SO SÁNH TÍNH KHÁNG VÀ ĐA KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH Escherichia coli TRÊN MẪU PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI VÀ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SO SÁNH TÍNH KHÁNG VÀ ĐA KHÁNG KHÁNG SINH CỦA
VI KHUẨN CỘNG SINH Escherichia coli TRÊN MẪU PHÂN
LẬP TỪ NGƯỜI VÀ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

Họ và tên sinh viên: TRẦN NGUYỄN TƯỜNG VI
Ngành: CHẾ BIẾN THỦY SẢN
Niên khóa: 2006-2010

Tháng 7/2010
-1-


SO SÁNH TÍNH KHÁNG VÀ ĐA KHÁNG CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH
Escherichia coli TRÊN MẪU PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI
VÀ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

Thực hiện bởi

Trần Nguyễn Tường Vi

Luận văn được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng Kỹ sư Chế Biến Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn: Th.s Nguyễn Hoàng Nam Kha

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 7/2010

-2-


LỜI CẢM ƠN
Chúng tôi xin cảm tạ:
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm TPHCM.
Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản.
Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Chế Biến Thủy Sản.
Thầy Nguyễn Hoàng Nam Kha.
Cùng toàn thể thầy cô Khoa Thủy Sản, gia đình và bạn bè đã tận tình hướng dẫn
tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và
hoàn thành đề tài này.
Do kiến thức còn hạn chế và là lần đầu tiên thực hiện đề tài này nên không khỏi
có những thiếu sót. Kính mong nhận được sự chỉ dạy, góp ý, phê bình của quý thầy cô
và các bạn.

-3-


TÓM TẮT
Đề tài “ So sánh tính kháng và đa kháng của vi khuẩn cộng sinh E. coli trên mẫu
phân lập từ người và cá tra (Pangasius hypophthalmus)” được tiến hành tại phòng thí
nghiệm Bệnh Học Thủy Sản trường Đại Học Nông Lâm TPHCM từ ngày 28/3/2010
đến ngày 28/6/2010.
Phương pháp đĩa khuếch tán được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này cùng
với mười lăm loại kháng sinh là Ampicillin (Am), Amoxicillin (Ax), Gentamicin (Ge),
Neomycin (Ne), Tetracycline (Te), Doxycycline (Dx), Ciprofloxacin (Ci), Norfloxacin
(Nr), Nalidixic acid (Ng), Trimethoprim/sulfamethoxazole (Bt), Chloramphenicol (Cl),
Nitrofurantoin (Fr), Colistin (Co), Streptomycin (Sm), Kanamycin (Kn).
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 56 chủng E. coli đã được phân lập thuần

trên người từ khoa Chăn nuôi thú y trường Đại Học Nông Lâm, 2 chủng đã được phân
lập thuần từ Đại học Y Dược và 14 chủng phân lập từ 5 mẫu phân từ Bệnh Viện Đa
Khoa Thủ Đức, TPHCM.
Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ trên các chủng E. coli phân lập từ người cho
kết quả như sau:
Về tính kháng kháng sinh: tỷ lệ vi khuẩn E. coli trên người kháng với 15 loại
kháng sinh thử nghiệm lần lượt là Am (78,5%), Ax (77,1%), Ge (18,8%), Ne (20,1%),
Te (72,9%), Dx (28,5%), Ci (22,2%), Nr (22, 2%), Ng (38,2%), Bt (63,2%), Cl
(18,1%), Fr (1,4%), Co (20,8%), Sm (44,4%), Kn (13,2%).
Về tính đa kháng: 85% các chủng E. coli trên người có tính đa kháng (kháng với
hai loại kháng sinh trở lên), 4,2% chủng E. coli nhạy cảm với cả 15 loại kháng sinh
thử nghiệm.
So sánh kết quả kháng sinh đồ của 72 chủng E. coli phân lập từ người với 72
chủng E. coli phân lập từ cá thấy rằng Am, Ax, Bt bị kháng tương đương nhau. Sm là
kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất trong họ Aminoglycosides để trị bệnh cho
người và cá. Ng bị kháng nhiều hơn Ci và Nr trong họ Quinolone. Vi khuẩn E. coli
trên cá kháng Co với tỷ lệ gấp 5 lần trên người. Hai kháng sinh cấm Cl và Fr bị kháng
trên cá với tỷ lệ cao hơn trên người.

-4-


Vi khuẩn E. coli phân lập từ cá thể hiện tính đa kháng cao hơn vi khuẩn phân lập
từ người.

-5-


MỤC LỤC
Trang tựa

Trang
i

Cảm tạ

ii

Tóm tắt

iii

Mục lục

v

Danh sách các chữ viết tắt

vii

Danh sách các bảng – biểu – hình

viii

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU

1

1.1 Đặt Vấn Đề

1

1.2 Mục Tiêu Nghiên Cứu

2

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1 Vi Khuẩn Escherichia Coli

3

2.1.1 Phân loại

3

2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

3

2.2 Định Nghĩa Kháng Sinh, Phân Loại và Cơ Chế Tác Động

4

2.2.1 Định nghĩa kháng sinh

4

2.2.2 Phân loại

4

2.2.3 Cơ chế tác động

5

2.3 Sự kháng thuốc

7

2.3.1 Cơ chế kháng thuốc

7

2.3.2 Nguồn gốc của đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn

8

2.4 Kháng Sinh Đồ

9

2.4.1 Khái niệm

9

2.4.2 Nguyên lý

9

2.4.3 Ứng dụng

10

2.4.4 Môi trường cơ bản để thực hiện kháng sinh đồ

10

2.4.5 Một số ứng dụng đạt được

10

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

14

3.1 Vật Liệu

14

3.1.1 Thời gian và địa điểm

14
-6-


3.1.2 Mẫu

14

3.1.3 Kháng sinh sử dụng

14

3.1.4 Một số vật liệu khác

14

3.2 Phương Pháp Nghiên Cứu

15

3.2.1 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu

15

3.2.2 Làm thuần

15

3.2.3 Thử nghiệm khả năng sinh indol

15

3.2.4 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

16

3.2.5 Giữ giống

17

3.2.6 Định danh vi khuẩn

17

3.2.7 Thử kháng sinh đồ

22

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

24

4.1 Định Danh Vi Khuẩn

24

4.2 Kháng Sinh Đồ

24

4.2.1 Kháng kháng sinh

25

4.2.2 Tính đa kháng

29

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

33

5.1 Kết Luận

33

5.2 Đề Nghị

34

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

-7-


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.

ADH
ADN
ARN
CIT
CLSI
EC broth
EMB
FDA
GEL
I
IND

LDC
Mc
MH
NA
NB
ODC
ONPG
PABA
PGA
R
S
SCA
TDA
TSB
TSI
VP

: Arginine dihydrolase
: Acid Deoxyribonucleic
: Acid Ribonucleic
: Citrate
: Clinical and Laboratory Standards Institute
: Escherichia coli broth
: Eosin Methylene Blue Agar
: Food and Drug Administration, United States
: Gelatinase
: Intermediate
: Indol
: Lysine decarboxylase
: MacConkey Agar

: Mueller Hinton Agar
: Nutrient Agar
: Nutrient Broth
: Ornithine decarboxylase
: O-Nitrophenyl β-D- galactopyrannoside
: p-aminobenzoic acid
: pteroyglutamic acid
: Resistive
: Sensitive
: Simmons Citrate Agar
: Tryptophane deaminase
: Trypticase Soy Broth
: Triple Sugar Iron Agar
: Voges-Proskauer

-8-


DANH SÁCH CÁC BẢNG - BIỂU ĐỒ - HÌNH ẢNH
BẢNG

NỘI DUNG

TRANG

4.1

Vi khuẩn E. coli phân lập từ phân người và phân lập
từ cá tra kháng với kháng sinh

4.2

Tính đa kháng của vi khuẩn E. coli phân lập
từ phân người và E. coli phân lập từ cá tra

BIỂU ĐỒ

NỘI DUNG

4.1

Vi khuẩn E. coli trên người và trên cá tra kháng

29
TRANG

với kháng sinh
4.2

26

26

Tính đa kháng của vi khuẩn E. coli phân lập từ người
và phân lập từ cá tra

30

HÌNH

NỘI DUNG

TRANG

4.1

Kết quả định danh vi khuẩn bằng test API 20E

24

4.2

Vi khuẩn E. coli phân lập từ người kháng với kháng sinh

31

4.3

Vi khuẩn E. coli phân lập từ cá kháng với kháng sinh

32

-9-


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Xã hội ngày càng phát triển, đời sống người dân ngày càng được cải thiện, nhu
cầu về sức khỏe, an toàn thực phẩm được đặt lên hàng đầu. Vấn đề đề kháng kháng

sinh trên hệ vi khuẩn cộng sinh trên người được Tổ chức Y tế Thế giới và Bộ Y tế
quan tâm đặc biệt. Các vi khuẩn này có thể hình thành tính kháng kháng sinh do đột
biến dưới tác dụng của áp lực chọn lọc kháng sinh hoặc do nhận được gene kháng từ
các vi khuẩn kháng khác qua chuỗi thức ăn. Ngoài ra, các vi khuẩn cộng sinh trên
người mang tính kháng kháng sinh cũng có khả năng truyền gene kháng này cho các vi
khuẩn khác, đặc biệt nguy hiểm là các vi khuẩn gây bệnh, gây khó khăn lớn cho việc
điều trị.
Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế nhất trong hệ
vi sinh vật đường ruột của người và các loài động vật. Hầu hết các dòng E. coli không
gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột.
Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá nuôi nước ngọt có sản lượng lớn
nhất ở nước ta hiện nay. Sản lượng cá tra cả năm 2009 thu hoạch ước tính đạt 1.006
nghìn tấn (theo báo cáo của Trung tâm Tin học và Thống kê (Bộ NN&PTNT)), chiếm
39,2% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, cá tra được nuôi công nghiệp
với mật độ cao là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến dịch bệnh (chủ yếu do vi khuẩn) xảy
ra thường xuyên do môi trường nuôi bị ô nhiễm.
Việc sử dụng kháng sinh không đúng liều lượng và thời gian trong điều trị bệnh
trên người cũng như trên cá là nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành tính kháng và
đa kháng kháng sinh trên hệ vi khuẩn cộng sinh. Đánh giá tính kháng và đa kháng
kháng sinh của hệ vi khuẩn cộng sinh trên người, đại diện là vi khuẩn E. coli, là vấn đề
cấp thiết, rất được quan tâm hiện nay. Ngoài ra, việc tìm hiểu khả năng lan truyền tính
kháng này thông qua việc so sánh tính kháng và đa kháng của vi khuẩn cộng sinh
- 10 -


(E. coli) trên người và trên cá tra, một mắt xích trong chuỗi thức ăn, là một định hướng
mới cần được nghiên cứu. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “So sánh tính kháng
và đa kháng kháng sinh của vi khuẩn cộng sinh E. coli trên mẫu phân lập từ người và
cá tra”.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn E. coli từ mẫu phân người.
Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ với 15 loại kháng sinh trên vi khuẩn E. coli
đã được phân lập.
So sánh tính kháng và đa kháng giữa E. coli phân lập từ mẫu phân người và cá
tra.

- 11 -


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vi Khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn Escherichia coli được phân lập và mô tả đầu tiên vào năm 1885 bởi bác
sĩ nhi khoa người Đức Theodor Escherich.
E. coli là trực khuẩn Gram âm không bào tử, di động nhờ chùm mao, kích thước
khoảng 1-1,5 μm. E. coli là vi sinh vật hiếu khí tùy ý, có mặt thường xuyên và chiếm
ưu thế trong ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ở ruột
già. (M. T. Parker, 1983)
2.1.1 Phân loại:
Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn E. coli thuộc:
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Escherichia
2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
E. coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi. Nhiệt độ tối thích là 35 – 37oC
(nhiệt độ phát triển có thể lên đến 45 – 49oC), pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu nhất là
7,2 – 7,4). E. coli có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ
ở 44oC trong môi trường canh EC (Escherichia coli broth), có khả năng sinh indole khi
được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong canh Trypton.
E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar), sau 24 giờ
hình thành những khuẩn lạc dạng tròn màu trắng đục, ướt, bề mặt bóng, kích thước

khoảng 2 – 3 mm.
Trên môi trường thạch EMB (Eosin Methylene Blue Agar), E. coli cho khuẩn lạc
xanh ánh kim.
Trên môi trường thạch MacConkey, E. coli cho khuẩn lạc tròn, lõm ở tâm, màu
đỏ hồng.

- 12 -


Trên môi trường thạch nghiêng TSI (Triple Sugar Iron Agar), E. coli tạo acid /
acid (vàng / vàng). E. coli có khả năng sử dụng cả hai loại đường glucose và lactose,
lên men kị khí glucose và lactose sinh ra acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường dẫn
đến thay đổi màu sắc của môi trường từ màu xanh lá cây chuyển sang màu vàng,
không có khả năng sinh H2S.
Để phân biệt E. coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dựa trên tính chất
sinh hóa đặc trưng của E. coli được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red
(MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt chung là IMViC.
E. coli cho kết quả IMViC là + + - - (Trần Linh Thước, 2002).
2.2 Định Nghĩa Kháng Sinh, Phân Loại và Cơ Chế Tác Động
2.2.1 Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là chất hữu cơ có nguồn gốc sinh học, bán tổng hợp hoặc tổng hợp có
tác dụng ức chế sự phát triển hoặc giết chết vi trùng trên cơ sở tiếp hợp với một điểm
tiếp nhận (receptor) trong quá trình biến dưỡng, dẫn đến sự ngưng trệ quá trình sống
của vi khuẩn (Nguyễn Như Pho, 2004).
2.2.2 Phân loại
2.2.2.1 Theo khả năng diệt khuẩn
a/ Kháng sinh tĩnh khuẩn: làm ngưng sự phát triển của vi khuẩn. Bạch cầu và
đại thực bào diệt khuẩn giúp cơ thể có điều kiện tham gia chống bệnh, ít tái phát bệnh
sau khi ngưng kháng sinh. Thích hợp với các bệnh có diễn tiến chậm, các trường hợp
phòng bệnh. Các nhóm kháng sinh: Tetracycline, Macrolide, Phenicol.

b/ Kháng sinh sát khuẩn: diệt vi khuẩn, thích hợp cho các bệnh nhiễm trùng cấp
tính. Do cơ thể không tham gia chống bệnh nên bệnh dễ tái phát sau khi ngưng kháng
sinh.

Nhóm:

Quinolones,

Aminosides,

Polypeptides,

Betalactams,

Sulfamid+Trimethoprim. (Nguyễn Như Pho, 2004)
2.2.2.2 Theo cấu tạo hóa học
Các kháng sinh được phân loại theo cấu tạo hóa học, từ đó chúng có chung một
cơ chế tác dụng và phổ kháng khuẩn tương tự. Mặt khác, trong cùng một họ kháng
sinh, tính chất dược động học và sự dung nạp thường khác nhau, và đặc điểm về phổ
kháng khuẩn cũng không hoàn toàn giống nhau, vì vậy cũng cần phân biệt các kháng
sinh trong cùng một họ. (Dược lý học 2007, Đại học Y Hà Nội)
- 13 -


Beta-Lactamines: Penicilline G, Ampicilline, Amoxicilline, Cephalosporine
Aminosides: Streptomycin, Gentamycin, Neomycin
Tetracyclines: Oxytetracylin, Chlortetracylin, Doxycyclin, Tetracyclin base
Phenicol: Chloramphenicol, Thiamphenicol, Florphenicol
Sulfamides: Sulfadimidin, Sulfametoxazol, Sulfadimetoxin
Furans: Furaltadone, Furazolidone, Nitrofurantoin

Macrolides: Spiramycine, Lincomycine, Tylosine
Quinolones: Oxolinique, Flumequine, Fluoroquinolones
Polypeptides: Colistine, Polymyxine
Nitroimidazoles: Dimetridazole, Ronidazole
Dyaminopyrimidin: Trimethoprime, Ormethoprime, Pyrimethamine, Diaveridine.
(Nguyễn Như Pho, 2004)
2.2.3 Cơ chế tác động
2.2.3.1 Tác động lên thành tế bào vi khuẩn
Thành tế bào vi khuẩn có cấu tạo từ chất Peptidoglycan gồm nhiều dây
Polysaccharid thẳng dọc và những đoạn ngang Pentapeptid. Polysaccharid gồm nhiều
phân tử đường mang amin: N-acetyl-glucosamine và N-acetyl-muramic (chỉ có ở vi
khuẩn).
Tiến trình hình thành vách tế bào bắt đầu bằng sự chuyển đổi L-alanin thành Dalanin. Sau đó hai D-alanin kết hợp với nhau. Tiếp đến D-alanin dipeptid nối với ba
amino acid khác và một đường N-acetyl muramic acid để tạo thành đường
Pentapeptid.
Pentapeptid kết hợp với Isoprenyl phosphate rồi di chuyển từ tế bào chất ra ngoài
màng tế bào. Tại đây chúng kết hợp với nhau để kéo dài thành chuỗi Peptidoglycan.
Bacitracin ngăn cản tiến trình này bằng cách gắn với Isoprenyl phosphate tạo
phức hợp vô dụng.
Vancomycin ngăn cản sự di chuyển đường Pentapeptid thành chuỗi đa phân tử
bên ngoài màng tế bào.
Giai đoạn cuối là hình thành dây ngang giữa các dây Peptidoglycan bằng cách nối
D-alanin của một chuỗi với diaminopimelic acid của chuỗi kế cận nhờ enzyme
transpeptidase.
- 14 -


β-lactamin ức chế giai đoạn này do cấu trúc của nó giống D-alanin (một vị trí trên
Peptidoglycan mà enzyme gắn vào).
2.2.3.2 Tác động lên màng bào tương

Màng bào tương có nhiệm vụ bao bọc và ngăn cách dịch tương bào. Có tính thấm
chọn lọc, điều hòa sự trao đổi với môi trường bên ngoài.
Kháng sinh thuộc nhóm polypeptid (Colistin, Polymicin) và Polyens (chất kháng
nấm) gắn kết trên các chất hóa học riêng biệt làm xáo trộn chức năng thẩm thấu khiến
các chất trong màng bào tương như Mg2+, K+, Ca2+ thoát ra ngoài (tác động như một
chất tẩy loại cation).
2.2.3.3 Tác động lên sự tổng hợp protein
Nhóm aminosides: bám vào tiểu đơn vị 30S ngăn cản sự giải mã di truyền của
ARN vận chuyển.
Nhóm phenicol: tương tác với aminoacyl và men peptidotransferase, ngăn chặn
các acid amin nối với nhau thành chuỗi.
Nhóm tetracyclines: ức chế sự phóng thích các acid amin từ ARN vận chuyển tại
ribosom.
Nhóm macrolides: ngăn chặn phức hợp acid amin-ARN vận chuyển gắn vào tiểu
đơn vị 50S.
2.2.3.4 Tác động cạnh tranh
Sulfamides đối kháng cạnh tranh với PABA (p-aminobenzoic acid) một tiền chất
để tổng hợp acid folic.
PABA kết hợp với pteroic acid hoặc glutamic acid để tạo ra pteroyglutamic acid
(PGA), chất này giống như một coenzyme trong sự tổng hợp Purin và Timin. Do đó
khi thiếu PABA sẽ gây thiếu Purin, acid nucleic.
Trimethoprim ức chế dihydrofolat reductase ngăn quá trình chuyển hóa
dihydrofolat thành tetrahydrofolat (dạng hoạt động của acid folic).

2.2.3.5 Tác động lên sự tổng hợp các acid nucleic
Rifampicin: ức chế men ARN polymerase.

- 15 -

Nhóm quinolones: ức chế men ADN gyrase cần thiết cho sự nhân đôi phân tử
ADN.
Nhóm nitrofurans: bám vào các base của ADN làm đứt đoạn chuỗi xoắn ADN.
(Nguyễn Như Pho, 2004)
2.3 Sự kháng thuốc
2.3.1 Cơ chế kháng thuốc
2.3.1.1 Vi khuẩn sản xuất enzyme phá hủy tác dụng của thuốc
Ví dụ: Vi khuẩn Staphylococci và các vi khuẩn Gr- có khả năng tiết enzyme
cephalosporinase (β.lactamase) phá hủy kháng sinh cephalosporine, làm cho kháng
sinh này mất tác dụng. Tuy nhiên kháng sinh cephalosporine các thế hệ sau có khả
năng kháng cephalosporinase.
- Ở vi khuẩn Gr- có thể tiết enzyme adenylylase, phosphorylase, acetylase phá
hủy tác dụng của các loại kháng sinh nhóm Aminosides.
- Tương tự, enzyme acetyltransferase của một số vi khuẩn phá hủy tác dụng của
Cloramphenicol.
2.3.1.2 Vi khuẩn làm thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào đối với thuốc
Vi khuẩn có khả năng thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào khiến kháng
sinh không thể đi vào tế bào vi khuẩn. Do đó kháng sinh không thể kìm hãm hay tiêu
diệt vi khuẩn.
Ví dụ : Vi khuẩn E. coli có thể thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào
khiến nhóm kháng sinh Tetracyclines, không thể vào bên trong tế bào để gắn với tiểu
phần 30s của ribosom vi khuẩn E. coli, để ngăn cản ARN vận chuyển chuyển acid
amin vào vị trí A trên ARNm-ribosom để tạo chuỗi polypeptid.
2.3.1.3 Vi khuẩn làm thay đổi điểm tác động của thuốc
Vi khuẩn có khả năng thay đổi điểm tiếp nhận kháng sinh để vô hiệu hóa tác
dụng của kháng sinh.
Ví dụ: Kháng sinh streptomycin sau khi xâm nhập vào vi khuẩn (Salmonella),
gắn với tiểu phần 30s của ribosom, làm vi khuẩn đọc sai mã thông tin trên ARNm
khiến quá trình tổng hợp protein bị gián đoạn. Nhưng vi khuẩn có khả năng thay đổi
cấu trúc điểm tiếp nhận (receptor) tiểu phần 30s của ribosom (do đột biến NST làm

mất hoặc thay đổi một loại protein ở tiểu phần 30s) làm streptomycin không thể gắn
- 16 -


với tiểu phần 30s được, do đó quá trình tổng hợp protein ở vi khuẩn vẫn diễn ra bình
thường.
2.3.1.4 Vi khuẩn có thể thay đổi con đường biến dưỡng để thoát khỏi tác động của
thuốc
PABA (p-aminobenzoic acid) là nguồn nguyên liệu cần thiết cho vi khuẩn tổng
hợp acid folic để phát triển. Do sulfamid có cấu trúc hóa học gần giống với PABA nên
sulfamid đã tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình tổng hợp acid folic của vi khuẩn.
Những vi khuẩn có thể sử dụng trực tiếp acid folic từ môi trường thì đều không chịu
ảnh hưởng của sulfamid. Những vi khuẩn khác có thể thay đổi con đường biến dưỡng
như sử dụng acid folic từ ngoài môi trường hoặc tự tổng hợp PABA trong tế bào mà
không cần PABA từ bên ngoài.
2.3.1.5 Vi khuẩn thay đổi enzyme
Ví dụ: Vi khuẩn nhạy Sulfamides có thể sản xuất ra enzyme tetrahydropteroic
acid synthetase có ái lực cao đối với sulfonamides hơn PABA. Sulfamides sẽ không
gắn với PABA để ngăn cản quá trình tổng hợp acid folic nữa mà gắn với enzyme
tetrahydropteroic acid synthetase. Kết quả là quá trình tổng hợp acid folic vẫn diễn ra
bình thường
2.3.2 Nguồn gốc của đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn
Đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn được chia làm hai loại: đề kháng tự nhiên và đề
kháng thu nhận.
2.3.2.1 Đề kháng tự nhiên
Bản thân vi khuẩn vốn có tính kháng với kháng sinh, ví dụ: streptomycete có một
số gene kháng với kháng sinh do nó sinh ra, hoặc màng tế bào một số vi khuẩn Gram
âm có cơ chế hình thành rào cản ngăn cản sự thẩm thấu xâm nhập của kháng sinh,
hoặc một số vi sinh vật thiếu hệ thống vận chuyển kháng sinh, hoặc thiếu điểm tiếp
nhận kháng sinh.

2.3.2.2 Đề kháng thu nhận:

- 17 -


Phát sinh trong quá trình phát triển của vi khuẩn do có sự thay đổi (đột biến hay
tiến hóa theo chiều dọc) về cấu trúc di truyền nhiễm sắc thể hoặc do thu nhận gene
kháng từ các vi khuẩn cùng hoặc khác loài (tiến hóa theo chiều ngang).
a) Tiến hóa theo chiều dọc: hoàn toàn tuân theo học thuyết tiến hóa của Darwin
– nguyên tắc chọn lọc tự nhiên: sự đột biến ngẫu nhiên trong chromosome (NST) của
một vi khuẩn sẽ tạo ra tính kháng cho vi khuẩn đó trong quần thể. Trong môi trường
chọn lọc kháng sinh, vi khuẩn không đột biến bị tiêu diệt còn vi khuẩn đột biến này sẽ
sống sót và phát triển mạnh.
b) Tiến hóa theo chiều ngang: vi khuẩn nhận gene kháng từ các vi sinh vật
khác. Ví dụ như: streptomycete có gene kháng với streptomycin (kháng sinh do nó
sinh ra), nhưng bằng cách nào đó đoạn gene này thoát ra và đi vào E. coli hoặc
Shigella. Hoặc, khả năng thường xảy ra hơn là một số vi khuẩn đột biến sinh gene
kháng rồi truyền gene này cho các vi khuẩn khác qua các quá trình chuyển gen như:
biến nạp (transformation), tải nạp (transduction) hay tiếp hợp (conjugation). (Kenneth
Todar, 2002)
2.4 Kháng sinh đồ
2.4.1 Khái niệm
Kháng sinh đồ là kỹ thuật để tìm độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh,
hay xác định lượng tối thiểu của kháng sinh ngăn cản sự tăng trưởng của vi khuẩn.
Ðộ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh luôn luôn thay đổi do tính thích
ứng và tính chọn lọc của vi khuẩn khi tiếp xúc với thuốc kháng sinh (Bộ Môn Vi Sinh
Y Học, Trung Tâm Đào Tạo Và Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế TPHCM, 1993).
Có 2 phương pháp làm kháng sinh đồ là: Phương pháp đĩa khuếch tán (định tính
và bán định lượng) và phương pháp pha loãng (định lượng).

2.4.2 Nguyên lý
Các chủng vi khuẩn khác nhau có độ nhạy cảm với các loại kháng sinh ở mức độ
khác nhau, chúng biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính vòng vô khuẩn xung quanh
đĩa giấy kháng sinh có chứa một nồng độ xác định khi có sự tiếp xúc giữa vi khuẩn –
kháng sinh.
2.4.3 Ứng dụng

- 18 -


Được thử nghiệm trên bất cứ vi khuẩn nào gây ra tiến trình nhiễm trùng nhằm
đảm bảo được kháng sinh trị liệu khi không thể đoán trước một cách chính xác độ
nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh nếu chỉ dựa vào định danh vi khuẩn.
Làm kháng sinh đồ để tìm hiện tượng kháng lại kháng sinh của vi khuẩn gây
bệnh, giúp chọn được loại kháng sinh tốt nhất để điều trị bệnh.
Kiểm tra xem thuốc kháng sinh có còn tác dụng với vi khuẩn gây bệnh hay
không.
Thăm dò và điều tra để tìm tính kháng sinh của các dược liệu, áp dụng vào điều
trị và nghiên cứu kháng sinh mới.
2.4.4 Môi trường cơ bản để thực hiện kháng sinh đồ
Thạch Mueller-Hinton (MH agar) là môi trường tốt nhất để thử nghiệm kháng
sinh đồ, các vi khuẩn dễ mọc vì các lý do:
- Cho kết quả có tính lập lại cao khi thử nghiệm kháng sinh đồ với các loại
môi trường.
- Ít ức chế với Sulfamides, Trimethoprime và Tetracycline.
- Thích hợp tăng trưởng cho hầu hết các vi khuẩn dễ mọc. Một số lượng lớn
các dữ liệu và kinh nghiệm là có từ kháng sinh đồ thực hiện trên môi trường
này.
2.4.5 Một số ứng dụng đạt được
Theo Nguyễn Hoàng Nam Kha và các cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu

“Thử nghiệm kháng sinh đồ trên vi khuẩn Gram âm được phân lập từ cá da trơn
(Pangasius spp)” được nuôi bè ở sông Mekong đã cho kết quả 92 chủng vi khuẩn được
phân lập. Trong đó, 11 chủng E. coli có tỷ lệ kháng trên 90% đối với trimethoprimsulphamethoxazole (SXT) và oxytetracycline (OTC). Chloramphenicol (C) và
Ampicillin (AM) bị kháng trên 54%. Tất cả các chủng

E. coli phân lập đều nhạy cảm

với nitrofurantoin (FT).
Theo Arias ML, Monge R, Artavia J, González P. (2000) đã nghiên cứu “Kiểu
nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn Gram âm phân lập từ thức ăn thông ruột”. Nghiên
cứu đã định danh 75 chủng trực khuẩn Gram âm phân lập được từ hỗn dịch thức ăn
thông ruột tại ba trung tâm y tế ở Costa Rica và thử kháng sinh đồ (phương pháp Kirby
– Bauer cải tiến và phương pháp ATB do Biomériaux đưa ra). Kết quả định danh cho
- 19 -


thấy nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế là: Aeromonas spp. (22,7%), Klebsiella spp.
(18,7%), Proteus spp. (18,7%), và Enterobacter spp. (4%). Kết quả thử kháng sinh đồ
(phương pháp Kirby – Bauer cải tiến) còn cho thấy 36% các chủng kháng với
Amoxycillin – Clavulanic acid, 25,3% kháng với Cefalor và 14,7% kháng với
Cefuroxime. Tất cả các chủng nhạy cảm với Imipenem và Ciprofloxacin. Phương pháp
ATB cho kết quả: vi khuẩn thể hiện tính kháng với Amoxycillin (74,6%), Amoxycillin
– Clavulanic acid (34,6%), Ticarcillin – Cefalotine (22,6%) và Piperacilline (2,6%).
Tất cả các chủng đều nhạy cảm với mười loại kháng sinh thử nghiệm khác.
Báo Dược lâm sàng tên tiếng Anh là Clinical Pharmacy Informations (Rational
use of drugs) của đại học Dược Hà Nội số 10/2006 đăng bài “Báo cáo hoạt động theo
dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam sáu tháng
đầu năm 2006” tại 10 bệnh viện tham gia chương trình “ASTS: Antibiotic
Susceptibility Test Surveillance” trong đó có bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Trung
ương Huế, bệnh viện Chợ Rẫy, v.v...Kết quả được thống kê cho thấy: Năm vi khuẩn

gây bệnh thường gặp nhất là : Klebsiella spp 17,8%, E. coli 16,0%, Acenetobacter spp
12,2%, Pseudomonas aeruginosa 11,5% và Staphylocoocus aureus 9,8%. Ở E.coli
kháng sinh hàng đầu Gentamicin và kháng sinh ưa chuộng cefotaxim đã bị đề kháng ở
mức 51,0% và 50,3%. Ceftazidim và Cefepim bị đề kháng ở mức 28,4% và 21,6%.
Kháng sinh dự trữ Ertapenem và Imipenem đã có 2,1% và 1,5% đề kháng. Tại các
bệnh viện miền Bắc, mức độ kháng Ampicillin của E. coli trên 90% ở hầu hết bệnh
viện, trừ Huế 74,4%, bệnh viện Việt Tiệp ở Hải Phòng 84,8%.
Theo Trần Thị Thanh Nga, Võ Thị Chi Mai, Trần Ngọc Sinh đã nghiên cứu
“Tình hình đề kháng kháng sinh ở khoa Tiết niệu, bệnh viện Chợ Rẫy trên 61 mẫu
nước tiểu ở người bệnh điều trị ở khoa Tiết niệu, bệnh viện Chợ Rẫy cho thấy kiểu
mẫu đề kháng thuốc của E. coli như sau : AMX-NAL-SXT-CHL-NOR-CIP-GENCFP. Amoxicillin (16/16 = 100%), Nalidixic acid (16/16 = 100%), TrimethoprimSulfamethoxazole (15/16 = 93,8%), Chloramphenicol (14/16 = 87,5%), Norfloxacin
(14/16 = 87,5%), Ciprofloxacin (13/16 = 81,2%), Gentamicin (12/16 = 75%),
Cefoperazone (11/16 = 68,75%).
Nghiên cứu về những ảnh hưởng đến sức khỏe con người và những xuất bản định
kỳ liên quan đến tính kháng kháng sinh trong sản phẩm thức ăn gia súc đã có những
- 20 -


báo cáo về vi khuẩn kháng kháng sinh phân lập được từ các trang trại và xác gia súc
đang làm tăng thêm mối quan tâm về việc sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp có
thể đóng một vai trò trong việc chọn ra những chủng kháng trong các vi khuẩn gây
bệnh trong thực phẩm. Việc tạo ra những chủng vi khuẩn mang tính kháng kháng sinh
hiện là một vấn đề còn gây tranh cãi. Nhiều người cho rằng việc sử dụng kháng sinh
bừa bãi trong nông nghiệp sẽ tạo ra một nguồn vi sinh vật mang tính kháng trong môi
trường mà có thể gây tác động xấu đến sức khỏe con người thông qua chuỗi thức ăn.
Một số người khác lại cho rằng việc lạm dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh của
con người sẽ làm tăng tính kháng kháng sinh của hệ vi khuẩn cộng sinh trên người và
vi khuẩn trong môi trường. Các nhà sản xuất thuốc thú y cho rằng hiện chưa có đủ
bằng chứng để kết luận là có mối liên hệ giữa việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn
gia súc và sự phát sinh ra các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh. Tuy nhiên tất cả đều

đồng ý rằng, sự lan truyền và sự phổ biến của các vi khuẩn gây bệnh mang tính kháng
kháng sinh là một vấn đề quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng. (Bộ môn Vi Sinh,
Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm (FDA), Trung tâm quốc gia về Nghiên cứu độc
chất, Jefferson, Arkansas, Hoa Kỳ, 2001).
Theo Shannon Brownlee, Washington Post (2000), vi khuẩn kháng thuốc truyền
từ gia súc sang người chủ yếu theo đường ăn thịt sống hoặc nấu không kỹ. Ngoài ra có
thể truyền trực tiếp từ môi trường chăn nuôi ở các trại chăn nuôi gia súc. Vấn đề sử
dụng thay thế nhiều loại thuốc kháng sinh mới cũng là một nguyên nhân làm vi khuẩn
quen thuốc. Trong thực tế, có hàng nghìn loại kháng sinh được sử dụng vào giữa
những năm 1960 và nếu loại nào không hiệu lực thì bác sỹ thay thế ngay bằng loại
khác. Các nhà khoa học đã xác định được những loại vi khuẩn có thể kháng với tất cả
các loại kháng sinh. Trong khi đó, các công ty dược liệu chỉ có một vài loại thuốc mới
trên thị trường. Đến nay FDA đã xác định được những loại kháng sinh mới và quan
trọng như: fluoroquinolones và synercid chỉ để sử dụng cho con người. Còn những
thuốc khác có thể dùng để phòng trị bệnh cho gia súc, nhưng không được cho vào thức
ăn nhằm mục đích tăng trọng. (trích dẫn bởi Nguyễn Quang Sáng, Viện chăn nuôi
nông nghiệp).

- 21 -


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật Liệu
3.1.1 Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm đã được tiến hành từ ngày 28/3/2010 đến ngày 28/6/2010 tại phòng
thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản trường Đại Học Nông Lâm TPHCM.
3.1.2 Mẫu:
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 56 chủng E. coli đã được phân lập thuần
trên người từ khoa Chăn nuôi thú y trường Đại Học Nông Lâm, 2 chủng E. coli đã

được phân lập thuần từ Đại học Y Dược và 5 mẫu phân để phân lập E. coli từ Bệnh
Viện Đa Khoa Thủ Đức, TPHCM.
3.1.3 Kháng sinh sử dụng
Stt
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Kháng sinh
Ampicillin
Amoxicillin
Gentamicin
Neomycin
Tetracycline
Doxycycline
Ciprofloxacin
Norfloxacin
Nalidixic acid

Trimethoprim/sulfamethoxazole
Chloramphenicol
Nitrofurantoin
Colistin
Streptomycin
Kanamycin

Kí hiệu
Am
Ax
Ge
Ne
Te
Dx
Ci
Nr
Ng
Bt
Cl
Ft
Co
Sm
Kn

3.1.4 Một số vật liệu khác
Ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, que cấy, bộ test API 20E.
Tủ cấy, nồi hấp áp lực, tủ sấy, tủ đông, tủ ủ, máy lắc.
- 22 -

Nồng độ

10µg
10µg
10µg
30µg
30µg
30µg
5µg
10µg
30µg
1.25/23.5µg
30µg
300µg
10µg
10µg
30µg


Môi trường: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), Tryptic Soy Broth (TSB),
Mueller Hinton agar (MH), MacConkey Agar (MC), Eosin Methylene Blue Agar
(EMB), Simon Citrate agar (SCA)…
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu
3.2.1.1 Sơ đồ thực hiện phân lập E. coli
Mẫu phân
Cấy trên MC (thử nghiệm lên men lactose)
Chọn khuẩn lạc đặc trưng (đỏ, tròn lõm đặc trưng)
Cấy lại trên EMB (khuẩn lạc phát ánh xanh đặc trưng)
Chọn 1 khuẩn lạc đặc trưng
Cấy trên TSB và SCA
Kiểm tra indole, citrate.

Kết luận sơ bộ E. coli
Định danh kiểm tra bằng API 20E
Kết luận E. coli
3.2.2 Làm thuần
Vi khuẩn sau khi được phân lập thì tiếp tục được làm thuần bằng cách chọn
những khuẩn lạc riêng lẻ từ các đĩa phân lập và tiến hành cấy ria chúng vào đĩa petri
khác với môi trường tương tự như môi trường dùng để phân lập. Tiến hành tiếp tục ít
nhất hai lần đến khi ta quan sát thấy không có khuẩn lạc khác (hình dạng, kích cỡ, màu
sắc).
3.2.3 Thử nghiệm khả năng sinh indol
3.2.3.1 Nguyên tắc
Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật có hệ
enzyme tryptophanase tạo nên indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản
ứng của indol với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminobenzaldehyde

- 23 -

(p-


DMABA). Nhân pyrrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzene của pDMABA tạo nên một phức chất dạng quinone có màu đỏ.
3.2.3.2 Hóa chất thử
Thuốc

thử

Kovacs:

isoamyl

alcohol,

p-Dimethylaminobenzaldehyde,

concentrated hydrochloric acid.
3.2.3.3 Phương pháp thử
Dùng pipet lấy 0,5ml huyền dịch vi khuẩn có thời gian phát triển 18-24 giờ trên
canh TSB (Trypticase Soy Broth) cho vào ống nghiệm nhỏ đã tiệt trùng. Tiếp theo,
nhỏ 1 – 2 giọt thuốc thử Kovacs vào.
3.2.3.4 Đọc kết quả
Phản ứng dương tính: xuất hiện vòng đỏ trên bề mặt canh trường.
Phản ứng âm tính: canh trường không đổi màu.
3.2.4 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
3.2.4.1 Nguyên tắc
Thử nghiệm khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất và nguồn đạm
ammonium. Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm tăng giá trị pH của
môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH
trong môi trường.
3.2.4.2 Hóa chất thử
Môi trường sử dụng là môi trường rắn Simmons Citrate Agar (SCA)
3.2.4.3 Phương pháp thử
Môi trường SCA chứa sodium citrate hoặc potassium citrate làm nguồn carbon
duy nhất, chỉ thị bromothymol blue, pH 6,9. Chỉ thị này có màu vàng ở pH dưới 6,0,
màu xanh lục ở pH trung tính và màu xanh dương ở pH lớn hơn 7,6.
Chủng thuần trên môi trường NA được cấy ria trên bề mặt môi trường SCA trong
ống thạch nghiêng. Ống thạch được ủ ở 35oC trong 24-48 giờ.
3.2.4.4 Đọc kết quả
Phản ứng dương tính: xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh
dương
Phản ứng âm tính: không có khuẩn lạc, môi trường giữ nguyên màu xanh lục.

- 24 -


3.2.5 Giữ giống
Nuôi cấy vi khuẩn E. coli trong canh trường TSB hoặc NB. Sau 18-24 giờ, vi
khuẩn phát triển sẽ làm đục canh trường nuôi cấy. Dùng pipet hút 0,5ml dịch vi khuẩn
vào ống giữ giống đã có sẵn 0.5ml glycerol 50% đã được tiệt trùng. Sau đó đem đi
votex cho đều. Giữ giống ở nhiệt độ -80oC.
3.2.6 Định danh vi khuẩn
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành định danh vi khuẩn E. coli bằng bộ test
API 20E gồm 20 thí nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn Gram [-]
3.2.6.1 Nguyên tắc các phản ứng
a/ ONPG (O-Nitrophenyl β-D- galactopyrannoside)
Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự tổng hợp của hai enzyme là βgalactosidase có vai trò xúc tác sự thủy phân lactose và permease có vai trò vận
chuyển lactose vào bên trong tế bào. Hoạt tính của enzyme β-galactosidase có thể
được xác định dựa vào một cơ chất tổng hợp là O-nitrophenyl-D-galactopyranoside.
Sự thủy phân cơ chất đường này bởi β-galactosidase sẽ phóng thích O-nitrophenol có
màu vàng.
b/ ADH (Arginine dihydrolase)
Phản ứng này đánh giá hoạt tính enzyme decarboxylase của vi khuẩn, có vai trò
xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl của một số amino acid tạo thành amine hoặc
diamine và CO2 trong điều kiện kỵ khí.
Vi khuẩn có arginine decarboxylase sẽ tách nhóm carboxyl của arginine. Sản
phẩm tạo ra là CO2 và putrescine. CO2 sinh ra làm tăng pH môi trường và làm biến đổi
màu chất chỉ thị. Ngoài ra, arginine còn có thể chuyển hóa thành citruline nhờ xúc tác
của enzyme arginine dihydrolase trước khi chuyển hóa thành putrescine và CO2. Do
vậy thử nghiệm argine decarboxylase (ADC) cũng được ký hiệu là ADH.
c/ LDC (Lysine decarboxylase )
Đây là phản ứng đánh giá hoạt tính enzyme decarboxylase của vi khuẩn dùng để

khử nhóm carboxyl của amino acid tạo thành amine hoặc diamine và CO2 trong điều
kiện kỵ khí.

- 25 -