Phân lập gen mã hóa enzyme GDP d mannose 3’ 5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin c từ cây quýt miền núi phía bắc việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ KIM CHI

PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA
ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE
LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C
TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

\

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ KIM CHI

PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA
ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE
LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C
TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM
Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm

THÁI NGUYÊN - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi
rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và
chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018
Tác giả

Nguyễn Thị Kim Chi

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã
tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công
trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Di truyền &
Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng DNA ứng dụng, Phòng thí nghiệm
Trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiệm
của đề tài.
Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt

thời gian học tập và thực hiện đề tài luận văn.
Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học của
Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm
- Đại học Thái Nguyên.

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018
Tác giả

Nguyễn Thị Kim Chi

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC ..........................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3
1.1. Phân loại thực vật học và đặc điểm sinh học của cây quýt .......................... 3
1.1.1. Phân loại thực vật học cây quýt ................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây quýt ................................................................ 3
1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt ....................................................... 4
1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid và một số gen, enzyme tham

gia tổng hợp ascorbic acid ở thực vật .................................................................. 6
1.2.1. Ascorbic acid ............................................................................................. 6
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vitamin C ......................................................... 7
1.3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền ....... 11
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 17
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ....................................................................... 17
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 17
2.1.2. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 17
2.2.1. Phương pháp thu mẫu .............................................................................. 17

iii


2.2.2. Phương pháp xác định trình tự gen.......................................................... 17
2.3. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 22
2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn ............................................ 22
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 23
3.1. Nhân bản và giải trình tự gen GDP-D từ DNA của giống quýt BS-LS ..... 23
3.1.1. Kết quả nhân bản gen GDP-D bằng kỹ thuật PCR ................................. 23
3.1.2. Kết quả tách dòng gen GDP-D ................................................................ 24
3.1.3. Đặc điểm của trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS ......... 25
3.2. Sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của
gen GDP-D ........................................................................................................ 30
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 34
1. Kết luận .......................................................................................................... 34
2. Đề nghị........................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 35

iv

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

bp

base pair

CIAA

24 Chloroform: 1 isoamylalcol

CTAB

Cetyl trimetyl amomnium bromide

DEPC

Diethyl Pyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleotide acid

DNTPs

Deoxynucleotide triphosphate

GDP-D

GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase

kb

kilo base

NCBI

National Center for Biotechology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

TAE

Tris - Acetate - EDTA

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1.

Thành phần phản ứng PCR nhân gen GDP-D ............................. 19

Bảng 2.2.

Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen GDP-D ....................... 19

Bảng 2.3.

Thành phần phản ứng gắn gen GDP-D vào vector tách dòng pBT..... 20

Bảng 2.4.

Thành phần phản ứng colony - PCR ............................................. 21

Bảng 3.1.

Những vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự nucleotide
của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946................. 27

Bảng 3.2.

Những vị trí amino acid sai khác giữa hai trình tự protein suy
diễn của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946........ 29

Bảng 3.3.

Trình tự gen mang mã số trên GenBank được sử dụng phân tích.... 30

Bảng 3.4.

Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của trình tự nucleotide của
gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và các trình tự trên

GenBank ........................................................................................ 31

Bảng 3.5.

Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của BS-LS và các trình tự
trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen
GDP-D........................................................................................... 32

v


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình1.1.

Các dạng Ascorbic acid trong tự nhiên .......................................... 7

Hình 1.2.

Con đường sinh tổng hợp Ascorbic acid ............................................. 8

Hình 3.1.

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của mẫu quýt
BS-LS với cặp mồi GDP-D-F và GDP-D-R................................. 23

Hình 3.2.

Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc ................ 24

Hình 3.3.

Đặc điểm trình tự nucleotide của mẫu BS-LS thu được bằng
máy xác định trình tự nucleotide tự động ..................................... 25

Hình 3.4.

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D phân lập
từ giống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D trên GenBank
mang mã số HQ224946 ................................................................. 27

Hình 3.5. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự nucleotide của
gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với một số trình tự
gen đã công bố trên GenBank ....................................................... 28
Hình 3.6.

Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen GDP-D
phân lập từ giống quýt BS-LS và từ gen GDP-D mang mã số
HQ224946 trên GenBank. ............................................................. 29

Hình 3.7.

Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của BS-LS với các trình tự
đã công bố trên GenBank dựa trên trình tự nucleotide của gen
GDP-D........................................................................................... 31

Hình 3.8.

Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của BS-LS với các trình tự
đã công bố trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn

của gen GDP-D ............................................................................. 32

vi


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) là giống cây ăn quả được nhiều
người biết đến với vị ngọt thanh, mùi thơm đặc trưng, chứa nhiều vitamin,
khoáng chất và dinh dưỡng cần thiết cho con người. Quýt được khuyến khích
sử dụng hằng ngày bởi các chuyên gia dinh dưỡng.
Quýt không chỉ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng mà còn đóng vai trò
tích cực trong phát triển kinh tế ở nhiều địa phương.Trồng quýt đem lại thu nhập
cao cho các hộ làm vườn so với các cây nông nghiệp khác, trung bình từ 80 - 100
triệu đồng/ha/năm.
Cây quýt được trồng lâu đời ở miền núi phía Bắc Việt Nam có sự thích
nghi sinh thái ở diện hẹp, do đó đòi hỏi khá kỹ tính về điều kiện canh tác, nông
hóa thổ nhưỡng hay tiểu vùng khí hậu. Điều này dễ nhận thấy mỗi loại quýt chỉ
trồng phù hợp trên một địa bàn đặc hữu với các giống thường gặp như quýt sen
(Phú Thọ), quýt hồng (Hà Giang), quýt đường (Lào Cai), quýt Quang Thuận
(Bắc Kạn), quýt Bắc Hà (Lào Cai), quýt giấy (Tuyên Quang), quýt Bắc Sơn
(Lạng Sơn) [4].
Quả quýt chứa hàm lượng vitamin C cao, khoảng 30mg- 36mg vitamin C
trong 100gram quả. Vitamin C tốt cho tóc, da, tiêu hóa, hệ thống miễn dịch và
cân bằng trọng lượng cơ thể. Mỗi giống quýt lại có hàm lượng vitamin C khác
nhau, điều này ảnh hưởng đến mùi vị, độ chua ngọt của mỗi giống quýt.
Nghiên cứu đặc điểm trình tự các gen tham gia tổng hợp vitamin C, và tìm
hiểu sự đa dạng của trình tự các gen này ở các giống quýt địa phương là cơ sở
đề xuất sử dụng đa dạng hóa trong việc chọn giống cho vùng trồng chuyên canh.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Phân lập gen

mã hóa enzyme GDP-D-mannose-3’.5’- epimerase liên quan đến tổng hợp
vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt Nam.”

1


2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá được đặc điểm trình tự gen liên quan đến tổng hợp vitamin C ở
mẫu quýt khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen liên quan đến tổng
hợp vitamin C ở mẫu quýt miền núi phía Bắc.
3.2. So sánh trình tự gen, trình tự amino acid suy diễn của enzyme liên
quan đến tổng hợp vitamin C ở mẫu quýt nghiên cứu với một số trình tự đã công
bố trên GenBank.

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phân loại thực vật học và đặc điểm sinh học của cây quýt
1.1.1. Phân loại thực vật học cây quýt
Cây quýt có tên khoa học là Citrus recutilata Blanco (tên khác: Citrus
suhuiensis Hort. ex Tanaka hoặc: Citrus deliciosa Tennre) [6], [11]. Quýt thuộc
chi Cam chanh (Citrus), họ Cam quýt (Rutaceae), bộ Cam quýt (Rutales).
Tập đoàn quýt trồng khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam được xác định
với nhiều giống quýt (Variele) trong loài Citrus recutilata Blanco với bộ nhiễm
sắc thể 2n = 18, quýt mang những đặc tính đặc trưng của chi quả có múi Citrus ở
đặc điểm có các túi chứa tuyến dầu và hoa lưỡng tính, thụ phấn nhờ sâu bọ [11].

1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây quýt
Cây quýt có tuổi thọ trung bình từ 20 - 50 năm, trong đó thời kỳ cho thu
hoạch quả tập trung khoảng 15 - 25 năm.
Quýt là cây thân gỗ, thường xanh, thiết diện tròn, màu nẫu thâm, cao 23m, hình dạng ngoài của cây thường có hình chóp, thân cây có gai, phần trong
vỏ cây chứa nhiều túi tiết tinh dầu thơm. Cây trồng bằng hạt thường có một gốc
lớn, cây trồng bằng cành chiết thì có nhiều cành gốc.
Quýt có rễ cọc khỏe , lan rộng, rễ phát triển tối ưu ở nhiệt độ 10-37oC,
khi nhiệt độ cao hơn hay thấp hơn cộng với độ ẩm của đất là 1% thì sự phát
triển của rễ sẽ ngừng lại hoặc tỷ lệ oxy trong đất từ 1,2 -1,5% thì rễ cũng ngừng
phát triển.
Lá quýt là đơn mọc cách, không có eo lá, trên lá chứa nhiều túi tiết dầu
thơm, dưới dạng điểm, có thể quan sát được bằng mắt thường khi soi qua ánh
sáng cường độ đủ lớn. Lá thay nhau rụng trong lúc lá mới xuất hiện nên cây lúc
nào cũng xanh lá.
Hoa quýt được hình thành ở nách lá, có cấu tạo là hoa cụm, lưỡng tính,
cánh hoa rời nhau, hoa mẫu bốn, trong hoa thường có đĩa mật, một đặc điểm

3


thích nghi với thụ phấn nhờ sâu bọ. Đài hoa gồm các mảnh dính nhau ở phía
dưới làm thành đài hợp hình đấu. Nhị hoa có số lượng gấp ba đến bốn lần cánh
hoa (do sự phân nhánh), chỉ nhị dính thành nhiều bó. Bộ nhụy đôi, một đầu vòi
và một đầu nhụy với nhiều lá noãn dính lại thành bầu trên, nhiều ô, mỗi ô tương
ứng với số lá noãn đính trụ giữa. Kích thước hoa khi nở trung bình từ 0,2 - 0,25
cm. Cây quýt miền Bắc ra lộc đầu tiên vào tháng 2 hoặc tháng 3 hằng năm, phần
lớn sinh cành cho quả, đợt 2 vào tháng 5 và tháng 6 ra hoa, đợt 3 vào tháng 7 và
tháng 8 đợt lộc này sinh ra cành khỏe dài, lá to màu nhạt. Trong các lứa ra hoa
thì lứa hoa tháng 2 và tháng 3 là tốt nhất.
Quả quýt là quả mọng với ba lớp vỏ, lớp vỏ ngoài chứa các túi dầu, lớp vỏ

giữa trắng xốp (cùi), vỏ quả giữa mỏng dai, phía trong có nhiều lông đơn bào
chứa nhiều nước mà người ta thường gọi là “tép”.
Sự sinh trưởng của quả quýt trải qua các giai đoạn: Giai đoạn ra hoa hình
thành quả (từ tháng 12 đến giữa tháng 3 năm sau), rụng quả sinh lý đợt một (cuối
tháng 4), rụng quả sinh lý đợt hai (đầu tháng 6), quả chắc xanh (cuối tháng 8) và
cho thu hoạch (đầu tháng 10 đến tháng 1 năm sau).
Quả quýt có hình dẹt (trừ quýt chum), vỏ màu vàng và mỏng, trọng lượng
của quả đạt khoảng 35 gam đến 145 gam. Vị quả ngọt sắc, chua nhẹ đặc biệt có
hương thơm đậm, đặc trưng rất dễ phân biệt với bất kỳ quả trong nhóm cây ăn
quả có múi khác. Quả trung bình có từ 8 đến 16 múi, số hạt trung bình của quả
giao động từ 10 đến 40 hạt. Hạt quýt có 2 lá mầm, đa phôi hay đơn phôi, hạt có
2 lớp màng vỏ, màng ngoài cứng do thấm nhiều lignin, màng trong mỏng.
Hạt thường chín cùng quả, nảy mầm ở nhiệt độ từ 10-30oC, nhiệt độ tối ưu
là 25-30oC [14].
1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt
Trong quả quýt có nhiều chất dinh dưỡng, vitamin, khoáng chất cần thiết
cho con người, đặc biệt chứa vitamin C giúp chống lại một số bệnh tật, tăng
cường sức đề kháng. Mỗi 100 gram quả quýt có thành phần dinh dưỡng gồm:

4


87,6 gram nước; 1,104 mg carotene - một loại vitamin chống oxy hóa, 30mg
vitamin C, 93mg kali, 26 mg canxi, 9mg magnesium, 0,3g chất xơ, 4,5 mg
natri, 7mg Chromium, 20mg phốt pho, 0,32 mg sắt và giá trị năng lượng là 48
kcal, protein chiếm 0,6 %, lipid chiếm 0,4 %, đường khoảng 8,6 %...Trong đó,
tinh dầu vỏ quýt (có tên thương phẩm là Mandarin oil), là chất lỏng màu vàng
đỏ có huỳnh quang xanh nhẹ. Thành phần chính tinh dầu vỏ quýt là limonen
(hơn 90 %), methylan - thranilat (1 %).
Trong quýt ngoài vitamin C, chất khoáng thì còn có một lượng chất xơ.

Chất xơ khi vào ống tiêu hóa sẽ trương lên do hút nước trong ruột, giúp cặn bã
của quá trình tiêu hóa dễ dàng thải ra ngoài. Chất xơ khi vào ruột kết hợp với
đường và acid tạo thể đông có tác dụng làm chậm quá trình hấp thụ một số chất
dinh dưỡng từ đó làm lượng đường trong máu tăng vừa phải, duy trì ở mức cần
thiết, nhờ đó mà cơ thể không thừa đường, không chuyển hóa thành mỡ dư thừa
dự trữ ở các mô gây béo phì.
Quả quýt không chứa chất béo hay cholesterol nhưng chứa nhiều vitamin
C. Quả quýt được chứng minh có tác dụng chống viêm, chống khối u, ức chế
đông máu và chống oxy hóa mạnh. Trên thực tế, hàm lượng vitamin C chỉ
chiếm 15 - 20% tổng số các chất kháng oxy hóa trong quả, trong khi những hợp
chất khác có khả năng chống oxy hóa cao gấp 6 lần vitamin C đó là hesperidin
từ flavanoid có nhiều trong lớp vỏ xơ trắng, màng bao múi của quả và một
lượng nhỏ trong tép [14].
Ăn cam quýt còn giúp chữa lành các vết thương nhanh hơn bởi vitamin
C đảm nhiệm vai trò quan trọng trong cơ thể để sản xuất collagenprotein chịu
trách nhiệm tạo ra các mô liên kết, giúp vết thương, vết cắt hay xước da mau
lành, thiếu hụt collagen khiến các tế bào trong mạch máu thiếu sự gắn kết, cho
phép máu rò rỉ trong các mô, cơ quan dễ dẫn đến chảy máu nướu răng và xuất
hiện đốm màu đỏ đặc trưng của bệnh Scorbut [28].

5


Quả quýt có vị chua tính ấm. Người bị cao huyết áp, bệnh mạch vành,
đau dạ dày, suy dinh dưỡng, cơ thể suy nhược sau khi ốm ăn quýt rất tốt. Vỏ
quýt khô gọi là trần bì, có tính ấm, có tác dụng làm khỏe dạ dày, long đờm, trị
ho, trị phong, lợi tiểu, chữa ợ hơi, đau thượng vi. Y học đã chứng minh, tinh
dầu thơm trong vỏ quýt có tác dụng hưng phấn tim, ức chế vận động của cơ dạ
dày, phòng xuất huyết. Vỏ quýt còn dùng để điều trị cao huyết áp, nhồi máu cơ
tim, có tác dụng tốt đối với các chứng bệnh đầy bụng, rối loạn tiêu hóa, kém ăn,

buồn nôn, ho nhiều đờm. Hạt quýt có vị đắng tính bình, vào hai kinh can và
thận, có tác dụng kiện tì, lý khí, táo thấp hóa đờm. Lá quýt vị đắng tính bình,
vào đường can kinh, có tác dụng trợ gan, hành khí, tiêu thủng, tan u cục, chữa
đau mạn sườn, sa nang, u cục ở vú [29].
1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid và một số gen, enzyme tham gia
tổng hợp ascorbic acid ở thực vật
1.2.1. Ascorbic acid
Ascorbic acid (vitamin C) có nhiều trong cây xanh, rau quả, đặc biệt trong
chanh, cam, bưởi, quýt, bắp cải và trong thịt, nhất là ở cây hồng gai và một số
giống ớt đỏ (có thể đạt tới 1% - 2 % khối lượng khô). Lần đầu tiên vitamin C
được tách chiết từ chanh, cam vào năm 1920. Đến năm 1933, vitamin C được
điều chế thành công bằng con đường tổng hợp hóa học không cần phải tách chiết
từ thực vật. Ngày nay, vitamin C được biết tồn tại trong tự nhiên dưới dạng khử
(L. ascorbic acid) và dạng oxy hoá (dehydroascorbic acid). Tuy nhiên, dạng oxy
hóa không phổ biến bằng dạng khử. Cả hai dạng đều tan trong nước, dễ bị phân
huỷ khi tiếp xúc với các chất oxy hoá hoặc bazơ. Cả hai dạng khử và dạng oxy
hoá đều có hoạt tính sinh học và đều tồn tại trong các dịch cơ thể. Hoạt tính của
vitamin C chủ yếu là do nhóm endiol của axit ascorbic, vì nhóm này làm nhiệm
vụ tham gia vận chuyển hydro [25].

6


(- C ===== C -)
|

|

OH

OH

Dạng khử (L. ascorbic acid)

Dạng oxy hoá
(dehydroascorbic acid)

Hình1.1. Các dạng ascorbic acid trong tự nhiên [19]
So với các vitamin khác, vitamin C là chất duy nhất không có ở dạng phức
hợp với các nucleotide hoặc coenzym. Đặc tính cơ bản của ascorbic acid là tác
dụng khử.
Đặc tính này để định lượng vitamin C khi cho nó tác dụng với một chất có
màu, rồi xác định bằng phương pháp so màu.
Trong cơ thể người hoàn toàn không tự tổng hợp được vitamin C mà phải
lấy từ các nguồn thức ăn bên ngoài vào. Vitamin C dễ tìm, có nhiều ở rau quả.
Trong cơ thể, vitamin C có nồng độ khác nhau ở mô và thể dịch, nơi nào chuyển
hoá mạnh nhất thì nồng độ vitamin C ở đó cao nhất.
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vitamin C
Nghiên cứu về cơ chế tổng hợp vitamin C ở thực vật gần đây được công
bố năm 1998 bởi Steven Clarke tại phòng thí nghiệm UCLA (University of
California, Los Angeles, Hoa Kỳ). Theo ông, các nghiên cứu từ năm 1998 đến
nay đã xác minh được phần lớn cơ chế này, mặc dù gen thực hiện bước thứ
bảy(g) trong sơ đồ hình 1.2 trong tổng số 10 bước chuyển hóa glucose thành
vitamin C được đề xuất vẫn còn là một ẩn số và đang tiếp tục nghiên cứu.
Quá trình nghiên cứu bắt đầu từ việc tìm ra vai trò của một gen có trong
loài giun C. elegans, một loài giun nhỏ được nhà nghiên cứu Tara Gomez từ
phòng thí nghiệm UCLA của Clarke sử dụng làm mẫu vật để nghiên cứu quá

7

trình lão hóa. Trình tự sắp xếp của gen cho thấy nó có mối quan hệ với một họ
gen bị biến đổi trong bệnh ung thư.
Sự cộng tác từ nhiều phòng thí nghiệm đã khám phá ra điểm tương đồng
trong gen của loài giun này với sản phẩm là gen GDP-L-galactose phosphorylase
(GGP hay VTC2) của một loài cải dại có tên Arabidopis thaliana, một loại thực
vật hoang dại mà bộ gen của chúng đã được biết rõ. Trước đây, các nhà khoa học
đã tìm thấy mối tương quan giữa những đột biến trong gen của loài thực vật này
với hàm lượng vitamin C thấp. Chính vì thế, một số nghiên cứu hiện nay tập
trung vào việc xác định cách mà sản phẩm của gen này góp phần vào quá trình
tổng hợp vitamin C [26].

Mạng lưới nội chất
hạt, polysacarit và
glycoprotein thành tế
bào

Ty thể

Quan điểm hiện tại về Sinh học thực vạt

Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid, Nicholas Smirnoff (2000) [21]
8


Steven Clarke tái hiện lại bước thứ 7(g) trong hình 1.2, một ẩn số trong
suốt một thời gian dài, trong quá trình tổng hợp vitamin C trong phòng thí
nghiệm, một phản ứng mà được miêu tả là bước khơi mào. Sau đó, so sánh 6
bước đầu tiên của quá trình tổng hợp vitamin C với một bản đồ gồm nhiều quá
trình chuyển hóa từ đường glucose đến các hợp chất tế bào mà có thể xảy ra. Tuy

nhiên, một khi sản phẩm của bước (f) là một hợp chất có tên GDP-L-galactose
có thể thoát ra ở nơi có mặt gen VTC2 thì các nguyên tử sẽ được hoàn thiện cấu
trúc để hướng đến việc tổng hợp vitamin C, đặc biệt là tạo ra một số các loại
vitamin khác. Enzyme VTC2 đã được biểu hiện và tinh chế từ vi khuẩn. Tác giả
và nhóm nghiên cứu đã chứng minh được rằng gen VTC2 chịu trách nhiệm ở
bước (g), bước mà các nhà nghiên cứu đã tìm kiếm rất lâu trong quá trình tổng
hợp vitamin C. Bởi vì, các enzyme xúc tác cho các bước thực hiện khơi mào
trong quá trình tổng hợp cho thấy các vị trí điều hòa sinh học nên các nhà nghiên
cứu hi vọng khám phá này có thể đưa đến những chiến lược mới khi mong muốn
của con người là tăng hàm lượng vitamin C trong cây trồng thực vật [21].
Trên cây ăn quả có múi, khi so sánh hàm lượng vitamin C giữa cam và
quýt (Citrus unshiu Marc và Citrus sinensis Osb.) của Trung Quốc, Xiao Y. Y.
và cs (2011) đã chỉ ra hàm lượng vitamin C ở cam nhiều hơn so với quýt. Đồng thời
tìm ra 4 gen mã hóa cho 4 loại enzyme (GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase; GDP-Lgalactose-pyrophosphatase; L-galactose dehydrogenase và L- galactono - 1,4 lactone dehydrogenase) liên quan đến con đường hình thành ascorbic acid trong
quả. Các tác giả đã giải mã thành công gen mã hóa GDP-D-mannose-3’.5’epimerase (mã số HQ224946) liên quan đến hoạt động của enzyme ascorbate
oxidase và ascorbate peroxidase. Khi quả chín, sự có mặt của GDP-D-mannose3’.5’-epimerase đã góp phần nâng cao hàm lượng vitamin C của cam nhiều hơn
1,5 lần so với quýt [21].
Cũng theo Xiao – Y.Y. và cs (2011), gen mã hóa GDP-D-mannose-3’.5’epimerase tìm thấy trên Citrus unshiu (một loài cam ngọt), gen có tổng chiều dài

9


1086 bp. Gen mã hóa quy định trình tự phân tử protein GDP - D - mannose 3’.5’- epimerase với 361 amino acid. GDP - D - mannose - 3’.5’- epimerase điều
phối vào quá trình hoạt hóa từ enzyme GDP - D – manose thành GDP - L galactose, bước chuyển hóa (e) trong hình 1.2 trên con đường sinh tổng hợp
ascorbic acid ở thực vật được công bố trên GenBank với mã số HQ224946 [22].
Nghiên cứu của Xiao – Y. Y. và cs (2011) cũng đã chỉ ra rằng, trên gen
hình thành 03 vùng để quy định bảo toàn chức năng protein gồm: (1) Vùng được
đặt tên “M1P -guanylylT_B_like_N”, từ vị trí amino acid thứ nhất đến 234, quy
định enzyme pyrophosphorylase GDP – mannose một trong số các enzyme
tham gia trực tiếp trong chu trình hình thành ascorbic acid; (2) Vùng có tên

“LbetaH - LbH”, từ vị trí amino acid thứ 256 đến 335, mã hóa enzyme
acyltransfase liên quan đến sự chuyển hóa ion trong tế bào; và (3) Vùng “other”
từ vị trí amino acid thứ 303 đến 330, vị trí hình thành sự liên kết giữa các chuỗi
polypeptide [22], [21].
Cũng theo Junjie T. và cs (2018) ascorbic acid phổ biến đóng một vai trò
quan trọng trong sự phát triển của cây trồng và khả năng chịu stress phi sinh học,
nhưng nồng độ ascorbic acid rất khác nhau giữa các cây khác nhau. GDP-Dmannose epimerase (GDP-D), xúc tác GDP-D-mannose đến GDP- L -galactose
hoặc GDP- L -gulose, là một enzyme quan trọng trong con đường sinh tổng hợp
ascorbic acid thực vật. Các chức năng và mô hình biểu hiện của GDP-D đã
được nghiên cứu kỹ trong các công trình trước đó, tuy nhiên, ít thông tin được
biết về các mô hình tiến hóa của gen. Trong nghiên cứu này, cấu trúc gen GDPD , các mô hình protein được bảo tồn tương ứng và các mối quan hệ tiến hóa đã
được phân tích một cách hệ thống. Tổng số 111trình tự gen GDP-D được lấy từ
59 bộ gen thực vật, đại diện cho hầu như tất cả các dòng chính của thực vật
xanh: dicotyledons, monocotyledon, thực vật hạt trần, pteridophytes, bryophytes
và chlorophytes. Kết quả cho thấy rằng homologs của GDP-D đã có mặt rộng rãi
trong thực vật xanh. Cấu trúc gen GDP-D được bảo thủ ở cây cao hơn, trong khi

10


rất đa dạng trong các phân nhóm cơ bản của phylogeny bao gồm lycophytes,
bryophytes và chlorophytes, cho thấy cấu trúc gen GDP-D có thể đã trải qua sự
phân hóa sâu sắc ở thực vật thấp hơn và sau đó dần dần cố định như sự tiến hóa
của thực vật. Các trạng thái cơ bản của GDP-D được bảo tồn mạnh mẽ trong
thực vật xanh, cho thấy chức năng bảo tồn của protein. Một vài nhánh và địa
điểm được lựa chọn và hầu hết các nhánh nằm trong phân nhóm chlorophyte,
cho thấy sự lựa chọn đa dạng ở một số nhánh và địa điểm có thể đóng vai trò
trong sự phát triển của GDP-D và đa dạng hóa sự lựa chọn giai đoạn đầu của
thực vật xanh. Kết quả này cung cấp thông tin chi tiết mới về bảo tồn chức năng
và sự phát triển của GDP-D[23].

Nghiên cứu của Gilbert L. và cs (2009) đã sử dụng các dòng cà chua biến
đổi gen đã được RNAi-slienced cho GDP-D, qua đó xác nhận rằng GDP-D thực
sự đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa sinh tổng hợp ascorbate trong
thực vật. Ngoài ra, các dòng cà chua chuyển gen biểu hiện các khuyết tật tăng
trưởng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và sự phát triển tế bào. Một tính năng
đáng chú ý hơn nữa của cây chuyển gen là sự mong manh và mất độ săn chắc
của trái cây. Phân tích thành phần thành tế bào của lá và phát triển quả cho thấy
hàm lượng monosaccharide thành tế bào được thay đổi trong các dòng chuyển
gen, đặc biệt là những liên kết trực tiếp với hoạt động của GDP-D như: mannose
và galactose. Khi được xem xét cùng nhau, những phát hiện này cho thấy mối
liên hệ mật thiết giữa sinh tổng hợp polysaccharide của ascorbate và tế bào
không chứa cellulose trong thực vật, giúp giải thích các yếu tố phổ biến trong các
đặc điểm không liên quan như độ cứng trái cây và hàm lượng ascorbate[24].
1.3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền
Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền được các nhà nghiên cứu sử dụng
bằng nhiều phương pháp khác nhau, mỗi phương pháp cung cấp các loại thông
tin khác nhau. Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của
người nghiên cứu. Có hai phương pháp sử dụng rộng rãi để nghiên cứu, đánh giá

11


đa dạng di truyền là: phương pháp xác định đa dạng di truyền dựa trên hình thái
(kiểu hình) và thông qua các chỉ thị phân tử (kiểu gen) [8].
Xác định đa dạng di truyền dựa trên kiểu hình là phương pháp cổ điển,
hiện nay vẫn được sử dụng phổ biến. Phương pháp này giúp các nhà nghiên cứu
nhận biết và phân biệt các giống khác nhau bằng mắt thường trên thực địa một
cách nhanh chóng. Các đặc điểm chính về hình thái như dạng thân cây, dạng lá,
màu sắc lá, hoa... được xem là những trạng thái cơ bản để nhận biết giữa các
giống với nhau. Những tính trạng chất lượng thường là những cặp tính

trạng tương phản được duy trì đơn gen, mỗi tính trạng có hai hay nhiều
dạng tương phản.
Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử sử dụng chủ
yếu trong nghiên cứu các phân tử protein và DNA.
Chỉ thị dựa vào protein là chỉ thị isozyme. Isozyme là các dạng khác nhau
của cùng một enzyme. Enzyme có bản chất là protein và là chất đa điện li nên
trong dung dịch nó là trạng thái phân tử. Dưới tác động của dòng điện một chiều,
các phân tử protein khác nhau về khối lượng kích thước, lực tĩnh điện.. sẽ
chuyển động với tốc độ khác nhau và phân bố ở vị trí khác nhau trên gel, các
băng đa hình từ các enzyme đặc hiệu đặc trưng cho sản phẩm protein có thể cung
cấp thông tin di truyền như các chỉ thị đồng trội. Khi nghiên cứu đa hình protein
trên các giống lúa, Mohd A. A. và cs (2012) chỉ ra được nhược điểm của phương
pháp này là bị phụ thuộc vào số lượng các loại enzyme có thể phát hiện, vì thế số
lượng chỉ thị/genome bị hạn chế. Các loại enzyme được cấu tạo từ nhiều kiểu
đơn vị sẽ làm cho việc phân tích trở nên phức tạp [10].
Chỉ thị DNA có thể hiểu đơn giản chúng như các cột mốc nằm trên trình
tự DNA trong hệ gen. Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đối
giữa chúng phản ảnh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống hay một loài trong
quần thể. Sinh vật có khả năng nhân bản DNA của chúng với độ chính xác cao
nhưng có nhiều cơ chế xảy ra có thể làm biến đổi cấu trúc DNA, đơn giản như

12


các cặp base hay phức tạp như đảo đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn.. do đó, chỉ thị
phân tử được xem là công cụ hiệu quả cho việc đánh giá tính đa dạng di truyền
phục vụ cho công tác chọn giống.
Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị sinh học phân tử được đưa ra
nhiều phương pháp, kỹ thuật khác nhau như: RFLP (Retriction fragment length
plymorphism - Đa hình về chiều dài phân cắt hạn chế), RAPD (Ramdom

amplified polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên),
AFLP (Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các phân
đoạn được nhân bản), STS (Sequence tagged site - Điểm trật tự được đánh dấu),
SSR (Simple sequence repeat - Trình tự lặp lại đơn giản)…[10].
+ Kỹ thuật sử dụng chỉ thị phân tử RFLP:
RFLP (Restriction fragment length polymorphisms - đa hình độ dài các
đoạn cắt giới hạn). Nguyên lý của phương pháp là dựa trên sự sai khác của phổ
điện di và độ dài của các phân đoạn bị cắt bởi enzyme giới hạn.
Nghiên cứu trên cây ăn quả có múi tại Pakistan, Sadaf A. và cs (2014)
thông qua kỹ thuật RFLP đã cho thấy chỉ với 15 giống quýt trồng khác nhau theo
vùng địa lý đã chia ra làm 06 nhóm quýt có mối quan hệ họ hàng khác nhau về
di truyền, ông cũng chỉ ra nhược điếm của RFLP là tốn kém và mất thời gian,
phương pháp này đòi hỏi một lượng DNA lớn [11].
Sadaf A. và cs (2014) cũng đã chỉ ra ưu điểm của RFLP là tận dụng được
biến dị tự nhiên, phát hiện tính biến dị của DNA trong các giai đoạn phát triển
hoặc ở các cơ quan khác nhau của thực vật, không phụ thuộc vào hiệu quả kiểu
hình, môi trường và tương tác gen.
+ Kỹ thuật sử dụng chỉ thị phân tử AFLP:
Chỉ thị AFLP (Amplified fragment length polymorphism - đa hình độ dài
các đoạn được nhân bản có chọn lọc). Đề xuất bởi Vos và cs đề xuất năm 1995,
là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR.

13


Nghiên cứu gần đây trên cây có múi của Kinley D. và Chinawat Y. (2015)
bằng chỉ thị AFLP trên 23 giống quýt trồng của Bhutan đã minh chứng được
quýt ở đây gồm 02 nhóm quần thể phụ khác nhau về di truyền. Các tác giả cho
biết, chỉ thị AFLP có thể phân tích bất kỳ hệ gen nào từ đơn giản đến phức tạp,
có thể nhân bản chọn lọc nhiều đoạn giới hạn, thu được nhiều băng DNA cho

mỗi mẫu nghiên cứu, phân tích đa hình di truyền trong khoảng thời gian ngắn,
đòi hỏi lượng DNA ít, cho sự đa hình cao. Nghiên cứu của Kinley cũng chỉ ra
hạn chế của kỹ thuật này thể hiện đối với hệ gen của thực vật tương đối lớn và
phức tạp nên khi xử lý bằng enzyme giới hạn sẽ thu được số phân đoạn DNA lớn
nên rất khó phân tích. Chỉ thị tiến hành qua nhiều bước nên rất tốn kém và phức
tạp [18].
+ Kỹ thuật chỉ thị RAPD (Random amplified polymorphic DNA)
Kỹ thuật RAPD dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, nhưng sử
dụng mồi ngẫu nhiên để nhân bản những đoạn DNA hoàn toàn ngẫu nhiên
trong hệ gen.
Kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân
tích di truyền hệ thống sinh học. Nó là phương pháp hiệu quả trong việc xác định
kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản
đồ di truyền. Nghiên cứu cây có múi ở Đồng bằng sông Cửu Long, Nguyễn Hữu
Hiệp và cs (2004) đã tìm ra sự sai khác về mặt di truyền của một loạt quýt trồng
tại Gò Quao - Kiên Giang với các giống quýt tiều, quýt xiêm, quýt xiêm đen…
với khoảng cách di truyền biến động từ 0 - 43 % [2].
Kỹ thuật RAPD có ưu việt thực hiện nhanh, dễ làm, ít tốn kém nên được
ứng dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu quan hệ di truyền, lập bản đồ di truyền,
xác định chủng loại phát sinh của thực vật. Khi hệ gen của cây trồng có những
thay đổi như đột biến gen, đột biến nhiễm sắc thể… đều làm thay đổi kích thước
của đoạn nhân bản. Tuy nhiên, hạn chế là số băng DNA nhân bản thu được nhiều

14


và không chắc chắn khi có băng DNA giống nhau thể hiện cùng kích thước trên
bản gel có thực sự ở cùng một vị trí trên hệ gen hay không.
+ Kỹ thuật chỉ thị SSR (Simple sequence repeat - trình tự lặp lại đơn giản)
Kỹ thuật này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc

của phản ứng PCR. Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một
loạt các trình tự nucleotide lặp lại, chúng đặc trưng cho loài. SSR gồm 2 đến 5
nucleotide lặp lại nhiều lần.
Điểm nhấn của phương pháp này đòi hỏi ở việc thiết kế đoạn mồi cho
phản ứng SSR, đoạn mồi được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ ở hai đầu của đoạn
SSR. số lần lặp lại nhiều lần làm cho các phân đoạn DNA được nhân có độ dài
ngắn khác nhau. Các trình tự lặp lại thường có ở vùng dị nhiễm sắc trên mỗi
nhiễm sắc thể. Chúng có vai trò điều hòa hoạt động của các gen, góp phần làm
tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong phân bào, nó có thể mang thông
tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật.
Thiết kế các cặp mồi SSR cho nghiên cứu đa hình di truyền đối với cây có
múi được công bố bởi nhóm tác giả Behruoz G., Masoumeh N. và Babak B.
(2012), khi nghiên cứu trên quýt trồng tại Iran, các tác giả đã cho thấy tính
chính xác và hữu hiệu trong xác định quan hệ di truyền, phân loại thực vật,
xây dựng bản đồ liên kết và chẩn đoán cặp lai cho ưu thế lai, thực hiện thí
nghiệm tương đối đơn giản, dễ thực hiện, có khả năng phát hiện tính đa hình
rất cao khi sử dụng kỹ thuật SSR. Dẫu rằng khó khăn của phương pháp là ở
việc thiết kế mồi cho phản ứng nhân các đoạn SSR, nó đòi hỏi chi phí giá
thành cao [20].
Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà số
đơn vị lặp lại xuất hiện sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản. Mức độ đa
hình được xác định sau khi điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide hoặc
gel agarose. SSR được phân tích nhờ PCR nên chỉ cần đòi hỏi một lượng mẫu
DNA rất nhỏ.

15


Kỹ thuật SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây
trồng vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao. Trong

thực tế, chỉ thị này đã được sử dụng nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến
năng suất, bệnh hại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ
gen. Bằng kỹ thuật này, Goh P. S. E. và cs (2011) tìm thấy sự đa dạng của hơn
100 mẫu quýt trồng ở Mailaysia, theo ông tập đoàn quýt ở vùng nghiên cứu chia
làm 04 nhóm chính có những biến đổi ở mức độ alen và tính di truyền hoàn toàn
độc lập [18].

16