Tối ưu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm aspergillus oryzae VTCC – f 0187

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
------------------------------------------

LÝ THỊ HUYỀN

TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA
CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
--------------------------------------------------

LÝ THỊ HUYỀN

TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA
CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trịnh Đình Khá

THÁI NGUYÊN - 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và nhóm
nghiên cứu. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và
chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong
luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể
đều được ghi nhận trong lời cám ơn.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những gì đã cam đoan ở trên.
Tác giả

Lý Thị Huyền


ii

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Đình Khá
giảng viên trường Đại học Khoa học, đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận
tình hướng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất
cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Công nghệ sinh
học trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều
kiện chu đáo cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp
đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết quả
như ngày hôm nay.

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quý báu đó !
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018
Học viên

Lý Thị Huyền


3

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤCDANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................... iii DANH
MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v DANH
MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... vi DANH
MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... vii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1.
Lý
do
chọn
đề
.....................................................................................................1

tài

2.
Mục
tiêu

của
..................................................................................................2

tài

đề

3.
Nội
dung
nghiên
...............................................................................................2

cứu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3
1.1.
................................................................................................................3
1.1.1.
Khái
..........................................................................................................3
1.1.2.
Phân
loại
.............................................................................................4

Protease
niệm
protease

1.1.3.
Cơ
chế
xúc
...................................................................................................8
1.1.4.
Nguồn
thu
...........................................................................................9

tác
protease

1.1.5.
dụng.........................................................................................................11
1.2.
Sinh
tổng
hợp
.......................................................................................14
1.2.1.
Chủng
....................................................................................................14

Ứng
protease
giống

1.2.2.
Môi

trường
cấy........................................................................................14

nuôi

1.2.3.
Các
phương
cấy..............................................................................14

nuôi

pháp


4

1.2.4.
Thu
nhận
...........................................................................................15

protease

1.2.5. Các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp protease của A.
oryzae ...............................................................................................................1
7
1.3.
Sản
xuất

protease
............................................................19

từ

Aspergillus

1.3.1.
Aspergillus
...........................................................................................19
1.3.2.
Sản
xuất
chế
............................................................................20

phẩm

oryzae
oryzae
protease

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............24
2.1.
Nguyên
liệu
.....................................................................................24

nghiên

cứu


5

2.1.1. Chủng giống ....................................................................................................24
2.1.2. Môi trường nuôi cấy........................................................................................24
2.1.3. Hóa chất ..........................................................................................................24
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................................25
2.1.5. Dung dịch và đệm ...........................................................................................25
2.2. Địa điểm và thời gian .........................................................................................26
2.3. Phương pháp nghiên
cứu....................................................................................26
2.3.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp protease
.....................................................................26
2.3.2. Xác định hoạt độ protease
...............................................................................26
2.3.3. Tối ưu một số yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng
hợp
protease......................................................................................................29
2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
protease .............................................................................................................
30
2.3.5. Xử lý số liệu ....................................................................................................31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................32
3.1. Khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 .............32
3.2. Tối ưu các điều kiện sinh tổng hợp protease......................................................33
3.2.1. Tối ưu tỉ lệ bột lõi ngô và bột đậu tương ........................................................33
3.2.2. Tối ưu tỉ lệ cám gạo bổ sung ...........................................................................34
3.2.3. Tối ưu độ ẩm ...................................................................................................35

3.2.4. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy .................................................................................36
3.2.5. Tối ưu pH nuôi cấy .........................................................................................37
3.2.6. Tối ưu thời gian lên men .................................................................................39
3.3. Sản xuất chế phẩm .............................................................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................44
PHỤ LỤC .................................................................................................................48


6

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu
..............................................4
Bảng 2.1. Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm ...........................................24
Bảng 2.2. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ...................................................25
Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm được sử dụng trong thí nghiệm ...........25
Bảng 2.4. Nồng độ pha loãng Tyrosine ....................................................................27
Bảng 2.5. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương và bột lõi ngô...................................29
Bảng 2.6. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương, bột lõi ngô và bột cám gạo .............30


7

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2. Sơ đồ phân loại protease ............................................................................5
Hình 1.3. Mô hình phân tử enzyme protease (papain)
...............................................6

Hình 1.4. Mô hình phân tử enzyme protease (renin)
.................................................7
Hình 2.1. Đường chuẩn Tyrosine ..............................................................................28
Hình 3.1. Hoạt tính phân giải casein của dịch chiết enzyme ngoại bào từ cơ chất
lên men xốp chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ..........................................32
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất bột đậu tương/lõi ngô đến khả năng sinh
tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187..........................33
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cám gạo đến khả năng sinh tổng hợp protease
của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ........................................................35
Hình 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm tới khả năng sinh tổng hợp protease của chủng
A. oryzae VTCC-F-0187..........................................................................36
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của
chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ...............................................................37
Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng sinh tổng hợp protease của
chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ...............................................................38
Hình 3.7. Khả năng sinh protease theo thời gian của chủng A. oryzae VTCC-F0187 .........................................................................................................39
Hình 3.8 Lên men chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sản xuất chế phẩm protease .....41
Hình 3.9. Khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
trong điều kiện tối ưu sau các lần lên men
..............................................42


vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên đầy đủ

BĐT

Bột đậu tương

LN

Lõi ngô

CG

Cám gạo

TCA

Tricloacetic acid

OD

Optical density (Độ hấp thụ ánh sáng)

Hdp

Hoạt độ protease

hspl

Hệ số pha loãng

HT

Hoạt tính

HTtb

Hoạt tính trung bình

SS

Sai số


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Enzyme là chất xúc tác sinh học được tổng hợp trong các tế bào sống
của cơ thể sinh vật. Enzyme tham gia các phản ứng sinh hóa trong cơ thể làm
tăng tốc độ của phản ứng nhưng không bị thay đổi sau phản ứng. Enzyme
không chỉ có ý nghĩa với quá trình sinh trưởng, sinh sản của sinh vật mà
enzyme còn có vai trò rất quan trọng với con người trong công nghệ chế biến
thực phẩm, trong y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Nhiều
quốc gia đã sử dụng phổ biến enzyme trong sản xuất và đời sống mang lại lợi
nhuận kinh tế lớn cho con người [2].
Protease là nhóm enzyme có khả năng thủy phân liên kết peptide được
úng dụng nhiều trong công nghiệp, nông nghiệp và công nghệ sinh học [31].
Protease có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dược phẩm, y tế,
thực phẩm và công nghệ sinh học, chiếm gần 60% thị trường enzyme [27],
trong đó protease từ vi sinh vật ước tính chiếm khoảng 40% tổng lượng
enzyme bán ra trên toàn thế giới [28].
Aspergillus oryzae là một loại nấm sợi được liệt kê như là một sinh vật
"thường được công nhận là an toàn (GRAS)" của Cục quản lý thực phẩm và

dược phẩm Hoa Kỳ. A. oryzae có một lịch sử sử dụng lâu dài trong ngành
công nghiệp thực phẩm trong sản xuất thực phẩm lên men truyền thống, do
hoạt tính phân giải protein cao [16, 24]. A. oryzae có khả năng sinh tổng hợp
nhiều loại enzyme ngoại bào như amylase, protease, pectinase, lipase,
xylanase, cellulase, catalase, phytase, glucose oxidase [23].
Sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện
đáng kể hiệu quả sản xuất, chế phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên, giá
thành chế phẩm protease còn khá cao do nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng
nhiều. Để phát triển các dây truyền sản xuất protease đạt hiệu quả cao, có
nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành để chọn lọc chủng giống, tìm
kiếm cơ chất mới


2

thích hợp cho sinh tổng hợp protease. Bên cạnh đó thì việc tối ưu các điều
kiện môi trường (nhiệt độ, độ pH, oxy hòa tan, thành phần môi trường) cũng
được các nhà nghiên cứu rất quan tâm, mục đích tm ra điều kiện nuôi cấy
phù hợp nhất để thu được lượng protease nhiều và hạ giá thành sản phẩm.
Để có thể chủ động sản xuất enzyme protease bằng các nguồn nguyên liệu
sẵn có trong nước, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tối ưu một số
điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của
chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC – F - 0187”
2. Mục tiêu của đề tài
Tạo quy trình sản xuất protease ngoại bào của chủng A. oryzae VTCC F - 0187 từ nguyên liệu rẻ và sẵn có trong nước.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát khả năng sinh protease của chủng A. oryzae VTCC - F – 0187
sau thời gian bảo quản chủng giống.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường và điều
kiện lên men đến khả sinh tổng hợp protease của A. oryzae VTCC - F - 0187.

- Thử nghiệm lên men sản xuất chế phẩm protease thô.


3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Protease
1.1.1. Khái niệm
Protease (peptide – hidrolase 3.4) là nhóm enzyme xúc tác quá trình
thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n, polypeptide trong phân tử
protein đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Ngoài ra, nhiều protease
cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển amino acid [1].

Hình 1.1. Sơ đồ enzyme protease thủy phân phân tử Protein [7]
Protease hay các enzyme proteolytic xúc tác các phản ứng thuỷ phân
protein và peptide. Protease có trong nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và trong
các hạt ngũ cốc nảy mầm. Protease có 2 loại: proteinase và peptidase.
Proteinase thuỷ phân protein thành các peptide và amino acid, peptidase
thuỷ phân các peptide thành amino acid. Sự phân chia protease thành hai
loại enzyme ở đây là điều ước lệ vì protease cũng thuỷ phân peptide [6].
Protease được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật
(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (có trong
gan, dạ dày...). Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu.
Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều
loại chế phẩm. Quá trình này có thể được thực hiện nhờ các protease vi sinh
vật được đưa vào trong quá trình lên men thu protease để sản xuất chế
phẩm [7].


4

1.1.2. Phân loại protease
Theo ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử,
protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống
phân loại các nhóm enzyme; Tuy nhiên, việc định tên cho các protease không
dễ dàng tuân theo cách định tên phổ biến của hệ thống enzyme bởi sự đa
dạng về cấu trúc và khả năng hoạt động.
1.1.2.1. Phân loại dựa vào pH hoạt động tối ưu
Trước đây, protease được phân loại một cách đơn giản dựa vào pH
hoạt động tối ưu thành ba nhóm: Protease acid, protease trung tính và
protease kiềm [1].
Bảng 1.1. Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu
Protease
Protease acid

Đặc điểm
Hoạt động ở pH 2-6, gồm phần lớn là aspartic
protease, một số cysteine protease và metalloprotease

Protease

trung Hoạt động ở pH 7-8, gồm cysteine protease,

tính

metalloprotease và một số serine protease

Protease kiềm

Hoạt động ở pH 8-13, chủ yếu là serine protease

1.1.2.2. Phân loại dựa vào các tiêu chí cơ bản
Phân loại dựa trên ba tiêu chí cơ bản: loại phản ứng xúc tác, bản chất hóa
học của trung tâm xúc tác và mối quan hệ giữa sự tiến hóa có liên quan đến
cấu trúc, protease được chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase
[1].


5

Hình 1.2. Sơ đồ phân loại protease [7]
* Exopeptidase
Phân loại dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide
exopeptidase
được phân chia thành hai loại:
Aminopeptdase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide;
Carboxypeptdase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Endopeptdase
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase được chia thành
bốn
nhóm:
Serin proteinase: Là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt
động


xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và

subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtlisin bao gồm hai loại enzyme vi
khuẩn như Subtlisin Carlsberg, Subtlisin BPN. Các serine proteinase
thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.
Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các protease thực vật như papain,
bromelin, một vài protein động vật và protease ký sinh trùng. Các cystein
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ
chất rộng.

Hình 1.3. Mô hình phân tử protease (papain) [11]
Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin,
cathepsin, rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong
trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.


Hình 1.4. Mô hình phân tử protease (renin) [17]
Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tm
thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo
proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới
tác dụng của EDTA.
Trong bốn nhóm protease kể trên, các cysteine proteinase và
protease- tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các
dẫn suất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid
thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn suất của
amino acid. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu
tương đối kỹ về câu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này

tương đổi bé , nhất là các cysteine proteinase. Các cysteine proteinase có
trọng lượng phân tử vào khoảng 20.000- 27.000 dalton. Tuy nhiên, cũng có
một số cysteine proteinase có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme
của Penicillium cyoneo’fulvum (44.000), A. oryzae OUT 5038 (52.000)
(Martin 1962, Morihara và Tsuzuki 1969). Trọng lượng phân tử của các
protease kim loại lớn hơn so với cysteine proteinase (khoảng 33.800 48.400). Protease tiol và nhiều protease-acid cũng có trọng lượng phân tử
vào khoảng 30.000 - 40.000 [8].


1.1.3. Cơ chế xúc tác
Một chất xúc tác dù là hóa học hay sinh học đều có tác dụng làm tăng
vận tốc của phản ứng. Vận tốc của phản ứng enzyme là lượng cơ chất bị
chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm được tạo thành trong một đơn vị thời
gian. Thông thường, lượng cơ chất hoặc lượng sản phẩm được biểu diễn
bằng nồng độ phân tử (M) và đơn vị thời gian là giây [8].
Sự xúc tác của enzyme thường được thực hiện bằng cách tạo ra ít nhất
một phức hợp tạm thời giữa enzyme và cơ chất. Mô hình đơn giản nhất là
mô hình của Michaelis. Mô hình này thừa nhận rằng phản ứng chỉ xảy ra với
một cơ chất và tạo thành chỉ một sản phẩm [8]:
E + S → ES → P + E
Trong đó: E là Enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme
- cơ chất, P là sản phẩm (Product)
* Giai đoạn đầu: phức hợp enzyme cơ chất dược tạo thành một cách nhanh
chóng và thuận nghịch nhờ các tương tác phi đồng hóa trị giữa cơ chất và
các amino acid nhận biết của tâm hoạt động của enzyme [8].
E (enzyme) + S (cơ chất)→ ES (hợp chất trung gian)
* Giai đoạn 2 (giai đoạn xúc tác ): gồm một chuỗi các phản ứng trung gian
nhằm biến đổi phức ES thành trạng thái quá độ trong đó cơ chất được liên
kết với các gốc amino acid xúc tác của tâm hoạt động enzyme (thường bằng
liên kết đồng hóa trị). Rồi trạng thái quá độ này sẽ tự chuyển hóa thành phức

enzyme
- sản phẩm và cuối cùng phức enzyme - sản phẩm sẽ phân ly thành enzyme
tự do và sản phẩm [8].
Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc
tác sinh học của enzyme người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng
đều thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzyme
và cơ chất thành hợp chất trung gian [2].
E (enzyme) + S (cơ chất)→ ES (hợp chất trung gian)


1.1.4. Nguồn thu protease
1.1.4.1. Protease động vật
Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa
nhiều enzyme nhất.
Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc
nhóm protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến
trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi casein thành paracasein có
khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình
đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất.
Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepsin (trong trường hợp thu
chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả
năng tiết ra pepsin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nghiên
cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài
Eudothia parasitca và Mucor purillus [1].
1.1.4.2. Protease thực vật
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu
được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ
quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để
chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết
tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công

nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá. Ficin thu được từ nhựa cây
sung (Ficus carica). Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên [1].
1.1.4.3. Protease vi sinh vật
Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…
gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium,
Streptomyces và một số và một số loại nấm men.


* Vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào
khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại
endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai
loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có
khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là
Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống
thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease
mạnh nhất.
Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở
vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt
động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease
trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm.
Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B.
thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng
phân tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong
khoảng pH rộng 7-12 [1].
* Nấm: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn
protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng:
Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium

chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại
protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các
protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3 [1].
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti...


cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong
sản xuất pho mát.
* Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên
cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một
số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.
fradiae, S. Trerimosus...
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là protease
được tách chiết từ S. grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả
năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino
acid. Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân
karetin. Protease từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao nên còn được
dùng trong công nghiệp chế biến thịt.
Như vậy, vi sinh vật được coi là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để
sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng
nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau: Chủ động về nguyên liệu
nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật; Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật
ngắn: 16-100 giờ nên có thể thu hoặc nhiều lần quanh năm; Có thể điều
khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng
và tăng hiệu suất tổng thu hồi); Giá thành tương đối thấp vì môi trường
tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức sản xuất. Tuy nhiên trong mọi trường hợp
cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng
ngừa, xử lý thích hợp [1].
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi
sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng

có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó
[1].


1.1.5. Ứng dụng
Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như
công


thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp…
1.1.5.1. Trong công nghiệp chế biến thịt
Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein
trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn.
Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được
chế phẩm keratinase thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch
đạm từ da, lông vũ. Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các
amino acid chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá
(chuyển dạng L sang D làm giảm giá trị sinh học của amino acid). Để thuỷ
phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm
y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy
người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 đối tượng: vi khuẩn,
nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1-2% khối lượng protein cần thuỷ
phân. Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được
vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu
dịch thuỷ phân [25].
1.1.5.2. Trong chế biến thuỷ sản
Khi sản xuất nước mắm (và một số loại mắm) thời gian chế biến
thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa
phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Hiện nay quy trình sản xuất
nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm

enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian
làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại
cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ [25].
1.1.5.3. Trong công nghiệp sữa
Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông
tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P.
roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất phomat. Trong công


nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng
độ dẻo và làm


nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn [25].
1.1.5.4. Trong sản xuất bia
Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền
của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy
phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự
thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính
làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da
có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi
thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân
lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách
từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtlis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và
xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã
đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng [25].
1.1.5.5. Trong công nghiệp dệt
Protease từ vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân
tạo (các sợi nhân tạo được tạo ra bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi

được được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein
serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ
tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng.
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành
khác như: Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất
tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng; Protease của nấm
mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm
thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và
gia cầm; Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine,