Độ thấu quang T: T = Tt / I0 = 10 –aCl + Độ hấp thụ quang A( hay còn gọi là mật
độ quang OD) :
A = OD = lg 1/T = lg 1/ 10 –aCl = lg10aCl = aCl
* Phép đo điểm cuối (End point):
Phép đo điểm cuối là một phép đo phức hợp màu tốc độ phản ứng tuyến tính với
thời gian, phản ứng kết thúc hoàn toàn sau một thời gian nhất định.
MĐQ mẫu thử
C mẫu thử =

x C mẫu chuẩn = MĐQ mẫu thử x K

MĐQ mẫu chuẩn
* Phép đo 2 điểm (two point, Fixtime):
Phép đo 2 điểm là phép đo phức hợp màu tốc độ phản ứng không tuyến tính với
thời gian, không xác định được thời điểm kết thúc của phản ứng (t1 = 30s và t2 =
90s).
∆A = A2 - A1. Trong đó ∆A là hiệu số mật độ quang.
C mẫu thử =

MĐQ mẫu thử
MĐQ

mẫu
7

x C mẫu chuẩn = ∆A mẫu thử x K


chuẩn
* Phép đo động học enzym (kinetic):
Là phép đo nhiều điểm, tốc độ phản ứng tuyến tính với thời gian có tác dụng đo
mật độ quang của sản phẩm tạo thành, hoặc đo sự giảm dần của nồng độ cơ chất.
Thông thường đo ở 5 thời điểm: t1 = 30s, t2 = 45s, t3 = 60s, t4 = 75s, t5 = 90s
Lấy hiệu số mật độ quang giữa hai thời điểm:
∆A1 = A2 - A1
∆A2 = A3 - A2
∆A3 = A4 - A3
∆A4 = A5 - A4
Tính trung bình mật độ quang giữa các thời điểm

∆Ā=

∆A1 + ∆A2 + ∆A3 + ∆A4
4

C mẫu thử = ∆Ā x K
7.1.2.3. Phương pháp điện cực chọn lọc ion:
Phương pháp đo điện thế dựa trên việc đo lường hiệu điện thế giữa 2 điện
cực. Một điện cực đo lường tiếp xúc với ion trong dung dịch. Điện thế giữa điện
cực này và điện cực chuẩn sẽ thay đổi khi nồng độ ion trong dung dịch thay đổi.
Phương pháp đo điện thế thích hợp cho việc đo lường các ion (chất điện giải) như
Na+ , K+ , Cl- .
Phương pháp điện cực chọn lọc ion dựa trên nguyên lý của kỹ thuật đo điện
thế, sự chênh lệch điện thế giữa điện cực chuẩn và điện cực chỉ thị (điện cực đo
lường) tỷ lệ thuận với nồng độ của ion được đo lường. Một điện cực chọn lọc ion
lý tưởng bao gồm một màng mỏng có khả năng thẩm thấu một loại ion đặc hiệu.
Với sự có mặt của ion đặc hiệu, màng sẽ tạo ra một hiệu điện thế tỷ lệ với sự hoạt
động của ion đó. Có 4 loại màng điện cực chọn lọc chính hay được sử dụng: điện
cực màng rắn, điện cực màng thủy tinh, điện cực màng lỏng, điện cực hợp chất.
Màng thủy tinh được chế tạo có tính chọn lọc với ion Na + và loại bỏ các cation
khác. Màng valinomycin được dùng cho đo lường K + có thể loại bỏ hiệu quả Na+ và
các ion nhiễu khác. Thành phần đặc trưng của phương pháp định lượng Cl - là điện
cực bạc – clorua bạc hoặc sulfide bạc.
Phương pháp điện cực chọn lọc ion có thể trực tiếp hoặc gián tiếp. Phương
8


pháp trực tiếp không đòi hỏi pha loãng mẫu bệnh phẩm, đo lường ion trong huyết
tương chứ không phải trong tổng thể tích. Vì vậy, các chất hòa tan như lipid,
protein khi tăng cao sẽ không ảnh hưởng đến phép đo. Phương pháp gián tiếp chỉ

cần một lượng mẫu nhỏ. Khi pha loãng sẽ dựa trên thể tích toàn phần, vì thế khi
lipid máu cao hoặc protein máu cao sẽ ảnh hưởng đến kết quả.
7.1.3 Giới thiệu máy xét nghiệm sinh hóa Beckman Coulter AU680:
Máy xét nghiệm hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680( AU680) là hệ
thống xét nghiệm tốc độ cao, năng suất, hiệu quả và tiết kiệm tối đa chi phí cho
PXN. AU680 được thiết kế cho các phòng xét nghiệm và bệnh viện vừa và lớn để
đáp ứng nhu cầu tăng nhanh về áp lực thời gian và năng suất.

Hình: Máy xét nghiệm hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680
Sự linh hoạt của thiết kế cho phép máy hoạt động độc lập hoặc kết nối với hệ
9


thống labo tự động. Tính năng truy cập ngẫu nhiên đạt tốc độ cao 800 xét nghiệm
quang/ giờ( 1200 xét nghiệm với bộ điện giải ISE), và khả năng cài đặt 63 loại xét
nghiệm trên máy. Hai hệ thống lấy mẫu: Một hệ thống lấy mẫu hiệu quả cao, đáp
ứng cho việc nạp mẫu liên tục với một số lượng lớn mẫu và một hệ thống lấy mẫu
cho chế độ chạy cấp cứu.
+ Rack Sample: Có thể chứa cùng một lúc 300 mẫu bệnh phẩm và việc nạp mẫu
được thực hiện trong suốt quá trình xét nghiệm khi cần thiết.
+ Rack STAT: Có thể chứa được 22 mẫu cho chế độ chạy cấp cứu. Nó được
thiết kế cho việc giữ lạnh mẫu bệnh phẩm và mẫu QC.
AU680 phát hiện tắc, phát hiện va chạm đầu probe và phát hiện bọt khí, mẫu bị
đông và bảo vệ đầu probe tránh va chạm. Khi mẫu bị vón cục với những sợi fibrin
được phát hiện, máy báo động và tự động dừng để tránh va chạm với ống đựng
mẫu.
Hệ thống truy nhập thông minh và hệ thống ISE tốc độ cao: AU680 kết hợp hệ
thống truy nhập ngẫu nhiên thông minh với 4 đầu probe, hóa chất di chuyển tự do
giữa 2 luồng cuvet phân phối vào hai khay hóa chất. Hệ thống sẽ nhanh chóng lựa
chọn điều kiện tốt nhất để phân phối mẫu tương ứng với những yêu cầu xét nghiệm

đã yêu cầu cho mỗi mẫu.
7.1.4 Các kỹ thuật định lượng các thông số nghiên cứu trên máy xét nghiệm
hóa sinh tự động AU680:
7.1.4.1 Nguyên lý định lượng Glucose bằng phương pháp GOPD
- Glucose + H2O

GOD Acid gluconic + H2O2 ( GOD: Gluco Oxy Dase)

2 H2O2 + Phenol + 4 amino-Antipyrin POD

Quinonemin + 4H 2O

( Peroxydase)
10


Đậm độ màu của phức hợp tạo thành tỷ lệ thuận với nồng độ glucose trong huyết
thanh và được xác định ở bước sóng 505 nm.
7.1.4. 2 Nguyên lý định lượng Ure bằng phương pháp động học UV
Với sự có mặt của nước và urease, ure sẽ bị thủy phân sinh ra amoniac và carbon
dioxide. Amoniac sinh ra kết hợp với 2-oxoglutarat và NADH dưới sự có mặt của
glutamate dehydrogenase( GLDH) để tạo thành glutamat và NAD +. Sự giảm độ hấp
thụ quang của NADH theo đơn vị thời gian tại bước sóng 340 nm tỷ lệ với nồng độ
ure trong mẫu thử.
Ure + H2O

urease

2 NH4+ + CO32GLDH

2- Oxoglutarate + 2 NH4+

2L- Glutamate + 2 NAD+ + 2H2O

7.1.4. 3 Nguyên lý định lượng Creatinin bằng phương pháp Jaffe động học
Creatinin + Acid pycric NaOH
( Vàng chanh)

Creatin pycrat
( vàng da cam)

Đậm độ màu đỏ da cam tỷ lệ thuận với nồng độ creatinin trong huyết thanh và
được xác định ở bước sóng 500 nm bằng phép đo động học 2 điểm( two point
kinetic)
7.1.4.4 Nguyên lý định lượng Albumin bằng phương pháp Bromocresol green
Albumin huyết thanh tác dụng với Bromocresol green( BCG) trong môi trường
của dung dịch đệm Succinate PH4.2 tạo phức hợp màu xanh lục.
Đậm độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ Albumin huyết thanh ở bước sóng 620 nm
bằng phép đo điểm cuối.
7.1.4. 5 Nguyên lý đo hoạt độ Alanin Transaminase ALT( GPT)
A.Alanin + α Cetoglutaric
A. Pyruvic + NADH2

LDH

ALT

A. Pyruvic + Glutamic
A. Lactic + NAD +

Phức hợp tạo thành trong quá trình phản ứng có độ đục giảm dần, được xác định
11


ở bước sóng 340 nm bằng phép đo kinetic như đối với AST.
7.1.4.6 Nguyên lý đo hoạt độ Aspartat Transaminase AST( GOT)
Acid Aspactic + α Cetoglutaric
Oxaloacetic + NADH2

MDH

AST

Oxaloacetic + Acid glutamic

Acid Malic + NAD +

Trong quá trình phản ứng, tạo phức hợp có độ đục giảm dần,( tốc độ giảm càng
nhanh, hoạt độ enzyme AST càng lớn). Bằng phép đo Kinetic ở bước sóng 340 nm,
với nhiều thời điểm khác nhau chúng ta xác định được hiệu số mật độ quang trung
bình, nhờ đó sẽ xác định được hoạt độ enzyme AST.
7.1.4.7 Nguyên lý định lượng Acid Uric bằng phương pháp Uricase perox.no
ascorb.ox
Acid Uric + 2 H2O + O2

Uricase Allantion + CO2 + H2O2

H2O2 + 3.5 Dicloro 2.Hydroxy benzen Sulfonic acid + 4 Amino Antipyrin
POD

Chronogen + HCL + 2 H2O
( Phức hợp màu hồng cánh sen)

Đậm độ màu của phức hợp tỷ lệ thuận với nồng độ acid uric trong máu và được
xác định mật độ quang ở bước sóng 505nm bằng phép đo điểm cuối.
7.1.4.8 Nguyên lý định lượng Cholesterol toàn phần bằng phương pháp cholesterol
Oxidase
Cholesterol este + H2O

cholesterol esterase

Cholesterol tự do + AX béo

Cholesterol tự do + O2 cholesterol oxydase
2H2O2 + 4 Aminoantipyrin + phenol

POD

Cholesten- 4 + H2O2
Quinonemin + 4 H2O
( phức hợp màu hồng cánh sen)

Đậm độ màu của phức hợp tỷ lệ thuận với nồng độ cholesterol toàn phần
trong huyết thanh và được xác định ở bước sóng 546 nm bằng phép đo điểm cuối.
7.1.4.9 Nguyên lý định lượng Triglycerid bằng phương pháp Lipase/GOD-PAP no
12


Correction:
Triglycerid + 3 H2O

Lipase

Glycerol + ATP
Glycero(3P) + O2

Glycerol + 3 acid béo

Glycerokinase

Glycerol 3phosphate + ADP

Glycerol 3P- Oxydase Dihydroxy acetone.P + H2O2

H2O2 + 4 Amino antipyrin

Peroxydase

Quinonemin + H2O
( Phức hợp màu hồng cánh sen)

Đậm độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ triglyceride trong huyết thanh, và được xác
định ở bước sóng 546 nm bằng phép đo điểm cuối.
7.1.4.10 Nguyên lý định lượng Protein bằng phương pháp Biuret reaction, end
point:
Protein trong huyết thanh tác dụng với ion Cu+2 trong môi trường kiềm( thuốc
thử Biure) tạo thành phức hợp màu xanh tím. Đậm độ màu của phức hợp tỷ lệ
thuận với nồng độ protein trong huyết thanh và được xác định mật độ quang ở
bước sóng 546 nm bằng phép đo điểm cuối.
7.1.4.11 Nguyên lý định lượng Bilirubin toàn phần bằng phương pháp

Dichlorophenyl Diazonium :
Bilirubin toàn phần trong huyết thanh cũng có phản ứng tạo phức hợp azo màu
hồng tím như bilirubin trực tiếp nhưng cần có mặt của cetrimid.
Phức hợp màu hồng tím tỷ lệ thuận với nồng độ Bilirubin trong huyết thanh
được xác định ở bước sóng 546 nm.
7.1.4.12 Nguyên lý định lượng Bilirubin trực tiếp bằng phương pháp
Dichlorophenyl Diazonium :
Nguyên tắc kỹ thuật định lượng bilirubin trực tiếp: Bilirubin trực tiếp trong huyết
thanh có khả năng tham gia phản ứng trực tiếp với acid Sulphanilic và acid Nitrơ
( trong thuốc thử Diazo) tạo thành phức hợp azo màu hồng tím.
7.1.4.13 Nguyên lý định lượng điện giải ( Na+, K+, Cl-) bằng phương pháp điện
13


cực chọn lọc ion
Sử dụng các màng điện cực đặc hiệu cho từng loại ion trong mẫu thử. Dùng điện
cực màng crown ether cho ion Na+ và K+, điện cực màng PVC cho ion Cl-. Mỗi
một ion đặc hiệu sẽ sinh ra một hiệu điện thế tỉ lệ với hoạt động của ion đó theo
phương trình Nernst. Sự chênh lệch điện thế giữa điện cực chuẩn và điện cực chỉ
thị tỉ lệ với nồng độ ion được đo lường.

8. Nội dung:
8.1. Đối tượng nghiên cứu
- Chúng tôi lựa chọn các xét nghiệm sinh hóa được thực hiện với tần suất cao tại
Bệnh viện 74 Trung ương.
- Các thông số hóa sinh máu cũng phải bao quát các phương pháp xét nghiệm hóa
sinh máu.
- Vì vậy, chúng tôi lựa chọn các thông số để thẩm định như sau: Ure, Creatinin,
Glucose, Uric, Bilirubin-T, Bilirubin-D, Protein, Albumin, Cholesterol, Triglycerid,
AST, ALT, Natri, Kali, Clo.

8.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 3 đến tháng 10 năm 2018.
- Địa điểm nghiên cứu: Khoa xét nghiệm – Bệnh viện 74 Trung ương.
8.3. Phương pháp nghiên cứu:
- Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang
- Vật liệu nghiên cứu:
+ Huyết thanh kiểm tra: Randox Human assay control2, Randox human assay
control 3
+ Huyết thanh ngoại kiểm của chương trình ngoại kiểm Hóa sinh của Trung tâm
kiểm chuẩn Đại học Y Hà Nội
- Trang thiết bị:
+ Máy phân tích hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680
+ Pipet tự động, ống nghiệm, máy ly tâm…
- Hóa chất sử dụng:
+ Thuốc thử trên hệ máy AU của hãng Beckman Coulter.
+ Chất chuẩn cho hệ thống AU 680: System calibrator
14


8.4. Nội dung nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành kiểm định 15 xét nghiệm hóa sinh, việc kiểm định bao gồm các
đặc tính:
- Khoảng tuyến tính
- Độ chính xác ngắn hạn và dài hạn
- Độ xác thực và hiệu năng phương pháp.
8.5. Phương pháp tiến hành và nhận định kết quả
8.5.1. Thực nghiệm đánh giá khoảng tuyến tính:
- Sử dụng mẫu nội kiểm với 2 nồng độ pha với nhau theo các tỷ lệ để có 5 nồng độ
cao thấp khác nhau. Mỗi nồng độ chạy lặp lại 5 lần. Kết quả được chấp nhận khi
Slope nằm trong khoảng 0.9 – 1,1 và r ≥ 0,9:

+ Mẫu 1: Mẫu có nồng độ thấp.
+ Mẫu 2: 3 phần mẫu thấp + 1 phần mẫu cao.
+ Mẫu 3: 2 phần mẫu thấp + 2 phần mẫu cao.
+ Mẫu 4: 1 phần mẫu thấp + 3 phần mẫu cao.
+ Mẫu 5: Mẫu cao
8.5.2. Thực nghiệm đánh giá độ chính xác:
- Độ chính xác ngắn hạn:
Sử dụng huyết thanh kiểm tra( QC) làm vật liệu để đánh giá độ chính xác. Tiến
hành chạy các mẫu QC, mỗi mức chạy lặp lại 20 lần trong một ngày. Hai mức
huyết thanh kiểm tra cho tất cả các chất phân tích. Tính giá trị trung bình, SD và
CV % của kết quả thu được để đánh giá độ chính xác ngắn hạn. Tiêu chuẩn chấp
nhận của độ chính xác ngắn hạn là: CV<= 0.25TEa. TEa là sai số toàn bộ cho phép.
- Độ chính xác dài hạn:
Trong 20 ngày tiến hành phân tích nồng độ của các chất trong huyết thanh kiểm tra
( n=20). Hai mức huyết thanh kiểm tra cho tất cả các chất phân tích. Tính giá trị
trung bình, SD và CV của kết quả QC thu được để đánh giá độ chính xác dài hạn.
Tiêu chuẩn chấp nhận của độ chính xác dài hạn là: CV <= 0.33TEa.
Giá trị sai số toàn bộ cho phép được lấy theo tiêu chuẩn CLIA theo trang web
/>8.5.3. Thực nghiệm đánh giá độ xác thực:
Sử dụng mẫu huyết thanh chương trình ngoại kiểm hóa sinh do Trung tâm
kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm Y học – Trường ĐH Y Hà Nội cung cấp.
Từ kết quả chạy ngoại kiểm của Khoa Xét nghiệm thực hiện trên máy xét
nghiệm sinh hóa AU680 so sánh với kết quả trung bình ngoại kiểm mà TTKC gửi
về khoa (kết quả tham chiếu) trong thời gian nghiên cứu.
Phân tích kết quả: Xây dựng phương trình tương quan Passing Bablok giữa
kết quả của phương pháp cần xác nhận và kết quả tham chiếu.
15


Xác định phương trình tương quan: y = ax + b với hệ số tương quan r.

Trong đó:
y là kết quả của phương pháp xét nghiệm cần xác nhận;
x là kết quả của phương pháp tham chiếu.
a là độ dốc (slope).
b là giao điểm của đồ thị với trục tung
Sử dụng phần mềm Excel (Data Analysis) để tính toán a, b và vẽ biểu đồ
tương quan để thể hiện mối tương quan giữa kết quả phương pháp cần thẩm định
và kết quả tham chiếu.
Đánh giá:
+ Độ dốc cho biết sai số tỷ lệ giữa phương pháp cần xác nhận với phương
pháp tham chiếu, lý tưởng có giá trị bằng 1.
+ Giao điểm với trục tung cho biết sai số hằng định giữa phương pháp cần
xác nhận với phương pháp tham chiếu, lý tưởng có giá trị bằng 0.
+ Nếu 95% khoảng tin cậy của độ dốc a bao hàm 1 thì xem như phương
pháp xét nghiệm cần thẩm định không có sai số tỷ lệ. Nếu bao hàm 0 thì xem như
phương pháp xét nghiệm cần thẩm định không có sai số hằng định so với phương
pháp tham chiếu.
+ Hệ số tương quan r ≥ 0.99, nếu r < 0.99: cần mở rộng việc tính toán trên
nhiều dữ liệu hơn.
So sánh tổng sai số với tổng sai số cho phép (TE với TEA).
Tiêu chuẩn chấp nhận: TE ≤ TEA.
8.5.4. Thực nghiệm đánh giá hiệu năng phương pháp:
Sử dụng thang đo Six – Sigma: Sigma = [(%TEA - % Bias)/%CV]
Với các phương pháp có giá trị Sigma <3: Hiệu năng phương pháp kém,
không chấp nhận được.
8.6. Quy trình nghiên cứu
Thu thập các kết quả nội kiểm hàng ngày và kết quả ngoại kiểm từ trung tâm kiểm
chuẩn Đại học Y Hà Nội.
8.7. Bộ công cụ nghiên cứu
- Sổ lưu kết quả nội kiểm

- Hồ sơ ngoại kiểm
8.8 Phân tích và xử lý số liệu
- Số liệu được xử lý và phân tích trên phần mềm SPSS 16.0
- Sử dụng test ANOVA để so sánh các giá trị: mean, SD, %CV, TEa, 1/4TEa,
1/3TEa, Bias, Sigma
16


8.9 Khía cạnh đạo đức của nghiên cứu
- Đề tài tiến hành sau khi Hội đồng khoa học Bệnh viện 74 thông qua và chấp
thuận cho nghiên cứu.
- Đảm bảo tính trung thực khách quan của số liệu

9. Kết quả dự kiến của đề tài
* Dự kiến kết quả nghiên cứu
9.1. Thực nghiệm đánh giá khoảng tuyến tính:
Bảng 3.1.Khoảng tuyến tính của các thông số hóa sinh trong nghiên cứu:
Thông số

Khoảng tuyến
tính của NSX

Khoảng báo
cáo của viện

Glucose
Ure
Creatinin
Uric
Bi-T

Bi-D
Protein
Albumin
Cholesterol
Triglycerid
AST
ALT
Na+
K+
Cl9.2. Thực nghiệm đánh giá độ chính xác:
17

Slope

R2

Bias (%)

TEA (%)


9.2.1. Độ chính xác ngắn hạn:
Bảng 9.2 : Kết quả đánh giá độ chính xác ngắn hạn trên máy hóa sinh AU 680
Xét
nghiệm

Huyết
thanh
kiểm
tra

n

Trung
bình

SD

CV(%)

Tea**
( %)

0.25xTE
a

Glucose
Ure
Creatinin
Uric
Bi-T
Bi-D
Protein
Albumin
Cholestero
l
Triglyceri
d
AST
ALT

Na+
K+
Cl-

9.2.2. Độ chính xác dài hạn:
Bảng 9.3 : Kết quả đánh giá độ chính xác dài hạn trên máy hóa sinh AU 680
Xét

Huyết

n

Trung

SD
18

CV(%)

Tea**

0.33xTE


nghiệm

thanh
kiểm
tra

bình

( %)

a

Glucose
Ure
Creatinin
Uric
Bi-T
Bi-D
Protein
Albumin
Cholesterol
Triglycerid
AST
ALT
Na+
K+
Cl-

9.3. Thực nghiệm đánh giá độ xác thực:
Bảng 9.4. Phương trình tương quan giữa kết quả định lượng các chất phân tích
trên máy AU680 và kết quả ngoại kiểm
Xét
Đồ thi y Độ dốc a
95%
Giao
95%

Hệ số
nghiệm = ax + b
khoảng
điểm b
khoảng
tương
tin cậy
tin cậy
quan r
độ dốc a
giao
điểm b
19


Glucose
Ure
Creatinin
Uric
Bi-T
Bi-D
Protein
Albumin
Cholestero
l
Triglycerid
AST
ALT
Na+
K+

Cl-

9.4. Thực nghiệm đánh giá hiệu năng phương pháp
Bảng 9.5: Giá trị sigma của các xét nghiệm nghiên cứu trên máy hóa sinh AU680
Thông số

Mean

SD

CV

|Bias|

Glucose
Ure
Creatinin
Uric
Bi-T
Bi-D
Protein
Albumin
Cholesterol
Triglycerid
AST
ALT
Na+
K+
Cl20

TE in
units

TEA

|Bias%|

Sigma


* Khả năng ứng dụng
- Trong quản lý chất lượng xét nghiệm, đáp ứng yêu cầu của Bộ tiêu chí đánh giá
mức chất lượng phòng Xét nghiệm Y học của Bộ Y tế cũng như tiêu chuẩn của ISO
15189.2012.
- Có thể dùng để đánh giá năng lực nhân viên hàng năm của Khoa xét nghiệm
* Các sản phẩm của đề tài: các bài báo, đào tạo (sinh viên, học viên sau đại học),
hướng dẫn sinh viên tham gia báo cáo tại Hội nghị khoa học
- Các bài báo đăng trên các tạp chí y học chuyên ngành
- Báo cáo tại các Hội nghị khoa học Hóa sinh y học…

10. Tài liệu tham khảo (trích dẫn theo quy định của Tạp chí Nghiên cứu Y học)
Tiếng việt
1. Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và VSV – Viện kiểm nghiệm an
toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia.
2. Trần Cao Sơn và cộng sự (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa
học và vi sinh vật, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
3.Trần Hoài Nam (2003), Kỹ thuật xét nghiệm hóa sinh ứng dụng trong lâm sàng,
NXB Y học 2003.
4. Bùi Tuấn Anh, Lê Minh Đức (2017), Thẩm định một số đặc tính máy
AU5800Beckman Coulter tại khoa Hóa sinh bệnh viện Bạch Mai – Tạp chí Y học

Việt Nam.
5.GS.TS. Nguyễn Nghiêm Luật – Thực hành hóa sinh - nhà xuất bản y học 2003.
6. Tạ Thành Văn – Hóa sinh lâm sàng – nhà xuất bản y học 2013.
7. GS Lê Đức Trình,GS Đỗ Đinh Hồ - Hóa sinh lâm sàng - NXB Y học 2009.
8. Bảo đảm và kiểm tra chất lượng xét nghiệm Hóa sinh lâm sàng - Bộ Y Tế - NXB
Y Học 2006.
9. Kỹ thuật xét nghiệm Hóa sinh lâm sàng - Bộ môn Hóa sinh ĐHY Hà Nội Năm
2002.
Tiếng anh
10. Linnet K, Body JC (2006). Selection and analytical evaluation of methods –
with statistical techniques. In: Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, editors. Tietz
21


textbook of clinical chemistry. 4th ed. Philadelphia: Sauders.
11. Westgard JO, Klee GG (2006). Quality management. In: Burtis CA, Ashwood
ER, Bruns DE, editors. Tietz textbook of clinical chemistry. 4th ed. Philadelphia:
Sauders.
12. James O.Westgard (1999). Basic method validation: Training in analytical
quality management for healthcare laboratories. Westgard Quality Corporation.
13. An annual report of Asian Quality Assurance Survery program (2003), Lee K N;
Yoonsy; Cho HI, Journal of laboratory, Medicine and Quality Asurance for Clinical
laboratory, 2004, 26, 5549-54.
14. Preanalytical factors affeting clinical laboratory test resul, by Assis Prof Ayman
Tallat Abbas, PhD.
15. Bullock D.G.and Wilde C.E. Anals of clinical Biochemistry, 1985, 20: 273-82.
16. Burnett D. A (2002) “ Practical guide to Accreditation in laboratory Medicine”
ACB VentUre Publications: London 2002.
17. />11. Phụ lục (nếu có):

12. Tiến độ thực hiện đề tài
- Tháng 3 năm 2018: Xây dựng đề cương nghiên cứu và hoàn thành đề cương
- Tháng 4 đến tháng 9 năm 2018: thu thập và xử lý số liệu
- Tháng 10 năm 2018: Hoàn thiện đề tài và báo cáo nghiệm thu

22


13. Kinh phí thực hiện đề tài (kèm theo dự toán kinh phí chi tiết): 12.500.000
đ (mười hai triệu đồng)
Trong đó: + kinh phí nhà trường hỗ trợ:…………(triệu đồng)
+ kinh phí từ nguồn khác: ……………(triệu đồng)
- Kinh phí xây dựng đề cương, hoàn thiện công cụ nghiên cứu và quy trình nghiên
cứu: 500.000 đ (năm trăm ngàn đồng)
- Kinh phí mua nguyên vật liệu vật tư hoá chất: 12.000.000(mười hai triệu đồng)
- Các chi khác:

Vĩnh Phúc, ngày 20 tháng 3 năm 2018
Ý kiến của khoa/ phòng
(Ký và ghi rõ họ tên)

Chủ nhiệm đề tài
(Ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Bá Vương
Giám đốc

Phòng ĐT-NCKH&CĐT

23