Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro cây diệp hạ châu (phyllanthus urinaria l )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM THỊ HỒNG LOAN

NGHIÊN CỨU TÁI SINH ĐA CHỒI IN VITRO
CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM THỊ HỒNG LOAN

NGHIÊN CỨU TÁI SINH ĐA CHỒI IN VITRO
CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA L.)
Ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã số: 8.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ TÂM

THÁI NGUYÊN - 2018


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận
văn là trung thực và chưa được ai công bố.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2018
Tác giả

Phạm Thị Hồng Loan

i


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận văn, em nhận được sự quan tâm giúp đỡ
của nhiều cá nhân và cơ quan đơn vị. Nay luận văn đã hoàn thành, em xin bày
tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu
và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu, em đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật
viên Trần Thị Hồng (Phòng Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học
Sư phạm - Đại học Thái Nguyên). Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý
báu đó.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Bộ môn Sinh học hiện đại
và Giáo dục sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện quá trình nghiên cứu.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô giáo Khoa
Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng
dạy, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và
bạn bè đã giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian học tập.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2018

Tác giả

Phạm Thị Hồng Loan

ii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ...........................................................................................................iii
DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ v
DANH MỤC HÌNH............................................................................................. vi
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 4
1.1. Giới thiệu chung về cây Diệp hạ châu........................................................... 4
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại .................................................................................. 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố sinh thái của cây Diệp hạ châu ................. 4
1.1.3. Kỹ thuật trồng Diệp hạ châu ....................................................................... 5
1.1.4. Tác dụng của một số thành phần hóa học trong cây Diệp hạ châu ............ 7
1.1.5. Một số bài thuốc dân gian từ cây Diệp hạ châu ......................................... 9
1.2. Quy trình nhân giống in vitro ........................................................................ 9
1.3. Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật ................. 11
1.3.1. Auxin ........................................................................................................ 12
1.3.2. Cytokinin .................................................................................................. 13

1.4. Một số nghiên cứu nuôi cấy cây dược liệu bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro ....... 14
1.4.1. Tình hình nuôi cấy in vitro cây dược liệu trên thế giới ............................ 14
1.4.2. Tình hình nuôi cấy in vitro cây dược liệu ở Việt Nam............................. 16
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 19
2.1. Vật liệu, hoá chất ......................................................................................... 19
iii


2.1.1. Vật liệu thực vật........................................................................................ 19
2.1.2. Hóa chất, thiết bị ....................................................................................... 19
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 19
2.2.1. Pha môi trường nuôi cấy........................................................................... 19
2.2.2. Khử trùng hạt ............................................................................................ 20
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ và kết hợp của chất kích thích sinh
trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin đến sự phát sinh chồi, sự sinh
trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ..................................................... 20
2.2.4. Nghiên cứu môi trường tạo rễ .................................................................. 21
2.2.5. Nghiên cứu giá thể đưa cây ra tự nhiên .................................................... 22
2.2.6. Xử lí và tính toán số liệu .......................................................................... 23
2.3. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................... 23
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 24
3.1. Kết quả khử trùng hạt .................................................................................. 24
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc
nhóm cytokinin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân
mang mắt chồi bên .............................................................................................. 26
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ
đọan thân mang mắt chồi bên ............................................................................. 26
3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi
từ đoạn thân mang mắt chồi bên ......................................................................... 28

3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA, BAP và
IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt
chồi bên ............................................................................................................... 30
3.3.1. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến phát sinh chồi và sự sinh
trưởng của chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên.................................. 31

iv


3.3.2. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự
sinh trưởng của chồi tái sinh từ mắt chồi bên ..................................................... 33
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA đến khả năng
ra rễ của chồi Diệp hạ châu trong ống nghiệm ................................................... 34
3.4.1. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Diệp hạ châu ............ 35
3.4.2. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Diệp hạ châu .............. 36
3.5. Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây
con trong vườn ươm ........................................................................................... 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................ 40
PHỤ LỤC

v


DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D

:

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

BAP

:

6-Benzylaminopurine

CS

:

Cộng sự

CT

:

Công thức

ĐC

:

Đối chứng

DNA

:

Deoxyribonucleic acid

IAA

:

Indole-3-acetic acid

IBA

:

Indole-3-butyric acid

Kinetin

:

6-furfurylaminopurine

MS

:

Murashige và Skoog, 1962

NAA

:

Naphthalene acetic acid

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt (sau 10 ngày) ................................................. 24
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của
chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ............................................... 27
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng
chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ............................................... 29
Bảng 3.4. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và NAA đến sự phát sinh
chồi và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên......... 31
Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và IBA đến sự phát sinh
chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên .... 33
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ (sau 8 tuần)...................... 35
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ (sau 8 tuần)...................... 37
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sinh trưởng của Diệp hạ
châu (sau 45 ngày) ............................................................................. 39

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Diệp hạ châu ................................................................................. 5
Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP 1,0mg/l đến phát sinh chồi và sự sinh
trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau 8 tuần)................ 28
Hình 3.2. Ảnh hưởng của kinetin 1,0mg/l đến phát sinh chồi và sự sinh
trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau 8 tuần) ................ 30
Hình 3.3. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và NAA 0,8mg/l đến sự

phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt
chồi bên (sau 8 tuần) ......................................................................... 32
Hình 3.4. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và IBA 0,8mg/l đến sự phát
sinh chồi và sự sinh trưởng chồi của từ đoạn thân mang mắt chồi
bên (sau 8 tuần) ................................................................................. 34
Hình 3.5. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ (sau 8 tuần) ...................... 36
Hình 3.6. Rễ Diệp hạ châu trong môi trường bổ sung IBA 0.5mg/l (sau 8 tuần) ...... 38
Hình 3.7. Cây Diệp hạ châu trong chậu (45 ngày) ............................................ 39

vi


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Viêm gan B là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến trên thế
giới, một trong những nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất. Hiện nay, trên toàn
cầu có ít nhất 2 tỷ người đang mang trên người virus viêm gan B, khoảng 400
triệu người đang bị viêm gan B mãn tính và sẽ có ít nhất 250 ngàn người thiệt
mạng mỗi năm. Việt Nam là thuộc các nước với tỷ lệ viêm gan B cao nhất thế
giới. Cứ 6 đến 7 người Việt Nam thì có 1 người đang bị nhiễm virus viêm gan
B. Căn bệnh này nếu được phát hiện ở giai đoạn đầu điều trị khỏi bệnh là rất
lớn. Hiện nay nhu cầu thuốc chữa viêm gan B và các loại bệnh khác rất cao đặc
biệt các chế phẩm thuốc từ cây dược liệu [5].
Trong tài liệu “Chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam giai
đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (được ban hành theo quyết
định số 68/QĐ -TTg ngày 10/01/2014 của Thủ tướng Chính phủ) đã đưa ra mục
tiêu cụ thể, đến năm 2020 Việt Nam phấn đấu sản xuất được 20% nhu cầu
nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nước. Thuốc được sản xuất trong nước
chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm. Trong đó, thuốc từ dược liệu
chiếm 30%. Để thực hiện một trong các trọng điểm của định hướng chiến lược

phát triển của ngành Y - Dược là đẩy mạnh công tác trồng trọt cây thuốc trên
quy mô lớn, phát triển nguồn dược liệu hàng hoá phục vụ cho việc điều trị
trong nước và xuất khẩu, mở ra cơ hội lớn cho việc giao thương, tham gia thị
trường quốc tế về dược liệu và dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên. Vì thế, việc
trồng và bảo tồn cây dược liệu rất cần thiết. Đẩy mạnh nghiên cứu, ứng dụng
các tiến bộ khoa học kỹ thuật để tạo ra các loại giống dược liệu có năng suất,
chất lượng đáp ứng yêu cầu sản xuất [26].
Diệp hạ châu là cây thuốc có dược tính sử dụng để chữa nhiều bệnh ở
người. Vùng phân bố của Diệp hạ châu khá rộng, cây mọc hoang tại Việt Nam
1


và nhiều nước khác trên thế giới, như Ấn Độ, Trung Quốc, Cu Ba, Peru,
Nigeria, Malaysia, Philippines, Guam, Brazil... [2], [3], [27].
Cây Diệp hạ châu có nhiều tác dụng trong việc điều trị viêm gan B.
Trong cây Diệp hạ châu có chứa phyllathin, hypophyllanthin, triacontanal có
nhiều tác dụng chữa bệnh, đặc biệt là khả năng giải độc, khôi phục chức năng
bình thường của gan, tốt trong các trường hợp suy giảm chức năng gan do sử
dụng nhiều bia rượu. Các chất này làm gia tăng lượng glutathione - chất bảo vệ
gan thường bị thiếu trầm trọng ở những người thường xuyên sử dụng bia rượu.
Năm 1995, các nhà khoa học Brazil cũng phát hiện tác dụng giảm đau mạnh và
bền vững của loài cây này. Tác dụng này là do gallic acid, có khả năng bảo vệ
khi gan bị viêm, tổn thương gan do bia rượu. Theo y học cổ truyền, Diệp hạ
châu vị đắng hơi ngọt, tính mát, quy kinh vào can, đởm nên có tác dụng kích
thích tiêu hóa, tăng tiết mật, giải độc [13], [28], [29].
Hàm lượng các dược chất trong Diệp hạ châu tự nhiên rất thấp, lá khô
chứa các chất đắng hypophylathin (0,05%), phylanthin (0,35%) [29]. Một trong
những biện pháp tăng lượng phyllathin, hypophyllanthin, triacontanal trong
diệp hạ châu là phương pháp chuyển gen tăng hoạt tính của enzyme xúc tác các
phản ứng tạo dược chất. Tuy nhiên, để chuyển gen thành công điều kiện tiên

quyết là phải xây dựng hệ thống tái sinh phù hợp.
Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài luận văn: “Nghiên
cứu tái sinh đa chồi in vitro cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tối ưu được môi trường tái sinh đa chồi cây Diệp hạ châu. Xác định
được giá thể phù hợp để đưa cây ra ngoài tự nhiên.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Nghiên cứu khử trùng hạt.
(2) Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ và kết hợp của chất kích thích sinh
trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng
chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách lá mầm.
2


(3) Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA, IBA đến khả năng ra rễ của Diệp
hạ châu trong ống nghiệm.
(4) Xác định loại giá thể thích hợp để đưa cây ra ngoài tự nhiên.

3


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Diệp hạ châu
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại
Tên gọi:
Tên Việt Nam: Diệp hạ châu
Tên khoa học: Phyllanthus urinaria L.
Tên khác: Chó đẻ răng cưa, cây Cau trời, Diệp hậu châu, nhật khai dạ bế,
Diệp hòe thái, Lão nha châu.

Phân loại:
Diệp hạ châu thuộc giới thực vật (Plantae). Ngành Ngọc Lan
(Magnoliophyta). Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida). Bộ Sơ ri (Malpighiales). Họ
Thầu dầu (Euphorbiaceae). Chi Phyllanthus [2], [3], [15].
1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố sinh thái của cây Diệp hạ Châu
Cây Diệp hạ châu là một loại cỏ mọc hằng năm, cao chừng 30cm, thân
gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, mang cành. Lá mọc so le, phiến lá thuôn, dài
từ 5 đến 15 mm, rộng từ 2-5 mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép nguyên hơi có răng
cưa rất nhỏ, mặt dưới lá trắng xanh, không cuống hay có cuống rất ngắn. Hoa
mọc ở kẽ lá, nhỏ, màu đỏ nâu, đơn tính, hoa đực ở đầu cành hoa, cái ở dưới.
Hoa có cuống rất ngắn. Quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống ở dưới lá, có
khía mờ và có gai, hạt hình 3 cạnh. Đường kính quả có thể đạt tới 2 mm, treo
dưới lá (Diệp hạ châu nghĩa là hạt dưới mặt lá). Hạt ba cạnh, hình trứng, màu
nâu nhạt, có vân ngang. Mùa hoa: tháng 4 – 6. Mùa quả: tháng 7 – 9 [32].
Diệp hạ châu phân bố trên các cánh đồng khô, ven đường, vùng đất bỏ
hoang,

bìa

rừng;

dưới

độ

cao

100

–

600m

tại

Ấn

Độ, Đài

Loan, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanma, Nepal, Nhật Bản, Sri Lanka, Thái
Lan, Trung Quốc (các tỉnh An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý
Châu, Hải Nam, Hà Bắc, Hà Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tô, Giang Tây,
4


Thiểm Tây, Sơn Đông, Sơn Tây, Tứ Xuyên, Tây Tạng, Vân Nam, Chiết
Giang), Việt Nam và Nam Mỹ [2], [3].

Hình 1.1. Cây Diệp hạ châu
1.1.3. Kỹ thuật trồng Diệp hạ châu
Cách làm đất trồng cây:
Cây có thể phát triển trên mọi loại đất, trừ đất trũng, nơi úng ngập. Tốt
nhất là đất pha cát và đặc biệt đất phải đủ ẩm. Có thể trồng riêng rẽ hoặc xen
canh trong vườn cây ăn quả chưa khép tán.
Diệp hạ châu trồng trên đất pha cát hay đất cát pha và đất bạc
màu,được cày bừa kỹ, trừ hết cỏ dại.
Nếu đất có pH dưới 5, cần bón lót tới 1 tấn vôi bột/ha. Để thuận lợi
cho việc chăm sóc, đất trồng diệp hạ châu cần lên luống rộng 1-1,5m, cao
20-25cm và rãnh rộng 30cm.
Cách chọn hạt giống:

5


Đảm bảo việc chọn lựa hạt giống chất lượng. Việc lựa chọn hạt giống
rất quan trọng vì nó sẽ giúp cây phát triển tốt, chọn giống tốt, thuần chủng
thì dược liệu sẽ có năng suất và hiệu quả chữa bệnh cao.
Sau 2 tuần gieo hạt: Đất vườn ươm được cày bừa kỹ, vơ hết cỏ, bón
lót phân quy ra 1 ha: phân chuồng 30 tấn, phân vi sinh 10 tấn; vôi bột 500kg.
Đất vườn ươm lên luống rộng 1m, cao 20 - 25cm. Lượng hạt giống gieo
trong vườn ươm 3g/m2 đất (Nếu gieo thẳng vào luống thì lượng hạt giống là
1g hạt giống/10m2 đất). Trước khi gieo cần xử lý bằng Atonik với tỷ lệ 1 gói
Atonik 10g pha với 40 lít nước cho 8 kg hạt giống. Hạt ngâm trong dung
dịch này 4 giờ, sau vớt ra để ráo nước, trộn với cát ẩm ủ 3-4 ngày cho đến
khi thấy nứt nanh thì đem gieo.
Đề phòng kiến ăn hạt, sau khi gieo cần phun thuốc basudin (theo liều
lượng được nhà sản xuất ghi trên bao bì).
Gieo vãi đều trên mặt luống, xoa nhẹ mặt luống cho lấp hạt, dùng rơm
rạ che phủ rồi tưới nước cho ướt rơm rạ để giữ ẩm cho đất. Sau 10 ngày có
thể bỏ vật che phủ.
Hạt Diệp hạ châu sẽ mọc sau 5-7 ngày. Khi câu con có 3-4 lá thật cần
tỉa bỏ những cây yếu, chỉ để lại mật độ 2x2 cm/cây. Quá trình chăm sóc cây
con ở vườn ươm đơn giản, luôn tưới nước cho đất ẩm, sau 20-25 ngày nhổ đi
trồng. Lúc này cây giống cao 10cm, thân mập, có bộ rễ phát triển thì chúng
ta tiến hành đánh cây đi trồng ra hốc.
- Chăm sóc cây trồng:
Để thuận lợi cho việc chăm sóc, đất trồng Diệp hạ châu cần lên luống
rộng 1-1,5m, cao 20-25cm và rãnh rộng 30cm.
Khi cây cao 10-15cm thì chúng ta có thể tiến hành trồng ra hốc. Với
khoảng cách cây cách cây 20×20cm.

Cây trồng xong, tưới nước ngay, sau 3 ngày dùng dung dịch Atonik
0,1% (1 gói 10g pha với 10 lít nước) phun vào luống cho cây mau bén rễ,
6


sau 7 ngày xới đất phá váng lần 1, sau 10 ngày phun dung dịch Atonik lần 2,
cây trồng cần làm cỏ và xới đất 1 lần nữa trước khi tán lá giao nhau.
Lưu ý: do trồng vào mùa khô nên thường xuyên phải tưới nước. Thời
gian tưới nước tốt nhất là lúc chiều tối hoặc trước 9h sán
- Thu hoạch quả: Chọn cành có nhiều quả già. Diệp hạ châu thu hoạch
lứa đầu tiên khi 3/4 số cây có hoa quả.Thu hoạch cây: Cắt cây, chừa khoảng
20cm gốc (để các cành ngủ mau tái sinh).
- Bảo quản phơi khô: Khi phơi phải trải mỏng, dưới lót tấm vải nhựa
để tránh rơi mất hạt, sau 3 ngày phơi nắng trực tiếp hoặc hong gió, quả già sẽ
tách vỏ hết. Để kiểm tra độ khô thì ta tiến hành bẻ thân, thấy cây khô giòn là
được. Thu lấy hạt và cành lá rụng để bảo quản. Hạt để làm giống (thu lấy hạt,
loại bỏ tạp chất, phơi lại 1-2 nắng cho khô), lá và cành khô làm thuốc. Để hạt
khô trong chai, lọ sạch khô kín. Cành và lá diệp hạ châu- cây chó đẻ sau khi thu
hạt cho vào túi khô, sạch kín và đây là dược liệu chính phẩm [33].
1.1.4. Tác dụng của một số thành phần hóa học trong cây Diệp hạ châu
Các hợp chất có hoạt tính trong Diệp hạ châu là ligan (phyllanthin,
hypophyllanthin, nirurin niranthin, phytetralin, niranthine…), flavonoids,
amariinn, furosin, amariinn acid, amarulone, triterpenes, sterol, alkaloids…
Nirtetralin, niranthin và phyltetralin ức chế carrageenan tạo ra trong quá trình
viêm và sự lan tràn bạch cầu trung tính. Trong vai trò kháng virus viêm gan,
niranthin cũng thể hiện hoạt tính chống HBsAg còn henokinin thể hiện hoạt
tính chống HBeAg. Ellagitanins garaniin và corilagin được chứng minh là chất
trung gian có tiềm năng kháng lại sự nhân lên của HIV-1 trong tế bào Hela
CD4+. Các phức chất phenol trong dịch chiết với nước của Diệp hạ châu có
hoạt tính chống oxi hóa mạnh nhất là phyllanthin, amriin, repandusinic acid và

phyllanthin D. Hoạt tính chống ung thư được thử nghiệm trên chuột với hỗn
hợp phyllanthin và hypophyllathin (1:1). Phyllanthin được chứng minh vai trò
bảo vệ tế bào gan chuột gây đọc với ethanol hoặc CCl4 [21], [30].
7


Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng bảo vệ gan của chất chiết
Diệp hạ châu hoặc những hoạt chất từ Diệp hạ châu. Chirdchupunseree và
Pramyothin (2010) chứng minh vai trò của phyllanthin trong việc bảo vệ tế bào
gan do đối kháng với những ảnh hưởng gây độc gan của cồn ethanol. Chất này
cũng phục hồi lại khả năng chống oxy hóa của tế bào gan chuột, bao gồm
glutathione tổng số, hoạt tính của glutathione tổng số và hoạt tính của
glutathione reductase [20], [21].
Theo nghiên cứu của Raphael và Khutan (2003), dịch chiết thân và rễ
Diệp hạ châu trong methanol với liều 50, 200 và 1000 mg/kg thể trọng dùng
theo đường uống đã ức chế loét dạ dày của chuột Wistar gây bệnh thực nghiệm
bằng ethanol tuyệt đối. Các thông số gồm hệ số loét, chảy máu giảm đáng kể
khi dùng Diệp hạ châu đắng. Một nghiên cứu khác của Odetola và Akojenu
(2000), dịch chiết diệp hạ châu đắng thử nghiệm có khả năng trì hoãn thời gian
bắt đầu tiêu chảy, giảm tần số đi phân dẫn đến ức chế nhu động ruột 79,9% so
với 86,9% do tác động của morphine được dùng như đối chứng [30].
Theo bài tổng hợp năm 2011, Patel và cộng sự đã tóm lược nhiều kết quả
nghiên cứu chứng minh quan trọng cả về cơ bản và ứng dụng của chất chiết
Diệp hạ châu hoặc các hoạt chất với nhiều tác dụng khác như chống ung thư,
chống sốt rét, lợi tiểu, hạ đường huyết và giảm cholesterol trong máu, điều hòa
miễn dịch bảo vệ thận. Ngoài ra, bài báo này cũng cho biết rằng sau nhiều năm
nghiên cứu, người ta chưa phát hiện ra tác dụng phụ hay độc tính của Diệp hạ
châu [30].
Tại Việt Nam, nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị viêm gan
của Diệp hạ châu đã được tiến hành. Nhóm nghiên cứu của Lê Võ Định Tường

(Học Viện Quân Y) đã thành công với chế phẩm Hepamarin từ Phyllanthus
amarus. Nhóm nghiên cứu của Trần Danh Việt, Nguyễn Thượng Dong (Viện
Dược Liệu) với bột Phyllanthin (2001) [31].
8


Đã có một số công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị viêm gan của
Diệp hạ châu. Song các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào chiết xuất các chất có
dược tính và ứng dụng trong điều trị bệnh.
1.1.5. Một số bài thuốc dân gian từ cây Diệp hạ châu
Tác dụng chữa viêm gan siêu vi B, cách làm: 30g cây Diệp hạ châu,12g
nhân trần,12g sài hồ,8g chi từ,12g hạ khô tảo.Tất cả sấy khô dùng để sắc lấy
nước uống ngày 1 tháng.
Chữa viêm gan do virus: Diệp hạ châu sao khô 20 g, sắc nước 3 lần.
Trộn chung các nước sắc, thêm 50g đường đun sôi cho tan, chia làm 4 lần uống
trong ngày. Khi kết quả xét nghiệm HBsAg (-) thì ngừng thuốc.
Chữa suy gan (do sốt rét, sán lá, lỵ amip, ứ mật, nhiễm độc): Cây Diệp
hạ châu sao khô 20g, cam thảo đất sao khô 20g. Sắc nước uống hằng ngày.
Chữa nhọt độc sưng đau: Dùng một nắm cây Diệp hạ châu với một ít
muối giã nhỏ, chế nước chín vào, vắt lấy nước cốt uống, dùng bã đắp chỗ đau.
Chữa bị thương ứ máu: Dùng lá, cành Diệp hạ châu và Mần tưới, mỗi
thứ một nắm, giã nhỏ chế nước đồng tiện vào, vắt lấy nước uống, bã thì đắp
hoặc hòa thêm bột Ðại hoàng 8-12g càng tốt (Hoạt nhân toát yếu).
Chữa xơ gan cổ trướng: Cây Diệp hạ châu sao khô 100g sắc nước 3 lần.
Trộn chung nước sắc, thêm 150g đường, đun sôi cho tan đường, chia nhiều lần
uống trong ngày (thuốc rất đắng), liệu trình 30 – 40 ngày. Khẩu phần hằng
ngày phải hạn chế muối, tăng đạm (thịt, cá, trứng, đậu phụ).
Chữa ăn không ngon miệng, đau bụng, sốt, nước tiểu màu sẫm: Dùng
cây Diệp hạ châu 1g, nhọ nồi 2g, xuyên tâm liên 1g. Tất cả các vị thuốc trên
phơi khô trong bóng râm và tán bột. Sắc bột thuốc này và uống hết ngay một

lúc. Uống mỗi ngày 3 lần (y học dân gian Ấn Độ) [2], [3].
1.2. Quy trình nhân giống in vitro
Quy trình nhân giống in vitro gồm các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc
Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng
cây mẹ ban đầu nên trong giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ
9


thường là cây khỏe, có giá trị kinh tế cao. Sau đó chọn cơ quan để lấy mẫu
thường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non. Mô chọn để nuôi
cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch
bệnh, giữ được các đặc điểm sinh học quý của cây, ít nguy cơ biến dị. Tùy theo
điều kiện giai đoạn này có thể kéo dài 3 – 6 tháng [9], [18].
Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng
Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài môi trường vào nuôi cấy để tạo nguyên
liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai đoạn này được tiến hành theo các bước:
(1) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy.
(2) Cấy mẫu vật vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường
nhân tạo (giai đoạn này gọi là giai đoạn cấy mẫu in vitro).
Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôi
trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời
gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy đã bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào, hoặc các
cơ quan, hoặc các phôi vô tính. Giai đoạn này phụ thuộc vào đặc điểm sinh lý
sinh thái của từng đối tượng đem nhân giống. Thông thường kéo dài từ 2 – 12
tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển [18].
Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi
Đây là giai đoạn quyết định hiệu quả của quá trình nuôi cấy mô, cây được
nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy. Khi mẫu sạch đã được tạo ra và
từ đó nhân được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình

nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất. Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất
trong điều kiện nuôi cấy. Thành phần và điều kiện môi trường cần được tối ưu
hóa nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh. Đối với môi trường nhân chồi, sử
dụng các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP, kinetin) với
nồng độ khác nhau tùy từng đối tượng. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ vài chồi
ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh hình thành các biến dị soma [18].
10


Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát triển rễ tự sinh,
nhưng thông tường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác để
kích thích tạo rễ. Đối với môi trường tạo rễ người ta thường sử dụng chất kích
thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin như: α – NAA, IAA, IBA. Thông thường giai
đoạn này kéo dài từ 2 – 8 tuần tùy từng đối tượng. Khi cây có đạt kích thước về rễ,
thân, lá đảm bảo cho sinh trưởng, phát triển bình thường ngoài tự nhiên, mới tiến
hành giai đoạn cuối là đưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên [18].
Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng
Đây là giai đoạn đầu cây được chuyển từ điều kiện vô trùng trong ống
nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên. Giai đoạn này quyết định khả năng ứng
dụng của quy trình nhân giống in vitro. Cây nuôi cấy in vitro được sinh trưởng
và phát triển trong những điều kiện tối ưu về nhiệt độ, độ ẩm, pH, dinh dưỡng.
Vì vậy, trước khi đưa ra trồng, người ta cần huấn luyện để thích nghi với điều
kiện tự nhiên. Cây được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn
ươm với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần phải đáp ứng các
yêu cầu: che cây con bằng nilon và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và
làm mát cây. Giá thể trồng cây có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo
không chứa đất, mùn cưa và bọt biển. Giai đoạn này đòi hỏi 4 – 16 tuần [18].
1.3. Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật
Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một

hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất
cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan. Tuy vậy,
yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm
lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hòa sinh
trưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm auxin và
nhóm cytokinin [1], [17].
11


1.3.1. Auxin
Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indol
axetic (IAA) và là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng. Trong thực vật
auxin không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở dạng liên kết không có hoạt tính
sinh học như IAA-glucose, IAA-myoinositol, IAA-glucan, IAA-aspartate…
Các dẫn xuất khác của indol cũng thể hiện hoạt tính của auxin là indol
tryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol ethanol [7].
Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và
chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực
vật như lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng
hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [7].
Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới
hàng loạt các quá trình sinh lý như: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích
thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có các
ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín
của quả, sự ra hoa… Do hoocmon thực vật tác động đến sinh trưởng thông qua
mối tương quan nồng độ giữa các loại hoocmon nên các quá trình trên đây
không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hoocmon khác. Tùy thuộc vào
nồng độ hoocmon mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác nhau đối với
auxin. Phản ứng nhanh nhất khi xử lý auxin là tăng độ kéo dài của tế bào thông
qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở của vách tế bào [7].

Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài chất đã
được sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp. Chỉ một thời gian ngắn sau khi IAA
được tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp chất có
giá trị. Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ dàng bị
phân hủy thành các chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh sáng và vi sinh
vật. Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hình thành rễ của
những lát cắt thân. Một số chất tổng hợp nhân tạo có vai trò tương tự như IAA,
12


trong đó có IBA. IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu nhưng nó có khả năng
ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của auxin [7], [17].
Auxin thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự
phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, tạo phôi vô tính, tạo rễ… Những auxin
dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA, IAA, NAA, 2,4-D. Trong số các auxin,
IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ, auxin phối hợp với
cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi. Auxin tan trong ethanol hoặc NaOH
pha loãng [7], [17].
1.3.2. Cytokinin
Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purin. Loại cytokinin đầu tiên phát
hiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin, tách từ mầm ngô. Ngoài ra
có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin,
chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà người ta
thu nhận bằng cách xử lý nhiệt DNA [7].
Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là
một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950. Những năm
1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA
được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng
độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy [7].
Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi

và trong quả đang phát triển. Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng
tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần
của các glycoside [17].
Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây,
đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein. Cytokinin
điều chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách như điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN
khi phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng thái
ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả,
13


gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, làm tăng diện tích phiến lá do
kích thích sự lớn lên của tế bào [17].
Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào,
tạo và nhân mô sẹo, phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi
vô tính, kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi
đỉnh, tăng cường phát sinh chồi phụ. Các loại cytokinin thường được dùng là:
kinetin, BAP… Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng [7].
1.4. Một số nghiên cứu nuôi cấy cây dược liệu bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro
1.4.1. Tình hình nuôi cấy in vitro cây dược liệu trên thế giới
Với những ưu thế của công nghệ nuôi cấy mô tế bào, việc ứng dụng
chúng trong nuôi cấy in vitro cây dược liệu được nhiều tác giả trên thế giới
quan tâm như:
Năm 2016, nhóm nghiên cứu của Wang CL và cs đã tiến hành tái sinh
cây Lúa mạch đen (một loại thảo dược hàng năm lâu đời) trong nuôi cấy in
vitro. Việc tái sinh cây lúa mạch đen bằng cách tạo ra phôi soma được điều tra
bằng hai loại lúa mạch khác nhau, Yuanzi và Xichang. Khả năng phục hồi của
Yuanzi tốt hơn so với Xichang, đoạn thân có khả năng tái sinh tốt hơn lá
mầm. Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo callus là môi trường cơ bản của MS
bổ sung 2mg/l 2,4D và 1mg/l Kinetin, có thể đạt đến 98,96% phát sinh mô sẹo.

Tỷ lệ tái sinh cây từ callus của lúa mạch đạt 55,77% trong môi trường MS bổ
sung 2,0mg/l BAP và 1,0mg/l Kinetin. Tỷ lệ tái sinh cây tối đa từ callus là
69,05% trong môi trường MS cơ bản bổ sung 3,0mg/l BAP và 1,0mg/l
Thidiazuron. Cây tái sinh chuyển vào môi trường cơ bản 1/2 MS bổ sung
1mg/l IAA cho tỷ lệ sống sót 75% sau khi chuyển cây tái sinh ra ngoài môi
trường tự nhiên trong điều kiện đồng ruộng [25].
Nghiên cứu của Shinde S và cs (2016) đã thiết lập một quy trình cho việc
nhân giống in vitro của cây ngải tây Ấn Độ. Một callus phát sinh thu được trên
môi trường MS bổ sung 2.5μM IAA. Ngoài ra, các mẫu còn được nuôi cấy trên
14


môi trường MS bổ sung với các chất kích thích sinh trưởng khác nhau. Tần số
tái sinh cây cao nhất (83,3%) từ mô sẹo khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ
sung BAP 2,5mM và 7,5mM 2-iP. Hiệu quả tạo chồi tối ưu 10.16 ±
2.24 chồi được tái sinh trên môi trường bổ sung 2,5μM BAP + 7,5μM 2-iP. Môi
trường MS bổ sung 10μM IBA có hiệu quả ra rễ của chồi cao. Các nghiên cứu
cho thấy cây tái sinh có sự ổn định về di truyền trong các cây trồng vi nhân
giống [24].
Agnieszka Pietrosiuk và CS (2007) đã nghiên cứu phương pháp nuôi cấy
Catharanthus roseus trong điền kiện in vitro, cung cấp nguồn nguyên liệu thực
vật để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp từ alkaloid. Dưới sự tác động của
enzyme, alkaloid monomerice, vindoline và catharanthine hình thành
vinblastine trong tế bào nuôi cấy in vitro. Kết quả quan trọng của nghiên cứu
này là, ajmalicine tổng hợp với lượng lớn từ mô sẹo, catharanthine thu được
trong lá và tế bào nuôi cấy trong bình bioreactor. Rễ tơ được tạo ra bằng cách
nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô sẹo. Các chất chuyển hóa
thứ cấp mức thu được từ rễ tơ cao hơn so với các cây ngoài tự nhiên. Các
alkaloid chiếm ưu thế trong rễ tơ là ajmalicine, serpentine, vindoline và
catharanthine hàm lượng cao hơn trong rễ chưa chuyển gen [19].

Nghiên cứu nuôi cấy tái sinh callus ở Chlorophytum borivilianum sử dụng
các loại Phytohormones khác nhau của Nakasha và cs (2016) để đánh giá ảnh
hưởng của các phytohormon khác nhau đối với sự phát triển của callus và
nghiên cứu tái tạo callus ở C. borivilianum. chồi non của C. borivilianum được
cấy trên môi trường MS được bổ sung 3% sucrozo và NAA hoặc 2,4-Dvới các
nồng độ khác nhau (0, 1, 5, 10, và 15mg/l). Sự kích thích callus đã được đánh
giá trong bốn chu kỳ nuôi cấy. Sự tái sinh từ callus được nghiên cứu trên các
môi trường được bổ sung BAP và kinetin hoặc thidiazuron ở nồng độ khác
nhau (0, 0.5, 1, 2 và 3mg/l). Chồi được tạo ra từ môi trường MS bổ sung 1,0
mg/L IAA. : Khả năng tạo callus đã được chứng minh tốt hơn trên môi trường
15