TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN
Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus )

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN QUỐC NAM
Ngành

: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Chuyên ngành

: NGƯ Y

Niên khóa

: 2006 – 2010

Tháng 06/2010
i


TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN
Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus )

Tác giả

NGUYỄN QUỐC NAM

Khóa luận được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng Kỹ Sư Nuôi Trồng Thủy Sản
Chuyên Ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn
TS NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 06/2010
ii


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn đến:
Cha mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ về tinh thần lẫn vật
chất cho con trong suốt thời gian đi học cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho
con được hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí
Minh cùng tất cả quý thầy cô trong khoa Thủy Sản đã truyền đạt kiến thức quý báu và tạo
mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường
Đặc biệt, tôi xin gởi lòng biết ơn sâu sắc đến TS.NGUYỄN HỮU THỊNH đã tận
tình giảng dạy và hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt
nghiệp.
Xin gửi lời cảm ơn đến anh Đỗ Viết Phương, chị Đào Thị Thanh Huê cùng các bạn
lớp DH06NY đã cùng gắn bó, chia sẽ và nhiệt tình giúp đỡ cho tôi hoàn thành luận văn.
Với thời gian hạn hẹp và kiến thức hạn chế nên luận văn không tránh khỏi những
sai sót.Tôi rất mong được sự thông cảm và đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn để
đề tài được hoàn chỉnh hơn.

iii


TÓM TẮT
Trong đề tài này chúng tôi tiến hành:
Gây cảm nhiễm cá tra cỡ 15 ± 1,5 g/con với vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng
phương pháp ngâm sau khi gây stress bằng cách rạch vây đuôi, vây ngực và xử lý với
Bronopol 8 ppm.
+ Thí nghiệm 1: Gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas hydrophila
bằng phương pháp ngâm sau khi gây stress bằng cách rạch vây đuôi, vây ngực. Cá được
ngâm 1 giờ trong các xô chứa 5 L nước với mật độ vi khuẩn tương ứng với từng nghiệm
thức là 5,35 x 108 ; 5,35 x 107 ; 5,35 x 106 ; 5,35 x 105 ; 5,35 x 104 CFU/mL.
Cá chết có các dấu hiệu bệnh tích rõ ràng và điển hình như : xuất huyết gốc vây,
dưới nắp mang, quanh miệng, hậu môn lồi, sưng đỏ, loét da. Aeromonas hydrophila gây
chết cá cấp tính từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4, ngày thứ 5 số cá chết giảm dần và chết rải
rác từng ngày. Đến ngày thứ 11 của thí nghiệm thì cá hồi phục hẳn. Tỷ lệ chết cao nhất là
NT I (mật độ vi khuẩn là 5,35 x 108 CFU/mL) với 30% và thấp nhất là ở nghiệm thức đối
chứng với tỷ lệ 0,67%.
+ Thí nghiệm 2: Gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas hydrophila
bằng phương pháp ngâm với mật độ vi khuẩn gây bệnh là 3,82 x 108 CFU/mL sau khi
gây stress bằng cách xử lý với Bronopol 8 ppm.
Sau 14 ngày theo dõi, chúng tôi nhận thấy cá cũng chết vào giai đoạn đầu của thí
nghiệm như ở thí nghiệm 1. Ở NT III có tỷ lệ chết cao nhất là 32,7%. Chúng tôi thấy rằng
việc xử lí cá với Bronopol ở nồng độ 8 ppm trong 24 giờ đã gây stress cho cá và tạo điều
kiện cho vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá.
Kết quả nghiên cứu cho thấy Aeromonas hydrophila có độc lực tương đối thấp và
các phương pháp gây stress trên có thể áp dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
iv

MỤC LỤC
Đề Mục

Trang

LỜI CẢM TẠ

iiii

TÓM TẮT

iError! Bookmark not defined.

MỤC LỤC

v

Danh sách các chữ viết tắt

vii

Danh sách các hình

viii

Danh sách các bảng, biểu đồ

ix

Chương 1

MỞ ĐẦU

1

1.1 Đặt Vấn Đề

1

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

2

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1 Đặc Điểm Sinh Học Cá Tra

3

2.1.1 Phân Loại

3

2.1.2 Phân bố

3

2.1.3 Đặc điểm hình thái

3

2.1.4 Điều kiện môi trường sống

4

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

4

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng

4

2.1.7 Đặc điểm sinh sản

5

2.2 Một Số Quan Điểm Về Bệnh

5

2.3 Tổng Quan Về Các Phương Pháp Gây Bệnh Thực Nghiệm

5

2.4 Đặc Điểm Chung Về Bệnh Do Vi Khuẩn Aeromonas hydrophila

6

2.4.1 Sơ lược về bệnh

6

2.4.2 Tác nhân gây bệnh

7

2.4.3 Triệu chứng và bệnh tích

9
v


2.5 Phòng Và Trị Bệnh Do Vi Khuẩn Aeromonas hydrophila Gây Ra Trên Cá Tra
10
2.6 Sơ Lược Về Bronopol

10

2.6.1 Nguồn gốc và tên gọi

10

2.6.2 Vai trò của Bronopol trong thủy sản

11

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

12

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu

12

3.2 Vật Liệu Và Hóa Chất Nghiên Cứu

12

3.2.1 Đối tượng

12

3.2.2 Dụng cụ

12

3.2.3 Hóa chất

12

3.3 Nội Dung Nghiên Cứu

13

3.4 Bố Trí Thí Nghiệm

13

3.4.1 Sơ đồ gây bệnh thực nghiệm

13

3.4.2 Thí nghiệm 1: gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas
hydrophila bằng phương pháp ngâm và gây stress bằng cách rạch vây đuôi,
vây ngực

14

3.4.3 Thí nghiệm 2: gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas
hydrophila bằng phương pháp ngâm và gây stress bằng cách xử lý với Bronopol 17
3.5 Phương Pháp Thực Hiện

19

3.5.1 Phương pháp giải phẫu nghiên cứu ký sinh trùng trên cá

19

3.5.2 Phân lập vi khuẩn trên cá thí nghiệm

20

3.5.3 Định danh sơ bộ vi khuẩn

20

3.5.4 Tăng sinh và xác định mật độ vi khuẩn

23

CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

26

4.1 Kết Quả Định Danh Vi Khuẩn Aeromonas hydrophila

26

4.2 Các Chỉ Tiêu Môi Trường

27
vi


4.3 Kết Quả Kiểm Tra Ký Sinh Trùng

28

4.4 Số Lượng Vi Khuẩn

28

4.4.1 Số lượng vi khuẩn trong thí nghiệm thứ 1

28

4.4.2 Số lượng vi khuẩn trong thí nghiệm thứ 2

29

4.5 Kết Quả Gây Cảm Nhiễm Trong Các Đợt Thí Nghiệm

29

4.5.1 Kết quả của thí nghiệm thứ 1

29

4.5.2 Kết quả phân lập và tái định danh vi khuẩn trong thí nghiệm thứ 1

35

4.5.3 Kết quả của thí nghiệm thứ 2

35

4.5.4 Kết quả phân lập và tái định danh vi khuẩn trong thí nghiệm thứ 2

40

Chương 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

41

5.1 Kết Luận

41

5.2 Đề Nghị

41

TÀI LIỆU THAM KHẢO
MỤC LỤC

42

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
NB

: Nutrient Broth.

NA

: Nutrient Agar.

cfu

: Colony forming unit.

ctv

: Cộng tác viên.

DO

: Dissolved oxygen.

pH

: Potential of hydrogen.

MS 222

: Tricacine methanesulfonate.

A

: Aeromonas.

NT

: Nghiệm thức.

ĐC

: Đối chứng.

viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình
Hình 3.1 : Hệ thống bể bố trí thí nghiệm lần 1

Trang
15

Hình 3.2:Gây trầy xước cho cá

16

Hình 3.3: Ngâm cá với vi khuẩn trong xô có sục khí

16

Hình 3.4: Hệ thống bể bố trí thí nghiệm 2

18

Hình 3.6: Cho khuẩn lạc vi khuẩn vào bình tăng sinh

23

Hình 3.7 và 3.8: Môi trường NB trước và sau khi tăng sinh vi khuẩn

24

Hình 4.1: Kết quả định danh Aeromonas hydrophila bằng bộ test API 20E

27

Hình 4.2:Hình thái vi khuẩn Aeromonas hydrophila Gram (-),trực khuẩn

27

Hình 4.3 và 4.4: Dấu hiệu xuất huyết tại vây hậu môn, vây đuôi của cá ở NTI.1
và NT III.1 (ngày thứ hai của thí nghiệm)

30

Hình 4.5: Nội quan của cá chết ở NT I.1, lách sưng to và sậm màu
(ngày thứ hai của thí nghiệm )

31

Hình 4.6: Cá ở NT IV.2 có dấu hiệu xuất huyết nặng toàn thân
(ngày thứ tư của thí nghiệm)

31

Hình 4.7: Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh NT III.2 trên NA

35

Hình 4.8:Cấy thuần vi khuẩn trên môi trường Rimler-shott (NT III.3)

35

Hình 4.9: Cá bệnh ở NT I.3 có biễu hiện xuất huyết ở vây hậu môn, vây đuôi,
mắt hơi lồi và xuất huyết (ngày thứ 3 của thí nghiệm)

37

Hình 4.10: Cá ở NT III.3 gan sưng, nhạt màu, có xuất huyết điểm.
Lách sưng to, sậm màu. Xuất huyết trên thành bụng ( ngày thứ 4 của thí nghiệm)37

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ
Bảng

Trang

Bảng 2.1: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các Aeromonads

9

Bảng 4.1: Kết quả các phản ứng sinh hóa định danh Aeromonas hydrophila

26

Bảng 4.2:Chất lượng nước trong thí nghiệm thứ nhất

28

Bảng 4.3:Chất lượng nước trong thí nghiệm thứ hai

28

Bảng 4.4:Mật độ Aeromonas hydrophila gây bệnh lần thí nghiệm 1

29

Bảng 4.5:Tỷ lệ chết trung bình (%) của các nghiệm thức của thí nghiệm 1

34

Bảng 4.6: Tỷ lệ chết trung bình (%) của các nghiệm thức sau thí nghiệm 2

39

Sơ đồ
Sơ đồ 3.1: Bố trí thí nghiệm 1

14

Sơ đồ 3.1: Bố trí thí nghiệm 2

17

Sơ đồ 3.3: Pha loãng vi khuẩn

25

Biểu đồ
Biểu đồ 4.1:Số lượng cá chết từng ngày của thí nghiệm 1

33

Biểu đồ 4.2: Số cá chết tích lũy ỡ mỗi nghiệm thức của thí nghiệm 1

33

Biểu đồ 4.3:Số lượng cá chết từng ngày của thí nghiệm 2

38

Biểu đồ 4.4: Số cá chết tích lũy ỡ mỗi nghiệm thức của thí nghiệm 2

38

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt Vấn Đề
Ngành nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam đang trên đà phát triển và có vai trò quan
trọng trong nền kinh tế quốc dân. Trong đó, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được
coi là một trong những đối tượng nuôi thủy sản phát triển mạnh và có giá trị xuất khẩu
cao. Trước đây, cá tra được nuôi được nuôi chủ yếu ở quy mô hộ gia đình với mật độ nuôi
thấp và nguồn giống từ tự nhiên là chính.
Ngày nay, khi nghề nuôi cá tra phát triển và có giá trị kinh tế cao, để nghề nuôi
càng ổn định và phát triển vượt trội nước ta đã chủ động nghiên cứu thành công công
nghệ sản xuất giống nhân tạo trên cá tra. Đồng thời để đáp ứng nhu cầu về sản lượng và
chất lượng sản phẩm với sự mở rộng thị trường, người nuôi trồng thủy sản đã chủ động
từng bước chuyển đổi sang hình thức nuôi thâm canh. Do đặc tính chịu được môi trường
khắc nghiệt nên cá tra nuôi thâm canh cho năng suất cao.
Tuy hình thức nuôi thâm canh đã đem lại thành công và lợi nhuận đáng kể cho

người nuôi nhưng do phát triển quá nhanh và không theo quy hoạch, mật độ nuôi cao nên
dịch bệnh trên cá tra xảy ra ngày càng nhiều và gây ra thiệt hại lớn. Hơn thế nữa, quản lý
chất lượng nước kém dẫn đến sự ô nhiễm môi trường tạo điều kiện cho các vi khuẩn gây
bệnh cơ hội phát triển cao trong môi trường nuôi như Aeromonas hydrophila. Khi sức
khỏe cá trong ao yếu đi những vi khuẩn cơ hội sẽ xâm nhập phát triển trong cơ thể gây
bệnh cho cá hoặc với mật độ vi khuẩn cao trong ao chúng sẽ làm giảm sức đề kháng của
cá tạo điều kiện cho vi khuẩn nguy hiểm gây bệnh bắt buộc phát triển. Đặc biệt, khi cá bị
stress, sây sát, lở loét…thường thấy Aeromonas hydrophila xuất hiện trong cơ thể cá bệnh
với tần số cao.

1


Aeromonas hydrophila là vi khuẩn cơ hội nên khi gây bệnh thực nghiệm thì tỷ lệ
chết rất thấp hoặc độc lực không đủ mạnh để gây bệnh cho cá. Do đó, cá phải được gây
stress làm suy giảm sức khỏe tạo cơ hội cho vi khuẩn xâm nhập. Có thể gây stress bằng
cách: bố trí với mật độ cao hoặc tạo vết thương như rạch vây. Bên cạnh đó trong nuôi
trồng thủy sản, việc sử dụng một số hóa chất để diệt ký sinh trùng, xử lý nước cũng có thể
gây stress cho cá. Từ đó bệnh do A. hydrophila có điều kiện bộc phát.
Do đó, được sự phân công và tạo điều kiện của khoa Thủy Sản – Đại học Nông
Lâm chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tìm hiểu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Aeromonas
hydrophila trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)”.
1.2 Mục Tiêu Đề Tài
Tiến hành thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm bằng vi khuẩn Aeromonas hydrophila
trên cá tra bằng phương pháp ngâm kết hợp với gây stress cho cá.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc Điểm Sinh Học Cá Tra
2.1.1 Phân Loại
Theo hệ thống phân loại của Tyson Robets và Vidthayvanon, 1991, vị trí phân loại của cá
tra như sau:
Ngành : Chordata
Lớp: Osteichthyes
Bộ: Siluriformes
Họ: Pangasiidae
Giống: Pangasianodon
Loài:Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage,1878).
2.1.2 Phân bố
Cá tra sống chủ yếu trong môi trường nước ngọt, phân bố ở lưu vực sông Mê Kông
(Việt Nam, Lào, Campuchia) và sông Chao Phraya Thái Lan. Ở Việt Nam những năm
trước đây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột cá Tra và cá Basa giống được vớt trên
sông Tiền và sông Hậu .
2.1.3 Đặc điểm hình thái
Cá tra có đầu rộng và dẹp bằng, mắt to, thân thon, dài, phần sau hơi dẹp bên. Thân
có màu hơi xanh và nhạt dần xuống hai bên hông, bụng cá có màu trắng nhạt, phía vây
đuôi hơi vàng, vây lưng và vây đuôi có màu xám đen. Phần cuối vây đuôi có màu hơi đỏ.
Vây lưng và vây ngực có gai cứng mang răng cưa ở mặt sau. Cá tra có hai đôi râu, râu
mép kéo dài chưa chạm đến gốc vây ngực, râu cằm ngắn hơn. Theo Robert và ctv (1991),
số tia vây bụng của cá tra V= 8 – 9. Vây hậu môn A = 31 – 33. Lược mang 28 – 38, bóng

3


hơi chỉ có một ngăn nằm duỗi thẳng trong xoang bụng. (trích bởi Phạm Văn Khánh,
1996).
2.1.4 Điều kiện môi trường sống

Cá tra sống được ở các thủy vực nước chảy và nước tĩnh, cá sống chủ yếu ở các
thủy vực nước ngọt, cũng có thể sống được ở các thủy vực nước lợ với nồng độ muối thấp
(khoảng 7 – 10‰). Nhiệt độ thích hợp cho sự tăng trưởng dao động từ 26 đến 300C. Nhờ
có cơ quan hô hấp phụ nên cá tra có thể sống trong các môi trường nước có hàm lượng
oxy hòa tan thấp. pH tối ưu: 6,5 – 8 (ở pH = 5 cá mất nhớt, râu teo, hoạt động chậm chạp,
khi pH = 11 cá có biểu hiện mất nhớt (Dương Tấn Lộc, 2004).
2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng
Cá tra là loài cá ăn tạp thiên về động vật. Cá tra khi tiêu hết noãn hoàng thích ăn
mồi tươi sống và có thể ăn thịt lẫn nhau nếu không được cho ăn đầy đủ hoặc giữ trong bể
ấp với mật độ dày.
Khi lớn lên, cá có tính ăn tạp thiên về động vật và cũng dễ dàng chuyển đổi loại
thức ăn. Trong ao nuôi, cá tra có khả năng thích nghi với loại thức ăn, kể cả những loại
thức ăn bắt buộc như mùn bã hữu cơ, cám, rau, phân hữu cơ, thức ăn hỗn hợp, động vật
đáy…
2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng
Cá tra sau khi tiêu hết noãn hoàng có chiều dài từ 1,0 – 1,1 cm. Cá có thể đạt đến
chiều dài 2 – 3 cm và có khối lượng trung bình là 0,52 g sau 14 ngày ương. Cá ương năm
tuần tuổi có chiều dài từ 5,0 – 6,0 cm và trọng lượng trung bình là 1,28 -1,50 g. Sau một
năm tuổi, cá có thể đạt trọng lượng từ 1,2 – 1,5 kg. Sau 3 - 4 năm tuổi, cá có thể đạt 3 – 4
kg. Nhìn chung cá tra có tốc độ sinh trưởng nhanh nhưng tốc độ tăng trưởng của cá tùy
thuộc vào mật độ nuôi, chất lượng thức ăn, chế độ chăm sóc và độ tuổi của cá (vì sau
khoảng 2-3 năm tuổi thì sự sinh trưởng của cá giảm xuống do cá bắt đầu có sự tích cho
quá trình thành thục sinh dục, bắt đầu có sự tạo trứng và tạo tinh (Mai Đình Yên và ctv.,
1992))

4


2.1.7 Đặc điểm sinh sản
Trong tự nhiên, tuổi thành thục của cá tra từ 3 – 4 năm, trọng lượng trung bình từ 5

-6 kg/cá thể với chiều dài tối thiểu là 60 cm. Vào mùa thành thục (từ tháng 4 trở đi), cá có
tập tính bơi ngược dòng di cư tìm đến bãi đẻ, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự
phát triển của tuyến sinh dục và đẻ trứng. Vì vậy, cá không đẻ tự nhiên ở phần sông
Mekong của Việt Nam. Bãi đẻ của cá nằm ở khu vực từ địa phận Cratie của Campuchia
trở lên. Tại đây, có thể bắt được những cá bố mẹ có trọng lượng 15 kg với buồng trứng đã
thành thục. Tại bãi đẻ, cá bố mẹ đẻ trứng thụ tinh tự nhiên, trứng dính vào cây cỏ thủy
sinh ven bờ. Sau khi nở, cá bột trôi theo dòng nước về hạ lưu đến các vùng ngập nước ở
Campuchia và xuôi theo sông Mekong về phía việt Nam.
Sức sinh sản của cá tra khoảng 13900- 15000 trứng/kg cá cái (trích bởi Nguyễn
Thị Bảo Ngọc, 2005).
2.2 Một Số Quan Điểm Về Bệnh
Bệnh là biểu hiện trạng thái bất thường của cơ thể sinh vật với sự biến đổi xấu của
môi trường xung quanh, cơ thể nào thích ứng thì tồn tại, không thích ứng thì mắc bệnh và
chết. Hay nói cách khác, bất cứ sự thay đổi trạng thái nào đó của cơ thể hoặc bộ phận cơ
quan nào ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của cơ thể sinh vật được gọi là bệnh.
Căn cứ vào nguyên nhân gây bệnh có thể chia ra 2 loại bệnh: bệnh truyền nhiễm và
bệnh không truyền nhiễm.
Bệnh truyền nhiễm thường do vi khuẩn, nấm, virus gây ra. Tính chất lây truyền
mạnh và có thể thành những ổ dịch lớn gây chết hàng loạt và có thể nhầm lẫn với nhiễm
độc hóa học. Bệnh không truyền nhiễm do môi trường, dinh dưỡng, độc tố.
2.3 Tổng Quan Về Các Phương Pháp Gây Bệnh Thực Nghiệm
† Phương pháp tiêm
Đây là cách gây bệnh bằng cách đưa trực tiếp vi khuẩn gây bệnh vào cá qua đường
tiêm. Thông thường ta tiêm vi khuẩn vào xoang bụng hoặc cơ.
Ưu điểm :
-

Liều vi khuẩn giống nhau ở mỗi cá thể gây bệnh.

-

Tỷ lệ chết ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau rất rõ.
5


-

Thời gian cá bệnh ngắn do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu.

Khuyết điểm
-

Có thể gây sốc, stress, gây tổn thương cho cá do kỹ thuật tiêm không đúng có khả
năng ảnh hưởng đến tỷ lệ chết.

-

Không giống con đường vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá trong điều kiện tự nhiên.

† Phương pháp ngâm
Vi khuẩn được pha với nước sau đó cho cá vào ngâm. Thời gian ngâm ngắn từ 1-5
phút, thời gian ngâm dài từ 30-60 phút.
Ưu điểm:
-

Khả năng xâm nhập vi khuẩn gần giống với tự nhiên.

-

Ít gây stress cho cá hơn so với phương pháp tiêm.

Khuyết điểm:
-

Có thể gây stress do ngâm trong bể có diện tích nhỏ.

-

Tỷ lệ cá chết giữa các nồng độ vi khuẩn khác nhau do lượng vi khuẩn xâm nhập khác
nhau giữa các cá thể cá khác nhau.
Cá yếu: Vi khuẩn nhiều.
Cá khỏe: Vi khuẩn ít.

Ngoài ra còn có một số trường hợp gây bệnh khác như:
-

Nuôi chung: Cá bệnh và cá khỏe nuôi chung bể để chúng lây nhiễm với nhau.

-

Qua đường miệng: Tẩm vi khuẩn vào thức ăn cho cá ăn.

-

Sử dụng ống tiêm đưa thức ăn có tẩm vi khuẩn vào dạ dày cá.

-

Gây mê cá sau đó nhỏ vi khuẩn vào mũi cá.

(Theo Nguyễn Hữu Thịnh, 2009)
2.4 Đặc Điểm Chung Về Bệnh Do Vi Khuẩn Aeromonas hydrophila
2.4.1 Sơ lược về bệnh
Bệnh xuất hiện chủ yếu vào các tháng có nhiệt độ nước cao. Bình thường vi khuẩn
hiện diện khá phổ biến trong môi trường nước, nhất là trong nước có nhiều chất hữu cơ.
Cả cá tra và cá basa đều dễ nhiễm bệnh. Cá con mẫn cảm với bệnh hơn cá trưởng thành,
khi bệnh xảy ra tỷ lệ chết từ 30% - 70% tùy thuộc vào cách quản lí và chăm sóc.
6


2.4.2 Tác nhân gây bệnh
Aeromonas hydrophila là trực khuẩn gram âm có khả năng di động nhờ tiêm mao,
lên men glucose có hoặc không có sinh hơi, đề kháng với vibriostatic agent 0/129 (2,4diamino,6,7-di-isopropyl pteridine), chuyển nitrate thành nitrite. Có thể phân lập vi khuẩn
từ cá bệnh trên môi trường Tryptic soy agar (TSA), Nutrient agar (NA) hoặc Brain-heart
infusion agar (BHIA). Vi khuẩn tạo thành các khuẩn lạc tròn, nhẵn, lồi có màu vàng. Khi
phát triển trên môi trường chọn lọc Rimler Shotts cho các khuẩn lạc có màu vàng. Vi
khuẩn có thể phát triển ở 50C, bị tiêu diệt ở 700C trong 5 phút (Huang và ctv. 1993)
Aeromonas hydrophila là một vi khuẩn khá phổ biến ở các ao hồ nước ngọt, đặc
biệt là khi có sự hiện diện của nồng độ cao các chất hữu cơ (Kaper và ctv, 1981). Ngoài
ra, nó còn là một vi khuẩn bình thường của đường tiêu hóa của cá (Trust và ctv, 1974).
Theo Eisa và ctv (1994), sự hiện diện của A. hydrophila trong đường ruột của cá rô phi
nuôi và trong tự nhiên lần lượt là 10% và 2,5%.
Aeromonas hydrophila được biết đến như là một mầm bệnh cơ hội. Thuật ngữ
“mầm bệnh cơ hội” ngụ ý rằng A. hydrophila luôn luôn có khả năng gây bệnh nếu có cơ
hội. Như đã nói ở trên, A. hydrophila hiện diện khá phổ biến trong tự nhiên và thậm chí
còn được tìm thấy trong đường ruột của cá khỏe mạnh. Do đó trong tự nhiên nhiễm trùng
của cá đối với A. hydrophila có lẽ chỉ là một vấn đề nhỏ. Tuy nhiên, với các hệ thống nuôi
cá thâm canh với mật độ dày đặc, cho dù các hệ thống này là ao hồ hoặc trong bể thì sự
bùng phát của bệnh đối với cá nuôi là vấn đề đáng quan tâm. Sự xuất hiện của bệnh này
thường liên quan đến yếu tố stress hoặc tình trạng sức khỏe của cá. Chẳng hạn như mật độ

nuôi dày đặc, tình trạng dinh dưỡng kém, chất lượng nước kém... là các nguyên nhân làm
cho dịch bệnh do A. hydrophila dễ dàng bùng phát. Nhiều nghiên cứu cho thấy cá được
nuôi trong các môi trường có chất lượng nước xấu như nitrite cao, hàm lượng ôxy hòa tan
(DO) thấp, hoặc hàm lượng khí CO2 cao thường dễ bị nhiễm trùng do A. hydrophila.
Theo Ventura và Grizzle (1987) vi khuẩn dễ dàng tấn công gây bệnh cho cá nheo
(Ictalurus punctatus) khi chúng bị các tổn thương trên da. Một nghiên cứu khác của
Peters và ctv (1988) chỉ ra rằng yếu tố stress khi nuôi cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss)
nhỏ với các con cá lớn sau đó cho chúng nuôi chung với cá bị nhiễm A. hydrophila. Sau 1
7


thời gian nuôi chung thì thấy rằng vi khuẩn phân lập từ cá nhỏ gia tăng nhiều hơn với tỷ
lệ cao hơn so với cá lớn. Yếu tố stress của cá nhỏ được căn cứ vào hàm lượng glucose
trong huyết tương tăng cao và sự gia tăng về số lượng bạch cầu.
Các căn bệnh do vi khuẩn này chủ yếu ảnh hưởng đến loài cá nước ngọt như cá
chép, cá rô phi, cá da trơn... và nhiều loài cá nhiệt đới hoặc cá cảnh. Bên cạnh đó nó cũng
có thể ảnh hưởng đến các loài cá nước lạnh. Theo Rahim và ctv (1985) đã phân lập được
A. hydrophila từ vết thương của 4 loài cá nước lợ bao gồm: Cá ngát, cá chẽm, cá mú, cá
trôi đen. Thampuran và ctv (1995) không chỉ phân lập được A. hydrophila từ cá biển tươi
hoặc đã chế biến mà còn phân lập được tại các vùng đánh bắt cá.
Đặc điểm huyết thanh và vaccine: aeromonads có tính kháng nguyên đa dạng nhất
trong các loài vi khuẩn gây bệnh cho cá. Số lượng kháng nguyên đa dạng vốn có trong
nhóm này được thể hiện thông qua kháng nguyên H (tiêm mao) và kháng nguyên O
(thân). Ewing và ctv. (1961) mô tả 12 nhóm kháng nguyên O và 9 nhóm kháng nguyên H.
Mỗi nhóm lại được chia ra thành 1 số serotype. Chdyniecki (1965) cũng đã nhận thấy sự
đa dạng kháng nguyên giữa các chủng aeromonads di động thu được từ cùng một quần
thể cá và ngay cả từ các cơ quan khác nhau của cùng một cá. Vaccine đơn giá dùng để
chống lại bệnh do A. hydrophila thường chỉ cho độ bảo hộ ở mức chấp nhận chống lại các
vi khuẩn tương đồng chứ không tạo được miễn dịch đối với các chủng A. hydrophila khác
(Schaperclaus, 1967). Do sự đa dạng kháng nguyên giữa các chủng A. hydrophila khá

phức tạp do đó các nghiên cứu đều tập trung chú trọng đến việc phát triển vaccine đa giá.
Hơn nữa việc cấp vaccine bằng các tiểu phần kháng nguyên cho hiệu quả bảo hộ tốt hơn
đối với các chủng vi khuẩn khác nhau so với việc cấp vaccine bằng toàn bộ tế bào kháng
nguyên.

8


Bảng 2.1: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các Aeromonads
Đặc điểm sinh lý,
sinh hóa
Di động
Phát triển ở 37oC
Tạo sắc tố nâu
β-galactosidase
Arginine dihydrolase
Lysine decarboxylase
Ornithine
decarboxylase
Simmons’ citrate
H2S production
Urease
Indole
Voges-Proskauer
Gelatin hydrolysis
Aesculin hydrolysis
Phát triển trên KCN
Acid from: Arabinose
Glucose
Inositol

Salicin
Sorbitol
Sucrose

A.hydrophila

A.
sorbia

A.
cavia
-e

+
+
+
+
d
d
+
+
+
+
+
d
+
+

+
+

+
+
d
d
+
+
+
+
+
+
+
d
+
+

+
+
+
+
d
d
+
+
+
+
+
+
+
+
+

d
+
+

Aeromonas salmonicida
Subsp. Subsp. Subsp. Điển
salmo achromo masou hình
nicida
enes
cida
+
d
+
+
+
d
+
+
+
d
d
+
+
d
d
+
d
d
+
d

+
+
d
+
+
y
d
+
+
+
+
+
+
d
d
d
d
d
d
+
+
d
+
+

y: không biết

d: phản ứng thay đổi
2.4.3 Triệu chứng và bệnh tích

Khi cá bị bệnh các gốc vây thường bị xuất huyết, xuất huyết dưới nắp mang, quanh
miệng, hậu môn lồi, sưng đỏ, loét da. Cá bơi lờ đờ, tách đàn, biếng ăn.
Cấp tính: Nhiễm trùng gây chết cá. Cá chết nhiều, xuất huyết ngoài da, khắp cơ thể
và nội quan. Mắt cá bị mờ, lồi, mù, bụng trướng to do tích dịch xoang bụng, gan nhạt
màu, thận sưng. Ruột sau sưng đỏ, lồi ra ngoài hậu môn.Vi khuẩn phát triển mạnh gây
nhiễm trùng toàn cơ thể và hoại tử lan rộng nhiều nội quan chủ yếu là gan và thận.
Bệnh mãn tính: Ổ viêm nhiễm xuất huyết trên da, cá chết rãi rác mỗi ngày, thượng
bì và hạ bì bị tổn thương, cơ bị viêm loét. Ngoài ra, còn thấy xuất huyết điểm giác mạc và
cơ nhưng nội quan không bị hoại tử.
( Nguồn: Nguyễn Hữu Thịnh, 2009)
9


2.5 Phòng Và Trị Bệnh Do Vi Khuẩn Aeromonas hydrophila Gây Ra Trên Cá Tra
Chúng ta cần hạn chế làm cá bị sây sát, phải vệ sinh ao nuôi đúng quy định để môi
trường nước luôn sạch. Bên cạnh đó không nên nuôi với mật độ quá dày để tránh gây
stress cho cá. Cần quản lý các chỉ tiêu chất lượng nước như nhiệt độ, pH, NH3, DO tạo
điều kiện cho cá phát triển khỏe mạnh.
Có thể phòng bệnh bằng cách dùng thuốc tím KMnO4 tắm cá, liều dùng là 4 ppm
đối với cá nuôi trong ao. Xử lý trong 3 ngày liên tục. Định kỳ tắm cá 1-2 tuần/lần hay 1
tháng/lần tùy vào sức khỏe cá.
Khi bệnh xảy ra chúng ta giảm hoặc ngưng cho ăn để hạn chế đến mức tối đa ô
nhiễm nước. Cần vớt bỏ cá bệnh nhằm tránh lây lan bệnh. Tránh lây lan bệnh từ các dụng
cụ nuôi, chim cò…
Dùng thuốc trộn vào thức ăn:
Oxytetracyline: 55 - 57 mg/1kg thể trọng, cho ăn 5 - 7 ngày.
Streptomycin: 50 - 75 mg/1kg thể trọng, cho ăn 5 - 7 ngày.
Kanamycin : 50 mg/1kg thể trọng, cho ăn 5 - 7 ngày.
Nhóm sulfamid: 150 – 200 mg/1kg thể trọng, cho ăn 7 ngày.
( Nguồn: Nguyễn Hữu Thịnh (2009) và Bùi Quang Tề ( 2006)).

2.6 Sơ Lược Về Bronopol

2.6.1 Nguồn gốc và tên gọi
Bronopol được phát triển bởi công ty The Boot Company PLC,

Notthingham,

Anh vào đầu những năm 1960 và được sử dụng lần đầu tiên như là chất bảo quản có tính
kháng khuẩn.
Tên hóa học : 2-bromo-2 nitropropane-1,3diol.
Tên thương mại: Pyceze, Onyxide 500…
Công thức hóa học : C3H6BrNO4.
Cấu tạo hóa học:

10


2.6.2 Vai trò của Bronopol trong thủy sản
Cơ quan Thuốc Thú y Anh (VMD) và Cơ quan Thuốc Thú y Quốc gia Pháp
(ANMV) đã cho phép sử dụng sản phẩm “Pyceze” có hoạt chất chính là Bronopol do
công ty Novartis Animal Vaccines Limited sản xuất để thay thế Malachite Green trong
điều trị bệnh nấm ngoại ký sinh và sát khuẩn trên cơ thể cá.
Trong vùng nước ngọt: Ở vùng nước lạnh và nước ấm Bronopol có độc tính nhẹ
đối với cá, độc tính trung bình với động vật không xương sống. Trong vùng nước lợ,
Bronopol có độc tính nhẹ đối với cá, độc tính trung bình với tôm. Trong vùng nước mặn,
Bronopol có độc tính cao hơn mức trung bình đối với động vật không xương sống. Ngoài
ra, Bronopol còn là hóa chất diệt khuẩn có thể hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, nấm,
tảo...
Theo Lê Long Hồ (2006): Xử lý rửa trứng bằng Bronopol ở nồng độ 10 ppm và 20
ppm cho tỷ lệ trứng nở cao hơn đối chứng nhưng ở nồng độ 40 ppm tỷ lệ trứng nở thấp

hơn ở nồng độ 10 ppm và 20 ppm.
Theo Trần Phương Đại (2007): Về khả năng diệt trùng quả dưa của Bronopol: ở
nồng độ 10 ppm và 20 ppm tắm trong 30 phút và 2 giờ thì cho hiệu quả cao nhất. Về khả
năng diệt khuẩn trong nước và trên cá thì Bronopol có khả năng diệt khuẩn trong nước
nhưng trên cá thì không cao và LC50-24h của Bronopol đối với cá tra là 13,07 ppm.
Một số lưu ý khi sử dụng Bronopol:
- Không sử dụng thuốc đối với trứng cá dùng cho người ăn.
- Không trộn thuốc với chế phẩm khác trong ngâm tắm trị bệnh.
- Không để thuốc dính vào da, mắt.
- Sản phẩm này có thể làm hỏng một vài chất dẻo.
- Bảo quản thuốc ở nhiệt độ dưới 250C.
- Liều lượng sử dụng đúng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Đậy nút kín sau khi sử dụng.

11


CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu
- Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3-5/2010.
- Địa điểm nghiên cứu: Trại Thực Nghiệm Thủy Sản và Phòng thí nghiệm Bệnh
Học Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật Liệu Và Hóa Chất Nghiên Cứu
3.2.1 Đối tượng
+Vi khuẩn Aeromonas hydrophila được phân lập từ cá bệnh ở Long Xuyên.
+ Cá tra giống ở trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản nuôi trong bể xi măng.
+ Cá đạt đến cỡ 15 ± 1,5 g/con thì chọn cá cùng cỡ, khỏe mạnh, không xuất huyết
để tiến hành thí nghiệm.
3.2.2 Dụng cụ

- Hệ thống bể composite có cùng kích thước. Mỗi bể chứa 70 L nước.
- Thau, vợt, xô, cân điện tử, kính hiển vi, lame, bộ dụng cụ tiểu phẩu, ống
nghiệm, đĩa petri, đèn cồn.
- Tủ cấy vi sinh, tủ ủ, máy sấy, nồi hấp Autoclave, máy Votex và một số dụng cụ
cần thiết khác.
3.2.3 Hóa chất
Hóa chất nhuộm Gram: Crystal violet, lugol, chất tẩy màu, Safranin.
Cồn 90o, cồn 70o, nước muối sinh lý, thuốc mê MS222.
Hóa chất thử phản ứng Oxidase : Đĩa giấy oxidase của công ty Nam Khoa hoặc đĩa
giấy có tẩm Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochlorid 1%.
Hóa chất thử phản ứng Catalase: H2O2 30%, dung dịch đệm phosphate.

12


Môi trường: NA (Nutirent Agar), NB ( Nutrient Broth), Rimler Shott (môi trường
chọn lọc đối với Aeromonas hydrophila).
Bộ testkit pH, DO, NH3/NH4.
3.3 Nội Dung Nghiên Cứu
Bố trí gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas hydrophila bằng
phương pháp ngâm :
- Thí nghiệm 1: Gây stress bằng cách rạch vây đuôi, vây ngực.
- Thí nghiệm 2: Gây stress bằng phương pháp ngâm với Bronopol 8 ppm.
3.4 Bố Trí Thí Nghiệm
3.4.1 Sơ đồ gây bệnh thực nghiệm
Vi khuẩn
Aeromonas hydrophila

Gây stress

Gây bệnh bằng phương pháp
ngâm

Quan sát triệu chứng, bệnh tích

Theo dõi tỷ lệ chết

Phân lập, tái định danh vi khuẩn

Kết luận

13


3.4.2 Thí nghiệm 1: Gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas hydrophila
bằng phương pháp ngâm sau khi gây stress bằng cách rạch vây đuôi, vây ngực
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 7 nghiệm thức với 3 lần lập lại
trong 21 bể composite chứa cùng thể tích 70 L. Số lượng cá bố trí là 50 con/bể.
Cá được bố trí thí nghiệm phải được thả trong bể tại phòng gây bệnh 2 ngày nhằm
giúp cá làm quen với điều kiện môi trường.
Nguồn nước cung cấp vào bể là nước máy sinh hoạt đã được trữ trong thời gian
24h để bay hơi chlorine có trong nước.
ĐC I.1

ĐC I.2

ĐC I.3

ĐC II.1

ĐC II.2

ĐC II.3

NT I.1

NT I.2

NT I.3

NT II.1

NT II.2

NT II.3

NT III.1

NT III.2

NT III.3

NT IV.1

NT IV.2

NT IV.3

NT V.1

NT V.2

NT V.3

Sơ đồ 3.1: Bố trí thí nghiệm 1

14


Trong đó:
+ ĐC I : Nghiệm thức đối chứng trong đó cá không bị gây trầy xước và không
ngâm vi khuẩn.
+ ĐC II : Nghiệm thức đối chứng trong đó cá bị gây trầy xước và không ngâm vi
khuẩn.
+ NT I : Nghiệm thức trong đó cá bị gây trầy xước và ngâm trong 5 L nước có pha
500 mL huyền dịch vi khuẩn .
+ NT II : Nghiệm thức trong đó cá bị gây trầy xước và ngâm trong 5 L nước có
pha 50 mL huyền dịch vi khuẩn.
+ NT III : Nghiệm thức trong đó cá bị gây trầy xước và ngâm trong 5 L nước có
pha 5 mL huyền dịch vi khuẩn.
+ NT IV : Nghiệm thức trong đó cá bị gây trầy xước và ngâm trong 5 L nước có
pha 0,5 mL huyền dịch vi khuẩn.
+ NT V : Nghiệm thức trong đó cá bị gây trầy xước và ngâm trong 5 L nước có
pha 0,05 mL huyền dịch vi khuẩn.

Hình 3.1 : Hệ thống bể bố trí thí nghiệm 1
15