Khảo sát một số đặc tính của nấm men saccharomyces cerevisiae cố định trong hệ gel alginat chitosan

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KETKESONE SIBOUPHA

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA
NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae
CỐ ĐỊNH TRONG HỆ GEL ALGINATCHITOSAN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh - Bộ môn Công
nghiệp Dược. Trong thời gian thực hiện khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự quan
tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình.
Với tất cả sự kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới cô
giáo ThS. Kiều Thị Hồng và PGSTS. Đàm Thanh Xuân đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo và tạo mọi điều kiện từ những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp.
Đồng thời, em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các
anh chị kĩ thuật viên trong Bộ môn Công Nghiệp Dược trong suốt quá trình làm đề tài
nghiên cứu và thực hiện tại bộ môn.
Em cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo trường
Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập
tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên giúp đỡ
em rất nhiều trong quá trình học tập và trong cuộc sống.
Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2018
Sinh viên
KETKESONE SUBOUPHA


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................Error! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1

Giới thiệu chung về alginat ...................................................................................2

1.1.1

Nguồn gốc ........................................................................................................2

1.1.2

Cấu trúc, đặc điểm, tính chất ...........................................................................2

1.1.3

Cơ chế tạo gel ..................................................................................................4

1.1.4

Ứng dụng ..........................................................................................................4

1.2

Giới thiệu chung về chitosan .................................................................................5

1.2.1

Nguồn gốc .......................................................................................................5

1.2.2

Công thức, cấu trúc .........................................................................................5

1.2.3

Tính chất ..........................................................................................................6

1.2.4

Ứng dụng ..........................................................................................................6

1.3

Phương pháp cố định tế bào ..................................................................................7

1.3.1

Khái niệm ........................................................................................................7

1.3.2

Phân loại ..........................................................................................................7

1.3.3 Ưu nhược điểm .................................................................................................8
1.3.4 Ứng dụng ..........................................................................................................9
1.4
1.4.1

Nấm men Saccharomyces cerevisiae ................................................................10
Nguồn gốc ......................................................................................................10

1.4.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo ............................................................................11
1.4.3 Ứng dụng ........................................................................................................11
1.5 Một số nghiên cứu về phương pháp cố định tế bào trên thế giới .........................12
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................14
2.1 Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị ...............................................................................14
2.1.1 Chủng vi sinh vật .............................................................................................14
2.1.2 Nguyên vật liệu và hoá chất.............................................................................14


2.1.3

hiết ị và dụng cụ ..........................................................................................14

2.1.4 Một số môi trường sử dụng..............................................................................15
2.1.5 Một số dung ịch ử ụng trong nghi n cứu ...................................................16
2.2 Nội dung nghiên cứu .............................................................................................17
2.2.1 Bào chế hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trong alginat
và alginat-chitosan .....................................................................................................17
2.2.2 Khảo sát khả năng tạo ethanol của tế bào nấm men Saccharomyes cerevisiae
cố định trong gel alginat – chitosan ..........................................................................17

2.2.3 Khảo sát khả năng tái ử dụng của các hạt cố định trong hệ gel alginat và
alginat-chitosan..........................................................................................................17
2.3 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................17
2.3.1 Phương pháp giữ giống ...................................................................................17
2.3.2 Phương pháp nhân giống ................................................................................18
2.3.3 Phương pháp l n men ......................................................................................18
2.3.4 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm ...........................................................18
2.3.5 Phương pháp cố định tế bào trong hệ gel canxi alginat .................................19
2.3.6 Phương pháp cố định tế bào trong hệ gel canxi alginat – chitosan ................19
2.3.7 Phương pháp định lượng đường ......................................................................19
2.3.8 Phương pháp đông khô ....................................................................................20
2.3.9 Phương pháp xác định kích thước hạt cố định tế bào nấm men .....................21
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................21
3.1 Bào chế hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trong alginat và
alginat-chitosan ..............................................................................................................21
3.2 Khảo sát khả năng tạo ethanol của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cố
định trong gel alginat – chitosan...................................................................................24
3.3 Khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt cố định trong hệ gel alginat và alginatchitosan ..........................................................................................................................28
3.3.1 Khảo sát hiện tượng của bình hạt cố định tế bào Saccharomyces cerevisiae
trong hệ gel alginat và alginat-chitosan sau khi lên men tái sử dụng 24h ................28
3.3.2 Khảo sát khả năng tạo Ethanol sau khi tái sử dụng ........................................31


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên hình

Trang

1

Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

14

2

Bảng 2.2: Thiết bị

14

3

Bảng 2.3: Dụng cụ

15

Bảng 2.4: Một số môi trường sử dụng

15

Bảng 3.1: Đặc tính của hạt Alg và Alg-Chi cố định tế bào nấm men S.

22

4

cerevisiae
5

Bảng 3.2: Đặc điểm của các bình lên men với tế bào nấm men tự do và

24

hạt cố định tế bào
6

Bảng 3.3: Lượng đường nấm men S. cerevisiae tự do và được cố định

26

trong các hạt Alg và Alg-Chi tiêu thụ sau 24h nuôi cấy trong 100ml
7

Bảng 3.4: Đặc điểm của các bình lên men của hạt cố định tế bào

28

alginat và hạt cố định tế bào alginat – chitosan sau khi tái sử dụng 24h
8

Bảng 3.5: Lượng đường trung bình tiêu thụ trong 100ml sau khi tái sử
dụng 24h

31


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT

Tên bảng

Trang

1

Hình 1.1: Hình ảnh mô tả cấu trúc của alginat

2

Hình 1.2: Mô hình vi trứng, vị trí của ion Ca
calci alginat

3

Hình 1.3: Cấu trúc đặc biệt của Alginic theo các đơn vị monome

4

4

Hình 1.4 : Cấu trúc hóa học của chitosan

5

5

Hình 1.5: Các kỹ thuật cố định tế bào

8

6

Hình 1.6: Hình thái của nấm men Saccharomyces cerevisiae

11

7

Hình 3.1: Hạt cố định tế bào

22

8

Hình 3.2: Hình ảnh các mẫu hạt cố định chụp dưới kính hiển vi điện tử

22

9

Hình 3.3: Bình lên men tế bào nấm men S. cerevisiae tự do

25

10

Hình 3.4: Bình lên men tế bào nấm men S. cerevisiae cố định trong hạt
alginat

25

11

Hình 3.5: Bình lên men tế bào nấm men S. cerevisiae cố định trong hạt
alginat-chitosan

25

12

Hình 3.6: So sánh khả năng tiêu thụ đường sau khi lên men 24h của hạt
cố dịnh tế bào nấm men S.cerevisiae

26

13

Hình 3.7: Bình lên men tế bào nấm men S. cerevisiae cố định trong hạt
alginat sau khi tái sử dụng 24h

29

14

Hình 3.8: Bình lên men tế bào nấm men S. cerevisiae cố định trong hạt
alginat-chitosan sau khi tái sử dụng 24h

29

15

Hình 3.9: So sánh khả năng tiêu thụ đường sau khi lên men tái sử dụng
24h của hạt cố dịnh tế bào nấm men S.cerevisiae

32

2+

2
trong gel và sự tạo gel

3


ĐẶT VẤN ĐỀ
Kỹ thuật cố định các xúc tác sinh học nói chung và kĩ thuật cố định tế bào nói
riêng đã có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và đời sống. Các
loại hình kĩ thuật này đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế thiết thực và nhanh chóng đi
vào thực tế. Cố định tế bào được hiểu là sự giam giữ các tế bào trong một không gian
phản ứng và vẫn giữ được tính chất xúc tác và có thể được tái sử dụng nhiều lần hoặc
liên tục để sản xuất những sản phẩm theo mong muốn. Nói cách khác cố định tế bào
nhằm hạn chế mọi sự vận động vật lí của các tế bào bằng cách cố định chúng trên các
vật thể gọi là chất mang bằng nhiều phương pháp như hấp thụ, liên kết ion, liên kết

nguyên tử, bọc trong gel mà không ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học của chúng.
Với kỹ thuật cố định tế bào trên gel alginat, công nghệ sinh học đã công nghiệp
hoá được một số sản phẩm cao như sản xuất liên tục các loại rượu bằng việc cố định
các tế bào nấm men, sản xuất acid hữu cơ, các chất kháng sinh và hormon bằng việc
cố định tế bào các vi khuẩn đồng thời nuôi cấy được mô tế bào của động thực vật, các
kháng nguyên...
Các ứng dụng của kỹ thuật cố định tế bào phát triển mạnh mẽ và được công
nghiệp hoá ở nhiều nước phát triển với các thành tựu rực rỡ. Tuy nhiên ở nước Việt
Nam ứng dụng của cố định tế bào còn chưa phát triển và phổ biến. Xuất phát từ những
lí do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát một số đặc tính của nấm
men Saccharomyces cerevisiae cố định trong hệ gel alginat-chitosan” nhằm thực
hiện các mục tiêu sau:
1. Bào chế hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trong alginate
và alginate-chitosan
2. Khảo sát khả năng tạo ethanol của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae
cố định trong hệ gel alginat và alginat-chitosan.
3. Khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt cố định trong hệ gel alginat và
alginat-chitosan.

1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1

Giới thiệu chung về alginat

1.1.1 Nguồn gốc
Alginat là loại polymer sinh học biển phong phú nhất thế giới và là loại
polymersinh học nhiều thứ hai trên thế giới sau cellulose. Alginat được phát hiện đầu

tiên bởi Stanford năm 1881, là một acid hữu cơ có trong tảo nâu, trọng lượng phân tử
từ 32.000 – 200.000 [7].
Nguồn alginat chủ yếu được tìm thấy ở thành tế bào và ở gian bào của tảo nâu ở
biển (thuộc họ Phaeophyceae), tảo bẹ Macrocystis pyrifera, Nodosum ascophyllum và
các loại Lamminaria nhưng nhiều nhất là ở tảo nâu, ở dưới dạng muối Alginat.
Alginat tồn tại dưới 2 dạng không tan là acid alginic và alginat canxi và magie (kí
hiệu: AlgCa, AlgMg) rất bền vững ở thành tế bào cây rong, tạo nên cấu trúc lưới gel
bền trên thành tế bào rong nâu [2].
1.1.2 Cấu trúc, đặc điểm, tính chất
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Acid alginic là một acid hữu
cơ có trong họ tảo nâu (thuộc họ Phaephyceae). Alginat là một polyme có các monome
là hai acid manuronic (viết tắt là M) và acid guluronic (viết tắt là G) gắn với nhau bằng
liên kết 1 – 4 glycosid [18 . Alginat có t lệ khối G cao (t số M G thấp) tạo gel cứng
hơn. Ngược lại, alginat chủ yếu là khối M thì gel hình thành mềm hơn và đàn hồi hơn
[35].

H nh 1.1 H nh ảnh m

ả cấu
2

c của a gina


Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, r tiền và được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực. Alginat có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung dịch và khả
năng tạo gel 18].
Độ nhớt dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh của phân tử alginat.
Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có
mặt của ion kim loại 14 , 22].

Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị II,
III, sự tạo gel được giải thích qua mô hình vi trứng [28]. Bình thường trong dung dịch
alginat tồn tại block M là các dải hẹp và block G là các dải gấp khúc. Khi có mặt ion
kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+, Sr2+,...) ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra.
Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng
không gian giống như ch đặt trứng 20]. Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống
này tạo nên mạng lưới không gian 3 chiều. Với cấu trúc gel này khi sử dụng làm màng
bao, chúng có vai trò như 1 tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường và
cho ph p giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng kiểm soát được 18].

Hình 1.2: M h nh vi

ứng, vị

của ion Ca2+

ong ge và

o ge can i

alginat
Hai gốc phân tử β-D-Mannuroic acid (M) và α- L-Guluronic acid (G) liên kết với
nhau bằng liên kết 1-4 glucozid phân bố trong mạch Alginat theo 3 loại khối (Block):
poly-G (G-G-G-G), poly-M (M-M-M-M) và poly-GM (G-M-G-M) liên kết ngẫu nhiên
trong chu i mạch [7].

3


Hình 1.3: Cấu

c đặc biệt của a ginic heo các đơn vị monome [7]

1.1.3 Cơ chế tạo gel
Khi nhỏ dung dịch alginat vào dung dịch có chứa cation kim loại hoá trị cao
(thường là Ca2+), bề mặt ngoài của hạt alginat sẽ bị gel hoá và các cation bên ngoài
môi trướng sẽ tiếp tục khuếch tán vào bên trong làm phân tử alginat bên trong tiếp tục
bị gel hoá. Quá trình này xảy ra trên bề mặt và phát triển vào bên trong
Alginat có khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hoá trị cao hoặc
khi phân tử alginat bị acid hoá.
Ở phương pháp tạo gel khi kết hợp với cation kim loại hoá trị cao có thể tiến
hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngoài và từ bên trong. Đa
phần sẽ sử dụng phương pháp tạo gel từ bên ngoài. Vì đây là phương pháp tạo gel phổ
biến nhất bởi nó có ưu điểm là tạo gel nhanh và đơn giản. Tuy nhiên tính đồng thể của
hạt lại không cao [5].
1.1.4 Ứng dụng
Alginat được sản xuất nhiều nhất ở Scotland, Nhật, Mỹ, Tây Ban Nha, Trung
Quốc... ở Việt Nam, chúng ta có nguồn rong mơ khá phong phú thích hợp cho việc sản
xuất alginat thương phẩm đạt chất lượng, thực tế đã sản xuất ở Nha Trang – Khánh
Hoà [10 . Alginat có nhiều ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như dệt thực
phẩm, giấy và dược phẩm. Natri alginat được sử dụng nhiều nhất và là thành phần phụ
gia để tạo hình, ổn định tăng độ dày, tạo hình dáng, hương vị...
Trong công nghệ bào chế dược phẩm, alginat được sử dụng làm tá dược rã, tá
dược dính trong viên n n, tá dược kiểm soát giải phóng ở viên giải phóng k o dài.
Natri alginat còn được sử dùng làm tá dược độn trong dạng viên nang, tá dược tăng độ
nhớt, ổn định thể chất trong các chế phẩm dạng kem, gel, bột nhão dùng tại ch ; chất
ổn định thể chất trong nhũ tương, h n dịch. Trong thời gian gần đây natri alginat được
sử dụng để bào chế dạng vi nang và siêu vi tiểu phân chứa dược chất, hay được sử
4

dụng trong một số chế phẩm có tác dụng tại ch như thuốc nhỏ mắt, nhỏ mũi 40].
Trong công nghệ vi sinh, alginat được sử dụng trong phương pháp cố định tế bào, hiện
nay còn được nghiên cứu sử dụng để tăng khả năng sống của chúng trong những điều
kiẹn bất lợi 19 , 31 , 38].
Trong ngành y tế, loại vải sợi được sản xuất từ natri và canxi alginat được sử
dụng để băng vết thương, cầm máu và làm vết thương mau lành hơn. Ngoài ra do tính
trương nở trong nước và khả năng bám dính của dạng gel trong nước, natri alginat còn
được sử dụng trong một số thuốc để ngăn cản trào ngược dạ dày – thực quản, giảm
triệu chứng ợ hơi... 40].
1.2

Giới thiệu chung về chitosan

1.2.1 Nguồn gốc
Chitosan là một polyaminosaccarid sinh học tự nhiên thu được từ phản ứng
deacetyl hóa của chitin, một polyme tự nhiên chu i dài của N-acetylglucosamin và
dẫn xuất đường glucose. Chitin là thành phần chính của thành tế bào nấm, xương
ngoài động vật chân đốt như tôm, cua, côn trùng [37].
1.2.2 Công thức, cấu trúc

Hình1.4 : Cấu trúc hóa học của chitosan
Chitosan là dẫn xuất đề acetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế
nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2).
Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamin liên kết với nhau bởi các
liên kết β-(1-4)-glicozit, do vậy chitosan có thể gọi là poly β -(1-4)-2-amino-2-deoxiD-glucose hoặc là poly β-(1-4)-D-glucosamin
5


1.2.3 Tính chất

Chitosan có phân tử lượng từ 3.800 đến 2.000.000 dalton, mức độ acetyl hóa từ
40% đến 98%. Kích thước tiểu phân, phân tử lượng, t trọng, độ nhớt, mức độ acetyl
hóa là những đặc tính quan trọng ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng làm tá dược
trong kỹ thuật bào chế.
Độ nhớt của dung dịch chitosan tăng lên khi tăng nồng độ chitosan, giảm nhiệt
độ và phụ thuộc mức độ deacetyl hóa của chitosan.
Nhóm amino của chitosan có pka xấp xỉ 6.5. Chitosan mang điện tích dương,
có tính base yếu, thấm nước, tan trong hầu hết các dung dịch acid hữu cơ ở pH nhỏ
hơn 6.5 như acid formic, acid acetic, acid tartaric và acid citric, nhưng không tan
trong acid sulfuric và acid phosphoric. Các muối glutamat, clorid của chitosan tan
trong nước. Chitosan không tan trong môi trường kiềm, môi trường trung tính. Đặc
tính này được ứng dụng để chế tạo vi cầu, vi nang chitosan 37].
Tính chất tích điện dương giúp cho chitosan hoạt động như một chất bám dính
sinh học, có khả năng bám vào các bề mặt tích điện âm như màng nhầy. Chitosan có
rất nhiều loại có khối lượng phân tử và mức độ deacetyl hóa khác nhau, đây là những
yếu tố ảnh hưởng đến kích thước phân tử, sự hình thành, kết tập phân tử và ứng dụng
của chitosan.
Chitosan có ưu điểm là độc tính thấp, tính tương thích sinh học cao với tế bào
vi khuẩn và nhiều hoạt chất khác, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm... đồng thời
còn tự phân hủy được nên chitosan thường được dùng làm chất mang trong công
nghệ dược phẩm.
1.2.4 Ứng dụng
Trong y học: Chitosan được sử dụng làm chỉ phẫu thuật tự hoại, chitoolygosaccarit; da nhân tạo; kem chống khô da, kem dưỡng da ngăn chặn tia cực tím
phá hoại da. Dùng làm thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày – tá tràng. Dùng bào chế
dược phẩm; thuốc giảm béo. Từ chitosan vỏ cua, vỏ tôm có thể sản xuất Glucosamin,
một dược chất quý dùng để giảm các triệu chứng của viêm xương khớp, chống viêm,
giảm nguy cơ ung thư phổi, là chất chống oxy…

6

Trong công nghệ thực phẩm:
Chitosan được dùng làm chất làm trong - ứng dụng trong công nghiệp sản xuất
nước quả: trong sản xuất nước quả, việc làm trong là yêu cầu bắt buộc. Thực tế hiện
nay đang sử dụng các chất làm trong như: genatin, bentonite, kali caseinat, tannin,
polyvinyl pirovinyl. Chitosan là tác nhân tốt để làm trong, giúp điều chỉnh acid trong
nước quả. Đối với dịch quả táo, nho, chanh, cam không cần qua xử lý pectin, sử dụng
chitosan để làm trong [5].
Sử dụng trong thực phẩm chức năng: Chitosan có khả năng làm giảm hàm
lượng cholesterol trong máu. Nếu sử dụng thực phẩm chức năng có bổ sung 4%
chitosan thì lượng cholesterol trong máu giảm đi đáng kể chỉ sau 2 tuần. Ngoài ra
chitosan còn xem là chất chống đông tụ máu. Nguyên nhân việc giảm cholesterol trong
huyết và chống đông tụ máu được biết là không cho tạo các mixen. Ứng dụng làm
màng bao (bảo quản hoa quả, thực phẩm).
Trong các công nghiệp khác: Làm tăng độ bền của giấy; Sử dụng trong sản xuất
sơn chống mốc và chống thấm; Dùng làm mực in cao cấp trong công nghệ in; Bảo
quản quả, hạt giống mang lại hiệu quả cao. Dùng làm thuốc kích thích sinh trưởng cây
trồng cho lúa, cây công nghiệp, cây ăn quả, cây cảnh…Xử lý nước thải công nghiệp
rất hiệu quả [5].
1.3

Phƣơng pháp cố định tế bào

1.3.1 Khái niệm
Kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “Kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các
tế bào còn nguyên vẹn lên một “vùng không gian nhất định” nhằm bảo vệ các hoạt tính
xúc tác mong muốn” [26], [28].
1.3.2 Phân loại
Nhiều quá trình trong công nghệ sinh học thuận lợi hơn nhờ kỹ thuật cố định,
do đó mà nhiều kỹ thuật và chất mang được đưa ra. Những kỹ thuật này có thể chia

thành 4 nhóm chính như là cố định trên bề mặt chất mang rắn, nhốt trong khung mạng
xốp, keo tụ tế bào (tạo hạt), nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn
[26], [28].

7


Hình1.5: Các kỹ thuật cố định tế bào [28]
1.3.3 Ưu nhược điểm
Ưu điểm của cố định tế bào :
Hoạt động kéo dài và sự ổn định của chất xúc tác sinh học, chất mang có thể đóng
vai trò như một chất bảo vệ chống lại ảnh hưởng hóa lý của nhiệt độ, pH, dung môi,
hoặc thậm chí là kim loại nặng [26], [28].
Mật độ tế bào trên một đơn vị thể tích của thiết bị phản ứng sinh học cao hơn, thời
gian phản ứng ngắn hơn và sự loại bỏ sự tăng trưởng của những tế bào vi sinh vật
không có lợi [26], [28].
Sự hấp thu cơ chất tăng và năng suất được cải thiện. Có thể thực hiện được với quá
trình liên tục. Khả năng chịu đựng được nồng độ cơ chất cao tăng, và giảm sự ức chế
của sản phẩm cuối [26], [28].
Với quá trình lên men, có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp dẫn đến cải thiện chất
lượng cho một số sản phẩm. Hoàn thiện sản phẩm dễ dàng hơn do giảm được thủ tục
tách chiết và lọc, do đó giảm giá thành cho thiết bị và yêu cầu về năng lượng [26],
[28].
Sự tái sinh và tái sử dụng chất xúc tác sinh học cho nhiều thời của sự vận hành gián
đoạn mà không phải tháo bỏ nó ra khỏi thiết bị phản ứng sinh học [26], [28].
Giảm rủi ro nhiễm vi sinh vật có hại bởi vì mật độ tế bào cao. Có thể sử dụng thiết
bị phản ứng sinh học nhỏ hơn, với sự thiết kế quá trình sông nghệ đơn giản hóa và do
đó giảm chi phí vốn. Giảm thời gian sản xuất ra sản phẩm [26], [28].

8

Nhược điểm của cố định tế bào:
Khi sử dụng tế bào vi sinh vật cố định, trong môi trường sản xuất, hiện tượng rò rỉ
hay rửa trôi tế bào ra khỏi chất mang ít hay nhiều là điều không thể tránh khỏi. Do đó,
việc thu nhận và tinh sạch sản phẩm đôi khi cũng khá phức tạp [26].
Tế bào cố định đòi hỏi nhiều nguồn dinh dưỡng và năng lượng đa dạng đảm bảo
khả năng phát triển và hoạt động bình thường. Khi đó, trong hệ thống sử dụng tế bào
cố định có thể xảy ra hiện tượng phân hu sản phẩm để cung cấp đầy đủ chất dinh
dưỡng và năng lượng cần thiết cho tế bào. Vì thế mà hiệu suất sử dụng tế bào cố định
có thể thấp hơn hiệu suất sử dụng tế bào tự do [26], [28].
Do được bao bọc bởi chất mang, thành tế bào, màng tế bào chất, … có thể gây
cản trở việc thẩm thấu cơ chất, sản phẩm và các cấu tử từ môi trường ra vào tế bào.
Một nhược điểm thường thấy ở những tế bào vi sinh vật được “gói” trong khuôn
có cấu trúc gel, những cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ không có điều kiện tiếp
xúc với tế bào vi sinh vật cố định. Vì thế mà hoạt lực của những tế bào cố định có thể
sẽ thấp hơn so với những tế bào tự do [26], [28].
Trong trường hợp cụ thể khi sản xuất ethanol, người ta không quan tâm đến sự ức
chế của ethanol lên hoạt động sống của nấm men khi tiến hành lên men gián đoạn, khi
đó nấm men chỉ được sử dụng một lần rồi được hoạt hoá lại cho lần sản xuất tiếp theo.
Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng của ethanol đến hoạt động của nấm men là rất lớn trong
quá trình lên men liên tục. Sau khi lên men, hoạt tính của tế bào nấm men có thể bị ức
chế bởi ethanol. Tương tự như vậy, khi sử dụng phương pháp cố định nấm men để sản
xuất ethanol liên tục, hoạt tính của nấm men cố định cần được duy trì và nồng độ
ethanol phải thấp để không gây ức chế đến tế bào nấm men. Như thế thì hiệu suất thu
nhận sản phẩm không cao. Nhiều phương pháp tháo sản phẩm liên tục khỏi thiết bị lên
men được nghiên cứu nhằm tránh những tác động không tốt của sản phẩm lên men đối
với nấm men [26], [28].
1.3.4 Ứng dụng
o Sản xuất kháng sinh:

9


Một số kháng sinh được nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp cố định tế bào như:
oxytetracyclin, neomycin, cephalosporin... Ampicillin và amoxicillin là 2 kháng sinh
được tổng hợp từ 6-APA. 6-APA được sản xuất ở quy mô công nghiệp bằng cách cho
penicillin G chảy qua các tế bào Escherichia coli hoặc Bacillus megatherium (có hoạt
tính enzym penicillinase cao) bất động trên các chất mang khác nhau, hiệu suất đạt tối
đa tới 99,5% [4], [42].
o Sản xuất enzym:
Vi sinh vật là nguồn tốt nhất để sản xuất enzym. Trong các enzym thì enzym thu
phân tinh bột α-amylase và glucoamylase được nghiên cứu nhiều hơn cả. Tế bào
Bacillus cereus được cố định bằng canxi alginat, nhồi vào thiết bị phản ứng tầng sôi để
sản xuất liên tục α-amylase chịu nhiệt cho tốc độ phản ứng tăng gấp 24 lần so với lên
men m bằng tế bào tự do. Vài enzym quan trọng khác cũng được nghiên cứu bằng
phương pháp cố định tế bào như: invertase, lipase, protease...[12], [42]. Ngoài ra còn
sản xuất các acid hữu cơ, alcol...
1.4

Nấm men Saccharomyces cerevisiae

1.4.1 Nguồn gốc
Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có
trong bánh mì nên thường gọi là men bánh mì là một loại vi sinh vật thuộc chi
Saccharomyces ngành nấm ascomycetes. Loài này có thể xem là loài nấm hữu dụng
nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay. Nó được dùng rộng
rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu và bia [16].
Saccharomyces cerevisiae là một trong những loài vi sinh vật nhân chuẩn được
khoa học dùng nhiều nhất cùng với Escherichia coli là hai loài vi sinh vật mô hình phổ

biến nhất.
Con người hiểu biết về nấm men Saccharomyces cerevisiae và những tính chất
của nó mới được hơn 150 năm. Đến đầu thế kỉ 19, nấm men bia, nấm men thải từ nhà
máy rượu bia đã được con người tái sử dụng để làm men sản xuất bánh mì. Cuối thế kỉ
19, nhiều cải tiến kỹ thuật như hệ thống thông khí (nước Anh), kỹ thuật li tâm để tách
nấm men ra khỏi môi trường tăng trưởng (Mỹ) đã được dùng để sản xuất men bánh
mì.
10


1.4.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo
Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có nhiều hình dạng: hình cầu, hình
oval hoặc elip, hình quả chanh, hình trụ... Nấm men có thể thay đổi hình dạng và kích
thước tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường xung quanh. Về kích thước, so với tế bào
các vi sinh vật khác thì tế bào nấm men khá lớn khoảng từ 5-6 đến 10-14 µm, sinh
sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử. Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng
đường glucose, galactose, saccharose, maltose như nguồn cacbon, chúng sử dụng axit
amin và muối amoni như nguồn nitơ. Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân
thật với cấu trúc tế bào có 3 phần chính: thành tế bào, tế bào chất và nhân. Thành tế
bào có cấu tạo bởi glucan và manan giúp chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh 4].

Hình 1.6: Hình thái của nấm men Saccharomyces cerevisiae
1.4.3 Ứng dụng
Nấm men Saccharomyces cerevisiae được dùng trong các ngành công nghiệp,
đặc biệt phổ biến trong công nghệ thực phẩm và y học. Nấm men Saccharomyces
cerevisiae được sử dụng phổ biến nhất vì nó có độ an toàn sinh học cao, có hàm lượng
protein, vitamin cao, có giá trị dinh dưỡng đặc biệt nên thường được bổ sung trực tiếp
vào thức ăn cho động vật.
Trong ngành dược: Sinh khối nấm men được sử dụng trong ngành dược để chế
tạo ra được sản phẩm quí giá nhằm điều trị một số bệnh như chế phẩm đông khô

Bioflor, Ultra Levure để điều trị một số bệnh như ỉa chảy, rối loạn tiêu hoá ở tr em.
Nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện đặc biệt có thể sản xuất các hợp
chất có chứa Selen hữu cơ trong y học để chữa trị hàng loạt các bệnh kể cả ung thư
[21]. Sinh khối nấm men có hàm lượng cao vitamin nhóm B, beta-caroten, acid
ribonucleic,các aminosid như lysine, cysteine... được dùng làm thuốc bổ... [4].

11


Ngoài ra nấm men được sử dụng nhiều để sản xuất thực phẩm, đồ uống như:
rượu, nước giải khát, ethanol, bánh mỳ....
1.5 Một số nghiên cứu về phƣơng pháp cố định tế bào trên thế giới
- Theo nghiên cứu “Ảnh hưởng của các tế bào bất động trong hạt alginat canxi
trong quá trình lên men rượu” 23]:
Các tế bào Saccharomyces cerevisiae được cố định trong hạt alginat canxi và
các hạt alginat canxi bao chitosan và nghiên cứu trong quá trình lên men của glucose
và sucrose để sản xuất ethanol. Việc lên men theo lô được tiến hành trong máy lắc và
đánh giá bằng cách theo dõi nồng độ chất nền và sản phẩm bằng HPLC. Sự cố định
của tế bào trong hạt alginat canxi và hạt alginat canxi bao chitosan cho phép tái sử
dụng hạt trong tám chu trình lên men tuần tự 10 giờ m i lần. Nồng độ cuối cùng của
ethanol sử dụng tế bào tự do là 40g L-1 và sản lượng sử dụng đường glucose và sucrose
là nguồn carbon là 78% và 74,3%. Đối với các tế bào cố định trong hạt alginat canxi,
nồng độ ethanol cuối cùng từ glucose là 32,9 ± 1,7 g L-1 với năng suất 64,5 ± 3,4%,
trong khi nồng độ ethanol cuối cùng từ sucrose là 33,5 ± 4,6 g L-1 với 64,5 ± 8,6 sản
lượng %. Đối với các tế bào cố định trong hạt alginat canxi bao chitosan, nồng độ
ethanol từ glucose là 30,7 ± 1,4 g L-1 với năng suất 61,1 ± 2,8%, trong khi nồng độ
ethanol cuối cùng từ sucrose là 31,8 ± 6,9 g L-1 với sản lượng 62,1 ± 12,8%. Các tế bào
bất động sản cho phép tám chu kỳ tái sử dụng liên tục 10 giờ được thực hiện với nồng
độ ethanol cuối cùng ổn định. Ngoài ra, không cần sử dụng kháng sinh và không bị
nhiễm bẩn. Sau chu kỳ thứ tám, đã có một vết vỡ đáng kể của các hạt làm cho chúng

không phù hợp để tái sử dụng.
- Theo nghiên cứu “Các thông số hoạt động và sự ảnh hưởng của chúng đối với
khả năng chuyển giao khối lượng trong một lò phản ứng sinh khối đáy” 14]:
Ảnh hưởng của sự chuyển đổi khối lượng bên trong đối với năng suất cũng như
hiệu suất của máy phản ứng sinh học đáy được xác định bằng cách thay đổi một số
thông số; lớp phủ chitosan, tốc độ dòng chảy, nồng độ glucose và kích thước hạt. Các
tế bào Saccharomyces cerevisiae đã được cố định trong hạt bao chitosan và không bao
chitosan để chứng minh ảnh hưởng đến việc truyền khối lượng hạt lên thời gian tiêu
thụ chất nền, giai đoạn suy vong và sản xuất ethanol. Kết quả cho thấy lớp phủ
chitosan, kích thước hạt, nồng độ glucose và tốc độ dòng chảy có ảnh hưởng đáng kể
12


đến thời gian suy vong. Thời gian suy vong của các hạt khác nhau (0.8, 2 và 4 mm)
giảm dần bằng cách tăng tốc độ và giảm kích cỡ hạt. Hơn nữa, phase lag lâu hơn đã
được tìm thấy ở sự kết hợp glucose trung bình cao hơn và cũng với các hạt bao
chitosan. Khi tăng tốc độ dòng chảy thì thời gian tiêu thụ glucose giảm. Lý do là do sự
giảm vận chuyển khối bên ngoài do sự gia tăng tốc độ dòng chảy vì glucose dễ dàng
vận chuyển đến bề mặt hạt. Thay đổi kích thước của hạt là một yếu tố bổ sung: vì nó
làm giảm chuyển khối lượng bên trong bằng cách giảm kích cỡ hạt. Lý do đằng sau
đây là khoảng cách cho các chất phản ứng để đạt được vị trí hoạt động của chất xúc tác
(tế bào) và độ dày của lớp chất lỏng tạo ra lớp xung quanh hạt alginat được giảm. Sự
kết hợp tối ưu các thông số bao gồm hạt kích thước nhỏ hơn 0.8 mm, tốc độ chảy hơn
90 ml/phút và nồng độ glucose 10 g/l được coi là điều kiện tối đa cho sản xuất ethanol.
- Theo nghiên cứu “Cố định tế bào nấm men ứng dụng trong lên men cồn rỉ
đường” [6]:
Các điều kiện cố định tế bào nấm men phù hợp cho quá trình lên men cồn từ rỉ
đường bằng phương pháp lên men liên tục đã được khảo sát, bao gồm nồng độ Naalginat, nồng độ CaCl2, tốc độ dòng chảy tạo hạt, mật độ tế bào trong dung dịch gel.
Ngoài ra đã đánh giá được việc tái sử dụng tế bào nấm men cố định trong lên men cồn
trên môi trường rỉ đường qua 4 lần lên men. Kết quả cho thấy điều kiện cố định tế bào

thích hợp là nồng độ chất mang Na-alginat 3 %, nồng độ dung dịch tạo gel CaCl2 2 %,
mật độ giống thích hợp trong dịch chất mang 109 tế bào ml gel, tốc độ dòng chảy tạo
hạt tế bào cố định cho hệ thống tạo hạt 24 kim (đường kính hạt 0.5 cm) là 200 ml/phút.
Ngoài ra kết quả đánh giá lên men cho thấy sau 4 lần lên men thì hạt tế bào cố định tái
sử dụng vẫn có hoạt lực khá tốt, nồng độ cồn tạo ra chỉ giảm nhẹ (từ 11 % v v xuống
10,5 % v v) so với lần đầu sử dụng.

13


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị
2.1.1 Chủng vi sinh vật
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae
2.1.2

Nguyên vật liệu và hoá chất
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Glucose

Trung Quốc

Acid clorid

Trung Quốc

Cao nấm men

Merck -Đức

Natri alginat

Ấn Độ

KH2PO4

Trung Quốc

Calci clorid

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

Acid acetic băng

Trung Quốc

(NH4)2SO4

Trung Quốc

Chitosan

Đức

Natri clorid

Trung Quốc

2.1.3

hiế

ị và dụng cụ
Bảng 2.2: Thiết bị

Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tên thiết bị

Nguồn gốc

Cân kỹ thuật

Đức (Satorious)

Nồi hấp tiệt trùng

Nhật (ALP)

Máy khuấy từ

Hàn Quốc (Wisd)

Tủ ấm CO2

Nhật (Sanyo)

Trung Quốc (KWF)

Tủ cấy vô trùng

Nhật (Sanyo)

Máy ly tâm

Đức (Satorious)

Tủ lạnh bảo quản

Hàn Quốc (LG)

Tủ lạnh

Hàn Quốc (LG)

Tủ sấy

Hàn Quốc (Daihan)

Đức (Christ Alpha)

Tủ lạnh sâu

Máy lắc ổn nhiệt

Thiết bị đông khô

14

Đức (HAIER
DW86W420 )


Bảng 2.3: Dụng cụ
Bình nón 100, 250, 1000ml

Pipet pasteur

Cốc có mỏ

Pipet chia vạch

Ống đong

Pipet tips (Đầu côn)

Ống ly tâm

Pipet Eppendort

Ống nghiệm có nắp

Đĩa petri đường kính 9 cm

2.1.4 Một số môi rường sử dụng
Bảng 2.4: Một số m i
Môi trường giữ giống

ƣờng sử dụng
Môi trường nhân giống

(g/100ml)

(g/100ml)

Glucose

5.0

Glucose

8.0

Cao nấm men

0.5

Cao nấm men

0.5

(NH4)2SO4

0.3

(NH4)2SO4

0.3

Mg SO4.7H2O

0.1

Mg SO4.7H2O

0.1

KH2PO4

0.2

KH2PO4

0.2

Thạch

2.0

Nước vừa đủ

100ml

Nước vừa đủ

100ml

pH

6.5-7

pH

6.5-7

15


Môi trường lên men

Môi trường bảo quản hạt

(g/100ml)

(g/100ml)

Glucose

8.0

Cao nấm men

0.2

Cao nấm men

0.5

Nước cất vừa đủ

100ml

(NH4)2SO4

0.3

MgSO4.7H2O

0.1

KH2PO4

0.2

Nước cất vừa đủ

100ml

pH

6.5-7

2.1.5

Một số un

ịch ử ụn

ron n hi n cứu

- Dung dịch alginat 3%: cân 3,00 gam natri alginat, phân tán đều trong 100 ml
nước cất. Đem hấp tiệt trùng ở 1150C trong 20 phút cho alginat đồng nhất.
- Dung dịch chitosan 0,5% trong acid acetic 0,5%, pH 5,5-6,0: cân 0,50 g
chitosan, hòa tan vào 90 ml acid acetic 0,5%. Điều chỉnh pH 5,5-6,0 bằng NaOH 1M
và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100 ml.
- Dung dịch canxi clorid (CaCl2) 2% (kl/tt): cân 2,00 g CaCl2, hòa tan hoàn toàn
trong 100ml nước cất.
- Dung dịch NaCl 0,9% (kl tt): cân 0,90 g NaCl, hòa tan hoàn toàn trong 100ml
nước cất.
- Dung dịch Acid sulfuric 25%.

16


2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Bào chế hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trong alginat

và alginat-chitosan
2.2.2 Khảo sát khả năn

ạo ethanol của tế bào nấm men Saccharomyes cerevisiae

cố định trong gel alginat – chitosan
2.2.3 Khảo sát khả năn

ái ử dụng của các hạt cố định trong hệ gel alginat và

alginat-chitosan
 Khảo sát hiện tượng của hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisiae trong hệ gel alginat và alginat-chitosan sau khi lên men tái sử
dụng 24h.
 Khảo sát khả năng lên men tạo ethanol của tế bào nấm men Saccharomyces
cố định sau khi tái sử dụng 24h.
2.3

Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1 Phươn pháp iữ giống
Pha môi trường nhân giống gồm:
Glucose

5.0g/ml

(NH4)2SO4

0.3g/ml

MgSO4.7H2O

0.1g/ml

KH2PO4

0.2g/ml

Thạch

2.0g/ml

Cao nấm men

0.5g/ml

Nước vừa đủ

100ml

pH

6.5-7

Cân đong các thành phần theo công thức rồi hoà tan, phân tán hết các thành
phần trong cốc có mỏ. Chia đều vào ống nghiệm (4-5ml ống), đậy nút kín. Hấp tiệt
khuẩn các ống nghiệm ở điều kiện 1atm 20 phút. Sau khi tiệt khuẩn xong đặt nghiêng
ống nghiệm để cho thạch nguội và đông lại. Tiến hành cấy giống trong tủ cấy vô
trùng: lấy một vòng que cấy từ khuẩn lạc nấm men trong ống giống. Sau đó cấy theo
hình zic zac lên bề mặt thạch, sao cho đường cấy đều, không bị đứt quãng. Nuôi trong

tủ ấm 30oC trong 18-24 giờ.
17


2.3.2 Phươn pháp nhân iống
Pha môi trường nhân giống gồm:
Glucose

8.0g/ml

(NH4)2SO4

0.3g/ml

MgSO4.7H2O

0.1g/ml

KH2PO4

0.2g/ml

Cao nấm men

0.5g/ml

Nước vừa đủ

100ml

pH

6.5-7

Cân đong các thành phần theo công thức rồi hoà tan, phân tán hết các thành
phần trong cốc có mỏ. Cho dung dịch vừa pha vào bình nón, đậy nút bông đem đi hấp
tiệt khuẩn ở 115

trong 20 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng. Tiến hành cấy giống

trong tủ cấy vô trùng: lấy vòng que cấy từ khuẩn lạc nấm men trong ống giống. Sau đó
đưa que cấy vào trong môi trường nhân giống, khuấy nhẹ cho khuẩn lạc phân tán vào
môi trường. Nuôi trên máy lắc ở

trong 18-24 giờ.

2.3.3 Phươn pháp l n men
Pha môi trường lên men gồm:
Glucose

8.0 g/ml

Cao nấm men

0.5 g/ml

(NH4)2SO4

0.3 g/ml

MgSO4.7H2O

0.1 g/ml

KH2PO4

0.2 g/ml

Nước vừa đủ

100ml

pH

6.5-7

Cho dung dịch vừa pha vào bình nón, đậy nút bông đem đi hấp tiệt khuẩn ở
115

trong 20 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng. Tiến hành cấy giống trong tủ cấy

vô trùng và để lên men trong tủ ấm ở

trong 18-24 giờ.

2.3.4 Phươn pháp iệt khuẩn bằng nhiệt ẩm
Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được gói kín bằng giấy bạc hoặc đựng trong bình
nón, đậy kín bằng nút bông, sau đó tiệt trùng trong nồi hấp tiệt khuẩn ở 1150C trong 20
phút.
18