Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng immunoglobulin g trong sữa và sản phẩm sữa bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH CẢNH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
IMMUNOGLOBULIN G TRONG SỮA VÀ
SẢN PHẨM SỮA BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH CẢNH
MÃ SINH VIÊN: 1301033

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
IMMUNOGLOBULIN G TRONG SỮA VÀ
SẢN PHẨM SỮA
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Cao Sơn
2. TS. Đặng Thị Ngọc Lan
Nơi thực hiên:

1. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất
2. Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Trần Cao Sơn và TS.
Đặng Thị Ngọc Lan, là những người tận tình dìu dắt trong quá trình nghiên cứu khoa học,
cũng như trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong khoa Độc học và dị
nguyên thuộc Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, đặc biệt TS. Trần
Cao Sơn và chị Nguyễn Thị Minh Hòa, đã giải đáp thắc mắc, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong
quá trình làm việc tại Viện.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất,
đặc biệt là TS. Đặng Thị Ngọc Lan đã giúp đỡ, quan tâm, tạo điều kiên thuận lợi cho tôi
hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này.
Tôi cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo và toàn
thể các thầy cô tại các bộ môn đã chỉ dạy và giúp đỡ trong suốt thời gian học tập 5 năm tại
trường Đại học Dược Hà Nội.
Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình tôi đã luôn bênh cạnh ủng hộ,
động viên để tôi có thể hoàn thành khóa luận của mình một cách tốt nhất.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Lê Đình Cảnh

i

MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................. ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... - 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................. - 2 1.1. Tổng quan về Immunoglobulin G .................................................................. - 2 1.1.1. Giới thiệu về tính chất và chức năng Immunoglobulin G........................... - 2 1.1.2. Cấu trúc của immunoglobulin G ................................................................. - 3 1.1.4. Nguồn cung cấp IgG từ sữa và thành phẩm từ sữa ..................................... - 4 1.2. Các phương pháp định lượng IgG .................................................................. - 5 1.2.1. Kỹ thuật phân tích dựa vào tương tác miễn dịch ........................................ - 5 1.2.2. Kỹ thuật định lượng dựa vào phương pháp tách ......................................... - 7 1.3. Tổng quan về sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao. ........................ - 9 1.3.1. Khái niệm .................................................................................................... - 9 1.3.2. Nguyên tắc................................................................................................... - 9 1.3.3. Pha tĩnh sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................ - 10 1.3.4. Pha động trong sắc ký ái lực trên sắc ký lỏng hiệu năng cao . ................. - 13 1.3.5. Một số nghiên cứu về định lượng immunoglobulin G .............................. - 13 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ................. - 15 2.1. Đối tượng...................................................................................................... - 15 2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị ........................................................................... - 15 2.2.1. Thiết bị ...................................................................................................... - 15 2.2.2. Dụng cụ ..................................................................................................... - 15 2.2.3. Hóa chất, chất chuẩn ................................................................................. - 15 2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... - 16 2.3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và sản phẩm sữa ........ - 16 2.3.2. Thẩm định phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng ......................... - 16 2.3.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị
trường Việt Nam.................................................................................................. - 16 ii


2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. - 16 2.4.1. Pha dung dịch chuẩn ................................................................................. - 17 2.4.2. Pha các dung dịch đệm .............................................................................. - 17 2.4.3. Quy trình xử lý mẫu .................................................................................. - 18 2.4.4. Phương pháp phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao .................. - 18 2.4.5. Thẩm định phương pháp [2]...................................................................... - 19 2.4.6. Phương pháp xử lý kết quả........................................................................ - 20 2.4.7. Phương pháp lấy mẫu ................................................................................ - 20 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................... - 21 3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và các sản phẩm sữa ..... - 21 3.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định IgG bằng thiết bị HPLC. ....................... - 21 3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu. ................................................................... - 25 3.2. Thẩm định phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng ............................ - 28 3.2.1. Độ đặc hiệu................................................................................................ - 28 3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)........................ - 29 3.2.3. Khoảng tuyến tính. .................................................................................... - 31 3.2.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ............................................................................. - 32 3.2.5. Độ lặp lại khác ngày .................................................................................. - 33 3.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị trường
Việt Nam ............................................................................................................. - 34 3.4. Bàn luận ........................................................................................................ - 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. - 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... - 39 PHỤ LỤC ............................................................................................................ - 42 -

iii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
AOAC

Giải nghĩa
Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội các cộng
đồng phân tích chính thức)

IgG

Immunoglobulin G

Igs

Immunoglobulin

Fab

Fragment antigen binding (Phần nhận biết kháng nguyên)

Fc

Fragment crystalizable (Phần dễ kết tinh)

HPLC
RID
ELISA

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
Radial imminodifusion (Miễn dịch khuếch tán)
Enzyme Linked Immunosorbent Assay- (Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch
liên kết với enzyme)

SEC

Size-exclusion chromatography (Sắc ký rây phân tử)

SPR

Surface plasmon resonance (Cổng hưởng plasmon bề mặt)

AC

Affinity chromatography (Sắc ký ái lực)
Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis

SDS-PAGE
(Điện di polyacrylamide với SDS)
LOD

Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of Qualification (Giới hạn định lượng)

DAD

Diode-array detectors ( Detector mảng diod)

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.Chức năng của các thứ lớp dưới của IgG .............................................. - 2 Bảng 1.2. Hàm lượng của các phân lớp dưới của IgG .......................................... - 4 Bảng 1.3. Khả năng liên kết của protein với kháng thể. ..................................... - 12 Bảng 1.4: Một số nghiên cứu về định lượng IgG ............................................... - 13 Bảng 2.1. Khối lượng cân chất chuẩn gốc IgG (10mg/g) ................................... - 17 Bảng 3.1. Khảo sát khối lượng cân mẫu ............................................................. - 27 Bảng 3.2: Tỉ lệ S/N ở nồng độ LOD 0,01 mg/g .................................................. - 30 Bảng 3.3. Độ chệch của các nồng độ chuẩn........................................................ - 31 Bảng 3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi....................................................................... - 33 Bảng 3.5. Độ lặp lại khác ngày ........................................................................... - 34 Bảng 3.6. Kết quả định lượng mẫu thực ............................................................. - 35 -

v


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu tạo của IgG .................................................................................... - 3 Hình 1.2. Phương pháp plasmon bề mặt ............................................................... - 7 Hình 1.3. Quá trình trong sắc ký ái lực .............................................................. - 10 Hình 1.4. Protein G được gắn trên Sepharose. .................................................... - 11 Hình 3.1. Khảo sát pH dung dịch nạp ................................................................. - 22 Hình 3.2. Thể tích nạp ......................................................................................... - 23 Hình 3.3. Khảo sát pH rửa .................................................................................. - 24 Hình 3.4. Sắc ký đồ rửa lại khi khảo sát pH =3 .................................................. - 24 Hình 3.5. Khảo sát thể tích rửa............................................................................ - 25 Hình 3.6. Sắc ký đồ thể hiện tính đặc hiệu ......................................................... - 28 Hình 3.7. Phổ hấp thụ IgG trong nghiên cứu ...................................................... - 29 Hình 3.8. Phổ hấp thụ IgG ................................................................................. - 29 Hình 3.9. Phổ hấp thụ ở nồng độ 0,5mg/g .......................................................... - 29 Hình 3.10. Phổ hấp thụ ở nồng độ 1mg/g ........................................................... - 29 Hình 3.11. Sắc ký đồ của nồng độ LOD 0,01 mg/g ............................................ - 30 Hình 3.12. Đồ thị khảo sát sự tuyến tính............................................................. - 32 -

vi

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, sữa và sản phẩm sữa đang ngày càng trở nên thiết
yếu vì giúp nâng cao và bảo vệ sức khỏe. Các sản phẩm này gồm các yếu tố tăng trưởng,
immunoglobulin, lactoperoxidase, lactoferrin, cytokine, nucleotid, vitamin, … [21-28].
Trong đó, immunoglobulin (Igs) mà chiếm đa số là imunoglobulin G có nguồn chủ yếu từ
sữa của loài động vật nhai lại [16] có vai trò giúp cơ thể tăng sức đề kháng. Việc sử dụng
các sản phẩm sữa có hàm lượng IgG cao đang là xu hướng của người tiêu dùng. Hiện nay,
Việt Nam vẫn chưa có tiêu chuẩn về hàm lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa vì vậy các
cơ quan kiểm tra đang tiến tới xây dựng tiêu chuẩn chung. Vấn đề đặt ra là phương pháp
định lượng IgG phù hợp để xây dựng các tiêu chuẩn.
Các phương pháp định lượng IgG đã phát triển từ rất lâu, nhưng để phù hợp với hàm
lượng IgG ở trong sữa đang là vấn đề khó khăn do IgG là một kháng thể nên cần phải sử
dụng phương pháp đặc hiệu. Chúng dễ bị biến tính do điều kiện nhiệt độ, bảo quản và quá
trình sản xuất, cùng với đó là bất cập về mặt kinh tế, thời gian, hay quy mô tiến hành. Việc
sử dụng phương pháp sắc ký để định lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa có tiềm năng
giải quyết được các khó khăn trên.
Xuất phát từ các nhu cầu trên chúng tôi đã xây dựng đề tài: “Nghiên cứu phương pháp
xác định hàm lượng IgG trong sữa và các sản phẩm sữa bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”
với 2 mục tiêu sau:
1. Xây dựng phương pháp và thẩm định phương pháp định lượng IgG trong sữa và các
sản phẩm sữa.
2. Áp dụng phương pháp định lượng hàm lượng một số mẫu sữa trên thị trường

-1-


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Immunoglobulin G

1.1.1. Giới thiệu về tính chất và chức năng Immunoglobulin G
Immunoglobulin G (IgG) là một trong số những kháng thể của cơ thể người và động vật.
IgG chiếm khoảng 80% tổng lượng kháng thể. IgG chủ yếu xuất hiện trong huyết thanh,
chiếm 75% của tất cả các Igs trong huyết thanh. IgG có chủ yếu trong các khoang ngoài
mạch máu, là lớp duy nhất của Igs có khả năng đi qua nhau thai, do đó việc miễn dịch được
đảm bảo truyền từ mẹ sang con.
Chức năng quan trọng nhất của IgG là giúp cơ thể miễn dịch, thông qua quá trình hoạt
hóa bổ thể. Chức năng khác của IgG là khả năng gắn các tế bào như các đại thực bào, các
bạch cầu đơn nhân, các bạch cầu đa nhân trung tính một số tế bào lympho có các thụ thể Fc
cho vùng Fc của IgG, giúp tế bào có thể tiếp nhận các kháng nguyên tốt hơn. Chức năng
của các phân lớp dưới của IgG được thể hiện ở Bảng 1.1.
Bảng 1.1.Chức năng của các thứ lớp dưới của IgG

Các
Khả
phân Tỷ
Khả năng
năng qua
TT lớp lệ
hoạt hóa
nhau
dưới %
bổ thể
thai
IgG

Khả năng gắn
thụ thể Fc trên
các tế bào thực
bào

Thời gian
bán hủy [12]

1

IgG1

66

Có

Cao thứ nhì

Ái lực cao

21 ngày

2

IgG2

23

Không

Cao thứ ba

Ái lực rất thấp

21 ngày

3

IgG3

7

Có

Cao nhất

Ái lực cao

7 ngày

4

IgG4

4

Có

Không

Ái lực trung bình

21 ngày

-2-


1.1.2. Cấu trúc của immunoglobulin G
IgG gồm 4 chuỗi polypeptit. Hai chuỗi nhẹ kí hiệu là L và hai chuỗi nặng kí hiệu là H,
gắn với nhau bởi cầu disulfua (S-S). Tất cả các IgG là monomer (globulin miễn dịch 7S)
Chuỗi nhẹ: Trật tự axit amin của hai chuỗi nhẹ giống nhau và được chia làm hai vùng.
Vùng có trật tự axit amin thay đổi gọi là vùng biến đổi (kí hiệu VL), nằm phía đầu amin
(-NH2) của phân tử. Vùng có trật tự không thay đổi gọi là vùng cố định (ký hiệu CL) nằm
phía đầu carboxyl (-COOH). Trật tự axit amin vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau
ở tất cả các lớp kháng thể, hoặc theo trật tự lamda hoặc theo trật tự kappa. Ngược lại, trật
tự ở vùng biến đổi luôn khác nhau, kể cả ở các kháng thể do cùng một tế bào sinh ra.

Hình 1.1. Cấu tạo của IgG [9]
Chuỗi nặng: IgG được cấu thành bởi chuỗi nặng gamma. Mỗi chuỗi nặng có 4 vùng axit
amin: một vùng biến đổi và ba vùng cố định. Vùng biến đổi (kí hiệu là VH) nằm phía đầu
amin đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên
(paratop). Vùng cố định nằm phía đầu carboxyl, chia làm 3 vùng nhỏ có kí hiệu CH1, CH2
và CH3. Giữa vùng CH1 và CH2 là vùng khớp nối có tác dụng như bản lề làm cho phân tử
có hình chữ Y và có thể điều chỉnh cho hai paratop gắn với epitop của kháng nguyên. Hai
cánh tay của chữ Y còn gọi là đoạn gắn kháng nguyên Fab (F: fragment, ab: antigen
binding), là phần nhận biết kháng nguyên [13]. Dưới tác dụng của papain, phân tử kháng

-3-


thể bị phân giải tại vùng bản lề thành 3 mảnh: hai mảnh nhỏ chứa toàn bộ chuỗi nhẹ và một
nửa chuỗi nặng có đầu amin. Một mảnh chính là Fab, mảnh còn lại của chuỗi nặng phía đầu
carboxyl có thể kết tinh được gọi là mảnh Fc (Fragment crystalizable). Mảnh này có thể
liên kết với đại thực bào, tế bào B và bổ thể. Các phân lớp dưới IgG khác nhau về số lượng

liên kết disulfid và chiều dài của vùng bản lề. [24]

1.1.4. Nguồn cung cấp IgG từ sữa và thành phẩm từ sữa
IgG có thể được đưa vào cơ thể qua tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch, hoặc bổ sung qua đường
ăn uống bằng việc sử dụng các loại thực phẩm chức năng, sữa non và sữa công thức. Trong
sữa và sữa non của bò, immunoglobulin G (IgG; phân lớp dưới IgG1 và IgG2) là thành
phần miễn dịch chính, mặc dù mức IgA thấp và IgM cũng có mặt [7, 8].
Bảng 1.2. Hàm lượng của các phân lớp dưới của IgG
Loài

Bò

Người

Kháng thể

Nồng độ (mg/ml)
Huyết thanh

Sữa non

Sữa

IgG

25,0

32–212

0,72

IgG1

14,0

20–200

0,60

IgG2

11,0

12,0

0,12

IgA

0,4

3,5

0,13

IgM

3,1

8,7

0,04

IgG

12,1

0,4

0,04

IgA

2,5

17,4

1,00

IgM

0,9

1,6

0,10

Ở động vật nhai lại như bò, IgG1 cấu thành khoảng 80% tổng hàm lượng Igs trong sữa,
trong khi Igs chủ yếu trong sữa ở hầu hết các loài có vú không nhai lại khác (bao gồm cả
con người) là IgA. IgA và IgM cũng được tổng hợp bởi các tế bào biểu mô hoặc tế bào biểu

mô tuyến vú [18].

-4-


1.2. Các phương pháp định lượng IgG
Có nhiều phương pháp để xác định nồng độ của IgG phù hợp với từng khoảng nồng độ
và nền mẫu khác nhau. Nồng độ IgG có thể được xác định một cách đơn giản bằng đo quang
[3]. Các phép đo như vậy thường được áp dụng đối với nồng độ chuẩn tinh khiết tuân theo
định luật Lamber - Beer. Hai nhóm phương pháp cơ bản để phân tích IgG dựa trên tách
hoặc miễn dịch.

1.2.1. Kỹ thuật phân tích dựa vào tương tác miễn dịch
Các kỹ thuật này dựa trên sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể (hoặc protein
gắn kết). Các nhóm phương pháp này có ưu điểm lã dễ phát hiện sự thay đổi cấu trúc của
protein (bao gồm cả IgG) và có thể phát hiện các sản phẩm làm giả.

1.2.1.1. Miễn dịch khuếch tán (Radial imminodifusion, RID)
Miễn dịch khuếch tán là kỹ thuật được Mancini sử dụng và mô tả đầu tiên [26]. Kỹ thuật
này sử dụng một kháng huyết thanh được hòa tan vào thạch đun lỏng, và hỗn hợp thạchkháng huyết thanh được đổ rải đều lên một phiến kính đặt trên mặt phẳng ngang. Sau khi
thạch đông, người ta đục các lỗ tròn trên thạch và cho huyết thanh cần đo hoặc huyết thanh
chứng vào. Kháng nguyên, mà trong trường hợp này là immunoglobulin G, sẽ khuếch tán
theo hướng ly tâm từ các lỗ ra vùng thạch có chứa kháng huyết thanh xung quanh. Bởi vì
nồng độ kháng thể (kháng huyết thanh trong thạch) cố định nên khi kháng nguyên trong lỗ
khuếch tán thì nồng độ giảm dần cho đến khi có tỉ lệ thích hợp với nồng độ kháng thể trong
thạch thì một vòng tủa sẽ hình thành. Đối với mỗi mẻ người ta làm ba lỗ chứa kháng nguyên
với nồng độ biết trước để vẽ thành đường chuẩn [5].
Giới hạn định lượng của RID là khoảng từ 50 mg/ml – 150 mg/ml [9]. Do đó phương
pháp này không phù hợp để định lượng IgG có hàm lượng thấp trong sữa.

1.2.1.2. Phản ứng miễn dịch Elisa
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm
hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa
trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với
một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản
-5-


ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã
xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà
biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Kĩ thuật này khá nhạy và
đơn giản. ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm,
kí sinh.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là kháng nguyên, kháng thể và
chất tạo màu, thực hiện qua hai bước:
-

Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

-

Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy

nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp
trong dung dịch thí nghiệm. Phương pháp định lượng IgG bằng phương pháp Elisa có thể
định lượng 1ng/ml [14]. Tuy nhiên khoảng tuyến tính của phương pháp này khá nhỏ khi
phân tích mẫu thực cần pha loãng rất nhiều lần, dẫn đến việc tốn thời gian, hoá chất và sai
số do pha loãng. Mặc dù các bộ kit định lượng trên thị trường đã thương mại hóa nhưng giá
thành vẫn còn rất cao, tốn kém chi phí vì chỉ được dùng được một lần.

1.2.1.3. Phương pháp cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) (surface plasmon
resonance).
Cộng hưởng Plasmon bề mặt (SPR) là quá trình phát hiện bằng quang học xảy ra khi ánh
sáng đi vào lăng kính được phủ lớp kim loại (vàng) mỏng. Dưới điều kiện cố định (bước
sóng, phân cực, góc tới), các điện tử tự do tại bề mặt hấp thụ photon ánh sáng và chuyển
đổi chúng sang sóng plasmon bề mặt. Sự suy giảm phản xạ của ánh sáng sẽ được nhìn thấy
dưới điều kiện của SPR.
Trong phương pháp định lượng IgG thì gắn trên bề mặt kim loại là các phối tử (kháng
nguyên cố định), khi mẫu thực di chuyển qua thì IgG liên kết với kháng nguyên làm thay
đổi chỉ số phản xạ. Độ thay đổi này tỉ lệ với số lượng liên kết (hay nồng độ IgG). Quá trình
được theo dõi trong một khoảng thời gian, để số lượng IgG trong mẫu liên kết toàn bộ với
kháng nguyên trên bề mặt. Các mẫu tiếp theo được chảy qua khi trên bề mặt khi các IgG
liên kết với kháng nguyên đã được loại bỏ và IgG được rửa giải ra ngoài. Quá trình thực

-6-


hiện với các mẫu có nồng độ IgG chuẩn từ đó nội suy cho các mẫu cần phần tích với nồng
độ IgG chưa xác định.
Xét nghiệm miễn dịch dựa trên SPR có ưu điểm cho việc phân tích các protein sữa nhỏ.
Một xét nghiệm miễn dịch sinh học tự động sử dụng SPR quang học đã được sử dụng để
định lượng IgG. Khoảng định lượng của phương pháp này từ 0,08-25 µg/ml. [29]

Hình 1.2. Phương pháp plasmon bề mặt

1.2.2. Kỹ thuật định lượng dựa vào phương pháp tách
Cả hai phương pháp sắc ký lỏng và kỹ thuật điện di đều phù hợp để xác định và định
lượng IgG trong nền mẫu phức tạp bao gồm sữa bò và sữa non. Thông thường, casein được
loại bỏ trước khi phân tích tách, do casein chiếm phần lớn protein trong sữa.

1.2.2.1. Điện di gel
Điện di là kỹ thuật dùng để phân tách và đôi khi tinh chế các chất đặc biệt là các protein
và các acid nucleotide trên cơ sở kích thước, khối lượng, điện tích và hình dạng của chúng.

-7-


Các phân tử protein và acid nucleic có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ như
giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamid gel. Trong đó gel của
agarose và polyacrylamid được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn
đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp
các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi
trong một khoảng tương đối. Khả năng di chuyển của các phân tử protein và acid nucleic
trong điện trường là khác nhau tùy thuộc vào độ ion, cường độ điện trường, kích thước và
hình dạng. Sau khi tách hoàn thành, các dải protein có thể được phát hiện bằng cách xử lý
gel với một chất phát hiện vết Coomassie Blue, liên kết đặc biệt với protein, mỗi dải đại
diện cho một protein. Định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng thiết bị đo độ hấp thụ
và nội suy từ đường chuẩn được xây dựng trên các protein chuẩn [18]. Nền gel sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) thường được sử dụng
trong định lượng IgG. Khi đó IgG được cắt thành các chuỗi nhẹ và nặng, xuất hiện dưới
dạng các dải riêng biệt. Do đó SDS-PAGE không thể phân biệt IgG ở giai đoạn ban đầu là
trạng thái tự nhiên hay bị biến tính. Khoảng định lượng của phương pháp này 0,2 mg/ml –
3,5 mg/ml. [19]. Kỹ thuật này không hay được dùng để định lượng IgG.

1.2.2.2. Sắc ký rây phân tử (SEC)
Sắc ký rây phân tử là phương pháp chia tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích
thước của chúng. Trong trường hợp pha động là một dung môi hữu cơ, kỹ thuật được gọi
là sắc ký thấm qua gel, còn trường hợp pha động là nước thì kỹ thuật được gọi là sắc ký lọc
trên gel. Mẫu được đưa vào cột chứa đầy gel hoặc một loại vật liệu xốp, và được pha động
dẫn chạy qua cột.

Khoảng kích thước lỗ của vật liệu nhồi trong cột sẽ xác định khoảng kích thước phân tử
được chia tách qua quá trình sắc ký. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để có thể đi vào
trong tất cả khoảng không gian của lỗ xốp và được rửa giải trong tổng thể tích thấm. Các
phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ xốp lớn nhất chỉ di chuyển được dọc theo cột
qua các khoảng trống giữa các hạt vật liệu nhồi mà không bị giữ lại, được rửa giải trong thể
tích loại trừ (thể tích trống). Sự chia tách theo kích thước phân tử xảy ra giữa thể tích trống
và tổng thể tích thấm. Sau đó chất phân tích được định lượng bằng phương pháp đo quang.

-8-


SEC đã thành công trong việc tách whey protein với IgG và định lượng trên cột Sepharose
[6]. Tuy nhiên, các vấn đề trong việc xác định IgG của SEC cũng đã được ghi nhận, đặc
biệt trong trường hợp có casein, một protein chính trong sữa làm ảnh hưởng tới khả năng
chia tách. Phương pháp này cũng có khả năng xác định được nguồn gốc của IgG.

1.2.2.3. Sắc ký ái lực (Affinity chromatography AC)
Phương pháp này kết hợp giữa sự tách và tương tác của IgG với protein G hoặc A. Các
loại protein này là protein mà bề mặt tế bào có liên kết đặc biệt (tuy nhiên không phải cơ
chế miễn dịch) với IgG thông qua phần Fc (không bị biến tính bởi nhiệt) của phân tử IgG.
Trong quá trình rửa giải với đệm trung tính, các protein khác trong sữa sẽ đi qua cột, sau
đó IgG sẽ được rửa ra với đệm có pH thấp. Phương pháp này phát hiện các protein bằng
việc đo độ hấp thụ tại bước sóng ≈ 280 nm, pic protein xuất hiện tại thời gian rửa giải pH
thấp sẽ chỉ là pic của một mình IgG. Tuy nhiên, cần loại bỏ casein do casein có khả năng
gây cản trở quá trình rửa giải IgG. Phương pháp có khoảng tuyến tính từ 1-100 mg/g [3],
phù hợp với việc phân tích sữa, sản phẩm từ sữa và sữa non.

1.3. Tổng quan về sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao.
1.3.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng hiệu năng cao (High Perform Liquid Chromatography HPLC) là

kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ
di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực
tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rủa giải các chất ra khỏi cột vì
vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Sắc ký ái lực là một kiểu sắc ký của HPLC. [1]

1.3.2. Nguyên tắc
Các hợp chất sinh học, như enzyme và cơ chất hoặc kháng nguyên và kháng thể, sở hữu
những đặc trưng nhận biết giữa chúng một cách chọn lọc để tạo thành các hợp chất phức.
Sắc ký ái lực là một phương pháp phân tách và tinh chế các chất vận dụng tính ái lực sinh
học của chúng. Tương tác giữa chúng thường có thể đảo ngược. Một phân tử được cố định

-9-


(pha tĩnh) có ái lực với chất phân tích, sau đó chất phân tích được rửa giải nhờ gradient pha
động [20].
Quy trình trong sắc ký ái lực gồm 4 bước sau:
(1) Cân bằng cột
Nhồi cột bằng pha tĩnh gồm phần chất mang đã cố định sẵn một phối tử phù hợp với mục
tiêu phân tách trên bề mặt. Cột được cần bằng nhờ dung môi chạy mẫu.
(2) Thêm mẫu và hấp phụ với hợp chất mục tiêu (Hình a)
Mẫu được đưa vào cột và thành phần mục tiêu hấp phụ lên trên pha tĩnh.
(3) Rửa cột (Hình b)
Việc rửa cột nhằm loại bỏ những thành phần không hấp phụ lên pha tĩnh.
(4) Xả cột (Hình c)
Dung môi được đưa vào để rửa giải thành phần mục tiêu đang hấp phụ trên pha tĩnh ra
khỏi cột nhằm thu hồi chúng. Quy trình bắt đầu lại từ bước (1). [27]

Hình 1.3. Quá trình trong sắc ký ái lực [27]

1.3.3. Pha tĩnh sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.3.1. Các chất hỗ trợ ái lực (Các chất mang pha tĩnh)
Loại chất mang được sử dụng phổ biến gồm agarose hay những hạt gel tổng hợp đại
phân tử (cấu tạo từ polyme) có tính ưa nước (ví dụ như polyvinyl alcohol polyacrylate, …).
Theo nguyên tắc, chất mang được chọn không có phản ứng gì (bất hoạt) với mẫu và bền về
mặt vật lý lẫn hóa học dưới những điều kiện sắc ký được thiết lập. Cũng cần phải lưu ý rằng

- 10 -


nếu các hạt gel có cấu trúc xốp, sự phân tán lỗ xốp và diện tích bề mặt riêng của chúng sẽ
ảnh hưởng đến lượng phối tử đang được cố định và lượng phối tử hữu hiệu (có hoạt động)
trên bề mặt vật liệu nhồi. [25]
Trong cột ái lực protein G thì chất mang là hạt Agrose liên kết chéo (Sepharose). Phương
pháp cố định Protein G lên bề mặt chất mang cũng rất quan trọng. Độ dài cánh tay nối rất
quan trọng trong việc các phối tử bắt và liên kết với chất phân tích. Trong cột Protein G thì
để tăng khả năng gắn với IgG đã sử dụng phương pháp kích hoạt N-hydroxysuccinimide,
trên Sepharose là 12 phân tử 6-aminohexanoic acid. Phương pháp khớp nối này mang lại
hiệu năng cao cho cột.
Qua trình gắn với protein G

Hình 1.4. Protein G được gắn trên Sepharose.[15]

1.3.3.2. Các phối tử
Protein G, một protein bề mặt tế bào từ Streptococci nhóm G, là một thụ thể Fc kiểu III.
ProteinG liên kết qua cơ chế không phải miễn dịch. Protein G gắn kết đặc biệt với vùng Fc
của IgG, nhưng nó liên kết mạnh hơn với một số IgG đa dòng (Bảng 1.3) và với IgG3 của
người.
Trong thí nghiệm này protein G được sản xuất từ E. Coli. GE Healthcare đưa ra một tái
tổ hợp, dạng protein G đó có vùng gắn kết tự nhiên với albumin đã được bị xóa di truyền,

do đó tránh các phản ứng không mong muốn với albumin. Protein tái tổ hợp G chứa hai
vùng rằng buộc Fc. Protein G Sepharose là một sự lựa chọn tốt hơn cho việc thu thập các
kháng thể chung vì nó gắn kết một phạm vi rộng hơn của IgG từ các loài sinh vật và liên
- 11 -


kết nhiều lớp IgG. Thông thường protein G có liên kết mạnh hơn protein A và thể hiện gắn
ít nhất với albumin, kết quả là chế phẩm sạch hơn và năng suất cao hơn. Sức kết dính protein
G với IgG phụ thuộc vào các nguồn và phân lớp của globulin miễn dịch. Khả năng liên kết
năng động phụ thuộc vào độ bền liên kết và trên một số các yếu tố khác, chẳng hạn như tốc
độ dòng chảy trong quá trình áp dụng mẫu. Nhiều kháng thể cũng tương tác ái lực thấp với
protein G thông qua vị trí Fab. Protein G hầu như không có liên kết với IgM, IgA hoặc IgE
ở người, mặc dù một số chúng liên kết yếu với protein A. Các phối tử protein G trong quá
trình sử dụng luôn luôn có khả năng bị tách ra khỏi chất nền, đặc biệt trong điều kiện rửa
giải khắc nghiệt. Sự gắn bó nhiều điểm của protein G với Sepharose cho kết quả mức rò rỉ
rất thấp trong một loạt các điều kiện rửa.
Bảng 1.3. Khả năng liên kết của protein với kháng thể. [27]
Phân lớp kháng thể

Liên kết với protein A

Liên kết với protein G

IgA

Không xác định

–

IgD

–

–

IgG1

++++

++++

IgG2

++++

++++

IgG3

–

++++

IgG4

++++

++++

Bò

Kháng thể

++

++++

Chó

Kháng thể

++

+

IgG1

+

++++

IgG2a

++++

++++

IgG2b

+++

+++

IgG3

++

+++

Loài

Người

Chuột

Các sản phẩm sữa chủ yếu có nguồn gốc từ sữa bò, vì vậy trong nghiên cứu này sử dụng
protein G là phù hợp.

- 12 -


1.3.4. Pha động trong sắc ký ái lực trên sắc ký lỏng hiệu năng cao .
Việc lựa chọn pha động trong sắc ký ái lực phụ thuộc vào khoảng pH cần sử dụng.
Protein G liên kết với IgG trong một khoảng pH rộng, cho nên việc lựa chọn dung môi phù
hợp không khó. Khoảng pH = 6 - 9 là điều kiện để protein gắn với IgG. Để phá vỡ liên kết
này chỉ cần pH của pha động giảm xuống khoảng pH từ 2,5 đến gần bằng 3, phụ thuộc vào
mẫu phân tích.

1.3.5. Một số nghiên cứu về định lượng immunoglobulin G
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu về định lượng IgG

Nền mẫu

Phương pháp định
lượng

Nồng độ IgG
trong sữa
%(kl/kl)
0.03–1.3

Sữa lạc đà

RID

Sữa non của bò

Elisa

Sữa và sữa non của bò

SPR

Sữa bò

SDS-PAGE

Sữa non lạc đà

SEC

Sữa non của bò và sữa
bột

AC

0.08

0.05–12

Tài liệu tham
khảo

[10]

[11]

[17]
[4]

Lên tới 1,7

8.5

[22]

[9]

Từ những thống kê trên đã cho thấy sự quan tâm của các nhà nghiên cứu với việc
xác định hàm lượng IgG sữa và các sản phẩm sữa. Có những phương pháp đã được sử dụng

- 13 -


rộng rãi như Elisa hay tới những phương pháp đang được triển khai nghiên cứu như SPR,
SEC..., nhưng vẫn còn những bất cập mắc phải
Từ những ưu điểm đã được chỉ ra trong tổng quan về sắc ký ái lực và cột Protein G,
nên nghiên cứu đã lựa chọn làm phương pháp định lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa.

- 14 -


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.1. Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu của phương pháp này là IgG có trong sữa và sản phẩm sữa, cụ thể
chính là IgG của bò.
Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và ứng dụng
phương pháp bao gồm sữa và các thành phẩm từ sữa.

2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.2.1. Thiết bị
-

Hệ thống sắc ký HPLC Aliance 2965 của hãng Waters.

-

Máy ly tâm Mikro, Hittech.

-

Máy lắc ngang H260, IKA.

-

Cân phân tích có độ chính xác 0,1 mg XS105, Mettler Toledo.

-

Máy đo pH Mettler Toledo.

2.2.2. Dụng cụ
-

Micropipet có thể tích điều chỉnh được 20µL-200µL, 100µL-1000µL.

-

Ống ly tâm loại 50mL, 15ml.

-

Vial 1,8mL.

-

Cốc 20ml.

2.2.3. Hóa chất, chất chuẩn
-

Chuẩn IgG (Sigma Cat. No. I5506, Sigma – Aldrich) (độ tính khiết 95%).

-

Na2HPO4 (Merck). (hàm lượng ≥ 99%)

-

NaCl (Merck). (hàm lượng ≥ 99,5%)

-

Glycine (Merck). (hàm lượng ≥ 99,7%)

-

NaOH (Merck). (hàm lượng ≥ 97,0%)

-

HCl (Merck). (hàm lượng 37 - 38%)

- 15 -


2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và sản phẩm sữa
2.3.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định IgG bằng máy HPLC
Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng:

-

pH của dung dịch đệm để gắn IgG lên cột.

-

pH dung dịch đệm rửa giải.

-

Thể tích dung dịch đệm nạp.

-

Thể tích dung dịch đệm rửa giải.

2.3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
Dựa trên phương pháp tủa các protein và chất béo:
-

Khảo sát các điều kiện ly tâm.

- Tỉ lệ pha loãng của mẫu.
2.3.2. Thẩm định phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng
Đánh giá các thông số cơ bản của phương pháp gồm có:
-

Tính chọn lọc, độ đặc hiệu.

-

Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ.

-

Khoảng làm việc.

-

Độ chụm (độ lặp lại).

-

Độ đúng (độ thu hồi).

-

Độ lặp lại khác ngày.

2.3.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị
trường Việt Nam
Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá hàm lượng IgG trong các sản phẩm sữa
khác nhau.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

- 16 -


2.4.1. Pha dung dịch chuẩn

2.4.1.1. Dung dịch chuẩn gốc IgG (10mg/g)
Cân chính xác 105,26 mg IgG gốc vào cốc 20ml, thêm dung môi NaCl 0,15M vào vừa
đủ 10,00 g lắc đều để hòa tan ở điều kiện 30°C trong 30 phút.

2.4.1.2. Dung dịch chuẩn làm việc.
Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn trên nền mẫu trắng có nồng độ từ 0,01 – 5 mg/g vào
lọ mẫu để tiến hành dựng đường chuẩn. Thể tích các dung dịch cần sử dụng để pha dãy
chuẩn được thể hiện trong bảng 2.1.
Cân IgG chuẩn gốc vào cốc 20 ml với khối lượng lần lượt như bảng sau thêm dung dịch
mẫu trắng đã được tách chiết vừa đủ 4,000 g, trộn đều sau đó lọc qua màng 0,45 µm, bỏ
dịch lọc đầu.
Bảng 2.1. Khối lượng cân chất chuẩn gốc IgG (10mg/g)
Nồng độ IgG chuẩn

Khối lượng IgG chuẩn gốc

(mg/g)

(g)

0,01

0,004

3,996

0,03

0,012

3,988

0,05

0,020

3,980

0,1

0,040

3,960

0,5

0,200

3,800

1

0,400

3,600

3

1,200

2,800

5

2,000

2,000

Khối lượng dịch mẫu trắng (g)

2.4.2. Pha các dung dịch đệm
Các dung dịch đệm được tham khảo để phù hợp với cột và phương pháp ái lực [3]

2.4.2.1 Dung dich đệm tủa cassein (CH3COONa, pH=2,95)

- 17 -