Nghiên cứu loại cafein từ lá chè (camellia sinensis l ) bằng carbon dioxyd siêu tới hạn

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ BẢO NGỌC

NGHIÊN CỨU LOẠI CAFEIN
TỪ LÁ CHÈ (Camellia sinensis L.) BẰNG
CARBON DIOXYD SIÊU TỚI HẠN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ BẢO NGỌC
Mã sinh viên: 1301290

NGHIÊN CỨU LOẠI CAFEIN
TỪ LÁ CHÈ (Camellia sinensis L.) BẰNG
CARBON DIOXYD SIÊU TỚI HẠN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
DS. Trần Trọng Biên
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công Nghiệp Dược

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc tới DS. Trần
Trọng Biên, tổ Chiết Xuất – bộ môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược
Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện
đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Văn Hân, TS. Bùi Thị Thúy
Luyện và tập thể cán bộ, giảng viên của bộ môn Công Nghiệp Dược – Trường đại
học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề
tài này.
Và em cũng cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị em những người
luôn bên em, giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, nghiên
cứu trong suốt thời gian qua.
Dù đã có nhiều cố gắng, song đề tài còn có thể có những thiếu sót. Kính
mong nhận được sự chia sẻ và nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các
thầy cô giáo.
Em xin trân trọng cảm ơn.
Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Lê Thị Bảo Ngọc


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ............................................................................... 2
1.1 Cây chè ............................................................................................................ 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật ........................................................................................ 2
1.1.2 Thành phần ................................................................................................... 2
1.1.2.1 Catechin ..................................................................................................... 2
1.1.2.2 Cafein ........................................................................................................ 4
1.1.3 Tác dụng sinh học của chè ........................................................................... 5
1.2 Phương pháp chiết xuất bằng dung môi CO2 siêu tới hạn .............................. 6
1.2.1 Nguyên tắc.................................................................................................... 6
1.2.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp chiết xuất bằng sCO2 ............................ 7
1.2.3 Ứng dụng của sCO2 trong chiết xuất cafein ................................................. 8
1.3 Một số phương pháp loại cafein trong lá chè .................................................. 8
1.3.1 Loại cafein bằng dung môi hữu cơ............................................................... 9
1.3.2 Loại cafein bằng nước nóng ....................................................................... 10
1.3.3 Loại cafein bằng vi sinh vật ....................................................................... 10
1.3.4 Loại cafein bằng dung môi siêu tới hạn ..................................................... 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 14
2.1 Nguyên liệu và thiết bị .................................................................................. 14
2.1.1 Nguyên liệu ................................................................................................ 14
2.1.2 Chất chuẩn và hóa chất .............................................................................. 14
2.1.3 Thiết bị thí nghiệm ..................................................................................... 14
2.2 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 15
2.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 15


2.3.1 Phương pháp định lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh.................... 15
2.3.2 Phương pháp chiết cafein từ lá chè xanh bằng CO2 siêu tới hạn ............... 16
2.3.3 Phương pháp chiết cafein từ lá chè xanh bằng nước và ethanol ................ 17
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................... 18
3.1 Xây dựng quy trình định lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh ............ 18
3.1.1 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng cafein và EGCG .................. 18
3.1.1.1 Tính đặc hiệu ........................................................................................... 18

3.1.1.2 Độ thích hợp hệ thống ............................................................................ 19
3.1.1.3 Khoảng tuyến tính ................................................................................... 20
3.1.2 Khảo sát quy trình chiết định lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh .. 21
3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết.......................................................................... 21
3.1.2.2 Khảo sát số lần chiết ............................................................................... 23
3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến quá trình loại cafein
bằng CO2 siêu tới hạn .......................................................................................... 24
3.2.1 Lựa chọn đồng dung môi chiết xuất........................................................... 24
3.2.2 Lượng đồng dung môi ................................................................................ 26
3.2.3 Kích thước nguyên liệu .............................................................................. 27
3.2.4 Áp suất chiết ............................................................................................... 28
3.2.5 Nhiệt độ chiết ............................................................................................. 29
3.2.6 Thời gian chiết............................................................................................ 30
3.3 So sánh với các phương pháp loại cafein khác ............................................. 32
3.4 Xây dựng quy trình loại cafein từ lá chè xanh quy mô 200g/mẻ .................. 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 36


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ

CO2

Carbon dioxyd

DĐVN IV

Dược Điển Việt Nam IV

EC

Epicatechin

ECG

Epicatechin gallat

EGC

Epigallocatechin

EGCG

Epigallocatechin gallat

EtOH

Ethanol

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance
Liquid Chromatography)

PPO

Polyphenol oxidase

POD

Peroxidase

sCO2

Carbon dioxyd siêu tới hạn

STT

Số thứ tự

TLTK

Tài liệu tham khảo

tt/tt

Thể tích/thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Một số nghiên cứu loại cafein từ lá chè xanh bằng dung môi sCO2 ... 12
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng................................................................. 14
Bảng 3.1 Kết quả thời gian lưu và diện tích píc của dung dịch chuẩn hỗn hợp . 19
Bảng 3.2 Mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ cafein và EGCG ........ 20
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát dung môi chiết xác định hàm lượng cafein và EGCG
trong lá chè xanh ................................................................................. 22
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát số lần chiết xác định hàm lượng cafein và EGCG
trong lá chè xanh ................................................................................. 23

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của đồng dung môi đến hiệu suất chiết cafein và EGCG. 24
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của lượng đồng dung môi ethanol 96% đến hiệu suất chiết
cafein và EGCG .................................................................................. 26
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất chiết cafein và
EGCG .................................................................................................. 27
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của áp suất đến hiệu suất chiết cafein và EGCG .............. 28
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết cafein và EGCG ............ 29
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chiết cafein và EGCG ......... 30
Bảng 3.11 Bảng so sánh hiệu suất chiết cafein và EGCG khi sử dụng sCO2,
nước và ethanol 96% ........................................................................... 33
Bảng 3.12 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hiệu suất chiết cafein và EGCG trên
quy mô 200 g/mẻ................................................................................. 34


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số loại catechin ........................................... 3
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của cafein ................................................................. 4
Hình 1.3 Giản đồ pha của carbon dioxyd.............................................................. 6
Hình 1.4 Sơ đồ thiết bị chiết xuất bằng dung môi CO2 siêu tới hạn ..................... 7
Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC thẩm định độ đặc hiệu .............................................. 19
Hình 3.2 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ
cafein ................................................................................................... 21
Hình 3.3 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ
EGCG .................................................................................................. 21
Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC của nguyên liệu và mẫu chè loại cafein bằng sCO2 . 32


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chè Camellia sinensis(L.) Kuntze là một trong những loài cây được trồng
phổ biến nhất trên thế giới do mang nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý.

Thành phần chính trong lá chè có lợi cho sức khỏe là các polyphenol – nhóm
hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa nổi bật. Trong đó, epigallocatechin gallat
(EGCG) là thành phần có hàm lượng lớn nhất và có tác dụng chống oxy hóa mạnh
nhất [19]. Ngày nay, polyphenol chè đã được chứng minh có tác dụng phòng
chống bệnh ung thư, bệnh tim mạch, bệnh cao huyết áp, bệnh đường ruột, bệnh
răng và có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá [16], [46].
Tuy nhiên, lá chè chứa một lượng lớn cafein (3 – 5%) và khi sử dụng cafein
quá mức sẽ gây ra nhiều tác dụng không mong muốn như hồi hộp, mất ngủ, rối
loạn tiêu hóa, sẩy thai, tăng huyết áp [18], [34]. Theo thống kê từ các nghiên cứu
đưa ra, đối với mỗi người bình thường, lượng cafein tiêu thụ ít hơn khoảng 300
mg mỗi ngày được coi là mức an toàn. Do đó, việc nghiên cứu chiết chọn lọc
cafein và giữ lại tối đa nhóm hoạt chất catechin là rất quan trọng để tạo ra loại chè
ít cafein tốt cho sức khỏe.
Gần đây, sử dụng CO2 siêu tới hạn (sCO2) được biết đến như một kỹ thuật
hiện đại trong chiết xuất các hợp chất tự nhiên do khả năng chiết chọn lọc, an
toàn, kinh tế, không tồn dư dung môi và đã được áp dụng để loại cafein trong hạt
cà phê, cacao. Nhằm ứng dụng phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới
hạn vào việc tạo ra sản phẩm lá chè ít cafein, đề tài “Nghiên cứu loại cafein từ
lá chè (Camellia sinensis L.) bằng carbon dioxyd siêu tới hạn” được thực hiện
với mục tiêu:
1. Đánh giá được ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết loại
cafein trong lá chè xanh bằng dung môi CO2 siêu tới hạn.
2. Xây dựng quy trình loại cafein từ lá chè xanh mẻ 200 g.

1


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Cây chè
1.1.1 Đặc điểm thực vật

Chè (Trà) Camellia sinensis (L.) Kuntze thuộc họ Chè Theaceae.
Chè là cây thân gỗ, cao khoảng 10 m. Lá chè mọc so le, không rụng, hình
trái xoan, phiến lá dày, bóng, mép lá có nhiều răng cưa. Hoa 5 – 6 cánh, có màu
biến đổi từ trắng đến hồng hoặc đỏ, mọc đơn độc ở nách lá, có mùi thơm, nhiều
nhị. Quả là một nang thường có 3 ngăn, chứa mỗi ô một hạt. Hạt không có phôi
nhũ, lá mầm lớn, có chứa dầu. Bộ phận dùng là búp và lá chè non (Folium Theae)
[5].
Cây chè được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, tiêu biểu là Trung
Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Nhật Bản và một số nước châu Á. Ở nước ta, chè được
trồng chủ yếu ở Thái Nguyên, Tuyên Quang, Hà Giang, Phú Thọ, Quảng Nam,
Đà Nẵng, Lâm Đồng, Đắk Lắk [5].
1.1.2 Thành phần
Thành phần hóa học của chè biến đổi rất phức tạp, nó phụ thuộc vào giống,
điều kiện đất đai, địa hình, kĩ thuật canh tác. Trong búp chè có polyphenol (30 –
36%), cafein (3 – 5%), protein, carbohydrat, theanin, acid amin, acid hữa cơ,
chlorophyll, enzym, chất khoáng,… Trong đó, polyphenol (chủ yếu là các
catechin) và cafein là những thành phần quan trọng quyết định hương vị của sản
phẩm [1].
1.1.2.1 Catechin
Catechin là tên gọi chung chỉ các flavonoid mang khung flavan-3-ol thường
gặp trong lá chè và còn được gọi là catechin chè xanh, polyphenol chè xanh. Trong
cấu trúc của catechin có 2 C bất đối (C2 và C3), mỗi dẫn chất có 4 đồng phân nên
có thể có 24 catechin khác nhau, tuy nhiên hiện nay mới có 12 catechin đã được
được phân lập và xác định cấu trúc từ lá chè xanh [1].
Về cấu tạo, các catechin có thể chia thành 2 nhóm: epicatechin (đồng phân
2R và 3R) và nonepicatechin (catechin), cũng có thể phân thành catechin tự do và
2


catechin ester hóa. Catechin chè xanh chủ yếu là các epicatechin (hình 1.1), trong

đó EGCG chiếm 10 – 50% tổng lượng catechin. Nonepicatechin chỉ chiếm một
lượng nhỏ trong chè. Hàm lượng mỗi catechin trong các giống chè và các bộ phận
của chè khác nhau, giảm dần theo thứ tự EGCG > EGC > ECG >EC [4].

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số loại catechin
Các catechin trong lá chè ở dạng tinh thể không màu hình kim hoặc hình lăng
trụ, có vị chát. Các catechin tan trong nước và một số dung môi hữu cơ: methanol,
ethanol, aceton, ethyl acetat… [1].
Catechin chè nhạy cảm và không ổn định với các enzym oxy hóa, nhiệt độ
và pH cao. Khi có mặt các enzyme polyphenol oxidase (PPO) và peroxidase
(POD), catechin dễ dàng bị oxy hóa tạo thành theaflavin và thearubegin. Điều
kiện hoạt động tối ưu của PPO và POD là 40°C và pH 5,5, vì vậy trong quá trình
chiết xuất và bảo quản catechin, cần điều chỉnh nhiệt độ và pH phù hợp để làm
giảm hoạt động của các enzym này. Tuy nhiên, tại nhiệt độ cao (> 95°C) các
epicatechin có khuynh hướng phá vỡ cấu trúc, tạo thành nonepicatechin. Ngoài
ra, các catechin rất ổn định trong dung dịch acid có pH < 4 nhưng độ ổn định của
3


chúng giảm dần khi pH tăng từ 4 lên 8 và trở nên mất ổn định trong dung dịch
kiềm có pH > 8 [47].
Tác dụng nổi bật nhất của các catechin chè xanh là khả năng chống oxy hóa.
Trong đó EGCG là chất có hoạt tính cao nhất [19]. Các catechin chè xanh đã được
chứng minh là chất chống oxy hóa hiệu quả hơn vitamin C và E [39]. Hoạt tính
chống oxy hóa của EGCG cao gấp 100 lần vitamin C và cao hơn 25 lần so với
vitamin E [13]. Ngoài ra, catechin còn có tác dụng chống ung thư, diệt khuẩn,
kháng viêm, kháng virus, giảm cholesterol, chống lão hóa [13], [23], [32], [45].
Do vậy, catechin chè xanh được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghệ thực
phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và dinh dưỡng.
1.1.2.2 Cafein

Trong số các chất nhóm methyl xanthin trong lá chè xanh gồm cafein,
theophyllin và theobromin, trong đó cafein (hình 1.2) chiếm hàm lượng lớn nhất,
khoảng 2 – 5% khối lượng khô.

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của cafein
Cafein ở dạng tinh thể không màu, không mùi, vị đắng, có nhiệt độ nóng
chảy 238°C và nhiệt độ thăng hoa 178°C. Cafein hơi tan trong nước, dễ tan trong
nước nóng, cloroform, ít tan trong ethanol và ether, tan trong các dung dịch acid
và trong các dung dịch đậm đặc của benzoat hay salicylat kiềm [3]. Trong dung
môi CO2 siêu tới hạn, khả năng hòa tan của cafein là 1,2 g/kg CO2 tại điều kiện
200 bar, 40°C và lên tới 5 g/kg CO2 tại điều kiện 350 bar, 80°C [22]. Mặc dù sCO2
rất có chọn lọc đối với cafein nhưng độ hòa tan của cafein trong dung môi này
thấp hơn dung môi hữu cơ, dẫn đến việc sử dụng một lượng lớn CO2 và do đó
tăng đáng kể chi phí vận hành. Tuy nhiên, khi thêm một lượng nhỏ đồng dung
4


môi phân cực làm tăng tính phân cực của dung môi, kết quả là độ hòa tan của các
hoạt chất phân cực trong các dung môi hỗn hợp này cao hơn so với sCO2 thuần
túy [25].
Cafein được biết đến là hoạt chất có tác dụng kích thích thần kinh trung ương,
do vậy khi cơ thể tiêu thụ ở mức liều cho phép, cafein mang lại nhiều tác dụng có
lợi, chẳng hạn như tăng khả năng tập trung và ghi nhớ nhanh. Ngoài ra, cafein có
khả năng chống oxy hóa và điều này đã được chứng minh trong một số nghiên
cứu gần đây [26], [37]. Tuy nhiên, khi tiêu thụ lượng cafein quá mức gây ra các
tác dụng không mong muốn như cao huyết áp, lo âu, mất ngủ, nhịp tim nhanh, đẻ
non và sảy thai [18], [34]. Bên cạnh đó, lượng cafein trong cơ thể quá cao có liên
quan đến lượng cholesterol trong máu cao, bệnh mạch vành, tác động tiêu cực đến
khả năng dung nạp glucose và độ nhạy insulin [15].
Theo thông tin từ Hiệp hội Nước giải khát Hoa Kỳ American Beverage

Association (2006) và Hội đồng thông tin thực phẩm Quốc tế International Food
Information Council (2003), lượng tiêu thụ ít hơn khoảng 300 mg cafein mỗi ngày
được coi là mức độ an toàn. Do vậy, việc sản xuất ra sản phẩm có hàm lượng
cafein nằm trong mức cho phép thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa
học. Ngày nay, nhiều nỗ lực đã được thưc hiện để tạo ra loại chè có hàm lượng
cafein thấp, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của người tiêu dùng.
1.1.3 Tác dụng sinh học của chè
Chè là một trong những sản phẩm được tiêu thụ nhiều nhất trên thế giới do
được đánh giá cao trong việc bảo vệ sức khỏe và chữa được nhiều loại bệnh.
Cây chè được đánh giá cao trong phòng chống một số bệnh liên quan đến
phản ứng oxy hóa, chẳng hạn như ung thư, tim mạch và các bệnh thoái hóa thần
kinh. Một số nghiên cứu dịch tễ học cũng như nghiên cứu trên mô hình động vật
cho thấy chè xanh có khả năng phòng chống nhiều loại ung thư khác nhau như da,
vú, tuyến tiền liệt và phổi [6], [20]. Ngoài khả năng chống ung thư, chè xanh cũng
cho thấy là có tác dụng giảm cholesterol máu [50] và ngăn chặn sự phát triển của
mảng xơ vữa động mạch [10].
5


Trong các bệnh lý liên quan đến tuổi và các bệnh thoái hóa thần kinh, chè
xanh đã được chứng minh là có khả năng đáng kể trong việc chống lại bệnh
Parkinson, bệnh Alzheimer và tổn thương thiếu máu cục bộ [29]. Trong một
nghiên cứu của Wu đã chỉ ra tác dụng chống đái tháo đường của chè xanh trên
các mô hình động vật kháng insulin [49].
Một số lợi ích khác của chè xanh như là kháng khuẩn, chống HIV, chống lão
hóa và chống viêm cũng đã được nghiên cứu và chứng minh [11], [14], [33], [42].
Do chè có rất nhiều tác dụng tốt đối với con người, là một loại sản phẩm
được nhiều người ưa chuộng nên ngành công nghiệp chè và nghiên cứu chè ngày
càng được quan tâm và phát triển.
1.2 Phương pháp chiết xuất bằng dung môi CO2 siêu tới hạn

1.2.1 Nguyên tắc
Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là quá trình chiết rắn – khí trong đó
dung môi là chất khí ở điều kiện siêu tới hạn. Độ nhớt thấp và sức căng bề mặt
gần như bằng không, cho phép dung môi siêu tới hạn thấm vào dược liệu sâu hơn
và nhanh hơn so với dung môi lỏng. Hơn nữa việc loại dung môi khí ra khỏi chất
chiết cũng đơn giản hơn so với dung môi lỏng [2].

Hình 1.3 Giản đồ pha của carbon dioxyd
Đối với mỗi chất thông thường, dưới mỗi một điều kiện nhất định chúng sẽ
tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái rắn, lỏng và khí. Nếu nén chất
khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất
mà ở đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái
6


khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn
(supercritical) (hình 1.3). Do vậy chỉ có những dung môi có nhiệt độ tới hạn thấp
và áp suất tới hạn không quá cao (để có thể dễ dàng đạt được) là thích hợp cho
mục đích chiết xuất. Trong đó có carbon dioxid là dung môi thông dụng nhất.
Khi CO2 được đưa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ, áp suất tới hạn của
nó (TC = 31°C, PC = 73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn. Khi đó,
CO2 có khả năng hoà tan rất tốt các đối tượng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3 dạng
rắn, lỏng, khí. Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần giảm áp suất thấp
hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản phẩm được
thoát ra ở bình hứng [2].
Điều chỉnh
P, T

Bình ngưng tụ
(CO2 lỏng)

Bình
tách
Bình
chiết

Bình
chứa
CO2

Làm Bơm
nóng
Hình 1.4 Sơ đồ thiết bị chiết xuất bằng dung môi CO2 siêu tới hạn
1.2.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp chiết xuất bằng sCO2
Ưu điểm
- Dung môi siêu tới hạn có độ nhớt thấp, khả năng khuếch tán tốt, áp suất hơi cao.
CO2 (khi được dùng) là dung môi chiết rẻ tiền, không độc hại và không ô nhiễm.
- Chất chiết ít bị tác động bởi nhiệt, quá trình chiết nhanh.
7


- Khả năng hoà tan và tính chọn lọc của dung môi có thể điều chỉnh được bằng
cách thay đổi áp suất và nhiệt độ.
- Dễ dàng tách hoàn toàn dung môi ra khỏi các chất chiết mà không cần giai đoạn
cất loại dung môi [2].
Nhược điểm
- Làm việc ở điều kiện áp suất cao, không thích hợp với mẫu chiết dạng lỏng.
- Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền.
- Chiết xuất mẫu mới: cần có nhiều nghiên cứu tìm các thông số tối ưu để chiết
xuất thành công [2].

1.2.3 Ứng dụng của sCO2 trong chiết xuất cafein
Hiện nay công nghệ chiết xuất bằng sCO2 đã và đang được áp dụng phổ biến
để chiết tách các hoạt chất sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược
phẩm, mỹ phẩm,… Dựa trên bằng sáng chế của Kurt Zosel, một số nước đã ứng
dụng công nghệ tách cafein ở quy mô công nghiệp, trong đó Đức là nước đầu tiên
có nhà máy công nghiệp tách loại cafein ra khỏi hạt cà phê áp dụng công nghệ
SCO2 do hãng HAG.A.G xây dựng vào năm 1979.
Nhiều nghiên cứu được thực hiện cho thấy tính khả thi của việc chiết xuất
cafein sử dụng công nghệ CO2 siêu tới hạn từ các nguồn nguyên liệu khác nhau
như: lá chè, bã chè thải từ ngành công nghiệp chế biến, hạt cacao, dầu cà phê,...
[7], [21], [31].
1.3 Một số phương pháp loại cafein trong lá chè
Lá chè chứa một lượng lớn catechin có tác dụng chống oxy hóa tốt cho sức
khỏe, nhưng nó cũng chứa hàm lượng cafein cao, gây ra các tác dụng bất lợi cho
sức khỏe con người. Điều này đã thúc đẩy sản xuất sản phẩm lá chè có hàm lượng
cafein thấp, do vậy các nghiên cứu loại cafein từ lá chè đã được thực hiện từ rất
sớm và tiếp tục phát triển cho đến hiện nay. Nhiều quá trình xử lý khác nhau đã
được đưa ra và được đánh giá dựa trên các tiêu chí sau: lượng cafein loại bỏ, lượng
catechin được giữ lại, tính an toàn với người sử dụng và môi trường, tính thuận

8


tiện. Dưới đây là 4 phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để loại cafein trong
lá chè.
1.3.1 Loại cafein bằng dung môi hữu cơ
Giữa những năm 1970, tất cả các quá trình loại cafein được thực hiện bằng
dung môi hữu cơ như benzen, chloroform, ether dầu hỏa, methylen clorid,
trichloroethylen, carbon tetraclorua, aceton, methanol, ethanol [27].
Lợi thế của việc sử dụng các dung môi hữu cơ là loại bỏ cafein chọn lọc và

có thể giữ lại phần lớn các thành phần có lợi cho sức khỏe đặc biệt là các catechin
nên phương pháp mang lại hiệu suất cao. Ngoài ra, phương pháp này có thể thực
hiện trên quy mô công nghiệp với chi phí vận hành tương đối thấp. Tuy nhiên,
dung môi hữu cơ có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người nếu chúng tồn dư
trong sản phẩm được sử dụng. Bên cạnh đó, trong quá trình sản xuất, các vấn đề
về an toàn lao động và khó khăn xử lý môi trường được đặt ra, do dung môi hữu
cơ dễ bay hơi và dễ gây cháy nổ.
Loại cafein bằng dung môi hữu cơ thường được thực hiện bằng cách làm
mềm lá chè trong nước, sau đó chiết bằng dung môi hữu cơ. Cafein hòa tan trong
dung môi hữu cơ gấp khoảng 10 lần so với trong nước ở nhiệt độ phòng, do đó
hầu hết cafein được chiết từ lá vào pha hữu cơ, nhưng các thành phần chính khác
của chè như catechin vẫn còn trong lá, sau đó được phơi khô để lấy lá chè đã loại
cafein [40].
Methylen chlorid được biết đến là dung môi tốt nhất và phổ biến nhất được
sử dụng để loại cafein cho đến giữa những năm 1970. Tuy nhiên, việc sử dụng
dung môi này hiện nay bị hạn chế bởi vì nó đã được xác định là một chất gây suy
giảm tầng ozon và tồn dư độc hại trong các sản phẩm loại cafein. Tương tự như
vậy, việc sử dụng các dung môi hữu cơ khác như chloroform, benzen,
trichloroethylen, carbon tetrachlorid và aceton trong quá trình loại cafeine hiện
nay bị hạn chế bởi Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA)
[44]. Những nguy cơ tiềm ẩn này đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tìm kiếm dung
môi thích hợp hơn để loại bỏ cafein khỏi lá chè xanh.
9


Gần đây, một loại dung môi khác tương đối an toàn được sử dụng để loại bỏ
cafein từ lá chè xanh là ethyl acetat. Được chứng minh có khả năng loại bỏ cafein
hiệu quả, tuy nhiên một số thành phần khác có lợi cho sức khỏe đặc biệt là EGCG
cũng bị loại bỏ cùng với cafein [12].
1.3.2 Loại cafein bằng nước nóng

Dựa vào tính tan tốt của cafein trong nước nóng và giải quyết vấn đề độc hại
của các dung môi hữu cơ gây ra khi sử dụng chúng để loại cafein, phương pháp
loại cafein bằng nước nóng đã được nghiên cứu.
Liang và cộng sự (2007) đã nghiên cứu việc loại cafein bằng nước nóng đối
với lá chè tươi và lá chè khô. Nhiệt độ nước, thời gian chiết xuất và tỷ lệ lá chè
tươi/dung môi nước là những thông số có ảnh hưởng đáng kể đối với quá trình
loại cafein. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu để loại cafein trong lá chè tươi là
nhiệt độ 100°C, trong 3 phút và tỷ lệ lá chè với nước là 1 : 20 (kl/tt). Nghiên cứu
cho thấy rằng phần lớn cafein từ lá chè tươi có thể được loại bỏ bằng cách xử lý
nước nóng nhưng khi áp dụng phương pháp này với lá chè khô, catechin cũng
được chiết xuất và mất đi một phần. Quá trình sấy khô và sàng lọc có thể phá hủy
các tế bào lá dẫn đến một số thành phần hóa học trong lá chè bao gồm catechin
và cafein được ép ra trên bề mặt của lá. Trong trường hợp này, catechin và cafein
dễ dàng hòa tan trong nước khi lá chè khô được xử lý nước nóng [28].
Xử lý bằng nước nóng là một phương pháp an toàn và rẻ tiền để tách cafein
ra khỏi lá chè xanh tươi. Tuy nhiên, phương pháp này không phù hợp để loại
cafein từ lá chè khô do tổng số catechin và các catechin thành phần chính như
EGCG bị loại bỏ đáng kể.
1.3.3 Loại cafein bằng vi sinh vật
Nguyên tắc sử dụng vi sinh vật để loại cafein là một số vi sinh vật có thể sử
dụng cafein làm nguồn carbon và nitơ để chuyển hóa và do đó, chúng có thể được
sử dụng để giảm hàm lượng cafein trong lá chè [17].
Các chủng Pseudomonas và Serratia là những chủng vi khuẩn có khả năng
phân hủy cafein tốt nhất [9], [30]. Vi khuẩn có thể được sử dụng để làm giảm hàm
10


lượng cafein có trong các loài thực vật mà thành phần có chứa cafein. Một phương
pháp đã được đề xuất để sản xuất lá chè có hàm lượng cafein thấp là nuôi dưỡng
vi khuẩn làm tiêu hủy cafein trên bề mặt lá. Ramarethinam và cộng sự (2004) đã

chứng minh rằng lá chè được làm giảm hàm lượng cafein bằng cách phun lên bề
mặt lá chủng vi sinh vật Bacillus không ảnh hưởng đến chất lượng của các thành
phần chè khác [38].
Sự làm giảm hàm lượng cafein cũng được quan sát thấy ở các loài nấm như
Stemphyllium sp., Penicillium sp. và Aspergillus sp.. Tuy nhiên, khả năng loại bỏ
cafein của vi khuẩn được đánh giá là tốt hơn so với nấm do mức độ thoái hóa
cafein ở vi khuẩn cao hơn và Pseudomonas putida được cho là vi sinh vật tốt nhất
để giảm cafein [17].
Mặc dù có ưu điểm là thân thiện môi trường, không tồn dư hóa chất, không
gây độc hại nhưng phương pháp này rất khó để nâng cấp quy mô và đòi hỏi kiểm
soát nghiêm ngặt các điều kiện như chủng vi sinh vật, hàm lượng cafein ban đầu,
nhiệt độ tiến hành, thời gian ủ. Do đó, cần có các nghiên cứu sâu hơn để tối ưu
hóa việc sử dụng vi sinh vật để loại cafein từ lá chè.
1.3.4 Loại cafein bằng dung môi siêu tới hạn
Sử dụng dung môi siêu tới hạn là phương pháp hiện đại nhất trong việc loại
bỏ cafein từ lá chè xanh. Quá trình loại cafein được tiến hành như sau: lá chè được
nghiền thành các tiểu phân có kích thước nhỏ (< 1 mm) và nạp vào bình chiết.
CO2 lỏng được bơm theo áp suất định trước, qua hệ thống gia nhiệt và đi vào bình
chiết. Cafein hòa tan trong CO2 siêu tới hạn và được đi qua bình tách, tại đây,
cafein được tách khỏi CO2 bằng cách giảm áp suất. Để tăng hiệu suất chiết, sCO2
thường được sử dụng kết hợp đồng dung môi (ví dụ EtOH 95%) bằng cách trộn
nguyên liệu với một lượng nhỏ đồng dung môi hoặc trộn lẫn đồng dung môi vào
cùng sCO2 trước khi dẫn vào bình chiết [35].

11


Bảng 1.1 Một số nghiên cứu loại cafein từ lá chè xanh bằng dung môi sCO2
TLTK

Nguyên liệu và

Điều kiện

thiết bị

Kết quả

Năm 2007 - Chè có hàm lượng - 10 g lá chè (kích thước Loại bỏ hơn
[36]

cafein 40,2 mg/g và 0,425 – 0,710 mm).
EGCG 143 mg/g.

90% cafein và

- Tốc độ dòng sCO2: 8,5 60% EGCG.

- Thể tích bình chiết g/phút.
100 mL.

- Đồng dung môi EtOH
95% (7 g/100 g CO2).
- Áp suất 300 bar.
- Nhiệt độ 70°C.
- Thời gian 2 giờ.

Năm 2008 - Chè có hàm lượng - 50 g lá chè (kích thước Loại bỏ 54%
[24]

cafein 32,92 mg/g và khoảng 0,520 mm).
EGCG 122,8 mg/g.

cafein và 21%

- Tốc độ dòng sCO2: EGCG.

- Thể tích bình chiết 28,08 kg/kg lá chè mỗi
230 mL.

giờ.
- Đồng dung môi nước.
- Áp suất 400 bar.
- Nhiệt độ 40°C.
- Nhiệt độ 5 giờ.

Năm 2010 - Chè có hàm lượng - 10 g chè xanh (kích Loại bỏ 70,2%
[43]

cafein 31,84 mg/g và thước 0,2 – 0,6 mm).
EGCG 95,33 mg/g.

cafein và 6,2%

- Tốc độ dòng sCO2: 1,5 EGCG.
L/phút.
- 15 mL đồng dung EtOH.
- Áp suất 300 bar.
- Nhiệt độ 80°C.
- Thời gian 2 giờ.

12


Năm 2012 - Chè có hàm lượng - 10 g lá chè.
[35]

Loại bỏ 96,6%

cafein 23,35 mg/g và - Đồng dung môi EtOH cafein
EGCG 81,69 mg/g.

95% (3 g/100 g CO2).

- Thể tích bình chiết - Áp suất 230 bar.

và

40,61%
EGCG.

- Nhiệt độ 63°C.

100 mL.

- Thời gian 2 giờ.
Năm 2018 - Chè có hàm lượng - 10 g lá chè (kích thước Cafein
[41]

cafein

1,80%

và 0,5 mm).

catechin 2,77%.

được

loại bỏ hoàn

- Tốc độ dòng sCO2: 10 toàn.
g/phút.
- Áp suất 250 bar.
- Nhiệt độ 60°C.
- Thời gian 3 giờ.

Mặc dù phương pháp xử lý này phức tạp hơn so với dung môi lỏng nhưng
có ưu điểm tính chọn lọc cao, thân thiện môi trường. Đó là lý do các nhà nghiên
cứu và người tiêu dùng đánh giá cao hơn và các nghiên cứu gần đây tiếp tục sử
dụng sCO2 để tách cafein trong lá chè xanh (bảng 1.1). Các nghiên cứu về loại
cafein từ lá chè xanh bằng sCO2 mang lại kết quả rất khác nhau vì phương pháp
này phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nguyên liệu, đồng dung môi áp suất, nhiệt
độ, thời gian, tốc độ dòng, thiết bị máy móc sẵn có,...
Việt Nam là một nước có sản lượng chè lớn. Năm 2015, tổng diện tích trồng
chè cả nước khoảng 134,7 nghìn hecta, sản lượng chè búp đạt 1 triệu tấn, với rất
nhiều loại chè thương phẩm khác nhau, trong đó chủ yếu là chè đen, còn lại là chè
xanh và các loại khác [1]. Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa tiến hành nghiên cứu sản
xuất sản phẩm loại cafein từ lá chè. Do đó, nhằm hướng tới đa dạng hóa, nâng cao
chất lượng các sản phẩm từ cây chè, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu
tìm điều kiện tối ưu hóa loại bỏ chọn lọc cafein chè bằng sCO2 để tạo ra một loại

chè ít cafein có lợi cho sức khỏe.

13


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1 Nguyên liệu
Lá chè xanh tươi được thu mua tại Đại Từ, Thái Nguyên năm 2018 và được
giám định tên khoa học tại bộ môn Thực Vật, trường Đại học Dược Hà Nội là
Camellia sinesis (L.) Kuntze. Sau đó, lá chè nguyên liệu được sấy khô ở 50°C
(hàm ẩm dưới 5%) trong tủ sấy tĩnh, xay thành bột và bảo quản trong túi PE kín
ở điều kiện phòng thí nghiệm.
2.1.2 Chất chuẩn và hóa chất
➢

Chất chuẩn

- Cafein chuẩn: hàm lượng 98,73%, lô MUST-17060110 (Chengdu Must
Biological Technology Co., Ltd.).
- EGCG chuẩn: hàm lượng 99,78%, lô MUST-17060113 (Chengdu Must
Biological Technology Co., Ltd.).
➢

Hóa chất
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng

STT

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

1

Methanol

Fisher (Hàn Quốc)

HPLC

2

Acid phosphoric

Merk (Đức)

Tinh khiết phân tích

3

Nước cất

Việt Nam

DĐVN IV

4

Ethanol 96%

Việt Nam

DĐVN IV

5

Isopropanol

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

6

Ethyl acetat

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

7

Aceton

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

8

Carbon dioxyd

Việt Nam

Tiêu chuẩn công nghiệp

99,9%
2.1.3 Thiết bị thí nghiệm
- Tủ sấy MEMMERT (Đức).
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy Sỹ).
14


- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản).
- Hệ thống chiết xuất siêu tới hạn Separex (Pháp).
- Các dụng cụ kiểm nghiệm khác.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Xây dựng quy trình định lượng cafein và EGCG trong lá chè.
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến quá trình loại cafein
bằng sCO2: kích thước nguyên liệu, loại đồng dung môi, lượng đồng dung môi,
áp suất, nhiệt độ, thời gian chiết.
- Xây dựng quy trình loại cafein từ lá chè xanh quy mô 200 g/mẻ.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp định lượng cafein và EGCG trong lá chè xanh
Tham khảo tài liệu [48], xác định hàm lượng cafein và EGCG trong lá chè
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Điều kiện sắc ký:

- Cột C18 Supelcosil (250 × 4,6 mm, 5 µm), cột bảo vệ RP18.
- Pha động: MeOH – Nước – Acid phosphoric (20 : 79,9 : 0,1, tt/tt).
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µL.
- Bước sóng phát hiện: 280 nm.
Chuẩn bị mẫu:
- Mẫu chuẩn:
Cân chính xác khoảng 10 mg cafein chuẩn và 15 mg EGGC chuẩn, hòa tan
trong bình định mức 25 ml bằng nước cất, sau đó pha loãng thành các dung dịch
chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm trong khoảng từ 8 đến 200 μg/mL đối với cafein
và từ 12 đến 300 μg/mL đối với EGCG.
- Mẫu thử:
Cân chính xác khoảng 200 mg bột lá chè xanh (trước và sau xử lý với sCO2)
cho vào bình nón dung tích 100 mL, chiết 2 lần × 30 mL nước, giữ nhiệt độ ở
50°C, trong vòng 30 phút. Dịch chiết được để nguội về nhiệt độ phòng và gộp vào
15


bình định mức 100 mL, bổ sung nước cất đến vạch. Sau đó, pha loãng thành dung
dịch có nồng độ thích hợp và lọc qua màng lọc 0,45µm.
Cách tiến hành:
Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Dựa vào diện tích píc của
dung dịch thử, dung dịch chuẩn thu được tính hàm lượng cafein và EGCG trong
mẫu thử.
Công thức tính
- Hàm lượng cafein (hoặc EGCG) trong mẫu chè trước và sau xử lý với sCO2 được
tính theo công thức:
X cafein (hoặc EGCG) (mg/g) =

St × Cc × k × 10

Sc × mt × (100 − B)

Trong đó:
Xcafein (hoặc EGCG) là hàm lượng cafein (hoặc EGCG) trong lá chè.
St và SC lần lượt là diện tích píc sắc ký của cafein (hoặc EGCG) trong mẫu thử
và mẫu chuẩn.
Cc là nồng độ cafein (hoặc EGCG) trong mẫu chuẩn (μg/mL).
k là hệ số pha loãng của mẫu thử.
mt là khối lượng mẫu thử (g).
B là hàm ẩm của mẫu thử (%).
- Hiệu suất chiết cafein (hoặc EGCG) bằng sCO2:
H = (1 −

X cafein (hoặc EGCG) trong mẫu chè sau xử lý với sCO2 (mg/g)
X cafein (hoặc EGCG) trong mẫu chè trước xử lý với sCO2 (mg/g)

) × 100%

- Hệ số chiết chọn lọc:
Hệ số chọn lọc =

Hiệu suất chiết cafein
Hiệu suất chiết EGCG

2.3.2 Phương pháp chiết cafein từ lá chè xanh bằng CO2 siêu tới hạn
Cân khoảng 20,00 g nguyên liệu có kích thước trong khoảng xác định, làm
ẩm với loại và lượng đồng dung môi thích hợp (≥ 30 phút). Nạp nguyên liệu đã
chuẩn bị vào bình chiết (dung tích 1 L) đã được nạp một ít bi sứ (để giảm không
gian trống không cần thiết của bình chiết), cài đặt nhiệt độ bình chiết và chờ đến
16

giá trị mong muốn (50 – 70°C). CO2 từ bình chứa được bơm vào bình chiết bằng
bơm cao áp theo tốc độ 50 g/phút đến áp suất khảo sát (100 – 400 bar). Khi bình
chiết đạt áp suất, tiến hành tắt bơm CO2 và ngâm trong 1 giờ. Sau đó bật bơm, mở
van tiết lưu để sCO2 chuyển sang bình tách, chú ý điều chỉnh van tiết lưu để áp
suất bình chiết luôn duy trì ở giá trị khảo sát. Ở bình tách, cao chiết chứa cafein
được tách khỏi CO2 bằng cách giảm áp suất (50 – 60 bar). Khí CO2 sau khi tách
khỏi cao chiết được ngưng tụ và bơm tuần hoàn trở lại bình chiết.
Các mẫu chè sau khi xử lý loại cafein được sấy khô ở 50°C trong 24 giờ
trong tủ sấy tĩnh để loại đồng dung môi và phân tích bằng HPLC.
2.3.3 Phương pháp chiết cafein từ lá chè xanh bằng nước và ethanol
Cân khoảng 20,00 g bột nguyên liệu vào bình nón dung tích 1 L, thêm 500
mL nước hoặc EtOH 96%, đậy kín, tiến hành chiết cafein trong 5 giờ ở nhiệt độ
60°C. Dịch chiết được làm nguội về nhiệt độ phòng, gạn vào bình định mức 1000
mL, pha loãng tới nồng độ thích hợp, lọc qua màng 0,45 µm và phân tích bằng
HPLC. Hiệu suất chiết cafein bằng nước hoặc EtOH 96% được so sánh với kết
quả chiết cafein bằng sCO2 sử dụng đồng dung môi EtOH 96% ở điều kiện 60°C
trong 5 giờ.

17