Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại hà nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

UYỄ

Ê

ỨU M

Ị

SỐ Ặ

ESCHERICHIA COLI (
Ừ BỊ, LỢ

A

Ợ

LUẬ Á

ỦY

Í

ỦA V K UẨ

ĨM V E )

Â

LẬ

Ế MỔ

Ế SĨ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học hú y
Mã số
ih

: 62 62 50 10
n

n h

học: 1. S.

uyễn Bá

2. S. ỗ

- 2012

iên

ọc húy


i

L

AM OA

Tôi xin cam đoan: Luận án “Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn
Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội”
là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Những số liệu, kết quả nghiên cứu
nêu trong luận án này là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận án
này đã được cám ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ
nguồn gốc.
ác iả luận án

uyễn hị h nh hủy


ii

L

ẢM Ơ

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hồn thành bản luận án, tơi
ln nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này, tôi
xin cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Đào
tạo Sau Đại học, Khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm, Cơ quan Thú
y vùng I đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo Nghiên
cứu sinh tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo và tập thể cán bộ Chi cục Thú

y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tơi điều tra, lấy mẫu thực hiện đề tài.
Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa
học là TS. Nguyễn Bá Hiên - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và TS. Đỗ
Ngọc Thúy - Viện Thú y đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong q trình thực
hiện đề tài và hồn thành luận án.
Tơi xin cảm ơn PGS.TS. Cù Hữu Phú, ThS. Lưu Thị Hải Yến và tập thể
cán bộ Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia đã giúp đỡ tôi thực hiện đề tài
nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc Ban lãnh đạo và tập thể cán bộ Cơ
quan Thú y vùng I, nơi tôi công tác đã ủng hộ, giúp đỡ tơi trong q trình thực
hiện luận án này.
Tơi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bố mẹ, chồng
và hai con trai cùng các bạn đồng nghiệp, bạn bè đã đồng hành, đóng góp cơng
sức, động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận án.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2012

ác iả luận án

uyễn hị h nh hủy


iii

MỤ LỤ
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục các chữ viết tắt

vii

Danh mục các bảng

ix

Danh mục hình

xi

MỞ ẦU

1

1

Tính cấp thiết của đề tài

1

2

Mục tiêu của đề tài

3

3

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3

4

Những đóng góp mới của luận án

4

h ơn 1
1.1

Ổ

QUA

L

U

Vi khuẩn E. coli

5
5

1.1.1

Phân loại E. coli

8

1.1.2

Đặc tính của vi khuẩn E. coli

9

1.2

Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC)

14

1.2.1

Danh pháp

14

1.2.2

Một số yếu tố độc lực của vi khuẩn nhóm VTEC

15

1.2.3

Vai trị của VTEC khơng thuộc nhóm O157

22

1.2.4

VTEC ở động vật

24

1.2.5

VTEC trong thực phẩm

28

1.2.6

Nhiễm VTEC ở người

29

1.3

Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E. coli và bệnh do chúng gây
ra tại Việt Nam

1.4

31

Phương pháp phát hiện VTEC trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm

32


iv

1.4.1

Phương pháp vi sinh vật

33

1.4.2

Phương pháp miễn dịch học

33

1.4.3

Phương pháp sinh học phân tử

34

1.5

Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng để phân loại vi sinh vật

1.5.1

40

Nguyên tắc

41

1.5.2. Kỹ thuật
1.5.3
h ơn

Ứng dụng của kỹ thuật phân tích PFGE
2

DU
Ê

2.1

42
,

UYÊ

L

U V

44
Ơ

Á

ỨU

Nội dung nghiên cứu

2.1.1

45

Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi
khuẩn VTEC

2.1.3

45

Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y trên địa
bàn Hà Nội

2.1.2

45

45

Tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính cơ bản của những chủng
VTEC phân lập được

45

2.2

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

46

2.3

Đối tượng nghiên cứu

46

2.4

Ngun liệu nghiên cứu

46

2.4.1

Mơi trường, hóa chất, dụng cụ thí nghiệm

46

2.4.2

Các chủng vi khuẩn đối chứng dương và âm

47

Phương pháp nghiên cứu

47

2.5.1

Phương pháp lấy mẫu

47

2.5.2

Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn trong canh khuẩn

2.5

nuôi cấy

48

2.5.3

Phương pháp tiến hành phản ứng PCR

48

2.5.4

Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR

51


v

2.5.5

Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR

52

2.5.6

Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn VTEC

52

2.5.7

Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng
vi khuẩn phân lập được

2.5.8

54

Xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn
gốc khác nhau bằng phản ứng PFGE (Pulsed-field gel
electrophoresis)

2.5.9

55

Xử lý số liệu

56

h ơn 3 KẾ QUẢ V
3.1

ẢO LUẬ

Thực trạng cơng tác kiểm sốt giết mổ, vệ sinh thú y trên địa bàn
Hà Nội

3.1.1

3.1.2

60

Thực trạng vệ sinh tại khu giết mổ gia súc, gia cầm trên địa
bàn Hà Nội

3.1.4

57

Kết quả điều tra điều kiện giết mổ và phương tiện vận chuyển
của các điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội

3.1.3

57

Thực trạng cơng tác kiểm sốt giết mổ tại các điểm giết mổ
gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội

64

Thực trạng điều kiện vệ sinh thú y tại cơ sở kinh doanh, chợ,
tiêu thụ sản phẩm thịt gia súc, gia cầm

3.2

57

69

Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi
khuẩn VTEC

70

3.2.1

Lựa chọn giữa PCR đơn mồi và Multiplex - PCR

70

3.2.2

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu

73

3.2.3

Kết quả thực hiện phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn
E. coli tham chiếu

3.2.4

75

Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR
dùng để xác định VTEC trong môi trường nhân tạo

77


vi

3.2.5

Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp
PCR dùng để xác định VTEC trong mẫu thịt sạch

3.2.6

Quy trình xác định sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong các
mẫu thịt

3.3

83

85

Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm VTEC trên bò, lợn tại các điểm giết
mổ và chợ thuộc địa bàn Hà Nội

3.3.1

Thu thập mẫu

3.3.2

87

Phân lập và giám định đặc tính sinh vật hóa học của các chủng

87

E. coli

89

3.3.3

Kết quả phân lập VTEC trong thịt

93

3.3.4

Kết quả phân lập VTEC từ mẫu lau thân thịt và mẫu phân tại
lò mổ

3.3.5

96

Kết quả xác định các loại độc tố của các chủng VTEC phân
lập được

98

3.3.6

Kết quả xác định serotyp O của các chủng VTEC phân lập được

3.3.7

Kết quả phân tích quan hệ di truyền của một số chủng vi
khuẩn VTEC phân lập được có nguồn gốc khác nhau

KẾ LUẬ V

Ề

Ị

100

103
107

Kết luận

107

Đề nghị

108

Danh mục các cơng trình đã cơng bố có liên quan đến luận án

109

Tài liệu tham khảo

110

Phụ lục

125


vii

DA

MỤ

Á

ỮV Ế

Ắ

A/E

Attaching and Effacing

BHI

Brain Heart Infusion

bp

base pair

BPW

Buffer Peptone Water

Cs.

Cộng sự

CT-SMAC

Cefixime Tellurite Selective Supplement

DNA

Deoxyribonucleic Acid

EaggEC

Enteroaggregative E. coli

E. coli

Escherichia coli

EHEC

Enterohaemorrhagic E. coli

EIEC

Entero invasive E. coli

EPEC

Enteropathogenic E. coli

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent asay

ETEC

Enterotoxigenic E. coli

FDA

Food and Drug Administration

HC

Hemorrhagic colitis

HUS

Hemolytic uremic syndrome

kDa

Kilodalton

LB

Luria Bertani

MR

Methyl Red

mDa

Megadalton

m-TSB

modified Trypticase Soy Broth

NB

Nutrient Broth

OMP

Outer membrane protein

PCR

Polymerase chain reaction

PFGE

Pulsed Field Gel Electrophoresis


viii

SLT

Shiga - like toxin

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TE

Tris-EDTA buffer

TTP

Thrombotic thrombocytopenic purpure

TSB

Tryptic Soy Broth

VK

Vi khuẩn

VP

Voges-Proskauer

VSATTP

Vệ sinh an toàn thực phẩm

VT

Verotoxin

VTEC

Verotoxigenic Escherichia coli

WHO

Tổ chức Y tế thế giới


ix

DAN

MỤ

Á BẢ

Tên bảng

STT

Trang

1.1

Hoạt tính sinh học của các loại VT

19

1.2

Một số enzym cắt hạn chế được dùng cho kỹ thuật PFGE

43

2.1

Trình tự mồi dùng để xác định các gen VT1, VT2 và eae

49

2.2

Thành phần các chất trong phản ứng PCR dùng để xác định các

gen VT1, VT2 và eae

2.3

Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định gen VT1,
VT2 và eae

2.4

50

Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn E. coli
đối chứng dương

2.5

50

51

Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn đối
chứng âm

51

3.1

Số lượng các điểm giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội

59

3.2

Kết quả điều tra điều kiện điểm giết mổ và phương tiện vận
chuyển của các điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội

3.3

Thực trạng vệ sinh của các điểm giết mổ gia súc, gia cầm thuộc
địa bàn Hà Nội

3.4

73

Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex – PCR để phát hiện các
chủng vi khuẩn E. coli đối chứng dương

3.6b

72

Kết quả xác định môi trường thích hợp ni cấy vi khuẩn E. coli
để chiết tách DNA cho phản ứng PCR

3.6a

68

Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR đơn và Multiplex - PCR để

phát hiện một số gen độc lực của VTEC

3.5

62

75

Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex – PCR với
các chủng vi khuẩn đối chứng âm

75


x

3.7

Kết quả nuôi cấy hai chủng vi khuẩn đối chứng dương trên một
số môi trường nuôi cấy

3.8

Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khi
xác định VTEC trên môi trường nuôi cấy

3.9

84

Tổng hợp số lượng và chủng loại mẫu thu thập được tại một số
điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội

3.11

80

Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khi
xác định VTEC trong mẫu thịt sạch

3.10

78

88

Tổng hợp số lượng mẫu thịt thu thập được tại một số chợ trên
địa bàn Hà Nội

89

3.12

Kết quả phân lập chủng E. coli từ mẫu ban đầu

90

3.13

Kết quả kiểm tra các đặc tính của vi khuẩn E. coli phân lập được

91

3.14

Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ mẫu thịt

93

3.15

Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ mẫu lau thân thịt và mẫu phân

96

3.16

Khả năng sản sinh độc tố của các chủng VTEC phân lập được

98

3.17

Kết quả xác định serotyp của các chủng VTEC phân lập được

101


xi

DA
TT

MỤ

Ì

Tên hình

Trang

1.1

Cấu trúc kháng ngun O

12

1.2

Cơ chế tác động của độc tố VT

18

1.3

Nguyên lý của phản ứng PCR

38

1.4

Chu trình nhiệt độ của phản ứng PCR

38

1.5

Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể sau khi xử lý với
enzym cắt hạn chế Sma I với vi khuẩn Haemophilus influenzae.

42

2.1

Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn

53

3.1

Sản phẩm của phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn đối chứng
dương và âm sau q trình điện di

3.2

Kết quả ni cấy chủng FD636 ở các nồng độ pha loãng khác
nhau trên thạch máu

3.3

79

Sản phẩm của phản ứng PCR với nồng độ pha lỗng khác nhau
từ mơi trường LB đã ni cấy chủng FD636

3.4

77

82

Sản phẩm của phản ứng PCR với nồng độ pha lỗng khác nhau
từ mơi trường LB đã ni cấy chủng FD523

82

3.5

Quy trình xác định VTEC trên thịt

86

3.7

Tính chất mọc của E. coli trên mơi trường MacConkey

92

3.8

Tính chất mọc của E. coli trên mơi trường thạch máu

92

3.9

Tính chất mọc của E. coli trên mơi trường EMB

92

3.10

Tính chất mọc của E. coli trên môi trường CT-SMAC

92

3.11

Khả năng lên men sinh hơi một số loại đường của E. coli

92

3.12

Khả năng sinh Indol của E. coli

92

3.13

Sản phẩm của phản ứng PCR từ mẫu thịt sau quá trình điện di

94

3.14

Sản phẩm của phản ứng PCR từ khuẩn lạc riêng biệt của một số
mẫu thịt sau quá trình điện di

95


xii

3.15

Sản phẩm của phản ứng PCR từ mẫu phân và mẫu lau thân thịt
sau quá trình điện di

3.16

Sản phẩm của phản ứng PCR từ những khuẩn lạc riêng biệt của
mẫu phân sau q trình điện di

3.17

98

Kết quả phân tích quan hệ di truyền của vi khuẩn VTEC bằng
phương pháp PFGE

3.18

97

105

Hình ảnh điện di xung trường (PFGE) của một số chủng vi khuẩn
VTEC phân lập được

106


1

MỞ ẦU
1

Tính cấp thiết củ đề tài
Trên phạm vi thế giới, ước tính hàng năm có khoảng 2 tỷ người bị ngộ

độc thực phẩm (Đậu Ngọc Hào, 2011) [2].
Ở Việt Nam, theo ước tính và thống kê của Tổ chức y tế thế giới
(WHO) có khoảng 8 triệu người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm, trong đó
phần lớn xảy ra tại các bếp ăn tập thể, khu công nghiệp, bếp ăn của học sinh.
Năm 2010, cả nước xảy ra 175 vụ ngộ độc thực phẩm, làm hơn 5.000 người
mắc và 42 trường hợp tử vong. Thiệt hại kinh tế cho chi phí điều trị bệnh và
nghỉ làm việc khoảng 8 triệu USD/năm (Phương Thuận, 2011) [101].
Các con số trên đây cho thấy một thực trạng đáng lo ngại về vấn đề vệ
sinh an tồn thực phẩm (VSATTP). VSATTP có vai trò rất quan trọng đối với

cuộc sống con người, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, tuổi thọ, chất lượng
môi trường, chất lượng cuộc sống, phát triển kinh tế và uy tín thương hiệu sản
phẩm, uy tín quốc gia.
Trong số rất nhiều nguyên nhân vi sinh vật gây ra các vụ ngộ độc thực
phẩm ở người (Salmonella, E. coli, Vibrio cholera, Listeria, Clostridium
botulinum ...), những năm gần đây, các vi khuẩn E. coli thuộc nhóm
Verotoxigenic (VTEC) ngày càng được biết đến như là một trong những tác
nhân quan trọng. Verotoxigenic E. coli là khái niệm dùng để chỉ nhóm các vi
khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra độc tố Verotoxin hoặc Shiga-like toxin.
Các chủng VTEC là nguyên nhân gây ra các ca bệnh lẻ tẻ hoặc các ổ dịch
lớn bệnh viêm ruột xuất huyết (HC) và hội chứng urê huyết (HUS), ban xuất
huyết giảm tiểu cầu (TTP), viêm đường niệu (Urinary tract infections), viêm
màng não (meningitis) (XU và cs. 1999) [92]; (Lake và Cressey, 2002) [49].
Mặc dù E. coli O157: H7 vẫn được biết đến như là một serotyp chính


2

phân lập được từ các vụ dịch ở hầu hết các quốc gia, các chủng VTEC thuộc
các serotyp khác cũng đã được chứng minh là có mối liên quan chặt chẽ với
các vụ dịch tương tự như serotyp O111 ở Canada, Italia, Đức và Australia,
O103 ở Pháp, Italia và O104 ở Mỹ.
Ở rất nhiều quốc gia, VTEC là tác nhân gây bệnh tiêu chảy rất hay gặp
(Wachsmuth, 1994) [95]. Ví dụ, ở Đức, VTEC được phân lập từ trẻ em bị tiêu
chảy là nguyên nhân vi khuẩn thường gặp đứng thứ 2, sau Salmonella và ở
Áo, VTEC là nguyên nhân thường gặp thứ 3, sau Salmonella và
Campylobacter (Allerberger và cs. 1996) [12].
Gần đây nhất, tháng 6 năm 2011, một đợt dịch do E. coli đã bùng phát
tại Đức và nhanh chóng lan ra các quốc gia châu Âu khác. WHO cho biết,
trên phạm vi tồn thế giới có hơn 1.270 ca nhiễm và 552 ca tiến triển thành

HUS; con số tử vong lên tới 18 người bao gồm 17 trường hợp ở Đức và 1
trường hợp ở Thụy Điển. Nguyên nhân của đợt dịch được xác định là do rau
quả bị nhiễm E. coli O104. Vụ dịch này gây tổn thất nặng nề tới nền kinh tế
thuộc liên minh châu Âu (EU), ước tính mỗi tuần người nơng dân tại đây thất
thu 200 triệu euro (tương đương 290 triệu USD).
Ở động vật, VTEC là nguyên nhân gây ra chứng viêm ruột xuất huyết
và tiêu chảy ở bò, gây phù đầu ở lợn. Động vật nhai lại, đặc biệt bê và bò là
nguồn tàng trữ mầm bệnh tiềm tàng và việc tiêu thụ các loại thực phẩm (thịt
bê, bò, các sản phẩm sữa) chưa qua xử lý kỹ là nguyên nhân chính gây ra các
trường hợp bị bệnh ở người do VTEC. Các nghiên cứu tại một số quốc gia về
sự tạp nhiễm phân ở các trang trại chăn ni bị sữa, đã chỉ ra sự dao động rất
lớn về tỷ lệ nhiễm của các chủng VTEC thuộc nhóm O157 (từ 0,2 đến 48,8%)
và khơng thuộc nhóm O157 (từ 0,4 đến 74,0%).
Trong những thập kỷ gần đây, ô nhiễm vi khuẩn E. coli thuộc nhóm
VTEC sản sinh độc tố Verotoxin (VT) trong thực phẩm đã trở thành đề tài
nghiên cứu của nhiều tác giả vì tính nghiêm trọng của các bệnh do vi khuẩn


3

này gây ra ở người (Bergamini, 2007) [16]. Việc xác định chính xác loại vi
khuẩn thuộc nhóm này là rất cần thiết, do mối nguy hại của vi khuẩn này liên
quan đến các nạn dịch tiêu chảy trầm trọng ở người và khả năng truyền lây
bệnh của chúng thông qua thức ăn có nguồn gốc động vật. Hiểu biết về các
đặc tính của vi khuẩn VTEC ở thịt các lồi động vật ni (bị, lợn…) làm thực
phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống
cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phịng chống bệnh thích hợp. Nhiều
cơng trình nghiên cứu đã được thực hiện và công bố ở hầu khắp các quốc gia
trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam vấn đề này vẫn chưa được chú ý.
Để có được những hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC trong thực trạng

giết mổ và chế biến thực phẩm tại Việt Nam, chúng tôi đặt vấn đề thực hiện đề
tài: "Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC)
phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội ”
2

Mục tiêu củ đề tài
- Xác định đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được từ

bị, lợn tại điểm giết mổ.
- Xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong
sản phẩm thịt tươi.
3

Ý n hĩ

h

học và thực tiễn củ đề tài

- Đề tài luận án là cơng trình nghiên cứu có hệ thống về vi khuẩn
E. coli nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta xác định và hiểu được
một số đặc tính cơ bản của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập được từ bị, lợn.
- Một số kỹ thuật mới và phương pháp phân tích kết quả có hệ thống
của đề tài luận án có thể ứng dụng trong nghiên cứu một số vi khuẩn khác ở
mức độ phân tử cũng như tài liệu giảng dạy về vi khuẩn nhóm VTEC.
- Hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC ở các lồi động vật ni làm thực


4

phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống
cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phịng chống bệnh thích hợp.
4

hữn đón

óp m i củ luận án

- Đề tài luận án là cơng trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu đặc tính
của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bị, lợn tại cơ sở giết mổ và một số sản
phẩm thịt bò, lợn bày bán trên một số chợ tại địa bàn Hà Nội.
- Thiết lập thành công phương pháp Multiplex PCR để xác định vi
khuẩn nhóm VTEC trên thịt trong điều kiện Việt Nam.
- Sử dụng phương pháp PCR, PFGE để xác định các yếu tố độc lực của
vi khuẩn E. coli và xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có
nguồn gốc khác nhau.


5

h ơn 1
Ổ
1.1

QUA

L

U

Vi huẩn E. coli
Hơn 100 năm trước, năm 1885, bác sỹ nhi khoa người Đức Theodore

Escherich đã lần đầu tiên mơ tả một lồi vi khuẩn phân lập được từ phân của
một bệnh nhân nhi. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacterium coli commune, và
sau nhiều lần đổi tên, vào năm 1919, vi khuẩn này được gọi với một tên thống
nhất là Escherichia coli, viết tắt là E. coli. Từ đó đến nay, E. coli được xác
định là loài vi khuẩn thường gặp nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của
người và động vật (Vu Khac Hung, 2004) [91].
E. coli là loài chủ yếu của giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae.
Chúng là những vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn. Quan sát dưới
kính hiển vi thường thấy vi khuẩn đứng riêng hoặc thành đôi. Phản ứng
Catalase dương tính, Oxidase âm tính, hiếu khí tùy tiện, có thể di động nhờ
lông (flagella) hoặc không di động. Hầu hết các chủng vi khuẩn đều lên men
đường Lactose, một số lên men chậm và một số không sinh hơi. Thơng
thường, E. coli có phản ứng Citrate âm tính, Methyl Red (MR) dương tính,
Voges - Proskauer (VP) âm tính và Indol dương tính. E. coli là vi khuẩn
thường thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật; từ đó E. coli được
thải vào nước, đất và đồng cỏ, không chỉ nhiễm lan trong đàn mà có thể
nhiễm vào một số sản phẩm nông nghiệp như rau, củ,...
Từ đầu những năm 1940, một số ý kiến cho rằng vi khuẩn E. coli là tác
nhân gây một số bệnh ở trẻ em. Doyle và Padhye (trích dẫn từ Bray và
Beavan, 1989) [28] gọi vi khuẩn này là Bacillus coli typ neopolitanum, mà
sau này được gọi là nhóm O111, và thuộc lớp EPEC. Từ đó, những nhóm
E. coli khác được thừa nhận là nguyên nhân gây tiêu chảy. Các vi khuẩn


6

E. coli gây bệnh có độc lực rất khác nhau và có khả năng gây ra một số bệnh
nghiêm trọng. Một số chủng sản sinh độc tố gây phá hủy tế bào Vero và Hela,
tương tự như độc tố do Shigella dysenteriae typ 1 sản sinh ra. Những độc tố
này được gọi với những tên khác nhau như Verotoxin, Verocytotoxin hoặc
Shiga-like toxin. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tên gọi thống nhất
là Verotoxin (VT) và các vi khuẩn có khả năng sản sinh độc tố này được gọi
là Verotoxigenic Escherichia coli, viết tắt là VTEC.
Trong những năm gần đây, các chủng E. coli gây tiêu chảy được chia
thành ít nhất 5 nhóm. Đó là E. coli gây độc ruột (ETEC - Enterotoxigenic
E. coli) - sản sinh độc tố ruột nhưng không xâm nhập, E. coli xâm nhập ruột
(EIEC - Entero invasive E. coli) có khả năng xâm nhập tế bào biểu mơ ruột,
E. coli gây bệnh tích ruột (EPEC - Enteropathogenic E. coli) có khả năng bám
dính vào tế bào biểu mơ và gây bệnh tích bám dính và xâm nhập (Attaching
and Effacing - A/E), E. coli gây ngưng kết (EaggEC - Enteroaggregative
E. coli) có khả năng bám dính vào tế bào biểu mơ nhờ một cơ quan giống
lông nhung và khuếch tán vào trong biểu mô ruột. Nhóm cuối cùng là VTEC
gây bệnh viêm ruột xuất huyết, huyết niệu và ban xuất huyết giảm tiểu cầu ở
người. Trước đây, VTEC là một phân nhóm của EPEC vì chúng cũng có khả
năng gây bệnh tích A/E ở biểu mô ruột của động vật cảm thụ. Nhưng khi phát
hiện một số chủng của VTEC có khả năng sản sinh độc tố VT để trợ giúp cho
yếu tố bám dính này, chúng đã được tách ra thành một nhóm riêng là VTEC.
E. coli O157: H7 hiện nay là chủng VTEC được báo cáo nhiều nhất gây
ra các vụ dịch lớn ở nhiều nước gồm cả Mỹ (MacDonald và Osterholm, 1993)
[55], Canada (Waters và cs. 1994) [96], Anh (Thomas và cs. 1996) [88] và
Nhật Bản (Bettelheim, 1997) [17]. Vi khuẩn này được xác định là một trong
các tác nhân gây ngộ độc nguy hiểm nhất trong các bệnh phát sinh do ngộ độc
thực phẩm gây nên hội chứng huyết niệu (Phạm Thị Tâm và cs. 2009, trích
dẫn theo Griffin, 1995) [6].

7

Vụ dịch đầu tiên được báo cáo vào năm 1982, E. coli O157: H7 được
xác định là nguyên nhân gây viêm ruột xuất huyết ở Mỹ. Trong một thập kỷ
sau đó, vi khuẩn này đã trở thành một vấn đề lớn liên quan đến sức khỏe cộng
đồng, được chính phủ nhiều nước quan tâm. Vụ dịch lớn nhất được báo cáo
xảy ra ở Nhật Bản trong tháng 7 - 8/1996, với 9.578 ca bệnh được ghi nhận và
11 người chết, 90 bệnh nhân được xác định là bị HUS. Vụ dịch lớn thứ hai xảy
ra ở Mỹ, với 732 ca bệnh trong đó 4 người chết, 55 người bị HUS hoặc TTP.
Mặc dù, serotyp O157: H7 là typ vi khuẩn nổi bật nhất của nhóm VTEC, một
số serotyp khác của nhóm này cũng liên quan tới một số bệnh ở người. Hơn
nữa, sự tồn tại của các serotyp này là khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau.
Có hơn 100 serotyp VTEC được xác định dựa trên kháng nguyên O có khả
năng gây một số bệnh nghiêm trọng ở người như HC, HUS, TTP.
Ở nhiều nước, VTEC là một tác nhân gây tiêu chảy thông thường
(Wachsmuth, 1994) [95]. VTEC gây nên các triệu chứng khác nhau, từ gần
như không có triệu chứng gì, có hoặc khơng có triệu chứng đau bụng nhẹ, đến
những triệu chứng nặng hơn như HC, HUS hoặc TTP. Đối tượng thường bị
nhiễm VTEC là trẻ em dưới 5 tuổi hoặc người già. Ở những người trưởng
thành và trung niên, các triệu chứng có thể nhẹ như bị tiêu chảy nhưng không
xuất huyết. Điều này xảy ra khi bị nhiễm ở liều thấp, dưới 100 vi khuẩn. Ở
động vật, VTEC gây viêm ruột xuất huyết và tiêu chảy ở trâu bị, chúng cũng
có thể gây bệnh phù đầu ở lợn (Đỗ Ngọc Thúy, 2004) [8].
Hầu hết các vụ dịch VTEC, thường do serotyp O157: H7, có liên
quan tới sử dụng thịt bị chưa chín kỹ, và một số thực phẩm tương tự hoặc
sữa tươi. Truyền qua thực phẩm là phương thức lây truyền chủ yếu của
VTEC. Vật ni, đặc biệt là trâu bị, là nguồn tàng trữ VTEC chính (Beutin
và cs. 1993) [18]. Trong q trình giết mổ, động vật mang trùng có thể
truyền vi khuẩn sang thịt qua phân, nhiễm chéo sang thân thịt của các gia

8

súc khác qua tay người giết mổ và dụng cụ lò mổ. Hiện nay, người ta vẫn
chưa khẳng định được liệu tất cả các chủng VTEC phân lập được từ động
vật có gây bệnh cho người hay khơng.
Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm của Việt Nam quy định : vi
khuẩn này khơng được phép có mặt trong 1g các loại thực phẩm như thịt hộp,
rau quả muối, nước uống, sữa và các sản phẩm từ sữa.
Ở Việt Nam, có rất ít thơng tin về VTEC ở những động vật mang trùng,
thân thịt sau khi giết mổ và thực phẩm. Hiện nay trên thị trường thế giới có rất
ít bộ kít phát hiện VTEC ngồi nhóm O157 (kit PCR DNA vịm, VTECLAMP). Do đó, các phương pháp phát hiện nhanh VTEC ở Việt Nam cần
phải được phát triển để xác định được vai trò của vi khuẩn này ở động vật
mang trùng và các sản phẩm từ động vật.
1.1.1 Phân loại E. coli
E. coli có thể được chia thành các nhóm dựa trên bệnh lý mà chúng gây
ra, vị trí các kháng ngun, định typ phage, thơng tin về plasmid và khả năng
sản sinh yếu tố dung huyết. Tuy nhiên, các phản ứng huyết thanh học thường
được sử dụng và hiệu quả khi phân loại E. coli (Hanna Evelina SidjabatTambunan, 1997) [38].
Năm 1944, Kauffman là người đầu tiên đưa ra một phương pháp phân
loại vi khuẩn E. coli dựa trên đặc điểm huyết thanh học, và cùng với một số
cải tiến, phương pháp này vẫn được áp dụng cho tới ngày nay. Theo đó, vi
khuẩn E. coli được phân loại dựa theo các kháng nguyên bề mặt, gồm có
kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên lông H (Flagellar) và kháng
nguyên giáp mô K (Capsular) (Lior, 1996) [53].
Mặc dù, E. coli được phân loại dựa trên 3 loại kháng nguyên này nhưng
kháng nguyên O và H thường được sử dụng nhiều hơn. Do đó, thuật ngữ
serotyp chỉ được sử dụng khi hai kháng nguyên này đã được xác định. Khi chỉ

9

có kháng nguyên O được xác định, các vi khuẩn E. coli được xếp thành nhóm
kháng nguyên O (serogroup O). Hiện nay, nhóm E. coli dựa trên kháng
nguyên O đã được xác định được đánh số từ O1 đến O173 (trừ 7 nhóm đã bị
loại : O31, O47, O67, O72, O93, O94, O122).
1.1.2 Đặc tính của vi khuẩn E. coli
1.1.2.1 Đặc tính hình thái
E. coli là trực khuẩn ngắn, hai đầu trịn, có kích thước 2 - 3 x 0,6 µm.
Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, đứng riêng rẽ, đôi
khi xếp 2 - 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài. Vi khuẩn không sinh nha bào và
không bắt màu với các thuốc nhuộm axit. Vi khuẩn có lơng và có khả năng di
động (Nguyễn Như Thanh và cs. 2001) [7]. Khi quan sát dưới kính hiển vi
điện tử, một số chủng vi khuẩn nhất định có mang cấu trúc fimbriae hay cịn
gọi là yếu tố bám dính (Nguyễn Thị Liên Hương, 2010) [4].
1.1.2.2 Đặc tính ni cấy
E. coli là trực khuẩn hiếu khí tùy tiện. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh
trưởng và phát triển của vi khuẩn này là 370C, pH thích hợp là 7,4; nhưng vi
khuẩn cũng có thể phát triển được ở mơi trường có pH từ 5,5 - 8,0 (Nguyễn
Như Thanh và cs. 2001) [7].
Vi khuẩn E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông
thường, một số chủng có thể phát triển được ở mơi trường tổng hợp đơn giản.
- Mơi trường thạch thường: hình thành những khuẩn lạc dạng S trịn,
ướt, bóng láng khơng trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 3mm. Ni lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát
thấy cả những khuẩn lạc dạng R và M.
- Môi trường nước thịt: phát triển rất nhanh, tốt, mơi trường đục đều có
lắng cặn màu tro nhạt dưới đáy, đơi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi
phân thối.

10

- Mơi trường MacConkey: khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, trịn nhỏ,
hơi lồi, rìa gọn, khơng làm chuyển màu môi trường.
- Môi trường thạch máu: khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền khơng gọn, màu
xám nhạt, một số chủng có khả năng gây dung huyết.
- Môi trường CT-SMAC: khuẩn lạc trịn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, màu hồng
cánh sen (lên men đường Sorbitol) hoặc màu trắng đục (không lên men đường
Sorbitol).
- Môi trường Simmon citrate: khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục.
- Môi trường Endo: khuẩn lạc màu đỏ.
- Mơi trường EMB: khuẩn lạc màu tím đen.
- Mơi trường SS: khuẩn lạc có màu đỏ.
1.1.2.3 Đặc tính sinh hóa
- Đặc tính lên men và sinh hơi các loại đường: vi khuẩn E. coli có khả
năng lên men và sinh hơi một số loại đường như: Glucose, Fructose,
Galactose, Lactose, Manitol, Levulose, Xylose; lên men không chắc chắn với
các loại đường như: Dulcitol, Saccarose, Salixin.
Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi nhanh đường Lactose, cịn vi khuẩn
Salmonella spp. khơng có đặc tính này. Đây chính là đặc điểm quan trọng để
phân biệt với E. coli và Salmonella.
- Đặc tính khác:
+ Vi khuẩn làm đơng vón sữa sau 24 - 72 giờ nuôi cấy ở 370C
+ Vi khuẩn không làm tan chảy gelatin
+ Các phản ứng: Indol, Catalase, MR dương tính; Citrat, Oxidase, VP,
Urease, H2S âm tính. Vi khuẩn E. coli có khả năng khử nitrat thành nitrit, khử
cacboxyl trong mơi trường lysine decacboxylase.
1.1.2.4 Sức đề kháng
Vi khuẩn E. coli có sức đề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt độ 550C trong 1

11

giờ hoặc 600C trong 30 phút, đun sôi ở 1000C thì chết ngay. Các chất sát trùng
như axit phenic 3%, HgCl2 0,5%, formol 1-2% có thể tiêu diệt vi khuẩn nhanh
trong 5 phút.
Trong phân, chất độn chuồng ẩm ướt, thiếu ánh sáng mặt trời, vi khuẩn
có thể tồn tại trên 2 tháng. Vi khuẩn E. coli có khả năng đề kháng với sự sấy
khơ và hun khói. Những chủng E. coli trong phân có xu hướng đề kháng với
nhiệt cao hơn những chủng phân lập được ở môi trường bên ngồi. Ở mơi
trường bên ngồi, các chủng E. coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng
(Gross W. G. 1994) [34].
1.1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli được chia làm các serotyp khác nhau dựa trên cấu trúc
kháng nguyên O, K, H và F. Cho đến nay, có ít nhất 173 kháng ngun O, 89
kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H đã được xác định (Gyles, 2004) [35];
(Orskov và Orskov, 1992) [67].
1.1.2.5.1 Kháng nguyên O (Somatic antigen)
Kháng nguyên O còn gọi là kháng nguyên thân, bản chất là
polysaccharide. Polysaccharide là một thành phần của lipopolysaccharide, đây
là thành phần cơ bản cấu tạo nên màng ngồi của vi khuẩn gram âm. Kháng
ngun O có khả năng chịu được nhiệt độ, các chất cồn và axit HCN 1N.
Cấu trúc phân tử lipopolysaccharide gồm 3 phần: gồm chuỗi lipit A,
một vùng lõi và chuỗi polysaccharide (kháng nguyên O). Khi làm mất dần
từng đơn vị đường của các chuỗi polysaccharide hoặc làm thay đổi vị trí ở các
đơn vị này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của vi khuẩn. Thành phần lipit trong
kháng nguyên có tác dụng quyết định độc tính của vi khuẩn E. coli.
Kháng nguyên O không phải là một kháng nguyên đơn (single antigen)
mà gồm một số thành phần và thường được gọi là nhóm kháng nguyên O. Các
nhóm kháng nguyên O khác nhau có thể có một vài thành phần kháng nguyên

12

chung, và do đó có thể gây phản ứng chéo giữa các nhóm. Phản ứng chéo với
các vi khuẩn khác cũng đã được ghi nhận như Shigella, Salmonella và
Citrobacter (Winkle và cs. 1972) [100].

ình 1.1. ấu trúc hán n uyên O (M i n và M rtin , 2006) [56].
KDO: ketodeoxyoctonate, Hep: hepto, Glu: gluco, Gal: galasto, GluNac:
Nacetylglucosamine, GlcN: glucosamine, P: phosphate
1.1.2.5.2 Kháng nguyên H (Flagella antigen)
Kháng nguyên H được cấu tạo bởi thành phần lơng của vi khuẩn, có
bản chất là protein. Việc xác định kháng nguyên H chỉ phù hợp khi khả năng
di động của vi khuẩn được thể hiện tốt qua một hoặc vài lần cấy chuyển trên
môi trường bán cố thể. Hầu hết các kháng nguyên H đều có tính đặc hiệu cao,
ít hoặc khơng có phản ứng chéo. Các chủng không di động được ký hiệu là
NM (Non motile) hoặc H-.
Kháng nguyên H kém bền vững hơn so với kháng nguyên O, kém chịu
nhiệt, bị phá hủy trong cồn 50% và các enzyme tiêu hóa protein, không bị tác
động khi xử lý bằng formol 0,5% .
Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng
ngưng kết. Phản ứng xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O và các hạt
ngưng kết cũng lớn hơn, giống như những cụm bông. Do vậy, vi khuẩn có