ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA BACILLUS SUBTILIS VÀ KHÁNG SINH TRONG VIỆC ỨC CHẾ VI KHUẨN E.COLI

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI- THÚ Y


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA BACILLUS
SUBTILIS VÀ KHÁNG SINH TRONG VIỆC ỨC CHẾ
VI KHUẨN E.COLI

Ngành
Khóa
Lớp
Sinh viên thực hiện

Tháng 7/2010

:Dược Thú y
:2005-2010
:DH05DY
:Nguyễn Ngọc Quỳnh Trâm


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI- THÚ Y

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đệ trình cấp bằng bác sỹ thú y chuyên ngành dược

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA BACILLUS SUBTILIS VÀ
KHÁNG SINH TRONG VIỆC ỨC CHẾ VI KHUẨN E.COLI

Người hướng dẫn
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Ngọc Quỳnh Trâm
Khóa: 2005-2010

TP. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 7 năm 2010

i


LỜI CẢM ƠN
Con biết ơn công ơn sinh thành, dưỡng dục của ba mẹ để cho con được như
ngày hôm nay.
Cảm ơn thầy Nguyễn Ngọc Hải đã động viên, khích lệ và giúp đỡ em trong
suốt thời gian thực hiện đề tài, nhất là đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức với tất cả
sự kiên nhẫn.
Cảm ơn chân thành đến cô Nguyễn Thị Kim Loan, thầy Trương Đình Bảo về
những lời khuyên, sự thân thiện mà các thầy cô đã mang đến cho em trong suốt thời
gian thực hiện đề tài.
Em chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa chăn nuôi thú y về sự dạy dỗ tận
tình trong suốt quá trình học tập của em.
Cuối cùng, cảm ơn tất cả những người bạn của tôi về sự giúp đỡ, động viên và
nhất là tình bạn mà họ đã mang đến cho tôi.

ii

TÓM TẮT
Sau khi phân tích 32 mẫu phân heo, chúng tôi đã thu nhận 64 gốc nghi ngờ, sau
khi quan sát dưới kính hiển vi và thực hiện các phản ứng sinh hóa, 25 gốc được nhận
định E.coli. 14 gốc đã được giữ lại để thực hiện kháng sinh đồ. Tỉ lệ phân lập E.coli là
43,75%.
100% các chủng E.coli được phân lập đề kháng với colistin, 71,43% đề kháng
với ampicilin và 64,29% đề kháng với gentamycin, riêng ofloxacin còn hiệu quả cao
trên E.coli, tỉ lệ nhạy cảm là 85,71%.
54,5% các chủng Bacillus subtilis hiện diện ở phòng thí nghiệm thể hiện khả
năng đối kháng yếu với E.coli.
100% các chủng Bacillus subtilis nhạy cảm với gentamycin và streptomycin,
83,3% nhạy cảm với ampicilin, ngược lại 100% đề kháng với colistin
Không có sự đồng vận giữa Bacillus subtilis và kháng sinh nhưng có một
chủng Bacillus subtilis đối kháng với ampicilin.
Từ khóa : E.coli- Bacillus subtilis- Kháng sinh- Đề kháng- Đối kháng- Tương tác

iii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 3.1: kết quả phân lập mẫu trên môi trường EMB
Hình 3.2: hình thái vi khuẩn nghi ngờ E.coli dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần
Hình 3.3 : Những khu vực ức chế được tạo ra bởi các đĩa giấy tẩm kháng sinh
Hình 3.4 : Những khu vực ức chế được tạo ra bởi những chủng Bacillus subtilis trên
thạch được trải E.coli
Hình 3.5 : Những vùng ức chế được tạo ra bởi canh khuẩn Bacillus subtilis ở các nồng
độ đường 0%, 1%, 2%, 3%.
Hình 3.6 : Những vùng ức chế được tạo ra bởi các đĩa giấy tẩm kháng sinh trên thạch

được trải E.coli.
Hình 3.7 : Đối kháng giữa Bacillus subtilis và ampicilin
Hình 3.8 : Không có sự đồng vận giữa Bacillus subtilis và colistin

iv


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 : Kết quả phân lập E.coli
Bảng 3.2 : Kết quả thực hiện kháng sinh đồ
Bảng 3.3 : Kết quả của thí nghiệm cấy trực tiếp khuẩn lạc Bacillus subtilis và E.coli
trên thạch
Bảng 3.4: Kết quả thí nghiệm đánh giá gián tiếp canh khuẩn Bacillus subtilis đối với
E.coli.
Bảng 3.5 : kháng sinh đồ của các chủng Bacillus subtilis được phân lập

v


DANH SÁCH SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Phân lập E.coli
Sơ đồ 2.2 : Thực hiện kháng sinh đồ
Sơ đồ 2.3 : Kiểm tra khả năng đối kháng trực tiếp của Bacillus subtilis với E.coli
Sơ đồ 2.4 : đọc kết quả của thí nghiệm 3.3.1
Sơ đồ 2.5 : đánh giá gián tiếp dịch cấy Bacillus subtilis với E.coli
Sơ đồ 2.6: tương tác giữa Bacillus subtilis và kháng sinh
Sơ đồ 2.7: đồng vận giữa Bacillus subtilis và kháng sinh
Sơ đồ 2.8: sự trung lập giữa Bacillus subtilis và kháng sinh
Sơ đồ 2.9: Sự đối kháng giữa Bacillus subtilis và kháng sinh

vi


MỤC LỤC
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1

1.ĐẶT VẤN ĐỀ

1

2. MỤC ĐÍCH

2

3. YÊU CẦU

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1. Sơ lược về E.coli

3

2.1.1. Nhắc lại về E.coli

3

2.1.2. Đặc điểm E.coli

3

2.2. Sơ lược về Bacillus subtilis

7

2.2.1. Lịch sử

7

2.2.2. Đặc điểm phân loại

8

2.2.3. Đặc điểm phân bố

8

2.2.4. Đặc điểm hình thái

8

2.2.5. Đặc điểm nuôi cấy

9

2.2.6. Đặc điểm sinh hoá

9

2.2.7. Kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp

9

2.2.8. Độc tính của Bacillus subtilis

13

2.2.9. Ứng dụng của Bacillus subtilis

14

2.3. Kháng sinh và sự đề kháng với kháng sinh

15

2.3.1. Kháng sinh

15

2.3.2. Sự đề kháng với kháng sinh

18

2.3.3. Biện pháp hạn chế sự gia tăng tính kháng thuốc của vi khuẩn.

19

2.4. Kháng sinh đồ

20

2.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng lên kháng sinh đồ

20

2.4.2. Chọn lựa kháng sinh

21

2.5. Phối hợp kháng sinh

22

2.5.2. Mục đích của phối hợp kháng sinh

22

2.5.3. Các phối hợp kháng sinh đồng vận và đối kháng

22

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
vii

23

1. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài

23

1.1. Địa điểm

23

2. Vật liệu

23

2.1. Mẫu

23

2.2. Thiết bị

23

2.3. Chủng Bacillus subtilis

23

3. Phương pháp thí nghiệm

24

3.1. Phân lập E.coli từ phân heo

24

3.2. Thực hiện kháng sinh đồ với các chủng E.coli

26

3.3. Đánh giá khả năng đối kháng của Bacillus subtilis với E.coli

27

3.4. Thực hiện kháng sinh đồ trên các chủng Bacillus subtilis có khả năng đối
kháng với E.coli .

29

3.5 Thí nghiệm đánh giá khả năng tương tác giữa Bacillus subtilis và kháng sinh
trên E.coli.

30

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

33

1. Kết quả phân lập E.coli

33

1.1. Kết quả được ghi nhận

34

1.2. Thảo luận

34

2. Kết quả thí nghiệm thực hiện kháng sinh đồ

35

2.1. Kết quả được ghi nhận

35

2.2. Thảo luận

35

3. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của Bacillus subtilis.
3.1. Thí nghiệm cấy trực tiếp những khuẩn lạc Bacillus subtilis và E.coli.

36
36

3.2. Thí nghiệm đánh giá gián tiếp dịch cấy của Bacillus subtilis đối với E.coli.
3.2.1. Kết quả ghi nhận

37

4. Kết quả thí nghiệm thực hiện kháng sinh đồ với Bacillus subtilis.
4.1. Kết quả ghi nhận

39
39

5. Kết quả thí nghiệm đánh giá sự tương tác giữa Bacillus subtilis và kháng sinh 40
5.1. Kết quả được ghi nhận

40

5.2. Thảo luận

41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Error! Bookmark not defined.
viii


CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.ĐẶT VẤN ĐỀ
E.coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột
của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp thì E. coli gây độc tăng
sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc,
đặc biệt là gia súc còn non gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi.
Do tính chất đề kháng rất nhanh với nhiều loại kháng sinh của E. coli thì việc
sử dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời việc sử dụng kháng sinh dẫn đến

xáo trộn hệ vi sinh vật đường ruột và làm xuất hiện ngày càng nhiều những chủng vi
khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho người tiêu dùng. Chính vì thế, hiện
nay, việc sử dụng các chế phẩm sinh học thay cho kháng sinh giúp cân bằng hệ vi sinh
vật đường ruột và giảm sự đề kháng của kháng sinh đang rất được chú trọng.
Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nhà sản xuất thức ăn gia súc luôn luôn trộn
kháng sinh vào trong sản phẩm của họ, mục đích là để phòng bệnh cho thú. Việc này
gây ra nhiều bất lợi trong việc áp dụng những sản phẩm chứa vi khuẩn có ích. Bacillus
subtilis là vi khuẩn được chọn lựa cho nhiều probiotics được sử dụng trong chăn nuôi,
vì thế thật hữu ích nếu Bacillus subtilis tương tác với kháng sinh trong trường hợp
trộn vi khuẩn này với kháng sinh
Dựa trên ý tưởng này, được sự đồng ý của khoa chăn nuôi thú y trường Đại học
Nông Lâm TP.HCM, bộ môn vi sinh truyền nhiễm, dưới sự hướng dẫn của Phó Giáo
Sư, Tiến Sĩ Nguyễn Ngọc Hải, tôi đã thực hiện đề tài với chủ đề: “Đánh giá sự tương
tác giữa Bacillus subtilis và kháng sinh trong việc ức chế vi khuẩn E.coli.”

1


2. MỤC ĐÍCH
Đánh giá khả năng của Bacillius subtilis khi kết hợp với kháng sinh để điều trị
tiêu chảy do E.coli.
3. YÊU CẦU
-Phân lập E.coli trên phân tiêu chảy
-Thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn E.coli phân lập được.
-Thử độ nhạy cảm với kháng sinh từ kết quả kháng sinh đồ của một vài chủng
Bacillus subtilis có ở phòng thí nghiệm.
-Đánh giá khả năng tương tác giữa:
 Bacillus subtilis với E.coli
 Kháng sinh với E.coli
 Bacillus subtilis kết hợp với kháng sinh trên E.coli

2


CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về E.coli
2.1.1. Nhắc lại về E.coli
E.coli thuộc giống Escherichia họ Enterobactericeae, một kí sinh bình thường
trong đường ruột và được phân lập từ phân của động vật hữu nhũ. Những giống thành
lập nên họ này là những vi khuẩn gram-, rộng 0,5-1µm, dài 1-6µm, thường di động, có
vỏ bọc, có lông và không sinh bào tử, hiếu khí hay yếm khí tuỳ nghi.(dẫn liệu Lê Thị
Mai Khanh, 2004)
Có 5 loài thuộc giống Escherichia:
 E.blattae
 E.coli
 E.fergusonii
 E.hermanii
 E.vulneris
2.1.2. Đặc điểm E.coli
2.1.2.1. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hoá
E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ nghi. Nhiệt độ thích hợp là 35370C, pH thích hợp là 6,4-7,5 (tối ưu nhất là 7,2-7,4).
Trong môi trường lỏng, sau 4-5 giờ, E.coli làm đục nhẹ môi trường, càng để
lâu càng đục, có mùi hôi thối, sau vài ngày có thể có váng mỏng trên bề mặt môi
trường. E.coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng. Trên môi trường EMB,
E.coli tạo khuẩn lạc tím ánh kim. Trên môi trường Macconkey, E.coli tạo khuẩn lạc
đỏ hồng, tròn, lồi.
E.coli lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như lactose,
glucose, manitol.... Người ta căn cứ vào khả năng lên men đường lactose để phân biệt
E.coli với một số vi khuẩn đường ruột khác( dẫn liệu Nguyễn Văn Nghĩa, 2002).
 ONPG(+), Urease(-), H2S(-), LDC(+)

 Nghiệm pháp IMViC: indol(+), methyl red(+), VP(-), simmons citrate(-)

3


2.1.2.2. Cấu tạo kháng nguyên
E.coli có đủ 4 loại kháng nguyên O,H,K,F.
Kháng nguyên O (somatic antigen): có bản chất là lipopolysaccharide của
màng tế bào, bền với nhiệt và cồn, khi đun nóng ở 1000C trong 2 giờ vẫn giữ được
tính kháng nguyên. Kháng nguyên O có thể được phát hiện bằng phản ứng ngưng kết,
kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và
có tính chất chuyên biệt cho từng loại vật chủ. Các E.coli có chung tính kháng nguyên
O thường có sự tương tác lẫn nhau và với nhiều nhóm kháng nguyên O của Shigella,
Salmonella.
Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, là các vi
nhung mao của vi khuẩn, tạo nên khả năng di chuyển của E.coli, kém chịu nhiệt, có 56
type kháng nguyên H.
Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): kháng nguyên K lúc đầu được
xác định bằng phản ứng ngưng kết. Người ta xác định có sự hiện diện của kháng
nguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O khi bị đun
nóng. Có hơn 80 type kháng nguyên K đã được xác định.
Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): tiêm mao dài khoảng 4µm,
đường kính 2,1-7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn. Tiêm mao không tham gia vào sự di
chuyển, ngắn hơn và nhiều hơn flagella. Tiêm mao giúp vi khuẩn kết dính vào tế bào
niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Một vài
E.coli đặc biệt là E.coli tiết độc tố ruột có những lông bám kháng mannose (mannose
ressistant-MR) cũng được dùng để phân loại về mặt huyết thanh học. Một vài lông
bám kháng mannose (ví dụ K88, K89) đã từng được coi là kháng nguyên K. Về sau
khi xác định được thành phần hoá học của những lông bám này có bản chất là protein
nên việc xếp chúng vào kháng nguyên K không còn phù hợp, chúng được xếp vào

nhóm kháng nguyên tiêm mao F.
2.1.2.3. Các chất độc do E.coli tổng hợp nên
Độc tố của E.coli: vi khuẩn E.coli tạo 2 loại độc tố đường ruột (Smith và Oyles,
1970), sự khác biệt giữa chúng là khả năng chịu nhiệt.

4


Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin-LT): độc tố LT của E.coli là
oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả (Cholera
toxin-CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như: cấu
trúc, trình tự acid amine (giống nhau khoảng 80%, tương đồng thụ thể, hoạt tính
enzyme và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào).
LT có 2 nhóm chính là LT-I và LT-II, hai độc tố này không cho đáp ứng miễn
dịch chéo nhau. LT-I được biểu hiện trong các chủng E.coli gây bệnh trên người và
động vật còn LT-II chỉ được tìm thấy trên những chủng E.coli phân lập được trên
động vật và rất ít chủng phân lập được trên người. Tuy nhiên không có bằng chứng
cho thấy LT-II có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập trung
chủ yếu vào LT-I.
LT-I là một oligopeptide, trọng lượng phân tử 86kDa, được cấu tạo từ một tiểu
đơn vị A có trọng lượng phân tử 28kDa và 5 tiểu đơn vị B11, 5 kDa. 5 tiểu đơn vị là B
sẽ gắn vào các thụ thể trên tế bào ruột còn tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tự
phân cắt thành 2 tiểu đơn vị là A1 và A2 liên kết với nhau bằng cầu nối disulfic. LT-I
có 2 loại, LTh-I có độc tính trên người và LTp-I có độc tính trên heo, sau khi độc tố đi
vào nội bào, chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vận chuyển của golgi (golgi
vận chuyển). Mục tiêu của LT trong tế bào là enzyme adenylate cyclase nằm ở lớp
màng ngoài của tế bào biểu mô ruột. Peptide A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase
chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến protein liên kết GTP (GTP-binding protein) là
Gs, gây hoạt hoá enzyme adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) trong tế
bào. Vì vậy, enzyme cAMP sẽ gắn vào và hoạt hoá enzyme protein kinase A. Enzyme

này hoạt động làm phosphoryl hoá kênh clorua nằm ở phía trên màng tế bào biểu mô
ruột vượt quá mức bình thường.
Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl
bởi những tế bào có lông nhung. Do đó, hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng làm
nước bên trong tế bào kéo ngược ra ngoài và dẫn đến hiện tượng tiêu chảy.
LT-II giống với LT-I và CT khoảng 55-57% ở tiểu đơn vị A, nhưng không
giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B. LT-II làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ
chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II sử dụng GD1 làm thụ thể thay vì GM1, tuy nhiên

5


như đề cập ở trên, thì không có bằng chứng cho thấy LT-II gây độc cho tế bào của
người và động vật.
Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin-ST): ST có trọng lượng phân tử nhỏ, trong
cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối disulfic tạo nên khả năng kháng nhiệt của độc tố.
Độc tố này có 2 loại, có cấu trúc và cơ chế hoạt động khác biệt nhau là STa và STb.
STa là một peptide gồm 18-19 acid amine với trọng lượng phân tử khoảng 2
kDa, STa được chia thành 2 loại là STp (ST porcine hay STIa) từ E.coli phân lập được
trên heo và STb (ST human hay STIb) của E.coli phân lập được trên người.
Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C), nó
nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mô ruột. Sự kết hợp của STa vào GC-C kích
thích hoạt tính GC dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào. Hoạt động cuối cùng
dẫn đến sự kích thích tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl gây ra sự tiết chất lỏng
trong ruột.
STb chủ yếu có lien quan đến dòng ETEC phân lập từ heo mặc dù cũng có báo
cáo vài chủng ETEC người cũng sản sinh STb. Không như STa, STb gây ra những tổn
thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô
ruột và teo nhung mao một phần. Thụ thể của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây
người ta cho rằng độc tố có thể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi

vào trong tế bào. Tác động của STb trong tế bào không giống như STa, thay vì phân
tiết Cl- nó lại kích thích tế bào ruột tiết bicarbonate (HCO3-). STb không làm gia tăng
hàm lượng cGMP nội bào mà làm gia tăng hàm lượng calcium nội bào bằng cách hấp
thu từ bên ngoài (dẫn liệu Lê Thị Mai Khanh, 2004).
2.1.2.4. Các chủng E.coli gây bệnh
Đối với các E.coli gây bệnh đường ruột, người ta chia làm 5 loại sau đây:
 Enteroaggregative E.coli (E.A.E.C hay E.Agg.E.C) là nhóm E.coli không
sinh enterotoxin, gây tiêu chảy kéo dài (trên 14 ngày). Trong hầu hết các báo cáo đều
mô tả E.A.E.C ở các ca tiêu chảy lẻ tẻ, nhưng E.A.E.C cũng có thể là tác nhân gây
thành ổ dịch (Vial và cộng sự, 1998).
 Enteroinvasive E.coli (E.I.E.C): rất giống với Shigella về mặt kháng
nguyên sinh hoá và đặc tính gây bệnh. Cả Shigella spp và E.I.E.C đều có khả năng

6


xâm nhập vào tế bào biểu mô kết tràng và chúng đều tiết 1 hay nhiều độc tố ruột liên
quan đến tiêu chảy (H.Lior,1994).
 Enterophathogenic E.coli (E.P.E.C): số lượng rất ít (chỉ nhóm O45 và
O108 là hiện diện trên heo) và thường liên quan đến các trường hợp tiêu chảy trên
những con heo cai sữa và sau cai sữa (Th.Alogninouwa,1994).
 Enterohaemorrhagic E.coli (E.H.E.C): gây tiêu chảy xuất hiện trên cả thú
và người, sản sinh độc tố thần kinh verotoxin (VT) hay độc tố shiga-like (shiga-like
toxin producing E.coli: SLTEC) gây các triệu chứng viêm ruột xuất huyết và hội
chứng viêm huyết niệu (H.Lior,1994).
 Enterotoxigenic E.coli (E.T.E.C): nhóm này gồm những E.coli tạo ra ít
nhất một trong hai loại độc tố đường ruột là ST và LT. Các ST và LT thường có một
hay nhiều yếu tố kết dính (F4, F5, F6, F41)cho phép chúng bám vào các vi nhung mao
ruột. Các nguồn E.T.E.C thường kết hợp với bệnh tiêu chảy trên heo còn bú và thường
thuộc

các

nhóm

huyết

thanh

sau:

O8,

O9,

O138,

O141,

O147,

O149,…(Th.Alogninouwa,1994)
2.1.2.5. Khả năng gây bệnh cho người
 Gây bệnh cho người
E.coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở
đường tiêu hoá. Tuy là vi khuẩn sống cộng sinh với người nhưng E.coli có thể gây
bệnh cơ hội, chúng có thể gây viêm đường tiêu hoá, tiết niệu, sinh dục, đường mật,
đường hô hấp và nhiễm khuẩn huyết, đặc biệt gây viêm dạ dày ruột ở trẻ em.
 Gây bệnh thực nghiệm trên thú
Khả năng gây bệnh cho súc vật yếu, phải đưa một lượng lớn vi khuẩn vào phúc

mạc chuột nhắt hay đường tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết.
E.coli gây bệnh trên heo con theo mẹ hầu hết đều thuộc lớp sản sinh độc tố ruột
hay E.T.E.C.
2.2. Sơ lược về Bacillus subtilis
2.2.1. Lịch sử
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi tổ chức y
học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các chiến sĩ
Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
7


Đến năm 1949-1957 khi Herry, Albot và các cộng sự tách được các chủng
thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó, “subtilistherapie” có nghĩa là sutilin ra đời trị
các chứng viêm ruột, viêm đại tràng , chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá.
Ngày nay vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi
trong chăn nuôi, y học, thực phẩm…(dẫn liệu Nguyễn Duy Khánh, 2006)
2.2.2. Đặc điểm phân loại
Bảng : phân loại Bacillus subtilis
Giới

Bactéria

Ngành

Firmicutes

Lớp

Bacilli

Bộ

Bacillales

Họ

Bacillacae

Giống

Bacillus

Loài

Bacillus.subtilis
(Bergey’s, 2004)

2.2.3. Đặc điểm phân bố
B.subtilis thường có mặt trong đất, nước, không khí, xác bã thực vật thối rửa và
cả trong đường tiêu hoá của người và động vật. B.subtilis hiện diện trong đất với một
số lượng phổ biến là 106-107 CFU/g. Vi khuẩn này có khả năng sinh bào tử để có thể
chịu đựng các điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt và những thay đổi bất lợi của môi trường
sống.Thông thường có khoảng 60% số lượng B.subtilis trong đất tồn tại ở trạng thái
này (Alexander, 1977).
2.2.4. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là các vi khuẩn gram dương hiếu khí, hình trực thẳng, hai đầu
tròn, kích thước 0,5-0,8 µm x 2,5-3 µm. Những vi khuẩn này nằm riêng rẽ hay sắp xếp
với nhau thành những chuỗi ngắn.
Bacillus subtilis có khả năng tạo bào tử dưới dạng hình ovale với kích thước
0,8-1,8 µm ở trung tâm tế bào vi khuẩn.Bào tử của Bacillus subtilis phát triển bằng

cách nảy chồi do sự nứt của vỏ, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm,
tia tử ngoại, phóng xạ…(Tô Minh Châu, 2000). Ngoài ra, Bacillus subtilis còn có khả
8


năng di động nhờ vào hệ thống lông roi phủ trên bề mặt vi khuẩn (Kenethe Todar,
2008).
Trên thạch dinh dưỡng: khuẩn lạc Bacillus subtilis trong mờ và gù lên. Những
khuẩn lạc này có màu trắng kem, bề mặt sáng với viền nhăn nheo. Đường kính khuẩn
lạc từ 3-5 mm. Sau 1-4 ngày nuôi cấy, bề mặt khuẩn lạc trở nên nhăn nheo với màu
nâu nhạt ( Nguyễn Đức Duy Anh, 2005)
Trong môi trường lỏng: Bacillus subtilis tạo những lớp màng mỏng trên bề mặt
sau thời gian nuôi cấy (Kenethe Todar, 2008)
2.2.5. Đặc điểm nuôi cấy
Bacillus subtilis là loài vi khuẩn ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 36560C và nồng độ NaCl có khả năng ức chế vi khuẩn là 10-1 (Lương Đức Phẩm, 2000)
Nhu cầu Oxy: Bacillus subtilis là loài hiếu khí hay yếm khí tuỳ nghi.
Bacillus subtilis có thể phát triển trong những môi trường phức tạp hoặc khá
đơn giản. Sự phân lập bước đầu có thể thực hiện trên thạch dinh dưỡng (peptone 5g/l,
cao thịt 3g/l, agar 15g/l, pH 6,8) hoặc trên J-agar (tryptone 5g/l, chiết nấm men 15g/l,
K2HPO4, glucose 2g/l, agar 20g/l, pH 7,4). (Kenethe Todar, 2008)
2.2.6. Đặc điểm sinh hoá
Các phản ứng sinh hoá được sử dụng để khẳng định Bacillus subtilis: phản ứng
lecithinase (-), khả năng phân giải casein(+), khả năng phân giải tinh bột (+), phân giải
gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP (+), indol (-), lên
men không sinh hơi các loại đường như: glucose, mannitol, saccharose, xylose,
arabinose.
2.2.7. Kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp
Tiềm năng sản xuất các kháng sinh của Bacillus subtilis đã được nhận thấy
khoảng 50 năm trước. Những kháng sinh có bản chất peptide chiếm ưu thế trong các
kháng sinh tổng hợp. Tuy nhiên, các nghiên cứu có hệ thống điều tra về phổ kháng

khuẩn hoàn chỉnh của các kháng sinh tổng hợp bởi các chủng B.subtilis khác nhau thì
vẫn còn hiếm (Pinchuk et al, 2002).
Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 66 loại kháng sinh khác nhau như
subtilin, subtilosin, sublancin, surfactin, bacitracin,…(Katz và Demain, 1997). Phần
lớn các kháng sinh có bản chất peptide tổng hợp bởi Bacillus subtilis có khả năng
9


chống lại các vi khuẩn gram dương (Ming và Epperson, 2002). Tuy nhiên, hỗn hợp
polymyxin, colistin và circulin thể hiện khả năng chống lại vi khuẩn gram âm hay
bacillomycin, mycobacillon và fungistatin có tác động mạnh trên nấm mốc và nấm
men (Katz và Demain, 1997).
Các kháng sinh peptide do Bacillus subtilis tổng hợp được chia thành 2 nhóm
lớn. Đó là các peptide kháng khuẩn tổng hợp dựa vào ribosome (RAMPsRibosomally synthesized Antimicrobial peptides) và những peptide kháng khuẩn tổng
hợp không dựa vào ribosome (non-RAMPs) (Hancock và Chapple, 1999). Các
RAMPs được tổng hợp trong suốt pha phát triển chủ động của B.subtilis, trong khi các
non-RAMPs được tổng hợp sau pha phát triển chủ động của B.subtilis (Tamehiro et al,
2001).
 Các peptide kháng khuẩn tổng hợp dựa vào ribosome (RAMPs)
Các RAMPs do B.subtilis tổng hợp ra bao gồm surfactin, nhóm inturin,
fengycin (Zuber, Nakano, et Marahiel, 1993), bacitracin, bacilysin (Ozcengiz,
Alaeddingolu et Demain, 1990)…
Surfactin: sỡ hữu khả năng kháng khuẩn, chống ung thư, tiêu máu, chống đông,
phân huỷ fibrin. Giống với các biosurfactant mạnh nhất, surfactin có rất nhiều ứng
dụng trong ngành môi trường và công nghệ sinh học. Những khả năng khác của nó đã
được ghi nhận gồm có sự nhũ hoá và chống mycoplasma…(Al-Ajlani et al, 2007)
Nhóm Inturin: những kháng sinh thuộc nhóm này là các hợp chất peptidolipid
có tác động chống nấm rất mạnh. Chúng có một chuỗi β-aminoacide gắn với một nửa
peptide gồm D và L α-aminoacides (Mhamedi et al, 1982).
Fengycin: bao gồm các enzyme (fengycin synthetase)- Fen C, Fen D, Fen A và

Fen B. Fengycin có khả năng kháng nấm rất mạnh.
 Các peptide kháng khuẩn tổng hợp không dựa vào ribosome (nonRAMPs)
Những peptide kháng khuẩn tổng hợp không dựa vào ribosome bao gồm TasA
(Stover và Driks, 1999), subtilosin (Babasaki et al, 1985)
TasA: có phổ kháng khuẩn rộng, được tiết ra trong môi trường nuôi cấy 30
phút sau khi sự tạo bào tử bắt đầu. Nó định vị trong lớp peptidoglycan của bào tử.

10


TasA giúp B.subtilis chiếm ưu thế trong sự hình thành (dẫn liệu Nguyễn Quỳnh
Nam,2006).
Subtilosin: là một bacteriocin có khả năng kháng khuẩn mạnh chống lại
Listeria monocytogenes và Bacillus cereus (dẫn liệu Nguyễn Quỳnh Nam, 2006)
Sublancin: kháng sinh này không tác động lên các vi khuẩn gram âm nhưng nó
có khả năng đối kháng rất mạnh lên các vi khuẩn gram dương. Sublancin là một
bacteriocin bền, không mất hoạt tính sau 2 năm bảo quản trong những điều kiện bình
thường (dẫn liệu Nguyễn Quỳnh Nam, 2006)
Bacilysocine: cấu trúc của bacilysocine là 1-(12-methyltetradecanoyl)-3phosphoglycerol. Bacilysocine thể hiện những khả năng kháng khuẩn nói chung và
khả năng kháng nấm nói riêng. Sự tổng hợp bacilysocine bắt đầu ngay lập tức sau pha
tăng sinh nhưng trước khi sự hình thành bào tử bắt đầu (Tamehiro et al, 2001)
 Những yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp kháng sinh của Bacillus subtilis
 Các khoáng chất thiết yếu
Mặc dù phần lớn các kháng sinh không cần đến ion kim loại cho các hoạt động
của nó nhưng vẫn có rất nhiều kháng sinh cần đến các ion kim loại để hoạt động, ví dụ
như bacitracin (Jamil et al, 2006). Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc
duy trì cấu trúc và chức năng của các kháng sinh này. Những kháng sinh này được gọi
là “metaloantibiotics” theo tiếng anh (Epperson et Ming, 2000)
Các ion kim loại có thể rất thiết yếu cho sự hình thành bacitracin (Weimberg,
1958). Sự sản xuất bacitracin bị ức chế bởi EDTA. Tác động ức chế của EDTA bị đảo

ngược bởi sự thêm vào trong môi trường nuôi cấy lượng dư Mn2+, Co2+, Zn2+ (Haavik,
1974).
 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Trong nghiên cứu “ Phân lập B.subtilis MH4 từ đất và tiềm năng của nó trong
việc sản xuất các kháng sinh polypeptide” của (Jamil et al, 2007), sự ủ trong vòng 96
giờ đã cho ra sự sản xuất kháng sinh tối ưu. Điều này cũng đã được thảo luận trong
nghiên cứu của (Demain, 1972) mà trong đó ông đã kết luận rằng sự tổng hợp của các
kháng sinh polypeptide được bắt đầu sau pha tăng trưởng của vi khuẩn.
 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

11


pH tối ưu cho sự sản xuất kháng sinh của Bacillus subtilis là 8. Tuy nhiên ở pH
từ 6-9 sự sản xuất kháng sinh cũng rất tốt (Jamil et al, 2007). Những sự thay đổi pH từ
bên ngoài ảnh hưởng rất nhiều đến các quy trình tế bào như sự điều hoà sinh tổng hợp
các chất biến dưỡng thứ cấp. Sự sản xuất bacitracin của Bacillus subtilis phụ thuộc
vào pH (Montserrat et al, 2000).
 Ảnh hưởng của nguồn carbon
Người ta đã tìm ra rằng sự hình thành các kháng sinh đạt tối đa khi glycerol
được sử dụng như một nguồn carbon. Tuy nhiên, các hoạt động sản xuất kháng sinh sẽ
tăng đáng kể khi maltose, glucose, sorbitol và lactose được sử dụng như nguồn carbon
(Jamil et al,2007).
 Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Sự tạo các kháng sinh đạt đến tối ưu khi acid L-glutamic được sử dụng làm
nguồn nitơ (Jamil et al, 2007). (Egorov et al, 1986) đã kết luận rằng sự thay thế
glutamate bởi tryptone có thể gây ra sự suy giảm đáng kể sự tăng sinh của vi khuẩn,
sự tích tụ sinh khối cũng như làm dừng quá trình tổng hợp kháng sinh.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nghiên cứu của (Jamil et al, 2007) đã cho thấy rằng nhiệt độ tối ưu cho sự hình

thành các kháng sinh phụ thuộc vào các vi khuẩn kiểm nghiệm, nó là 300C đối với
Staphylococcus aureus, và là 370C đối với Micrococcus luteus. Tuy nhiên, theo
(Anker et al, 1947) thì sự sản xuất kháng sinh này đạt đến tối đa ở 370C.
2.2.7. Tính đối kháng của Bacillus subtilis
 Với vi sinh vật gây bệnh
Hình thức đối kháng chủ yếu của Bacillus subtilis đối với vi sinh vật gây bệnh
là cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh.
Tác dụng chủ yếu của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện ở 3 hướng
chủ yếu sau:
 Làm ngưng tổng hợp thành (màng) tế bào hay làm tan màng tế bào vi
khuẩn và do đó phá huỷ tính chất thẩm thấu của tế bào, các ion Mg2+, Na+, Ca2+ thoát
ra ngoài, tế bào chết.

12


 Ảnh hưởng quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Chất kháng sinh
có thể phong bế quá trình tổng hợp protein bằng cách ngăn cản ribosome tổng hợp
chuỗi polypeptide hay đưa đến tổng hợp protein bất thường.
 Ảnh hưởng đối với acid acetic, cụ thể là phá huỷ sự trao đổi của AND
và ARN bằng cách ức chế men ARN polymerase hay gắn vào các base làm đứt đoạn
chuỗi xoắn kép AND.
Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số
lượng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi
khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn
chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh
trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976, trích dẫn
bởi Lý Kim Hữu).
 Với đồng loại
 Trong môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, Bacillus subtilis đã tạo ra

chất kháng sinh giết chết những tế bào vi khuẩn bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này
nhằm tiêu thụ chất dinh dưỡng giải phóng từ các tế bào này với mục đích kéo dài thời
kì trước khi tạo bào tử (Richard Losik, Jone Gonzales và cộng sự, 1993)
2.2.8. Độc tính của Bacillus subtilis
( Dẫn liệu Nguyễn Nhật Chen, 2008)
 Đối với con người
Một số chủng Bacillus subtilis cũng như họ hang gần của nó là B.licheniformis,
B.pumulis, B.megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một enzyme có khả năng
phá vỡ tế bào của động vật hữu nhũ. Tuy nhiên vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấy
lecithinase gây bệnh trên người.
Một số nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis cũng liên quan đến vài trường hợp
gây ngộ độc thực phẩm.
Bacillus subtilis sản xuất độc tố ngoại bào là subtilisin, mặc dù subtilisin có
độc tính thấp nhưng trong thành phần protein của nó có khả năng gây dị ứng đối với
những người tiếp xúc trong thời gian dài, gây những bệnh như viêm da, viêm đường
hô hấp…

13


Bacillus subtilis có tính độc rất thấp đối với người vì nó sản xuất enzyme ngoại
bào và là tác nhân gây độc nhưng không đủ để có thể gây hại cho người. Ngoại trừ
những trường hợp có đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ thống miễn dịch của người
đang suy yếu. Trong một số trường hợp, người ta vẫn phát hiện Bacillus subtilis ở
những bệnh nhân bị ung thư phổi, hoại thư bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả…. Tuy
nhiên, tỉ lệ các trường hợp này là rất hiếm, chỉ có 2 trong 24 trường hợp nhiễm
Bacillus (trong 1034 ca nhiễm) là do Bacillus subtilis.
 Đối với động vật
Bacillus subtilis được phát hiện trong một số trường hợp bò và cừu sẩy thai.
Tuy nhiên, Bacillus subtilis vẫn không được cho là nguyên nhân gây bệnh.

Bacillus subtilis nhiễm vào và gây tử vong cho muỗi Anophelis aulicifacies gây
sốt rét ở Ấn Độ (I.Geetha và A.M. Manonmani, 2008) và được sử dụng như một tác
nhân kiểm soát sinh học trong nghiên cứu bệnh này.
 Đối với thực vật
Bacillus subtilis gây phân huỷ pectin và polysaccharides của mô thực vật dẫn
đến thối củ khoai tây, gây những vết viêm loét trên một số cây rừng.
2.2.9. Ứng dụng của Bacillus subtilis
Các đặc tính có ích của Bacillus subtilis
-

Sản sinh enzyme amylase, pectinase, protease, lipase, trypsin, urease,
mannose,…

-

Sản sinh các acid hữu cơ: acid lactic, acid acetic làm giảm pH đường ruột.

-

Sản sinh vitamin nhóm B

-

Cạnh tranh vị trí bám dính với vi sinh vật gây bệnh.

-

Sản xuất các kháng sinh ức chế các vi sinh vật gây bệnh.

-

Bacillus subtilis còn được xem là tác nhân kích thích miễn dịch trong điều trị
một số bệnh.
 Trong công nghiệp
Bacillus subtilis được ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất ra enzyme và một

số chất hoá học cho công nghiệp như amylase, protease, inosine, ribosides,
aminoacid,…. Trong đó, protease được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chất tẩy
rửa.
14


 Trong y học
Việc trao đổi gen giữa những chủng thuộc Bacillus subtilis khi chúng cùng phát
triển trong đất đã được biết đến khá lâu. Klier và cộng sự đã chứng minh khả năng
trao đổi plasmide giữa Bacillus subtilis và Bacillus thuringensis. Một số nghiên cứu
chỉ ra rằng Bacillus subtilis chuyển gen có khả năng kích ứng hay làm ức chế khả
năng biểu hiện độc tố hay 1 số thành phần độc tố trong các vi khuẩn trong các bệnh ho
gà, bạch hầu, viêm phổi,… điều này có ý nghĩa rất lớn đối với y học. Tuy nhiên, cũng
còn tồn tại một vấn đề là Bacillus subtilis hoàn toàn có thể nhận được các gen quy
định tính độc từ các vi khuẩn độc có quan hệ tương đối gần về mặt di truyền và gây
hại.
Giáo sư Đặng Đức Trạch, Hoàng Thuỷ Nguyên đã nghiên cứu sản xuất chế
phẩm B.subtilis đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy.
Khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế
phẩm B.subtilis dung điều trị bệnh tiêu chảy trên người.
Năm 1982, bác sĩ Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế
phẩm coli_subtyl (Escherichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát do bệnh tiêu
chảy gây ra ở lợn so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng
tốt.

 Trong nông nghiệp
Bacillus subtilis ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia
solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae,… ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công tác
bảo vệ nông sản sau thu hoạch.
Bacillus subtilis được ứng dụng vào sản xuất các chế phẩm nhằm làm giảm tái
phát bệnh tiêu chảy gây ra trên heo so với điều trị bằng kháng sinh.
2.3. Kháng sinh và sự đề kháng với kháng sinh
2.3.1. Kháng sinh
2.3.1.1. Định nghĩa
Kháng sinh là một chất có nguồn gốc sinh học hoặc tổng hợp, có tác dụng đặc
hiệu lên một giai đoạn chính trong sự chuyển hoá của vi khuẩn (kháng sinh kháng
khuẩn)

15


hay nấm (kháng sinh kháng nấm) (Hồ Huỳnh Quang Trí và Nguyễn Thị
Thanh,1995).
2.3.1.2. Phân loại
Từ lâu, người ta đã dùng cách phân loại dựa vào cơ chế tác động lẫn cấu trúc
hoá học, bao gồm:
-

Kháng sinh tác dụng lên thành vi khuẩn (ức chế sự tổng hợp peptidoglycane)
 Họ β-lactamines
Các kháng sinh họ β-lactamines có khả năng gắn vào một số đạm đặc biệt của

màng bào tương được gọi là các đạm nối penicillines (PBP). Các đạm nối penicillines
này là những men cần thiết cho sự tổng hợp chất peptidoglycane của thành vi khuẩn.
Các kháng sinh thuộc họ β-lactamines gắn vào các đạm này làm cho chúng bị bất

hoạt, sự tổng hợp chất peptidoglycane của thành vi khuẩn bị khiếm khuyết.Các vi
khuẩn khiếm khuyết thành sau đó sẽ bị vỡ ra.
 Nhóm glycopeptides
Vancomycine và Teicoplanine ức chế một trong những giai đoạn cuối cùng của
sự tổng hợp peptidoglycane. Chúng tạo thành một phức hợp dipeptide D-alanyl-Dalanine nằm ở đầu của chuỗi peptidoglycane.
 Fosfomycine
Fosfomycine ức chế men pyruvyl-transferase là men có vai trò quan trọng
trong quá trình tổng hợp peptidoglycane.
-

Kháng sinh tác dụng lên màng bào tương
 Nhóm polymyxine
Các kháng sinh nhóm polymyxine bám lên các phospholipids của màng bào

tương làm biến đổi cấu trúc của màng này. Khi đó, màng bào tương mất đi tính thẩm
thấu chọn lọc, không còn khả năng ngăn các thành phần bào tương thoát ra ngoài.
-

Kháng sinh tác dụng lên sự tổng hợp đạm
 Nhóm Aminosides
Các kháng sinh nhóm aminosides bám vào tiểu đơn vị 30S của ribosome, ngăn

cản việc giải mã di truyền bởi các ARN vận chuyển làm cho sự tổng hợp đạm của vi
khuẩn bị ức chế.
 Nhóm phenicole
16