Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng chống oxy hóa invitro của cao cây lá đắng

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THU GIANG
1201139

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY
HÓA INVITRO CỦA CAO CÂY LÁ ĐẮNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THU GIANG
1201139

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY
HÓA INVITRO CỦA CAO CÂY LÁ ĐẮNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Phạm Thái Hà Văn
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dƣợc học cổ truyền

HÀ NỘI - 2017


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………. .........................................................1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN……………….. .........................................................2
1.1. Tổng quan về cây lá đắng .........................................................................2
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Vernonia ..................................2
1.1.2. Loài Vernonia amygdalina Del ..........................................................3
1.1.3. Tác dụng sinh học ..............................................................................6
1.2. Sự hình thành các dạng oxy hoạt động và hệ thống các chất chống oxy
hóa (CCOH) trong cơ thể ...................................................................................7
1.2.1. Sự hình thành các dạng oxy hoạt động ..............................................7
1.2.2. Hệ thống các chất chống oxy hóa (CCOH) trong cơ thể ...................8
1.2.3. Sự liên quan giữa gốc tự do với một số quá trình bệnh lý ...............10
1.2.4. Các phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa .........................12
1.3. Tổng quan về cao đặc .............................................................................12
1.3.1. Định nghĩa ........................................................................................13
1.3.2. Phương pháp điều chế cao ...............................................................13
1.3.3. Yêu cầu chất lượng với cao ..............................................................13
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị .........................................................................15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.......................................................................15
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ dùng cho nghiên cứu ............................................15

2.1.3. Hóa chất, thuốc thử ..........................................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................16
2.2.1. Điều chế cao chiết ethanol lá đắng ..................................................16
2.2.2. Nghiên cứu/ khảo sát thành phần hóa học cao chiết ethanol lá
đắng….. .........................................................................................................16
2.2.3. Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao chiết ethanol lá đắng 16
2.2.4. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro cao chiết ethanol lá
đắng….. .........................................................................................................17
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................17
2.3.1. Phương pháp điều chế cao ...............................................................17
2.3.2. Phương pháp xác định độ ẩm ..........................................................18
2.3.3. Phương pháp cảm quan ...................................................................18
2.3.4. Phương pháp định tính .....................................................................18
2.3.5. Phương pháp bán định lượng ..........................................................22
2.3.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro .......................................24
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................27
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .................................................28
3.1. Điều chế cao chiết ethanol lá đắng .........................................................28
3.2. Nghiên cứu/ khảo sát thành phần hóa học cao chiết ethanol lá đắng .....29
3.2.1. Định tính ...........................................................................................29
3.2.2. Bán định lượng .................................................................................32
3.2.2.2. Thẩm định phương pháp HPTLC..................................................34
3.3. Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao chiết ethanol cây lá đắng........37
3.3.1. Tính chất: .........................................................................................37
3.3.2. Độ ẩm: ..............................................................................................37
3.3.3. Định tính: .........................................................................................38
3.3.4. Bán định lượng luteolin bằng HPTLC: ............................................38

3.4. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao chiết ethanol lá
đắng…. .............................................................................................................38
3.4.1. Tiến hành ..........................................................................................38
3.4.2. Kết quả .............................................................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………… ......................................................43

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CCOH: chất chống oxy hóa
SOD: enzym superoxyd dismutase
DOXHĐ: dạng oxy hoạt động
LDL: lipoprotein tỷ trọng thấp
DĐVN IV: dược điển Việt Nam IV
HPTLC: high performance thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng hiệu
năng cao)
DPPH: 1,1 – diphenyl – 2 – picrylhydrazyl
TLC, SKLM: Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng)
MDA: Malonyl dialdehyd
POL: peroxyd hóa lipid
TMCB: thiếu máu cục bộ
TMTL: tưới máu trở lại
RSD: độ lệch chuẩn tương đối
TT: thuốc thử


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 3.1. Hàm lượng chiết cao lá đắng ethanol 70%

28

Bảng 3.2. Định tính các thành phần có trong cao

29

Bảng 3.3. Kết quả phân tích sắc ký đồ cao lá đắng sau khi phun

31

thuốc thử ở bước sóng 254 nm
Bảng 3.4. Thể tích tiêm mẫu

32

Bảng 3.5. Hàm lượng luteolin có trong cao cây lá đắng

33

Bảng 3.6. Diện tích pic của 6 lần tiêm chuẩn

36

Bảng 3.7. Hàm lượng luteolin chuẩn và diện tích pic đáp ứng

36

Bảng 3.8. Độ ẩm cao

38

Bảng 3.9. Độ hấp thụ và % ức chế gốc tự do của cao tổng lá đắng
và quercetin

40


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các Vernonioside

5

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của luteolin

6

Hình 2.1. Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

15

Limonat 5
Hình 2.2. Cấu trúc hóa học của DPPH

25

Hình 3.1. Kết quả định tính flavonoid ở bước sóng 254 nm

31

Hình 3.2. Sắc ký đồ định lượng bằng HPTLC ở bước sóng 254

33

nm
Hình 3.3. Hình dạng pic và Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn

35

Đồ thị 3.1. Đường chuẩn phân tích nồng độ luteolin theo diện

34

tích pic
Đồ thị 3.2. Mối liên hệ giữa hàm lượng luteolin và diện tích pic

36

Đồ thị 3.3. Khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây lá đắng

41

Đồ thị 3.4. Khả năng chống oxy hóa của chất đối chứng
quercetin

41

LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân
thành nhất tới ThS. Phạm Thái Hà Văn – người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ
bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như động viên, hỗ trợ tôi
về mọi mặt từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn thiện khóa luận.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS-TS. Nguyễn Mạnh Tuyển đã hỗ trợ,
chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài và ThS. Nghiêm Đức
Trọng – Bộ môn Thực vật đã giúp tôi giám định tên khoa học của mẫu
nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các Thầy cô giáo và các anh chị kỹ
thuật viên Bộ môn Dƣợc học cổ truyền – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã
luôn hỗ trợ kịp thời, tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên
cứu tại bộ môn.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng
toàn thể các Thầy cô giáo Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã dạy dỗ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và các bạn của tôi đã luôn động
viên, khích lệ và nhắc nhở, luôn sát cánh bên tôi, là động lực lớn giúp tôi vượt
qua mọi khó khăn.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có
hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý
của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Trần Thu Giang


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây lá đắng có nguồn gốc từ châu Phi, đã được di thực vào Việt Nam

trong một thời gian dài và được nhân dân ta sử dụng như một loại rau xanh ăn
hằng ngày hoặc thảo dược để phòng và điều trị các bệnh như: tiểu đường,
lipid máu, các bệnh chuyển hoá liên quan đến gan...
Trong bối cảnh cây lá đắng ngày càng được sử dụng rộng rãi, xuất hiện
nhiều nghiên cứu về đặc điểm thực vật cũng như thành phần hoá học của cây.
Các nghiên cứu này đã khẳng định được cây lá đắng di thực vào Việt Nam là
loài Vernonia amygdalina Del. và ít nhiều khẳng định được các tác dụng sinh
học của cây lá đắng thông qua việc phát hiện các hợp chất hoá học liên quan.
Tuy nhiên chưa có một nghiên cứu chính thức nào tiến xa hơn trong việc đưa
cây lá đắng tiếp cận gần hơn với người sử dụng. Việc chế biến và sử dụng lá
đắng vẫn còn rất thủ công. Người dân chủ yếu dùng lá tươi hoặc đã phơi khô
hãm uống như chè hoặc nấu thành canh để ăn.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành
phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa invitro của cao cây lá đắng” với
mục đích đưa ra bào chế cao giúp cho việc sử dụng loại dược liệu này được
thuận tiện, dễ dàng hơn và bước đầu nghiên cứu tác dụng của cây lá đắng. Để
hoàn thành mục đích đó chúng tôi tiến hành để tài với các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu thành phần hóa học của cao cây lá đắng.
2. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên in vitro của cao cây lá đắng.
Để thực hiện các mục tiêu trên đề tài cần thực hiện những nội dung sau:
1. Khảo sát một số tiêu chuẩn cao về cảm quan, độ ẩm, định tính các
thành phần hóa học, định tính và bán định lượng luteolin.
2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa invitro của cao cây lá đắng.

1


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về cây lá đắng

1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Vernonia
1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Vernonia
Theo một số tài liệu, chi Vernonia được xếp vào vị trí phân loại như
sau:
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Bộ Cúc (Asterales)
Họ Cúc (Asteraceae)
Chi (Vernonia)
Chi Vernonia gồm khoảng 1000 loài cây thân thảo và cây bụi trong họ
Cúc. Một số cây được biết đến như là cây gỗ. Một số loài ăn được và có giá
trị kinh tế. Chúng thường có hoa màu tím đậm [18].
Các loài của chi này thường được tìm thấy ở Châu Á, Châu Phi, Bắc và
Nam Mĩ. Tại Ấn Độ, chi này có 56 loài và 17 thứ [19].
1.1.1.2. Đặc điểm của chi Vernonia
Cây lâu năm hoặc hằng năm hiếm khi là cây bụi, cây nhỏ, dây leo hoặc
bò sát, ít khi có nhựa mủ. Lông đơn giản, đơn sắc, dạng chữ T, hình sao hoặc
2


có tuyến. Lá thường xen kẽ, hiếm khi mọc đối hoặc chụm ba lá, đôi khi mọc
hình hoa thị đơn giản, không cuống hoặc có cuống. Lá thường có gân lông
chim. Toàn bộ mép lá có dạng thuỳ hoặc đầy gai, thường có những đốm
tuyến. Hoa mọc thành cụm, cụm hoa có 1 – 200 hoa, cụm hoa thường lưỡng
tính. Lá bắc xếp chồng lên nhau, có khoảng từ 1 đến 12 lá, lá bắc trong không
rụng hoặc rụng sớm. Tràng hoa có màu trắng hoặc tím, hiếm khi có màu
vàng, hình ống [18].
1.1.2. Loài Vernonia amygdalina Del.

1.1.2.1. Đặc điểm thực vật
Loài V.amygdalina Del. có các đặc điểm sau [4]:
Cây bụi hay cây gỗ nhỏ, cao 1,5 – 3 m. Thân vừa phải phân nhiều
nhánh, thân cây non có góc cạnh, gần như nhẵn ở dưới, nhiều lông bao phủ
bên ngoài.
Lá mọc cách, nhiều hình dạng và kích thước, hình mác, một số hình
trứng, kích thước 3 – 17 x 1,3 – 7 cm, đỉnh lá nhọn, mép lá có khía răng cưa,
mặt trên lá nhẵn, có nhiều lông mềm, mặt dưới của lá và gân có màu nhạt
hơn, có lông, vị đắng. Cuống lá dài 1 – 4 cm, có nhiều lông mịn.
Cụm hoa đầu với nhiều lá bắc nhỏ, dài 0,1 – 0,2 cm; có mùi thơm, có
cuống ngắn. Đầu mang hoa có 11 – 35 hoa lưỡng tính, hình chuông rộng 0,2 –
0,5 cm, đế hoa nhỏ dài 0,2 – 0,5 cm, màu trắng kem. Tổng bao 25 – 30 lá bắc
xếp 4 – 5 hàng, hình trứng hoặc hình chữ nhật hoặc nhọn, dài 0,4 – 0,6 cm,
màu xanh hơi nâu ở đỉnh, hình dài hẹp, vòng trong dài hơn vòng ngoài.
Tràng hoa thu hẹp dần bên dưới. Bộ nhị dài 4,5 – 5 mm, với 5 chỉ nhị,
bao phấn dính nhau thành ống dài 3 – 4 mm, dính nhau ở đuôi. Chỉ nhị dài 11

3


– 14,5 mm; bao phấn thuôn dài hình elip, kích thước 2 – 2,5 x 0,5 – 0,9 mm.
Vòi nhụy dài 8 – 9,5 mm, phía trên tách ra mang 2 đầu nhụy.
Quả bế hình elip thuôn dài, 3 – 4 x 0,5 – 1 mm, quả có 10 gân. Túm
lông với những sợi lông cứng loe ra ở đầu.
1.1.2.2. Đặc điểm phân bố
Lá đắng có nguồn gốc từ Châu Phi, đã di thực về Việt Nam. Lá đắng rất
dễ trồng, chủ yếu bằng cách giâm cành.
1.1.2.3. Thành phần hóa học
Lá cây được dùng làm thực phẩm rau xanh ăn hàng ngày do có hàm
lượng chất dinh dưỡng, vitamin và khoáng chất tương đối dồi dào [17], [25].

Trong 100g lá có:
49,0 mg vitamin C
21,5 IU vitamin A
106,2 IU vitamin E
0,5 mg thiamin
0,13 mg riboflavin
0,03 mg niacin và một lượng nhỏ riboflavin và niacin
Hàm lượng Fe rất lớn 468,16 (mg/g)
Ca 3,324 (mg/kg)
P 1,288 (mg/kg)
K 2,009 (mg/kg)
Na 3,746 (mg/kg)
Mg 1,1 (mg/kg)
Mn 449,44 (mg/kg)
Cu 26,22 (mg/kg)

4


Zn 580,52 (mg/kg)
Một lượng nhỏ Se, Cr
Tỷ lệ protein trong lá chiếm 6,71%
Chất béo 34,03%
Thành phần hóa học (các chất chuyển hóa thứ cấp) trong cây tương đối đa
dạng:
Lá cây có alcaloid, saponin, tanin [25], [26], anthraquinon, flavonoid,
sesquiterpen lacton [22], [27], [29].
Vỏ thân cây có saponin, tanin, alcaloid, flavonoid, hydrocyanid [17], [23].
Nhóm sesquiterpen lacton gồm có hydroxyvernolid, vernolid, vernodalol,
vernolepin, vernodalin [24], vernodalinol [30] liên quan đến tác dụng kháng

ký sinh trùng sốt rét.

R1

R2

A1

β-OH, H

H

A2

α-OH, H

H

A3

O

H

B1

H, H

OH

Vernonioside A1, A2, A3, B1
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Vernonioside
Nhóm flavonoid có 3 flavon là luteolin, luteolin 7-O-beta-glucosid,
luteolin 7-O-glucuronosid và hàm lượng cao vitamin C liên quan đến hoạt

5


tính chống oxy hóa và có thể có vai trò chống ung thư, chống lại bệnh tiểu
đường và xơ vữa động mạch của lá đắng [28].

Luteolin
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của luteolin
1.1.3. Tác dụng sinh học
Lá đắng có tác dụng hạ đường huyết, hạ lipid máu, bảo vệ gan, chống
oxy hóa, nên được dùng để phòng và chữa bệnh tiểu đường, xơ vữa động
mạch, bệnh chuyển hóa liên quan đến bệnh gan [18], [25], [28]; chống ung
thư [28].
Cao chiết nước lá đắng liều 300mg/kg thể trọng dùng theo đường uống
thử trên chuột cống trắng có tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa trên mô
hình gây độc gan bằng ethanol mãn (35 ngày) [16].
Cao chiết nước lá đắng liều 50mg/kg thể trọng dùng đường uống thử
nghiệm trên chuột nhắt trắng có tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa trên mô
hình gây độc gan bằng ethanol bán cấp (7 ngày) [29].
Ngoài ra ngoài dân gian còn sử dụng lá đắng với các tác dụng sau:
- Tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể. Chữa rối loạn tiêu hóa, đau bụng
và tả lỵ.
- Hạ sốt và điều trị cảm lạnh tích cực nhờ các hợp chất xanthone, acid
phenolic trong lá.
6

- Điều trị các bệnh qua đường tình dục như bệnh lậu nhờ tác dụng của
các chất chống oxy hóa trong lá.
- Chống giun sán.
- Duy trì sức sống tình dục. Giúp nhuận tràng và chữa táo bón.
- Chống sốt rét vì chất đắng trong lá có thể thay thế cho quinin.
- Chữa đau họng, ho, trừ đờm, chỉ cần nhai 1 lá trước khi đi ngủ vào ban
đêm và sáng sớm sẽ thấy giảm các triệu chứng ho.
- Tăng cường khả năng sinh sản, uống nước lá đắng giúp kích thích khả
năng sinh sản ở phụ nữ khó sinh. Các lá có chứa nhiều carotene, giúp
cân bằng quá trình tổng hợp các hormon sinh dục nữ và duy trì nồng độ
estrogen đo đó giúp phụ nữ khỏe mạnh và kéo dài tuổi xuân.
- Chống buồn nôn và tăng cường cảm giác ngon miệng.
- Hỗ trợ điều trị viêm gan siêu vi B và C.
- Tăng tiết sữa cho con bú.
- Giảm đau và làm êm dịu thần kinh dễ ngủ. Chống mẩn ngứa ngoài da.
Độc tính của lá đắng rất thấp nên có thể sử dụng lâu dài an toàn [22], [25].
Trên thực nghiệm, dịch chiết nước từ lá có độc tính rất thấp nên có thể dùng
liều cao mà vẫn an toàn trong điều trị bệnh cho người [25].
1.2.

Sự hình thành các dạng oxy hoạt động và hệ thống các chất chống
oxy hóa (CCOH) trong cơ thể

1.2.1. Sự hình thành các dạng oxy hoạt động
Trong chuỗi hô hấp tế bào oxy nhận điện tử và kết hợp với hydro tạo
thành nước. Quá trình oxy nhận điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào thực tế qua
nhiều giai đoạn và mỗi giai đoạn chỉ nhận một điện tử. Đầu tiên, oxy nhận
một điện tử từ phân tử cytochrom tạo thành gốc superoxyd (

7

). Gốc này


(

) bị enzym superoxyd dismutase (SOD) phân hủy tạo thành H2O2 theo

phản ứng:
2

+ 2H+

H2O2 + O2

(1)

SOD

Với hằng số tốc độ k1 = 109M/s.
H2O2 tạo ra nhanh chóng bị GSHPO và cơ chất là GSH chuyển thành
nước theo phản ứng:
H2O2 + 2 GSH

2H2O + GSSG

(2)

GSHPO

Với hằng số tốc độ k2 = 108M/s.
Bình thường do k1 và k2 rất lớn nên chủ yếu sản phẩm của quá trình hô
hấp là nước. Tuy nhiên trong cơ thể vẫn tồn tại một lượng rất nhỏ H2O2 và
. Đây là 2 chất có tính chất oxy hóa mạnh, do chuyển động nhiệt hoàn
toàn ngẫu nhiên mà chúng va đập phản ứng với nhau tạo ra 1O2 (oxy đơn bội)
và •OH (gốc hydroxyl). Đây là 2 tiểu phân có khả năng phản ứng rất cao.
Chúng tấn công vào các tổ chức của cơ thể tạo ra các gốc tự do mới như LO•
(alkoxyl), LOO• (peroxyl)…
Các gốc tự do của oxy và các dạng oxy có khả năng phản ứng cao như
vậy được gọi là các dạng oxy hoạt động hay các oxydant [1], [10], [12].
1.2.2. Hệ thống các chất chống oxy hóa (CCOH) trong cơ thể
Trong cơ thể có một hệ thống các chất trung hòa hoặc phân hủy các dạng
oxy hoạt động trên và được gọi là các CCOH hay các oxydant bao gồm: ([1],
[10], [12]).

8


- Enzym superoxyd dismutase (SOD)
Có 2 loại SOD:
 MnSOD có ở ty thể.
 CuZnSOD có ở bào tương.
Cả 2 loại này đều phân hủy đặc hiệu

theo phản ứng (1).

- GSH và GSHPO:
Cơ chất và enzym này phân hủy các peroxyd và H2O2 theo phản ứng:

LOOH + GSH

GSSG + LOH + H2O

(3)

GSHPO

LOOH: peroxyd.
- Vitamin E:
Đây là một vitamin tan trong mỡ, có khả năng nằm ở các tổ chức màng,
vừa có vai trò bẫy các gốc tự do thứ cấp như LO•, LOO•… vừa loại bỏ
1

O2 – một chất khơi mào cho quá trình POL. Do đó vitamin E là một

chất bảo vệ tốt màng tế bào, ngăn chặn sự tấn công của các gốc tự do.
- β-caroten, ubiquinon và các chất tương tự tồn tại ở dạng semiquinon
(gốc bền) và có tác dụng bẫy các gốc tự do.
- Các tác nhân phức hóa các kim loại chuyển tiếp như sắt và đồng. Bình
thường phản ứng của

với H2O2 tạo ra 1O2 và •OH xảy ra rất chậm

(phản ứng Harber – Weiss), nhưng khi có mặt các kim loại chuyển tiếp
ở trạng thái tự do (Fe2+, Cu+) thì phản ứng xảy ra rất nhanh (khi đó
được gọi là phản ứng Fenton). Sắt và đồng trong cơ thể luôn tồn tại
dưới dạng phức như Ferritin, Ceruloplasmin, Transferin…
 Transferin: Người khỏe mạnh chỉ cần 20 – 30 % lượng transferin
là đủ làm mất hoạt tính xúc tác của sắt. Khi có quá tải sắt, huyết

tương không đủ transferin và phản ứng Fenton xảy ra rất nhanh.
 Lactoferin: Làm mất hoạt tính xúc tác của sắt trong các dịch trên.

9


 Celuroplasmin: Là 1 protein chứa đồng. Nó có khả năng tạo
phức với đồng làm mất hoạt tính xúc tác phản ứng Fenton của
đồng, nó cũng oxy hóa Fe2+ thành Fe3+, ngăn cản sự tạo thành
các gốc oxy hoạt động từ phản ứng Fenton.
1.2.3. Sự liên quan giữa gốc tự do với một số quá trình bệnh lý
1.2.3.1. Gốc tự do với một số quá trình viêm
Khi tác nhân gây viêm (vi khuẩn, dị vật…) xâm nhập vào cơ thể thì các
tế bào ở đó bị kích thích tiết ra các yếu tố hóa ứng động, hấp dẫn bạch cầu
đến làm nhiệm vụ thực bào. Khi tiếp xúc với vi khuẩn hoặc các tác nhân lạ,
bạch cầu mọc ra các giả túc, bao lấy chúng. Khi màng bao quanh đã được
khép kín, ở bạch cầu có sự tăng đột ngột chuyển hóa oxy để sinh ra

, OH•,

H2O2… nhằm mục đích tiêu hủy các tác nhân này. Để bảo vệ mình, bạch cầu
cũng sản sinh ra rất nhiều các chất chống oxy hóa như SOD, GSH, catalase…
song vẫn có khoảng 10% bạch cầu chết, do chính các dạng oxy hoạt động mà
nó sinh ra. Khi bạch cầu bị ly giải, các gốc tự do của oxy thoát ra ngoài, tấn
công vào các tế bào xung quanh, gây tổn thương làm cho sự đáp ứng kích
thích của tế bào ở khu vực đó càng xảy ra mạnh hơn, những đáp ứng đó tương
ứng trên lâm sàng là các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau ( viêm) [10].
1.2.3.2. Gốc tự do với các bệnh tim mạch
Bệnh tim mạch thường là bệnh của người già. Bởi vì khi già thì các
DOXHĐ tăng, các CCOH giảm. Chính sự chuyển dịch cân bằng các DOXHĐ

với các CCOH này làm cho lượng các gốc tự do có nhiều khả năng oxy hóa
các hạt lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) [10].
Các hạt LDL bị oxy hóa không còn ở trạng thái tự nhiên, không còn vai
trò cung cấp cholesterol cho tế bào, trở thành chất lạ bị các đại thực bào hay
các bạch cầu thực bào. Khi nó trầm lắng xuống thành mạch, mỗi hạt LDL bị
10


oxy hóa, bị bạch cầu hay các đại thực bào ăn theo cơ chế sinh ra các gốc tự do
cứ lớn dần, phát triển thành đám tế bào bọt. Và từ đó các đám tế bào bọt phát
triển thành các mảng xơ vữa thành mạch. Thành mạch tích tụ nhiều tế bào
bọt, cứ phình to dần, làm hẹp dần lòng động mạch. Khi lòng động mạch bị thu
hẹp tới 70 – 80% so với bình thường là lúc máu lưu thông tới các tổ chức
không đủ nhu cầu. Đặc biệt ở động mạch vành, khi đó bắt đầu xuất hiện
những cơn co thắt ngực và tiếp theo sẽ dẫn tới nhồi máu cơ tim [10].
Hiện tượng các mảng xơ vữa bong ra, lang thang theo dòng máu và có
thể bít một mao mạch nào đó trên đường di chuyển, gây ra tắc mạch, dẫn đến
nhũn não và các tai biến mạch máu não [10].
Quá trình nhồi máu, nhũn não… đều do không được cung cấp đủ lượng
máu theo yêu cầu gây ra tình trạng thiếu máu cục bộ (TMCB). Người ta thấy
TMCB có thể do tắc mạch hay chèn ép thành mạch gây ra. Hiện tượng này có
thể nhất thời, cũng có thể khá lâu. Khi dòng máu lưu thông lại được đưa tới
thì gọi là tưới máu trở lại (TMTL) [10].
Người ta thấy rằng các gốc tự do của oxy tăng lên rất nhanh ngay trong
thời gian TMCB và đặc biệt tăng vọt lên ngay khi TMTL. Chính sự gia tăng
các gốc tự do khi TMCB và TMTL (hay xảy ra khi phẫu thuật, choáng,
sốc…) đã góp phần phá hủy thành mạch, cơ tim và các tổ chức của cơ thể,
làm cho các triệu chứng bệnh tim mạch thêm nặng nề [10].
1.2.3.3. Gốc tự do với quá trình ung thư
Ngày nay bản chất gốc tự do của các tác nhân ung thư đã dần sáng tỏ.

Mặc dù các tác nhân gây ung thư có bản chất hết sức khác nhau: có thể là các
tác nhân vật lý (tia phóng xạ, tia X…), có thể là do tác nhân hóa học (có hàng
nghìn chất hóa học có thể gây ung thư). Song nhìn chung tất cả các tác nhân

11


này khi xâm nhập vào cơ thể, bị chuyển hóa dẫn đến hậu quả làm cho các
DOXHĐ gia tăng [10].
Sự gia tăng của các gốc tự do, điển hình là gốc OH•, sẽ tạo ra điều kiện
cho các gốc này tấn công vào các ADN, gây ra những tổn thương về cấu trúc.
Những tổn thương này không được sửa chữa, di truyền lại tức là đột biến xuất
hiện làm cho tế bào bình thường phát triển dần thành bất thường. Các tế bào
bất thường phát triển mạnh thành u lành và cuối cùng thành u ác tính với các
biểu hiện ung thư lâm sàng [10].
1.2.4. Các phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa
Có một số phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa như sau:
- Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH.
- Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO.
- Phương pháp xác định hàm lượng MDA.
- Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II.
- Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym Xanthin oxydase.
Trong khóa luận này, tôi xin được trình bày phương pháp thử hoạt tính ức
chế gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol cây lá đắng vì phương pháp này có
một số ưu điểm sau:
- DPPH có thể được sử dụng trong các dung môi hữu cơ và dung dịch
nước không phân cực và có thể sử dụng để kiểm tra cả 2 chất chống
oxy hóa ưa nước và ưa mỡ.
- Có độ chính xác cao, dễ dàng thực hiện và giá trị kinh tế cao.
- DPPH được phép phản ứng với toàn bộ mẫu và đủ thời gian nhất định

trong phương pháp này.
1.3.

Tổng quan về cao đặc

12


1.3.1. Định nghĩa
Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất
quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay đông vật với các
dung môi thích hợp. Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy
khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp) [3].
Cao đặc: Là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại
trong cao không quá 20% [3].
1.3.2. Phương pháp điều chế cao
Quá trình điều chế cao thường có 2 giai đoạn [3]:
Giai đoạn 1: Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi với phương pháp
thích hợp: ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm kiệt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất
bằng thiết bị siêu âm.
Giai đoạn 2: Dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại không quá
20%. Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết
thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ
không quá 600C. Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm
thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt
độ không quá 800C.
1.3.3. Yêu cầu chất lượng với cao
Đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và đạt các yêu
cầu chung sau đây [3]:
- Mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô

tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử
dụng.

13


- Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác): không quá
20%.
- Hàm lượng cồn: đạt 90 – 110% lượng Ethanol ghi trên nhãn (áp dụng
cho cao lỏng và cao đặc).
- Kim loại nặng: đáp ứng yêu cầu quy định trong chuyên luận riêng.
- Dung môi tồn dư: nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước
hay hỗn hợp cồn – nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu
cầu quy định trong Phụ lục 10.14: Xác định dung môi tồn dư – DĐVN
IV.
- Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: đáp ứng yêu cầu quy định trong
Phụ lục 12.17: dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật – DĐVN IV.
- Giới hạn nhiễm khuẩn: đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 13.6:
thử giới hạn nhiễm khuẩn – DĐVN IV.

14


Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Lá cây lá đắng. Cây lá đắng đã được giám định bởi ThS. Nghiêm Đức

Trọng – Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội và tên khoa
học là Vernonia amygdalina Del., họ Cúc Asteraceae.
- Cao chiết ethanol 70% của lá cây lá đắng.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ dùng cho nghiên cứu
- Cân kỹ thuật Precisa.
- Tử sấy Memmert.
- Bình nón, bình định mức, pipet, cốc có mỏ, ống nghiệm và các dụng cụ
thủy tinh khác.
- Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Limonat 5 (Camag –
Switzeland): (hình 2.1)
 Thiết bị phun mẫu Limonat 5.
 Thiết bị chụp ảnh Camag.
 Phần mềm: WinCats, Videoscan.

(1)

(2)

Hình 2.1. Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Linomat 5
(1) Thiết bị phun mẫu Linomat 5.
(2) Thiết bị chụp ảnh Camag.

15


- Bản mỏng silicagel 60GF254 (Merck), cốc chạy sắc ký, bình phun thuốc
hiện màu.
- Máy đo quang UV HITACHI U-1800.
- Micropipet 10 – 100 µl, 100 – 1000 µl.
- Máy cất quay thu hồi dung môi Buchi Rotavapor R-200.

- Bếp cô cách thủy BATHS.
2.1.3. Hóa chất, thuốc thử
- Chất chuẩn luteolin, quercetin: Trung Quốc.
- DPPH: Nhật Bản.
- Dung môi: n-hexan, ethyl acetat, acid formic, ethanol, butanol,
methanol, acid acetic, aceton, nước cất… đạt tiêu chuẩn phân tích theo
tiêu chuẩn DĐVN IV.
- Thuốc thử trong phản ứng hóa học: thuốc thử Fehling A, Fehling B;
thuốc thử Buchardat, Dragendoff, Mayer; thuốc thử Lugol, Cianidin;
dung dịch NaOH, dung dịch FeCl3, acid Sulfuric, acid Clohydric…
- Thuốc thử hiện màu: amoniac.
2.2.

Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Điều chế cao chiết ethanol lá đắng
Nghiên cứu bào chế cao từ dược liệu lá đắng: chiết xuất bằng ethanol
70%.
2.2.2. Nghiên cứu/ khảo sát thành phần hóa học cao chiết ethanol lá đắng
Định tính, bán định lượng thành phần hóa học của cao.
2.2.3. Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao chiết ethanol lá đắng
- Tính chất.
- Độ ẩm.
- Định tính bằng phản ứng hóa học trong ống nghiệm.

16