THỬ NGHIỆM VACCINE NGÂM VÀ CHO ĂN PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA BỘT (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM VACCINE NGÂM VÀ CHO ĂN PHÒNG BỆNH
GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA BỘT
(PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS)

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHẠM HOÀNG HUY
Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Chuyên ngành: NGƯ Y
Niên khóa: 2006 – 2010

Tháng 08/2010


THỬ NGHIỆM VACCINE NGÂM VÀ CHO ĂN PHÒNG BỆNH
GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA BỘT
Pangasianodon hypophthalmus

Tác giả

NGUYỄN PHẠM HOÀNG HUY

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư
ngành Nuôi Trồng Thủy Sản chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn:
TS. NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 08 năm 2010


CẢM TẠ
Chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Nhà Trường, Khoa Thủy Sản và Thầy
Cô đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi để hoàn thành đề tài này
Đặc biệt, chúng tôi xin cảm ơn Thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã tận tình hướng dẫn và
dìu dắt tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Chúng tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy
Trần Hữu Lộc và anh Đỗ Viết Phương đã tạo điều kiện và chia sẻ nhiều kinh nghiệm
quý báu cho tôi để hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn các thầy, các anh ở Trại thực nghiệm thủy sản và các bạn lớp DH06NY đã
tận tình hỗ trợ chúng tôi trong thời gian qua.
Dù đã cố gắng nhưng do hạn chế về kiến thức và thời gian nên luận văn không
tránh khỏi sai sót. Tôi mong Thầy Cô và các bạn thông cảm và đóng góp ý kiến để
luận văn được hoàn chỉnh hơn.
Chân thành cảm ơn!

ii


TÓM TẮT
Đề tài : “ Thử nghiệm vaccine ngâm và cho ăn phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra
bột (Pangasianodon hypophthalmus) ” được tiến hành trên cá tra bột, sử dụng vaccine
dạng ngâm và cho ăn. Bao gồm các nội dung sau:
Thí nghiệm 1(TN1): Xác định tỷ lệ sống của cá bột khi ngâm vaccine 4 giờ và sau
khi ngâm 24 giờ. Sử dụng vaccine cho ăn đối với cá bột sau 1 tháng thì kiểm tra tỷ lệ
sống của cá và gây bệnh xem khả năng bảo hộ của vaccine.
Thí nghiệm 2 (TN2): Cá được tiếp tục nuôi thêm 2 tháng. Trong thời gian đó cấp
vaccine cho ăn 7 ngày và ngưng cấp vaccine trong 15 ngày rồi tiến hành gây bệnh.
Xem xét khả năng bảo hộ của vaccine.

Sau thời gian thực hiện đề tài chúng tôi thu được kết quả sau:
Việc sử dụng vaccine ngâm cho cá bột với các nồng độ pha loãng 1/25, 1/50,
1/100, 1/150, 1/200 sau 4 giờ và 24 giờ không gây hại và làm chết cá. Vaccine an toàn
và tỉ lệ sống của cá cao.
Đối với cá tra cỡ từ 2g đến trên 10g sử dụng vaccine cho ăn liên tục hoàn toàn an
toàn tuyệt đối với cá.
Chúng tôi nhận thấy việc sử dụng kết hợp vaccine ngâm và cho ăn hoàn toàn an
toàn và không ảnh hưởng đến việc sinh trưởng và phát triển của cá.
Sử dụng kết hợp 2 dạng vaccine ngâm và cho ăn không cho hiệu quả bảo hộ đối
với cá bột.

iii


MỤC LỤC
Trang tựa................................................................................................................. i
Cảm tạ.................................................................................................................... ii
Tóm tắt.................................................................................................................. iii
Mục lục ................................................................................................................. iv
Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................... vii
Danh sách các bảng và sơ đồ..............................................................................viii
Danh sách các đồ thị............................................................................................. ix
Danh sách các hình ................................................................................................ x
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề........................................................................................................ 1
1.2 Mục tiêu đề tài ................................................................................................. 1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
2.1 Bệnh gan thận mủ trên cá tra........................................................................... 3
2.1.1 Đặc điểm phân loại của Edwarsiella ictaluri ............................................... 3
2.1.2 Đặc điểm gây bệnh ....................................................................................... 3

2.1.3 Dịch tễ của bệnh ........................................................................................... 3
2.1.4 Triệu chứng bệnh tích................................................................................... 4
2.1.5 Phương pháp chẩn đoán bệnh....................................................................... 4
2.1.6 Phương pháp phòng và trị bệnh.................................................................... 5
2.2 Vaccine trong nuôi trồng thủy sản................................................................... 5
2.2.1 Định nghĩa về vaccine .................................................................................. 5
2.2.2 Lịch sử nghiên cứu vaccine trong thủy sản .................................................. 5
2.3.3 Phân loại vaccine .......................................................................................... 6
2.3.3.1 Vaccine bất hoạt ........................................................................................ 6
2.3.3.2 Vaccine hỗn hợp ........................................................................................ 6
2.3.3.3 Vaccine sống.............................................................................................. 6
2.3.3.4 Vaccine tiểu phần ...................................................................................... 6
2.3.3.5 DNA vaccine ............................................................................................. 7
2.3.4 Phương pháp cấp vaccine ............................................................................. 7
2.3.4.1 Phương pháp tiêm...................................................................................... 7
iv


2.3.4.2 Phương pháp ngâm .................................................................................... 7
2.3.4.3 Phương pháp tắm....................................................................................... 8
2.3.4.4 Phương pháp cho ăn .................................................................................. 8
2.3.4.5 Phương pháp bơm cao áp .......................................................................... 8
2.3.4.6 Phương pháp bơm vào đường ruột ............................................................ 8
2.3.5 Vai trò của vaccine trong thủy sản ............................................................... 8
2.3.6 Các nguyên tắc sử dụng vaccine .................................................................. 9
2.3.7 Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vaccine ......................................................... 9
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 11
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 11
3.2 Vật liệu, trang thiết bị và hóa chất................................................................. 11
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 11

3.2.2 Chế phẩm vaccine....................................................................................... 11
3.2.3 Vi khuẩn thí nghiệm ................................................................................... 11
3.2.4 Hệ thống bể thí nghiệm .............................................................................. 11
3.2.5 Dụng cụ....................................................................................................... 12
3.2.6 Hóa chất và môi trường .............................................................................. 12
3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 12
3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................... 12
3.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi ................................................................................... 13
3.3.3 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn............................................... 14
3.3.4 Phương pháp làm phản ứng vi ngưng kết kháng thể .................................. 14
3.3.5 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn sống ............................... 15
3.3.6 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm ........................................................ 15
3.3.7 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm .............................................. 15
3.3.8 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn từ cá bệnh ......................................... 15
3.3.9 Phương pháp làm thuần vi khuẩn ............................................................... 16
3.3.10 Phương pháp định danh vi khuẩn ............................................................. 16
3.3.11 Phương pháp xử lí số liệu......................................................................... 16
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................... 17
4.1 Các chỉ tiêu chất lượng nước trong quá trình thí nghiệm.............................. 17
v


4.2 Tỷ lệ sống của cá trong quá trình cấp vaccine............................................... 17
4.2.1 Sau 4 giờ cấp vaccine ................................................................................. 17
4.2.2 Sau 24 giờ cấp vaccine ............................................................................... 18
4.2.3 Sau một tháng thí nghiệm........................................................................... 19
4.3 Kết quả gây nhiễm lần 1 ................................................................................ 20
4.3.1 Kết quả kiểm tra sức khỏe cá nuôi trước khi thí nghiệm ........................... 20
4.3.2 Trọng lượng trung bình cá gây nhiễm lần 1 ............................................... 21
4.3.3 Mật độ vi khuẩn có trong bình tăng sinh gốc và lượng vi khuẩn sống trong dung

dich gây nhiễm cho cá ......................................................................................... 22
4.3.4 Kết quả cấy phân lập và định danh vi khuẩn.............................................. 22
4.3.5 Triệu chứng và bệnh tích ............................................................................ 23
4.3.6 Tỷ lệ chết của các nghiệm thức .................................................................. 25
4.3.7 Kết quả kiểm tra cá còn sống sau khi gây nhiễm lần 1 .............................. 26
4.3.8 Hiệu quả bảo hộ của các nghiệm thức........................................................ 27
4.4 Kết quả quá trình gây nhiễm lần 2................................................................. 28
4.4.1 Kết quả kiểm tra sức khỏe cá nuôi trước khi thí nghiệm ........................... 28
4.4.2 Trọng lượng trung bình của cá khi gây nhiễm lần 2 .................................. 28
4.4.3 Mật độ vi khuẩn có trong bình tăng sinh gốc và lượng vi khuẩn sống trong dung
dịch gây nhiễm cho cá ......................................................................................... 29
4.4.4 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn .................................................... 29
4.4.5 Tỷ lệ chết của cá nghiệm thức .................................................................... 29
4.4.6 Tỷ lệ chết của cá còn sống sau khi gây nhiễm lần 2 .................................. 30
4.4.7 Hiệu quả bảo hộ miễn dịch của các nghiệm thức....................................... 31
4.4.8 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể ...................................................... 33
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 35
5.1 Kết luận.......................................................................................................... 35
5.2 Đề nghị .......................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 36
PHỤ LỤC ........................................................................................................... 38

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BHIA:

Brain Heart Infusion Agar

BHIB:

Brain Heart Infusion Broth

CĐCN:

Cường độ cảm nhiễm

DO:

Dissolved Oxygen

NB:

Nutrient Broth

PCA:

Plate Count Agar

TLCN:

Tỷ lệ cảm nhiễm

TSA:

Tryptic Soy Agar

RPS:

Relative Percent Survival

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 3.1: Sơ đồ thứ tự các giếng........................................................................ 16
Bảng 4.1: Các chỉ tiêu môi trường trong quá trình thí nghiệm........................... 17
Bảng 4.2: Bảng số liệu ước lượng tỷ lệ cá chết sau 4 giờ ngâm vaccine ........... 18
Bảng 4.3: Bảng số liệu ước lượng tỷ lệ cá chết sau 24 giờ ngâm vaccine ......... 19
Bảng 4.4: Bảng số liệu cá còn lại sau 1 tháng cấp vaccine dạng cho ăn ............ 19
Bảng 4.5: Trọng lượng của cá sau khi ương 1 tháng .......................................... 21
Bảng 4.6: Kết quả các phản ứng sinh hóa của E. ictaluri .................................. 22
Bảng 4.7: Bảng số liệu tỷ lệ cá chết khi gây nhiễm lần 1................................... 23
Bảng 4.8: Tỷ lệ cá còn sống vào ngày thứ 14 có sự tạo thành khuẩn lạc trên đĩa cấy
............................................................................................................................. 25
Bảng 4.9: Khả năng bảo hộ miễn dịch của các nghiệm thức khi gây nhiễm lần 1
............................................................................................................................. 26
Bảng 4.10: Hiệu giá kháng thể trung bình của các nghiệm thức khi gây nhiễm lần 1
............................................................................................................................. 27
Bảng 4.11: Trọng lượng trung bình của cá khi gây nhiễm lần 2 ........................ 28
Bảng 4.12: Tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức khi gây nhiễm lần 2 ..... 30
Bảng 4.13: Kết quả phân lập cá còn sống vào ngày thứ 14 có sự tạo thành khuẩn lạc
trên đĩa cấy........................................................................................................... 31
Bảng 4.14: Khả năng bảo hộ miễn dịch trung bình của các nghiệm thức khi gây nhiễm
lần 2 ..................................................................................................................... 32
Bảng 4.15: Hiệu giá kháng thể của các nghiệm thức khi gây nhiễm lần 2......... 33

viii

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1: Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình ở các nghiệm thức trong 14 ngày của thí
nghiệm 1 .............................................................................................................. 25
Biểu đồ 4.2: Hiệu quả bảo hộ miễn dịch của các nghiệm thức khi gây nhiễm lần 1
............................................................................................................................. 27
Đồ thị 4.3: Tỷ lệ cá chết tích lũy ở các nghiệm khi gây nhiễm lần 2 ................. 30
Biểu đồ 4.4: Hiệu quả bảo hộ miễn dịch của các nghiệm thức khi gây nhiễm lần 2
............................................................................................................................. 32

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 3.3: Hệ thống bể bố trí nuôi cá thí nghiệm ................................................ 13
Hình 4.2: Kiểm tra số lượng cá bột chết bằng cách rút 2 lít nước đáy............... 19
Hình 4.3: Trộn vaccine vào thức ăn cho cá ........................................................ 21
Hình 4.7: : Kết quả định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng bộ test Nam Khoa

............................................................................................................................. 23

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cá tra được nuôi thâm canh nhiều ở Đồng Bằng Sông Cửu Long có sản lượng lớn
với kim ngạch xuất khẩu cao. Trong 4 tháng đầu năm 2010 xuất khẩu cá tra cả nước
đạt 424 triệu đô la Mỹ chiếm 33,4% so với tổng giá giá kim ngạch xuất khẩu thủy sản.

Tuy nhiên, việc phát triển nghề nuôi cá tra nhanh và việc nuôi thâm canh đã xuất
hiện nhiều khó khăn như con giống kém chất lượng, môi trường ngày càng suy thoái
dẫn đến dịch bệnh liên tiếp xảy ra, cá thương phẩm không đạt chất lượng. Môi trường
ô nhiễm và dịch bệnh làm giảm tỉ lệ sống trung bình của cá nuôi. Bệnh gan thận mủ do
vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là bệnh gây thiệt hại nhất trong các ao nuôi cá tra. Bệnh
này xuất hiện vào năm 1998 ở một số vùng nuôi cá tra như An Giang, Đồng Tháp và
Cần Thơ, sau đó lan rộng ra hầu hết các tỉnh và bệnh xuất hiện hầu hết ở các giai đoạn
của cá. Trong một vụ nuôi, bệnh có thể xuất hiện nhiều lần, đặc biệt là ở giai đoạn cá
giống gây thiệt hại rất lớn, tỷ lệ hao hụt lên đến 90% nếu không được chữa trị kịp thời
(Từ Thanh Dung và ctv, 2003; Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2002). Các trại nuôi cá tra đã
sử dụng nhiều loại hóa chất, chế phẩm sinh học và kháng sinh khác nhau để cải thiện
môi trường và phòng trị bệnh. Tuy nhiên hiệu quả phòng và điều trị bệnh này còn rất
thấp.
Hiện nay vaccine phòng bệnh cho cá tra còn đang được nghiên cứu và chưa đưa
ra áp dụng rộng rãi. Nhiều yêu cầu được đặt ra cho việc nghiên cứu vaccine là khả
năng phòng bệnh, hiệu quả, thời gian phòng bệnh, tác dụng phụ và tính an tòan có ảnh
hưởng đối với cá. Được sự phân công và hỗ trợ của ban chủ nhiêm khoa, chúng tôi đã
thực hiện đề tài: “Thử nghiệm vaccine ngâm và cho ăn phòng bệnh gan thận mủ trên
cá tra bột ”.
1.2 Mục tiêu đề tài

1


Xác định tính an tòan của vaccine ngâm phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra
bột.
Xác định khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine đối với cá tra.

2

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Bệnh gan thận mủ trên cá tra
2.1.1 Đặc điểm phân loại của Edwardsiella ictaluri
Ngành: Proteobacterri
Lớp: Gammaproteobacterria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Edwardsiella
Loài: Edwardsiella ictaluri
Vi khuẩn gram âm, hình que mảnh, kích thước 1 x 2-3 μm, không sinh bào tử,
chuyển động nhờ vành tiêm mao, yếm khí tùy nghi, catalase dương, cytocrom oxidase
âm, oxy hóa âm và lên men trong môi trường O/F glucose.
Vi khuẩn phát triển chậm trên môi trường nuôi cấy, cần mất 36 – 48 giờ để hình
thành khuẩn lạc nhỏ li ti trên thạch BHIA tại 28 – 30OC ( Valerie và ctv, 1994). Khi
môi trường nuôi cấy có sự hiện diện có sự hiện diện của một loài vi khuẩn phát triển
nhanh hơn Edwardsiella ictaluri

thì khi đó chúng sẽ ức chế hoặc làm cho

Edwardsiella ictalurii phát triển rất chậm (Shotts và Walman, 1990).
2.1.2 Đặc điểm gây bệnh
Vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh bắt buộc, chỉ tồn tại trong nước trong
một thời gian ngắn khoảng 8 ngày (Hawke,1979). Tuy nhiên, chúng có thể tồn tại
trong bùn đến 95 ngày ở 25OC (Plumb và Quinlan, 1986).
Vi khuẩn có khả năng tồn tại trong gan, thận, não vài tháng sau khi cá khỏi
bệnh nên có thể là nguồn lây lan mầm bệnh. Vi khuẩn trong nước có thể qua đường
mũi của cá xâm nhập vào các cơ quan khứu giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu
giác, sau đó vào não (Miyazaki và Plumb, 1985; Shotts và ctv, 1986) và có thể theo

thức ăn vào bên trong cơ thể cá qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu
(Shotts và ctv, 1886).
2.1.3 Dịch tễ của bệnh

3


Tại Việt Nam vào năm 1999 bệnh được phát hiện. Bệnh xảy ra chủ yếu trên cá
tra nuôi công nghiệp cả hình thức nuôi bè và nuôi ao. Bệnh có tính chất lây lan rộng,
điều trị không hiệu quả.
Năm 2001, có thông tin về bệnh cá tra xảy ra trên Đồng Bằng Sông Cửu Long
mô tả dấu hiệu chung như: cá gầy yếu, hầu hết bụng sưng to và bị xuất huyết ở vây
đuôi và một số điểm trên cơ thể. Bên trong quan sát thấy có nhiều đốm trắng hoại tử
đường kính khoảng 1 – 3 mm phía trên bề mặt và dọc suốt phần nhu mô gan, thận và
lách. Mang tái nhợt chứa nhiều chất nhày.
Bệnh xảy ra từ giai đoạn cá hương đến giai đoạn cá thịt và giảm dần sau giai
đoạn 5 tháng tuổi. Bệnh có thể lây lan trong ao qua nguồn nước, chất thải và cá bệnh
hoặc chết. Ngoài ra bệnh có thể lây lan qua các dụng cụ dùng chung hoặc các động vật
khác như chim, cò.
Bệnh phát triển mạnh ở nhiệt độ nước 20 – 28OC. Nhiệt độ >30OC tỉ lệ cá chết
giảm dần và cá có thể tự khỏi bệnh.
2.1.4 Triệu chứng bệnh tích
Dấu hiệu biểu hiện bên ngoài không rõ ràng, thường có dấu hiệu phổ biến như:
Bỏ ăn, bơi lờ đờ, xuất huyết quanh các tia vây và hậu môn, lồi mắt,… Những dấu hiệu
này tương tự như dấu hiệu bệnh do nhóm vi khuẩn khuaån Aeromonas spp và
Pseudomonas sp. Trong vài trường hợp cá chết nhưng bên ngoài không có dấu hiệu gì.
Điểm đặc biệt và dấu hiệu đặc trưng là những dấu hiệu trên nội tạng.
Giải phẩu mẫu bệnh học nhận thấy trên cơ quan nội tạng có những đốm màu
trắng giống như viêm có mủ. Đường kính đốm trắng từ 1 – 3 mm. Tùy theo mức độ
nhiễm mà chúng nằm rải rác hay dày đặc trên nội tạng.

Những đốm trắng này xuất hiện nhiều ở gan và thận. Khi cá bị bệnh nặng,
những cơ quan này bị hủy hoại hoàn toàn.
2.1.5 Phương pháp chẩn đoán bệnh
Phân lập vi khuẩn trong môi trường BHIA hoặc môi trường TSA có bổ sung
5% máu. Đĩa cấy ủ ở nhiệt độ 28 – 300C trong 48 giờ. Dùng KIT API 20E hoặc Nam
Khoa để định danh.
Phản ứng miễn dịch: Phản ứng ngưng kết trên phiến kính, phản ứng ELISA. Kĩ
thuật PCR cũng thường được áp dụng nhưng phức tạp và đòi hỏi kĩ thuật cao.
4


2.1.6 Phương pháp phòng và trị bệnh
Biện pháp phòng bệnh quan trọng nhất là quản lí môi trường nuôi tốt, kiểm tra
các chỉ tiêu chất lượng nước như: DO, NH3, nhiệt độ, pH…..
Các loại thuốc hóa chất dùng thường kém hiệu quả khi bệnh xảy ra. Cải tạo đáy
ao và hút bùn thật kĩ. Khi ao xảy ra bệnh thì nên giảm cho ăn, vớt bỏ và tiêu hủy cá
bệnh. Dụng cụ được sử dụng riêng để ngăn chặn mầm bệnh lây lan và khử trùng mỗi
khi sử dụng.
Chọn cá giống khỏe mạnh và được kiểm tra kĩ không có mầm bệnh. Vận
chuyển cá giống đúng kĩ thuật.
2.2 Vaccine trong nuôi trồng thủy sản
2.2.1 Định nghĩa về vaccine
“Vaccine là những chế phẩm kháng nguyên có nguồn gốc từ mầm bệnh, đã
được chuyển thành vô hại bằng nhiều cách khác nhau, có tác dụng kích hoạt hệ miễn
dịch sao cho có tính kháng bệnh tốt hơn khi tiếp xúc với mầm bệnh lần sau” (Ellis,
1988).
2.2.2 Lịch sử nghiên cứu vaccine trong thủy sản
1936, Nybelin công bố nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch của cá đối với vi
khuẩn Vibrio angullarum. 1939, tác giả tiếp tục nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá
đối với vi khuẩn Pseudomonas punctacta.

1940, Smith công bố nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch của cá đối với
Bacterium salmonicida.
1966, nền công nghiệp nuôi cá hồi phát triển mạnh nhưng bệnh do vi khuẩn
Vibrio anguillarum và Vibrio ordalli gây ra rất nghiêm trọng nên đã thúc đẩy việc phát
triển vaccine phòng bệnh.
1984, Austin công bố 7 phương pháp làm bất hoạt tế bào vi khuẩn trong vaccine
cho cá.
1995, Reinertse và Haaland tiếp tục nghiên cứu vaccine cho sự phát triển của
ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản trên thế giới.
Tiếp sau đó, nhiều công trình nghiên cứu tìm hiểu hạn chế về cơ chế hấp thu
kháng nguyên và phòng vệ bằng phương pháp sử dụng vaccine ngâm và cho ăn đã

5


được tiến hành (Nakanishi và Ototake, 1997; Quentel và Vigneulle, 1997; Mooreetal,
1998).
Tính đến tháng 7 năm 2005, đã có 35 loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn và 2
loại vaccine phòng bệnh virus được đăng kí bản quyền và sử dụng cho 6 đối tượng
nuôi phổ biến trên 41 quốc gia trên thế giới bao gồm cá hồi, cá chẽm Châu Âu, cá
chẽm Châu Á, cá rô phi, cá turbot và cá bơn đuôi vàng (Hastain và ctv, 2005).
2.3.3 Phân loại vaccine
2.3.3.1 Vaccine bất hoạt
Vaccine bất hoạt là vaccine được sản xuất từ chủng vi khuẩn gây bệnh sau khi
nuôi cấy tăng sinh và giết vi khuẩn bằng nhiệt hay hóa chất. Vaccine này sản xuất đơn
giản, rẻ tiền được sử dụng phổ biến. Tuy nhiên mức độ phòng bệnh của vaccine này
thấp. Vi khuẩn thường được sử dụng làm bất hoạt là vi khuẩn gram âm như: Vibrio
anguillarum,Vibrio ordalii, Vibrio salmonicida và Yersiniaruckerii. Vaccine này sử
dụng bằng cách tiêm hoặc ngâm còn đối với vi khuẩn Aeromonas salmonicida thì chỉ
có thể dùng phương pháp tiêm mới có hiệu quả (Ellis, 1997; Midtlyng, 1997). Trong

vài năm gần đây, bất hoạt virus gây bệnh truyền nhiễm hoại tử gan tụy ở cá hồi Đại
Tây Dương rất thành công cho thấy kết quả rất khả quan trong sản xuất vaccine.
(Dixon, 1997).
2.3.3.2 Vaccine hỗn hợp
Vaccine hỗn hợp là vaccine có chứa nhiều loại chủng vi khuẩn gây bệnh khác
nhau đã được bất hoạt nhằm gia tăng khả năng phòng cho một hoặc nhiều bệnh khác
nhau.
2.3.3.3 Vaccine sống
Vaccine sống là vaccine được sản xuất dựa vào biến đổi gene của vi khuẩn gây
bệnh. Quan trọng là xác định được gen độc lực và loại bỏ gene độc lực trước khi sử
dụng vi khuẩn. Vaccine này đem lại nhiều thuận lợi hơn trong nuôi trồng thủy sản
(Benmansour và Kinkelin, 1997) như giúp kích thích tốt hệ thống miễn dịch ở cá
(Marsdenetal, 1996). Khi so sánh với vaccine bất hoạt thì vaccine sống có nhiều ưu
điểm hơn như chống lại nhiều loại vi khuẩn cùng chủng loại (Marsdenet và ctv, 1998)
và khả năng bảo vệ cao. Mặc dù có nhiều nguy cơ thay đổi độc lực của mầm bệnh
vaccine và đòi hỏi kĩ thuật cao nhưng nhiều quốc gia vẫn tiếp tục nghiên cứu.
6


2.3.3.4 Vaccine tiểu phần
Vaccine tiểu phần là vaccine được sản xuất từ tiểu phẩn kháng nguyên của tác
nhân gây bệnh. Tiểu phần kháng nguyên vi khuẩn chiếm tỉ lệ rất nhỏ trong cấu trúc tế
bào như thành tế bào vi khuẩn, một phần vỏ, protein, nội bào hoặc ngoại bào của vi
khuẩn cũng như virus.
Vaccine được sản xuất theo 3 phương pháp dưới đây:
Sản xuất bằng cách chiết tách trực tiếp tiểu phần kháng nguyên của vi khuẩn
sau khi nuôi cấy tăng sinh như làm vỡ tế bào, tách lọc protein, nội bào hoặc ngoại bào.
Sản xuất bằng cách xác định gen độc lực sau đó đưa gen độc lực vào plasmid
hoặc thực khuẩn trước khi đưa vào vi khuẩn E.coli và nuôi cấy vi khuẩn trong điều
kiện đặc biệt nhằm sản xuất vaccine tiểu phần cần thiết sau đó tách lọc kháng nguyên

và sử dụng.
Việc nghiên cứu vaccine này phức tạp và tốn kém nên ít được sử dụng trong
thủy sản. 1998, Frost đã chứng minh được vaccine tiểu phần có ảnh hưởng đến sự thay
đổi đáp ứng kháng thể. Vaccine tiểu phần ở cá có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại
bệnh IPN (Infectious Pancreatic Necrosis) (Frost và Ness, 1997).
2.3.3.5 DNA vaccine
DNA vaccine là loại vaccine có thành phần chính là gen độc lực của chủng vi
khuẩn gây bệnh được tổng hợp và đưa trực tiếp vào cơ thể cá hoặc được nhân lên trong
vi sinh vật mang nó trước khi đưa vào cơ thể vật chủ. Vaccine này sản xuất đòi hỏi kĩ
thuật rất cao, nhiều tốn kém. Thường vaccine này được nghiên cứu phòng bệnh do
virus.
2.3.4 Phương pháp cấp vaccine
2.3.4.1 Phương pháp tiêm
Phương pháp này sử dụng đối với cá có trọng lượng lớn: Từ 20g – 50g trở lên.
Tiêm vào xoang bụng hoặc cơ vùng lưng của cá. Phương pháp này có ưu điểm là
vaccine được đưa vào cơ thể cá đồng đều, đáp ứng miễn dịch tốt nhất, mạnh nhất và
cao nhất, hiệu quả bảo vệ cao nhất. Khuyết điểm của phương pháp này là mất nhiều
thời gian, tốn kém chi phí nhân giống và gây stress lớn đối với cá. Phương pháp này
đòi hỏi kĩ thuật cao và thao tác nhanh để hạn chế stress cho cá.
2.3.4.2 Phương pháp ngâm
7


Phương pháp này là sử dụng chủ yếu đối với cá nhỏ, thời gian ngâm từ vài giây
đến một vài phút. Ưu điểm của phương pháp này là: vaccine sử dụng ít, thời gian
ngâm nhanh, ít tốn kém tiền bạc, phương pháp thực hiện đơn giản. Khuyết điểm là:
gây stress cao do dồn cá hoặc hạ mức nước, đáp ứng miễn dịch thấp.
2.3.4.3 Phương pháp tắm
Phương pháp này thì cá được ngâm trong dung dịch có chứa vaccine từ vài
chục phút đến vài giờ giúp cá có thời gian tiếp xúc với vaccine dài. Ưu điểm của

phương pháp này là không gây stress do cá không phải chuyển khỏi bể, không tốn
nhiều công sức, phương pháp đơn giản dễ áp dụng cho toàn đàn, dùng cho cá lớn.
Khuyết điểm là sử dụng vaccine nhiều, đáp ứng miễn dịch thấp, hiệu quả bảo vệ không
cao.
2.3.4.4 Phương pháp cho ăn
Phương pháp này là dùng vaccine trộn vào thức ăn cho cá, cá nhỏ thì trộn
vaccine vào thức ăn tự nhiên. Ưu điểm là: dễ áp dụng cho toàn đàn, đơn giản, nhanh,
áp dụng cho liều vaccine nhắc lại khi đã được sử dụng trước đó. Khuyết điểm của
phương pháp này là: tỉ lệ bảo vệ không cao do tùy thuộc vào khả năng ăn của cá, bị
phân hủy bởi pH và enzyme của dạ dày và có đáp ứng miễn dịch thấp nhất trong các
phương pháp trên.
2.3.4.5 Phương pháp bơm cao áp
Phương pháp này giống như phương pháp tiêm. Nhưng dùng xilanh có áp xuất
cao để đưa vaccine vào cơ thể vật chủ không gây ra vết thương. Chi phí cao và đòi hỏi
thiết bị chuyên dùng.
2.3.4.6 Phương pháp bơm vào đường ruột
Phương pháp giống như phương pháp tiêm nhưng tiêm vào đường ruột thông
qua hậu môn. Mặc dù có nhiều ưu điểm và không gây tổn thương nhưng do chi phí cao
và tốn kém công sức, thời gian nên khó áp dụng.
2.3.5 Vai trò của vaccine trong thủy sản
Hiện nay ngành nuôi cá công nghiệp ngày càng phát triển mạnh, xuất hiện rất
nhiều loại bệnh khác nhau nếu không có các biện pháp phòng bệnh thích hợp thì sẽ
xảy ra rất nhiều thiệt hại.

8


Vaccine là sự lựa chọn hàng đầu trong việc phòng bệnh cho cá vì nhiều ưu điểm
như hiệu quả kinh tế cao do giảm việc sử dụng kháng sinh và hóa chất, không gây ô
nhiễm môi trường do không sử dụng các loại kháng sinh và hóa chất, giúp cá nâng cao

khả năng miễn dịch chống lại các mầm bệnh xâm nhập, ngăng ngừa dịch bệnh lan ra
do cá có khả năng kháng bệnh.
Tại Na Uy, việc sử dụng vaccine đã làm giảm lượng kháng sinh phải sử dụng
cho cá hồi giảm từ 47 tấn xuống còn 1 tấn/ năm và trở thành chiến lược trong mục tiêu
phòng bệnh cá trong nông nghiệp (Markestad và Grave, 1997). Surum vào năm 1999
công bố rằng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản đã làm tăng khả năng đề kháng của
mầm bệnh và các yếu tố không phải mầm bệnh của vi sinh vật cũng như làm tăng nguy
cơ cho môi trường cho cả người và vật nuôi.
Hiện nay có nhiều hướng nghiên cứu vaccine nhằm đạt được nhiều mục tiêu
quan trong như tính an toàn, thời gian bảo vệ dài, phòng được nhiều bệnh bằng một
liều vaccine, cách cấp vaccine đơn giản.
Hơn nữa việc sử dụng vaccine đem lại một thuận lợi lớn, cá được phòng bệnh
do virus và vi khuẩn hiệu quả hơn trong khi kháng sinh chỉ trị được bệnh do vi khuẩn.
2.3.6 Các nguyên tắc sử dụng vaccine
- Dùng vaccine để phòng bệnh sẽ có hiệu quả hơn so với nhiều biện pháp khác.
- Cấp vaccine cho cá nhiều lần và phải cấp vaccine nhắc lại.
- Cấp vaccine cho cá giống để phòng bệnh.
- Cá được cấp vaccine phải khỏe mạnh, không bị stress.
- Khi cá bệnh không được cấp vaccine.
- Trong lúc cấp vaccine nếu thấy cá có hiện tượng chết thì phải ngưng cấp để
kiểm tra.
- Người cấp vaccine phải được huấn luyện.
- Nguồn gốc vaccine phải rõ ràng, có thời hạn sử dụng, thành phần, nước sản
xuất, hướng dẫn sử dụng..
- Khi cấp vaccine cho cá thì phải chọn thời điểm thời tiết ít biến động nhằm
không làm cá bị stress và có đáp ứng tốt nhất với vaccine.
2.3.7 Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vaccine

9

Vaccine khi được phát triển trong nuôi trồng thủy sản thì cần phải được đánh
giá đầy đủ trước khi được thương mại hóa. Việc đánh giá hiệu quả của vaccine thường
sẽ được tiến hành gây nhiễm với 2 nhóm cá. Nhóm cá được gây miễn dịch bằng loại
vaccine cần xác định và nhóm cá đối chứng không gây miễn dịch. Sau đó sẽ gây bệnh
cho cá và theo dõi trong khoảng thời gian đã định trước hoặc lúc cá không còn chết
nữa. Đối với Edwardsiella ictaluri thì thời gian là khoảng 14 ngày. Tác nhân gây bệnh
phải gây tỷ lệ chết hoặc mắc bệnh trên 50% nhưng nhỏ hơn 90% đối nhóm đối chứng.
Các nguyên nhân gây khác và nguyên nhân gây chết không do bệnh cần phải xác minh
và không gây chết quá 10% trong các nhóm thí nghiệm.
Hiệu quả bảo hộ RPS (Relative Percent Survival) có công thức sau:
RPS(%) = 100 ×( 1- Tỷ lệ chết của nhóm cấp vaccine/ Tỷ lệ chết của nhóm
không cấp vaccine)
Vaccine sẽ có hiệu quả bảo hộ tốt và có thể được thương mại hóa khi RPS ≥
60% (Bader và ctv, 2004).

10


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu bắt đầu từ 23/12/2009 đến 14/03/2010
Địa điểm tiến hành tại Trại thực nghiệm thủy sản Trường Đại Học Nông Lâm
TP.HCM, phân tích mẫu và làm thí nghiệm tại Phòng thí nghiệm bệnh học thủy sản
của Khoa Thủy Sản, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu, trang thiết bị và hóa chất
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Cá tra bột 1 ngày tuổi được vận chuyển từ Đồng Tháp về trại thực nghiệm thủy
sản, trường đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Cá được đóng trong 18 bao kích

thước 25 x 15 x 55 cm, mỗi bao chứa khoảng 20000 cá bột trong 3 lít nước có pha sẵn
vaccine với tỷ lệ lần lượt là 1:25, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200 và đối chứng không có
vaccine.
Nhiệt độ trong quá trình vận chuyển từ 29 – 300C.
Sau khi chuyển về cá được ương trong các bể composit có chuẩn bị hệ thống
sục khí và gây màu. Cá sau khi tiêu hết noãn hoàng, tùy theo kích cỡ cá sẽ được cho ăn
artemia, moina, trùn chỉ, thức ăn dang bột hoặc viên.
Mỗi ngày cho cá ăn 2 lần, cách 2 ngày kiểm tra chỉ tiêu nước 1 lần và đo nhiệt
độ mỗi ngày. Trước khi chuyển cá một ngày sang bể khác thì không cho ăn.
3.2.2 Chế phẩm vaccine
Vaccine gồm hai dạng: dạng ngâm (ImV) và dạng cho ăn (OrV). Vaccine cho
ăn liều dùng là: 2 ml vaccine/100g thức ăn.
Vaccine được bảo quản ở 4 - 80C, tránh ánh sáng.
3.2.3 Vi khuẩn thí nghiệm
Chủng vi khuẩn E. ictaluri được phân lập từ cá tra bị bệnh gan thận mủ vào
tháng 1/2009 tại Vĩnh Long được bảo quản ở nhiệt độ -200C tại phòng thí nghiệm
Bệnh học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2.4 Dụng cụ

11


Tủ lạnh, tủ đông (-200C), tủ cấy vi khuẩn, vợt, máy votex, autoclave, kính hiển
vi, cân điện tử, máy ảnh, dụng cụ tiểu phẩu, máy sục khí, nhiệt kế, test đo chất lượng
nước hiệu SERA của Đức.
Bể kính (30×30×40 cm) dùng trong thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm. Bể
composit (500 lít) dùng cho ương cá.
Ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, lame, lamelle, pipet, bộ định danh
Nam Khoa và các dụng cụ cần thiết khác.
3.2.5 Hóa chất và môi trường

Hóa chất:
+ Nhuộm Gram: Crystal violet, dung dịch lugol, dung dịch tẩy (cồn 70%),
safrain.
+ Hóa chất khác: Dầu soi kính, thuốc thử catalase, đĩa giấy thử oxydase (của
Công ty Nam Khoa).
Các môi trường sử dụng:
+ PCA (Plate Count Agar): Nuôi cấy, phân lập, đếm vi khuẩn.
+ BHIB (Brain Heart Infusion Broth): Tăng sinh vi khuẩn.
+ BHIA (Brain Heart Infusion Agar): Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Cá bột 1 ngày tuổi được chia làm 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp
lại gồm: nghiệm thức đối chứng (ĐC) không xử lí vaccine, 5 nghiệm thức ngâm
vaccine (NT) với nồng độ vaccine pha loãng lần lượt là : 1/25, 1/50, 1/100, 1/150,
1/200. Cá được đóng trong 18 bao kích thước 25 x 15 x 55 cm, mỗi bao chứa khoảng
20.000 cá bột trong 3 lít nước có pha sẵn vaccine được vận chuyển từ Đồng Tháp về
trại thực nghiệm thủy sản, trường đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Thời gian vận
chuyển cá khoảng 4 giờ. Sau đó cá được thả vào 18 bể composite đã được chuẩn bị sẵn
chứa 0,7 m3/bể được xử lý sạch, gắn hệ thống sục khí và được gây màu tự nhiên.
Ngày thứ 12, cấp vaccine cho cá ở dạng cho ăn (OrV), vaccine được trộn vào
thức ăn theo tỷ lệ 2 ml/100g thức ăn và cho ăn liên tục đến ngày thứ 25, ngày 2 lần.
Đối với cá ở bể ĐC thì không cho ăn thức ăn trộn vaccine.

12


Ngày thứ 34, tiến hành gây bệnh thực nghiệm lần 1 bằng phương pháp ngâm cá
với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cho cả ĐC và NT. Mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại,
mỗi lần lặp lại bố trí 30 cá.
Ngày thứ 62, tiến hành cấp vaccine lần 2 ở dạng cho ăn (OrV). Vaccine được

trộn với thức ăn theo tỷ lệ 2 ml/100g. Cho ăn 2 lần/ ngày, liên tục trong 7 ngày. Đối
với cá ở bể ĐC thì không cho ăn thức ăn trộn vaccine.
Ngày thứ 84, gây bệnh thực nghiệm lần 2 bằng phương pháp ngâm cá với vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri. Mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại bố trí 10
cá.
Trong suốt quá trình thí nghiệm cá được cho ăn tối đa. Tùy theo kích cỡ cá mà
thức ăn có sự thay đổi phù hợp từ artemia, moina, trùn chỉ, thức ăn dạng bột, dạng
mảnh, dạng viên.
Trong 1 tuần lễ đầu không thay nước, sau đó cách 2 ngày thay nước 1 lần.
Cá được chuyển lên phòng thí nghiệm 2 ngày trước khi gây nhiễm.
Sử dụng phương pháp bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên.

Hình 3.3: Hệ thống bể bố trí nuôi cá thí nghiệm
3.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi
13


 

+ Tỷ lệ cá chết:
- Sau 4 giờ ngâm vaccine, quan sát và ước lượng tỷ lệ cá chết của mỗi bao

vận chuyển.
- Sau 24 giờ ngâm vaccine, xác định tỷ lệ cá chết bằng phương pháp xi phong
2L nước đáy của bể ương
- Trong 14 ngày khi gây nhiễm lần 1 và lần 2.
+ Tỷ lế cá còn sống sau 1 tháng nuôi
+ Hiệu giá ngưng kết của kháng thể
+ Hiệu quả bảo hộ miễn dịch
+ Các chỉ tiêu môi trường như pH, nhiệt độ, DO, NH3, được kiểm tra theo định

kỳ.
3.3.3 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn
Tăng sinh vi khuẩn: Sau khi vi khuẩn tạo thành các khuẩn lạc trên các đĩa môi
trường BHIA. Chọn những khuẩn lại rời, đặc trưng dùng que cấy vòng lấy vài khuẩn
lạc cho vào bình tam giác chứa 500 ml môi trường BHIB. Sau đó cho dung dịch tăng
sinh lên máy lắc trong 18 giờ ở nhiệt độ 250 – 280C.
3.3.4 Phương pháp làm phản ứng vi ngưng kết kháng thể
Chuẩn bị dung dịch PBS (Phosphase Buffered Saline), nước muối sinh lí, FKC
(Formolin kill cell), formol 46%, pipet, ống hút, khay 96 giếng.
Cách làm dung dịch PBS: Dùng các hóa chất NaCl 7,2g, Na2HPO4 1,48g,
KH2PO4 0,43g, H20 1000 ml, pH = 7.4. Dùng cân điện tử cân chính xác lượng trên cho
vào bình có thể tích 1 lít lắc đều các hóa chất cho tan. Sau đó đem đi hấp tiệt trùng
trong 20 phút.
Cách làm FKC: Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường BIHB ở bình 1000 ml
trong 18 giờ ở nhiệt độ 250 – 280C. Sau đó cho formol 46% vào với liều lượng 5ml
formol trong 100ml dung dịch tăng sinh để nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau đó đem
vào máy ly tâm quay 6000 vòng/phút trong 15 phút hút bỏ phần nước rửa lại phần cặn
ở đáy bằng nước muối sinh lí 3 lần. Sau đó đem bảo quản trong tủ lạnh.
Cách làm phản ứng vi ngưng kết: Đợt 1: Cá được nghiền rồi cho vào dung dịch
PBS với tỉ lệ 1 trọng lượng : 10 thể tích. Sau đó đem ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 15

14