BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU
MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG
(Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ
SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khố: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ MINH THÙY

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
**********************

BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU
MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG
(Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ
SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Giáo viên hƣớng dẫn:
TS. BÙI MINH TRÍ

Sinh viên thực hiện:
TRƢƠNG THỊ MINH THÙY

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007


LỜI CẢM ƠN
Con thành kính ghi ơn Ba Mẹ đã sinh ra và nuôi nấng con thành ngƣời. Con xin cảm
ơn gia đình về tất cả.
Em xin chân thành cảm ơn:
Các Thầy, Cô trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt
kiến thức cho em trong suốt 4 năm học.
Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động
viên, giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện khóa luận.
Thầy TS. Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt q trình thực hiện khóa
luận.
Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa sinh đã động viên,
giúp đỡ em trong q trình thực hiện khóa luận.
Ban quản lý rừng phịng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá
trình thu thập mẫu.
Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh chị trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý
Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu.
Các bạn cùng thực hiện đề tài đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
khố luận.
Xin cảm ơn tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi chia sẻ bao niềm

vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt cảm ơn tất cả các bạn cùng phịng đã
ủng hộ tinh thần và đồng hành với tơi trong suốt thời gian học tập. Chúc mọi ngƣời đều
hạnh phúc và thành đạt.
Xin chân thành cảm ơn!

Trƣơng Thị Minh Thùy

ii


TĨM TẮT
TRƢƠNG THỊ MINH THÙY, Đại Học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh, 9/2007.
“BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ
TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”.
Giáo viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ.
Khóa luận đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh
trƣờng Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh từ 7 / 5 / 2007 đến 31 / 8 / 2007.
Rừng ngập mặn là hệ sinh thái gồm nhiều loài cây khác nhau, trong đó có Đƣng
Rhizophora mucronata Lamk., một lồi chiếm số lƣợng lớn ở vùng nƣớc mặn, đồng
thời quần thể Đƣng cũng là hàng rào bảo vệ bờ biển các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt
đới. Tuy ý nghĩa kinh tế và môi trƣờng của rừng ngập mặn ngày càng đƣợc cơng nhận,
song diện tích của chúng trên khắp thế giới đang giảm dần theo thời gian do ô nhiễm và
nạn phá rừng. Trên cơ sở đó, cần có những kế hoạch hợp tác nhằm cải thiện hệ sinh
thái, thiết lập sự phát triển bền vững cho rừng ngập mặn nói chung và khu dự trữ sinh
quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nói riêng. Khóa luận này nhằm mục đích thiết lập quy
trình thích hợp cho việc đánh giá sự đa dạng di truyền cây Đƣng Rhizophora mucronata
tại rừng ngập mặn Cần Giờ.
Kết quả đạt đƣợc:
 Hồn thiện quy trình ly trích DNA từ mẫu lá Đƣng tƣơi.

 Xây dựng đƣợc quy trình phản ứng RAPD đối với cây Đƣng. Xác định đƣợc
OPAC10 là mồi tạo độ đa hình cao nhất trong số những mồi tiến hành khảo sát. Từ
14 mẫu, OPAC10 đã khuếch đại 18 locus, trong đó có 2 band đồng hình (trọng
lƣợng phân tử: 300 bp và 400 bp) và 13 band đa hình.
 Kết quả phân tích bằng phần mềm NTSYS 2.1, hệ số đồng dạng di truyền giữa
các cá thể trong quần thể Đƣng tự nhiên và Đƣng đƣợc trồng biến thiên từ 46 đến 79
%. Kết quả phân tích trên 14 mẫu ngẫu nhiên khác, chúng tôi nhận thấy hệ số đồng
dạng di truyền dao động từ 68 đến 100 %. Điều này cho thấy giữa các cá thể trong

iii


quần thể Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có mối quan hệ di
truyền tƣơng đối gần, tuy nhiên chúng lại phân bố rải rác khắp các tiểu khu vì vậy
giữa các cá thể vẫn thể hiện đƣợc tính đa dạng sinh học cao.
Tp. HCM, ngày 7 tháng 9 năm 2007.

Trƣơng Thị Minh Thùy

iv


ABSTRACT
TRUONG THI MINH THUY, Nong Lam University, Ho Chi Minh City,
September 2007.
“PREMILINARY RESEARCH ON METHOD DEVELOPMENT AND
GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Rhizophora mucronata Lamk. IN
CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA BY RAPD”.
The thesis was carried out in Chemical and Biological Analysis and Experiment
Center at Nong Lam University from May to August in 2007.

Supervisor: BUI MINH TRI, PhD.
Mangrove is an ecological term referring to a taxonomical diverse assemblage of
trees, including Rhizophora mucronata Lamk., that forms the dominant plant
communities in tidal, saline wetlands along sheltered tropical and subtropical coast.
Although the economic and environmental significance of mangroves is being
increasingly recognized, it is in fact, decreasing around the world because of pollution
and deforestation of the mangrove forests. By those reason, it is necessary to set up an
integrated plan improving the ecosystem in order to establish a sustainable development
for the mangrove forest in general and Can Gio Biosphere reserve are in particular. This
research was aimed to set up appropriate protocols for evaluating genetic diversity of
Rhizophora mucronata in Can Gio mangrove forest.
The obtained results were:
 Set up suitable protocol for extracting genomic DNA of fresh leaves of R.
mucronata.
 Optimize RAPD analysis protocol for R. mucronata. It was indicated that Primer
OPAC10 gave highest polymorphic level among tested primers. From 14 samples,
primer OPAC10 amplified at 18 loci, those included 2 monomorphic bands (with
molecular weight: 300 bps & 400 bps) and 13 polymorphic bands.
 Analysing with NTSYS 2.1, similarity between the natural R. mucronata and
cultivated R. mucronata populations was in a range from 46 to 79 %. Another

v


analysis on 14 randomized samples, we obtained similarity ranged from 68 to 100%.
The result also suggested that R. mucronata at Can Gio biosphere reserve area have
not had closed relation but scattered in to various groups.

vi

MỤC LỤC
CHƢƠNG

TRANG

Trang tựa ............................................................................................................................ i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ iii
Tóm tắt .............................................................................................................................. iv
Abstract ............................................................................................................................. vi
Mục lục ............................................................................................................................. viii
Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................. xii
Danh sách các bảng .......................................................................................................... xiii
Danh sách các hình........................................................................................................... xiv
Chƣơng 1.

MỞ ĐẦU ....................................................................................................1

1.1.

Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1

1.2.

Mục đích ..................................................................................................................... 2

1.3.

Yêu cầu ....................................................................................................................... 2

1.4.

Giới hạn của đề tài ..................................................................................................... 2

Chƣơng 2.
2.1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3

Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ,
Tp. Hồ Chí Minh ....................................................................................................... 3

2.1.1.

Khái niệm và chức năng của khu dự trữ sinh quyển ..................................... 3

2.1.2.

Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................... 4

2.1.2.1.

Điều kiện tự nhiên ..................................................................................... 4

2.1.2.2.

Chức năng từng vùng trong khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh .............................. 6

2.1.2.3.

2.1.3.
2.2.

Hệ sinh vật ở rừng ngập mặn Cần Giờ ................................................... 7

Thực trạng của rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay ........................................ 8

Cây Đƣng (Rhizophora mucronata Lamk.) ........................................................... 9

vii


2.2.1.

Phân loại ............................................................................................................. 9

2.2.2.

Hình thái học .................................................................................................... 10

2.2.3.

Phân bố ............................................................................................................. 11

2.2.4.

Giá trị kinh tế ................................................................................................... 11

2.3.

DNA (Deoxyribonucleic acid) ............................................................................... 12

2.3.1.

Quy trình ly trích DNA thực vật .................................................................... 13

2.3.2.

Các phƣơng pháp định lƣợng, định tính DNA ............................................. 14

2.3.2.1.
2.3.2.2.
2.4.

Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ ................................ 14
Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di .......................................... 15

Enzyme giới hạn (RE – restriction enzyme) ........................................................ 16

2.4.1.

Các loại enzyme giới hạn ............................................................................... 16

2.4.2.

Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn ................................................. 16

2.4.3.

Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA ............................ 16

2.5.

PCR (Polymerase Chain Reaction) ....................................................................... 18

2.5.1.

Khái niệm ......................................................................................................... 18

2.5.2.

Nguyên tắc của phản ứng PCR ...................................................................... 18

2.5.3.

Quy trình phản ứng PCR ................................................................................ 19

2.6.

Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng ......................... 20

2.7.

Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity) .............................................................. 21

2.8.

Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền ............................................. 21

2.9.

Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử ... 22

2.9.1.

Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) .............. 22

2.9.1.1.

Khái niệm ................................................................................................. 22

2.9.1.2.

Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP ...................... 23

2.9.2.

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) ............... 24

2.9.2.1.

Khái niệm ................................................................................................. 24

2.9.2.2.

Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật AFLP ...................... 26

2.9.3.

Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................ 27

2.9.3.1.

Khái niệm ................................................................................................. 27

viii


2.9.3.2.

Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD ..................................................... 29

2.9.3.3.

Những hạn chế của kỹ thuật RAPD ...................................................... 29

2.9.3.4.

Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RAPD ..................... 29

2.9.4.

So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền
và phát hiện chỉ thị phân tử ............................................................................. 30

Chƣơng 3.
3.1.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ..............................31

Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................................ 31

3.1.1.

Thời gian thực hiện ......................................................................................... 31

3.1.2.

Địa điểm thực hiện .......................................................................................... 31

3.2.

Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................. 31

3.2.1.

Nguyên tắc thu thập mẫu ................................................................................ 31

3.2.2.

Cách ký hiệu mẫu ............................................................................................ 31

3.2.3.

Cách lấy mẫu .................................................................................................... 32

3.2.4.

Cách bảo quản mẫu ......................................................................................... 32

3.3.

Phƣơng pháp thí nghiệm ......................................................................................... 32

3.3.1.

Quy trình ly trích DNA ................................................................................... 32

3.3.1.1.

Vật liệu dùng trong ly trích DNA .......................................................... 32

3.3.1.2.

Quy trình ly trích DNA ........................................................................... 33

3.3.1.3.

Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .......... 35

3.3.1.4.

Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp
điện di trên gel agarose .......................................................................... 35

3.3.2.

Kỹ thuật RAPD ................................................................................................ 35

3.3.2.1.

Vật liệu dùng trong RAPD ..................................................................... 35

3.3.2.2.

Tiến hành thí nghiệm .............................................................................. 37

Chƣơng 4.
4.1.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................42

Kết quả thu thập mẫu Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ .......................................................................................... 42

4.2.

Bảo quản mẫu .......................................................................................................... 43

4.3.

Kết quả OD (Optical Density) ............................................................................... 44

ix


4.4.

Kết quả điện di ......................................................................................................... 45

4.4.1.

Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 1 ............................ 45

4.4.2.

Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 2 ............................ 45

4.4.3.

Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 3 ............................ 47

4.5.

Kết quả phản ứng RAPD ........................................................................................ 49

4.5.1.

Kết quả khảo sát Primer OPAC10................................................................. 49

4.5.2.

Kết quả khảo sát 7 mồi trên cây Đƣng cùng một số cây ngập mặn khác . 50

4.5.3.

Kết quả khảo sát nồng độ OPAC10 .............................................................. 53

4.5.4.

Kết quả sử dụng OPAC10 thực hiện phản ứng RAPD
với tất cả các mẫu DNA ly trích đạt tiêu chuẩn .......................................... 53

4.5.5.
4.6.

Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD ................................................ 56

Bƣớc đầu đánh giá mức độ di truyền cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ bằng phần mềm NTSYS .............................................. 56

Chƣơng 5.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................61

5.1.

Kết luận ..................................................................................................................... 61

5.2.

Đề nghị...................................................................................................................... 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................63

x


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AFLP

:

Amplified Fragment Length Polymorphism.

bp

:

Base pair.

DNA

:

Deoxyribonucleic Acid.

dNTP

:

Deoxynucleotide Triphosphate.

EB

:

Extraction Buffer.

EDTA

:

Ethylenediamine Tetra Acetic Acid.

GPS

:

Global Position System.

MAB

:

Man and Biosphere.

OD

:

Optical Density.

PCR

:

Polymerase Chain Reaction.

RAPD

:

Random Amplified Polymorphism of DNA.

RE

:

Restriction Enzyme.

RFLP

:

Restriction Fragment Length Polymorphism.

RNA

:

Ribonucleic Acid.

Rnase

:

Ribonuclease.

SSCP

:

Single – strand Conformation Polymorphism.

SSR

:

Simple Sequence Repeat.

STS

:

Sequence – tagged Sites.

Ta

:

Annealing temperature.

TAE

:

Tris Glacial Acetic Acid EDTA.

TE

:

Tris EDTA.

Tm

:

Melting temperature.

UNESCO :

United Nations Educational Scientific and Cultural Organization.

UV

:

Ultra Violet.

WWF

:

World Wildlife Fund.

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và
phát hiện chỉ thị phân tử ........................................................................ 30
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 .. 37
Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 ................................ 37
Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 .. 38
Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 ................................ 38
Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 .. 39
Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 ................................ 39
Bảng 3.7: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4 .. 40
Bảng 3.8: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4 ................................ 40

xii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ........................... 5
Hình 2.2 Các thành phần trong cấu tạo hình thái cây Đƣng .................................. 10
Hình 2.3 Cấu trúc mạch đơi xoắn kép của phân tử Deoxyribonucleic acid ........... 12
Hình 2.4 Một số enzyme cắt giới hạn .................................................................... 17
Hình 2.5 Phản ứng PCR ......................................................................................... 20
Hình 2.6 RFLP trong trƣờng hợp có đột biến điểm ............................................... 23
Hình 2.7 Nguyên lý kỹ thuật AFLP ....................................................................... 25
Hình 2.8 Nguyên lý kỹ thuật RAPD ...................................................................... 28
Hình 4.1 Vị trí các mẫu Đƣng đƣợc thu thập trên bản đồ Cần Giờ ....................... 42
Hình 4.2 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 1 ......................................... 45
Hình 4.3 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 2 ......................................... 45
Hình 4.4 Sự khác biệt giữa DNA mẫu ly trích theo quy trình 2 và quy trình 3 ..... 46
Hình 4.5 Kết quả điện di 12 mẫu ly trích theo quy trình 3 .................................... 47
Hình 4.6 Kết quả điện di 13 mẫu ly trích theo quy trình 3 .................................... 47

Hình 4.7 Kết quả điện di sử dụng primer OPAC10, khảo sát quy trình RAPD .... 49
Hình 4.8 Kết quả điện di khảo sát Primer 1 ........................................................... 50
Hình 4.9 Kết quả điện di khảo sát Primer 9 và 2 ................................................... 50
Hình 4.10 Kết quả điện di khảo sát Primer RAH8................................................. 51
Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của mẫu 7.12 với 7 mồi ................... 51
Hình 4.12 Kết quả điện di khảo sát nồng độ Primer OPAC10
trên mẫu 2B.14 và 7.12 ......................................................................... 53
Hình 4.13 Kết quả điện di 7 sản phẩm RAPD ....................................................... 53
Hình 4.14 Kết quả điện di 8 sản phẩm RAPD ....................................................... 54
Hình 4.15 Kết quả điện di 10 sản phẩm RAPD ..................................................... 54
Hình 4.16 Cây phân loại 6 cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ ........................................................................ 57
Hình 4.17 Cây phân loại 14 cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ ........................................................................ 59

xiii


1

Chƣơng 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong quá trình tồn tại và phát triển, con ngƣời không ngừng khai thác, tàn phá
tài nguyên thiên nhiên và môi trƣờng. Ngày nay, sự mở rộng và phát triển các khu công
nghiệp đã tạo một lƣợng khí thải vơ cùng lớn, gây ơ nhiễm khơng khí góp phần tàn phá
sự sống trên trái đất. Những hoạt động đó đang dần làm mất cân bằng hệ sinh thái, phá
hủy một trong những nguồn tài nguyên quý giá nhất, không thể thay thế trên thế giới,
đó là đa dạng sinh học - cơ sở của sự sống còn, sự thịnh vƣợng và phát triển bền vững.
[41]
Từ thực tế trên, các khu dự trữ sinh quyển đƣợc ra đời, nhằm thực hiện nhiệm vụ

trọng yếu: Bảo vệ hệ sinh quyển - một hệ sinh thái khổng lồ, đồng thời đảm bảo sự cân
bằng, bảo tồn đa dạng sinh học, thúc đẩy kinh tế - xã hội phát triển và duy trì các giá trị
văn hóa truyền thống. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là khu dự trữ sinh
quyển đầu tiên của Việt Nam đƣợc UNESCO công nhận [22]. Với cảnh quan thiên
nhiên tƣơi đẹp, thành phần các loài động thực vật phong phú, đa dạng, rừng ngập mặn
Cần Giờ không những là rừng phòng hộ mà còn là điểm du lịch sinh thái hấp dẫn, mơ
hình học tập và nghiên cứu lý tƣởng [22], [43]. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn
Cần Giờ là nguồn tài ngun vơ giá, có vai trị và vị trí đặc biệt quan trọng đối với đời
sống cộng đồng dân địa phƣơng và các vùng phụ cận. Quần thể Đƣng (R. mucronata)
cùng những quần thể thực vật khác góp phần điều hịa khí hậu [30], chắn gió, chống xói
lở, giảm bớt sự xáo trộn đất đai và ô nhiễm nguồn nƣớc ven biển, nuôi dƣỡng, cung cấp
thức ăn cho các loài động vật hoang dã và hải sản có giá trị cao, đồng thời tạo sinh kế
cho ngƣ dân [21]. Nhằm đem lại hiệu quả kinh tế và môi trƣờng cao hơn, chúng ta cần
lập kế hoạch phát triển lâu dài và bền vững, tiến hành nghiên cứu, đánh giá nguồn gene
và mức độ đa dạng di truyền các quần thể thực vật rừng ngập mặn Cần Giờ, trong đó có
quần thể Đƣng, nhằm tìm đƣợc những chỉ thị phân tử phục vụ đắc lực cho việc chọn lọc


2

nhanh giống Đƣng, góp phần đảm bảo cơng tác trồng và phát triển rừng đạt hiệu quả
cao nhất. Phƣơng pháp tốt nhất đáp ứng yêu cầu này là sử dụng các marker phân tử.
Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Nông
Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy TS. Bùi Minh Trí chúng tơi đã tiến hành
thực hiện đề tài: “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ
MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.)
TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ
THUẬT RAPD”.
1.2. Mục đích
 Hồn thiện quy trình ly trích DNA đối với cây Đƣng.

 Xây dựng quy trình RAPD và bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần
thể Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
 Phục vụ công tác tuyển chọn giống Đƣng để lai tạo và xây dựng tiền đề cho những
nghiên cứu chuyên sâu về sự đa dạng di truyền, nhận diện chỉ thị phân tử.
1.3. Yêu cầu
 Thu thập mẫu lá từ những cây Đƣng có đặc điểm hình thái khác nhau: thân cây to,
cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị bệnh, cây mọc tự nhiên hay đƣợc trồng.
 Ly trích DNA có chất lƣợng tốt làm nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD.
 Thực hiện kỹ thuật RAPD và phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 2.1.
1.4. Giới hạn của đề tài
 Đề tài chỉ tiến hành nghiên cứu quần thể Đƣng tại một số tiểu khu trong khu dự trữ
sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh.
 Thời gian thực hiện ngắn.
 Chƣa đủ điều kiện để thực hiện nhiều thí nghiệm tối ƣu, chƣa khảo sát nhiều primer
đối với kỹ thuật RAPD nhằm đạt đƣợc kết quả chính xác hơn.


3

Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ,
Tp. Hồ Chí Minh
2.1.1. Khái niệm và chức năng của khu dự trữ sinh quyển
Sinh quyển là lớp vỏ trái đất có các sinh vật sống trên đó, kể cả đại dƣơng, ao
hồ, sơng suối, đất và phần dƣới của khí quyển. Sinh quyển cùng với khí quyển, địa
quyển và thủy quyển tác động qua lại với nhau trong “Hệ thống trái đất”. [45]
Sinh quyển là một hệ sinh thái khổng lồ, bao gồm các hệ sinh thái nhỏ hơn trên
bề mặt trái đất. Việc bảo tồn nguyên vẹn tất cả hệ sinh thái là điều khơng thể, nên ngƣời
ta chỉ có thể lựa chọn ra một số đại diện của các hệ sinh thái này để bảo tồn với ý nghĩa
là các khu dự trữ vốn gene, loài và hệ sinh thái cho toàn bộ sinh quyển. [45]

Khu dự trữ sinh quyển là những vùng có các hệ sinh thái trên cạn hoặc ven biển
đƣợc quốc tế công nhận trong phạm vi chƣơng trình Con ngƣời và Sinh quyển (Man
and Biosphere – MAB) của UNESCO, nhằm thúc đẩy và trình diễn mối quan hệ giữa
con ngƣời với thiên nhiên. Các khu dự trữ sinh quyển là mơ hình mẫu của các hệ sinh
thái trên trái đất, là phịng thí nghiệm sống cho việc nghiên cứu và giám sát các hệ sinh
thái đem lại lợi ích cho ngƣời dân địa phƣơng mà không gây hại đến môi trƣờng. [45]
Mỗi khu dự trữ sinh quyển có 3 chức năng [45]:
 Chức năng bảo tồn: đóng góp vào việc bảo tồn đa dạng di truyền, loài, hệ sinh
thái và cảnh quan.
 Chức năng phát triển: thúc đẩy phát triển kinh tế bền vững về sinh thái cũng nhƣ
các giá trị văn hóa truyền thống.
 Chức năng hỗ trợ: tạo điều kiện cho các hoạt động nghiên cứu, giám sát, giáo
dục và trao đổi thông tin giữa các địa phƣơng, quốc gia, quốc tế về bảo tồn và
phát triển bền vững.


4

2.1.2. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
2.1.2.1. Điều kiện tự nhiên
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc hình thành ở hạ lƣu sơng
Đồng Nai – Sài Gịn đổ ra biển Đơng ở cửa Xồi Rạp, Đồng Tranh và vịnh Gành Rái,
đồng thời nằm ở cửa ngõ Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành
phố khoảng 300 km. [8], [29], [44]
Tọa độ địa lý [29]
 Vĩ độ Bắc: 10o 22’ 14” – 10o 37’ 39”
 Kinh độ Đơng: 106o 46’ 12” – 107o 00’ 59”
Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đơng, phía Tây giáp tỉnh Tiền
Giang và Long An, phía Đơng giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.
Cần Giờ có khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo với hai mùa rõ rệt: mùa mƣa

từ tháng 5 – 11, gió hƣớng Tây Nam, mùa nắng từ tháng 12 – 4 năm sau, gió hƣớng
Đơng Nam. Nhiệt độ trung bình 25,8 0C. Lƣợng mƣa thấp, trung bình từ 1.000 – 1.200
mm / năm. [27]
Dân số khoảng 63.000 ngƣời (2003), sống chủ yếu bằng nghề đánh bắt và nuôi
trồng thủy sản. Dân cƣ phân bố không đều trên địa bàn 7 xã, phần đông tập trung ở xã
Bình Khánh, Long Hịa, Cần Thạnh và An Thới Đơng. [17]
Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là 75.740 ha
(2000) [29], [51], gồm vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp. Theo định hƣớng qui
hoạch phát triển của huyện Cần Giờ đến năm 2010, cơ cấu đất đai về cơ bản vẫn giữ vai
trò nồng cốt là rừng phòng hộ, rừng sinh quyển trên diện tích khoảng 38.000 ha (1993 1999) [29], mở mang thêm diện tích ni trồng thủy sản (6.990 ha [23]) với nguyên tắc
gắn bó chặt chẽ với các hệ sinh thái rừng ngập mặn.


5

Ghi chú:

Vùng lõi
Vùng đệm
Vùng chuyển tiếp

Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.


6

2.1.2.2. Chức năng từng vùng trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần
Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh
a. Vùng lõi (4.721 ha)
Vùng lõi bao gồm các tiểu khu rừng số 3, 4b, 6, 11, 12 và 13. Vùng này đặc

trƣng cho các hệ sinh thái rừng trồng, đặc biệt là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc
theo các kênh rạch và bìa rừng, có mức độ đa dạng sinh học cao về thành phần các loài
động vật, thực vật, vi sinh vật cùng cảnh quan rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn [28],
[45]. Các chức năng chính bao gồm:
 Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên.
 Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trƣờng sống của động vật hoang
dã, đặc biệt là chim nƣớc.
 Bảo tồn hệ thống thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển, nơi kiếm ăn và
sinh đẻ của các loài động vật vùng triều.
 Tiến hành một số cơng trình nghiên cứu khoa học về sức bền hệ sinh thái và du
lịch sinh thái có giới hạn.
b. Vùng đệm (41.139 ha)
Là vùng tiếp giáp với vùng lõi, có thể tiến hành các hoạt động kinh tế, nghiên
cứu, giáo dục và giải trí nhƣng khơng ảnh hƣởng đến mục đích bảo tồn vùng lõi.
Vùng đệm bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22. 23 và 24. Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, dựa trên các quần
xã chiếm ƣu thế [28], [45], bao gồm:
 Góp phần bảo vệ chung vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển.
 Tạo không gian lớn cho thú hoang dã ngoài vùng lõi. Khi các khu vực này trở
nên ổn định, có thể bổ sung vào vùng lõi nếu cần thiết.
 Tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hóa nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái.
 Các mơ hình lâm ngƣ kết hợp với môi trƣờng cũng đƣợc ứng dụng trong vùng
này cho cƣ dân địa phƣơng.


7

c. Vùng chuyển tiếp (29.880 ha)
Vùng chuyển tiếp bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ, cả các khu
lúa nƣớc và vƣờn cây ăn trái cùng thảm cỏ dọc theo bờ biển Cần Thạnh, Long Thành,

Lý Nhơn. [28], [45] Chức năng chính của vùng này:
 Đệm xã hội: các hoạt động sản xuất trong vùng chuyển tiếp cung cấp các loại
sản phẩm và dịch vụ chủ yếu cho cƣ dân địa phƣơng. Việc sử dụng đất và tài
nguyên thiên nhiên trong khu vực này không đƣợc mâu thuẫn với mục tiêu của khu
dự trữ sinh quyển do UNESCO qui định. Mối quan hệ giữa con ngƣời và thiên nhiên
phải đƣợc hài hòa.
 Đệm mở rộng: việc quản lý và phát triển của vùng chuyển tiếp nhằm mục tiêu
mở rộng khơng gian có sẵn nhƣ mơi trƣờng sống cho các loài thú hoang dã từ vùng
đệm.
2.1.2.3. Hệ sinh vật ở rừng ngập mặn Cần Giờ
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ mang tính đa dạng sinh học cao.
Hệ thực vật, có trên 158 lồi thực vật thuộc 76 họ, các loài chủ yếu nhƣ Đƣớc, Bần
trắng, Mắm trắng, các quần hợp Đƣớc đôi - Bần trắng cùng Xu ổi, Trang, Đƣng (Đâng
hay Đƣớc xanh) và các loài nƣớc lợ nhƣ Bần chua, các quần hợp Mái dầm – Ơ rơ, Dừa
lá, Ráng. Thảm cỏ biển với các loài ƣu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia
sp., đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa, vƣờn cây ăn trái.
Thảm thực vật này là mơi trƣờng sống cho nhiều lồi động vật [29], [40], [44],
theo thống kê năm 1999 nhƣ sau:
 Khu hệ động vật thủy sinh khơng xƣơng sống có trên 700 loài thuộc 44 họ, 19
bộ, 6 lớp, 5 ngành. Điển hình: Tơm sú (Penaeus monodon), Cua biển (Scylla
serrata).
 Khu hệ cá có trên 137 lồi thuộc 39 họ, 13 bộ. Điển hình: cá Dứa (Pangasius
polyurandon), cá Thịi lịi (Periophthalmus schosseri).
 Khu hệ động vật có xƣơng sống trên cạn có 9 lồi lƣỡng thê, 31 lồi bị sát, 4
lồi hữu nhũ. Trong đó có 11 lồi bị sát có tên trong sách đỏ Việt Nam nhƣ: Tắc kè


8

(Gekko gekko), Kỳ đà nƣớc (Varanus salvator), trăn Đất (Python molurus), trăn

Gấm (Python reticulatus), rắn Cạp nong (Bungarus fasciatus), rắn Hổ mang (Naja
naja), rắn Hổ chúa (Ophiophagus hannah), Vích (Chelonia mydas), cá Sấu hoa cà
(Crocodylus porosus).
 Khu hệ chim có khoảng 130 lồi thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 lồi chim
nƣớc và 79 lồi khơng phải chim nƣớc sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau. Điển
hình nhƣ: Cò lạo Ấn Độ (Mycteria leucocephala), Choắt lớn mỏ vàng (Tringa
stagnatilis).
Ngày 21 / 01 / 2000, khu rừng ngập mặn Cần Giờ đã đƣợc MAB / UNESCO
công nhận là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam nằm trong mạng lƣới 459
khu dự trữ sinh quyển thuộc 97 quốc gia trên thế giới tính đến 10 / 2004, đồng thời
cũng là khu rừng trồng đầu tiên của thế giới đƣợc công nhận là khu dự trữ sinh quyển.
[49], [52]
2.1.3. Thực trạng của rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay
Sau 29 năm tái tạo (1978 - 2007) và 7 năm là khu dự trữ sinh quyển (2000 2007), chất lƣợng rừng tại rừng ngập mặn Cần Giờ đã có chiều hƣớng giảm. Sâu bệnh
phát triển mạnh. Đặc biệt khi mật độ cây quá dày, tán cây bao kín nhƣ hiện nay thì sự
tấn cơng của sâu bệnh sẽ càng thuận lợi hơn. Sâu ăn lá, nấm trắng, sâu đục thân làm cho
cây sinh trƣởng chậm và chết hàng loạt. Hiện ở rừng Cần Giờ, cây khỏe và cây bệnh
đang sống chen nhau [50]. Ngồi ra, do bịt kín bờ đê, không cho nƣớc ra vào tự nhiên
nhƣ trƣớc nên gây ra hiện tƣợng cả khu vực nƣớc bị tù đọng, sẫm màu, rễ cây ngày
càng phát triển nên sự lắng tụ càng nhiều làm cho vùng đất gò cao hơn. Bên cạnh đó,
việc xây dựng tuyến đƣờng xuyên Bắc – Nam rộng lớn nhƣ hiện nay đã phân rừng
thành 2 khu rõ rệt tạo sự cách ly địa lý, nên hệ sinh thái cũng có sự khác biệt. Một số
loài động vật (chuột, ếch, nhái) cũng hạn chế qua lại. Tuyến đƣờng này khơng những
làm ơ nhiễm khơng khí, mà còn ngăn cản dòng chảy ở một số nơi, làm hạn chế nƣớc
triều ngập vào rừng hoặc gây tình trạng ứ nƣớc, làm cây chết, chủ yếu là đƣớc. Rừng
ngập mặn Cần Giờ khơng chỉ là rừng phịng hộ mà còn là khu dự trữ sinh quyển, khu


9

bảo tồn thiên nhiên. Cho nên nhất thiết phải có chủ trƣơng về quản lý và những tác
động lâm sinh, cũng nhƣ cơ chế chính sách phù hợp cho khu rừng này. [39]
2.2. Cây Đƣng (Rhizophora mucronata Lamk.)
2.2.1. Phân loại [35], [46], [47]
Tên La tinh: Rhizophora mucronata.
Ngành: Thực vật có hoa.
Ngành phụ: Thực vật hạt kín.
Lớp: Hai lá mầm.
Lớp phụ: Có nhiều cánh tràng.
Bộ: Sim Myrtales.
Nhóm: Cây ngập mặn.
Họ: Đƣớc Rhizophoraceae.
Chi: Rhizophora.
Lồi: mucronata Lamk.
Tên thơng dụng tại một số quốc gia Đông Nam Á [47]
Brunei: Lengayong.
Campuchia: Doeum prasak.
Indonesia: Bakau bakau hitam.
Malaysia: Bakau jangkar.
Mianma: Pyoo.
Philipine: Bakßuan.
Singapore: Belukap.
Thái Lan: Phangka.
Việt Nam: Đƣng, Đâng, Đƣớc xanh.


10

2.2.2. Hình thái học
Cây gỗ cao khoảng 20 m, đƣờng kính 60 – 70 cm. Vỏ có màu xám đen hay đỏ

sẫm, có đƣờng nứt ngang đều đặn. Hệ rễ rất phát triển, gốc có nhiều rễ chống hình nơm,
và rễ nổi. Trên rễ có nhiều lỗ bì. Rễ dài khoảng 3 m, đƣờng kính rễ dao động từ 2,5 –
8,0 cm. Mạng lƣới rễ đan vào nhau chằng chịt nhƣ những tấm đăng khổng lồ giữ phù
sa. [31], [34], [46], [47]
Lá đơn, mọc đối, dài 6 – 16 cm, rộng 3 – 8 cm, dày, cứng, dai. Lá màu xanh đậm
bóng có hình trái xoan hay thn nhọn giáo. Gân giữa lớn, màu lục, gân bên không rõ.
Cuống lá thơ, hơi dẹt, màu lục. Lá kèm hình tam giác thƣờng rụng sớm.

C

B

A

C

A

B
D

Hình 2.2 Các thành phần trong cấu tạo hình thái cây Đƣng. [18], [37], [28]
(A) lá, (B) hoa, (C) trái, (D) hệ thống rễ.
Đài hoa không rụng cho đến khi thành trái [12]. Có 4 đài hoa, nhiều lá đài, lá đài
hình ovan, nhọn, có nhiều thịt, dày, màu xanh lá, khơng có lơng tơ. Đài hoa dài khoảng
1,2 cm, rộng khoảng 0,7 cm, chiều dài các đài hoa bằng nhau.
Cánh hoa màu trắng, có 4 cánh hoặc nhiều hơn, nhọn, cánh hoa đều, mọc thẳng,
không theo quy luật, có lơng tơ, mép ngun hơi cong, dày, đầy thịt. Các cánh hoa mọc
so le với đài hoa. Mặt lƣng cánh hoa có lơng thƣa, uốn cong vào ơm lấy nhị. Nhị 8
chiếc, chỉ nhị ngắn, bao phấn 3 khía, bầu trung hoặc bầu dƣới hình nón 2 ơ, mỗi ô 2

11

nỗn, vịi chẻ đơi [12]. Hoa có cuống dài khoảng 0,5 cm, dẹt, màu xanh lá, khơng có
lơng tơ.
Trái non hình trứng phía dƣới phình rộng, màu lục hoặc màu xám, có đài rủ
xuống. Trụ mầm dài 35 – 70 cm, phía dƣới hơi phình to, một hạt. Trái Đƣng nảy mầm
ngay trên cây mẹ, trái chín rơi xuống, trụ mầm cấm vào trong bùn nhƣ một cái cọc,
tránh cho cây con khỏi bị nƣớc biển cuốn trôi, cây con tự cấm rễ xuống bùn để tiếp tục
phát triển. [2], [12]
2.2.3. Phân bố
Đƣng đƣợc tìm thấy ở nhiều nơi, dọc bờ biển Ấn Độ Dƣơng, Tây Thái Bình
Dƣơng nhƣ Ấn Độ, Campuchia, Trung Quốc (đảo Hải Nam, Đài Loan), Malaysia,
Indonesia, Philipin, Nhật Bản, Madagascar, Ustralia, Melanesia. Ở Kenya (Đông Phi),
Đƣng là loài cây đặc trƣng cho Rhizophoraceae. [2], [47]
Ở Việt Nam Đƣng đƣợc trồng trên các bãi bồi ven biển, chịu ảnh hƣởng thƣờng
xuyên của thủy triều giàu mùn hay trên các bãi đang ổn định ở vùng ngập mặn ven
biển. Cây trƣởng thành nhanh, tái sinh hạt tốt, ra hoa vào khoảng tháng 5 – 6, tạo trái
vào tháng 10 – 11.
2.2.4. Giá trị kinh tế
Gỗ Đƣng màu đỏ vàng sẫm, nặng, rắn nên đƣợc sử dụng trong xây dựng, làm đồ
nội thất, làm củi rất tốt, than đốt tỏa nhiệt lƣợng cao [26], [32]. Vỏ cây giàu tannin,
đƣợc dùng trong công nghiệp thuộc da, nhuộm lƣới đánh cá [46]. Bột vỏ cây Đƣng còn
đƣợc dùng làm thuốc trị bệnh thiếu máu, bệnh đái tháo đƣờng, bệnh viêm họng, bệnh
xuất huyết, chứng huyết niệu, urê máu, lá cây còn đƣợc dùng làm thuốc cao đắp rất tốt
[33]. Ngoài ra, Đƣng cịn giữ chức năng điều hịa khí hậu, chắn gió, chống xói lở đất
ven sơng, ven biển, mở rộng diện tích bãi bồi ra biển, giảm bớt sự xáo trộn đất đai và ô
nhiễm nguồn nƣớc ven biển, nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho các loài động vật
hoang dã và hải sản có giá trị cao [43]. Trong quá trình phân giải lƣợng protein trong

lớp thảm mục nhờ quá trình hoạt động của vi sinh vật, quần thể Đƣng đã giúp tạo ra
nhiều mùn bã hữu cơ là nền tảng của chuỗi thức ăn đặc trƣng của vùng ven biển cửa