Khảo sát tác động giảm đau của nọc thô và các phân đoạn nọc rắn cạp nong Việt Nam Bungarus fasciatus

NTTU-NCKH-05

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

--------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2015-2016

Tên đề tài:
Khảo sát tác động giảm đau của nọc thô và các phân đoạn nọc rắn cạp nong Việt
Nam Bungarus fasciatus
Số hợp đồng: 2016.01.17 /HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thùy Trang
Đơn vị công tác: Khoa Dược – Đại học Nguyễn Tất Thành
Thời gian thực hiện: 1/2016 – 1/2017

TPHCM-2017
TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 201


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-----------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2015 - 2016

Tên đề tài:
Khảo sát tác động giảm đau của nọc thô và các phân đoạn nọc rắn cạp nong Việt
Nam Bungarus fasciatus
Số hợp đồng :2016.01.17 /HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thùy Trang
Đơn vị công tác: Khoa Dược – Đại học Nguyễn Tất Thành
Thời gian thực hiện: 1/2016 – 1/2017



MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 2
1.1.

Giới thiệu về nọc rắn ........................................................................................................ 2

1.1.1.

Nguồn gốc, đặc điểm và phân loại ............................................................................ 2

1.1.2.

Phân bố...................................................................................................................... 2

1.1.3.

Đặc tính loài .............................................................................................................. 2

1.1.4.

Nọc rắn ...................................................................................................................... 3

1.1.5.

Các ứng dụng trong y học ......................................................................................... 5

1.2.

Loài rắn cạp nong ............................................................................................................. 6

1.2.1.

Đặc điểm loài ............................................................................................................ 6

1.2.2.

Nọc rắn cạp nong ...................................................................................................... 8

1.3.

Đại cương về đau ............................................................................................................. 9

1.3.1.

Định nghĩa và phân loại ............................................................................................ 9

1.3.2.

Thuốc điều trị đau và những mặt hạn chế ............................................................... 13

1.3.3.

Tác dụng giảm đau của nọc rắn .............................................................................. 14

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 16
2.1.

Động vật thử nghiệm ...................................................................................................... 16

2.2.

Dụng cụ .......................................................................................................................... 16

2.3.

Hóa chất.......................................................................................................................... 16

2.4.

Phương pháp thử nghiệm tác dụng giảm đau ................................................................. 17

2.4.1.

Mô hình giảm đau trung ương bằng phương pháp nhúng đuôi chuột..................... 17

2.4.2. Mô hình giảm đau ngoại biên với phương pháp gây đau quặn bằng acid acetic ......... 18
2.5.

Phân tích thống kê kết quả ............................................................................................. 18

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................ 19
3.1.

Tách các phân đoạn của nọc rắn bằng phương pháp sắc ký trên cột Superdex HR75 ... 19

3.1.1.

Tác động giảm đau ngoại biên ................................................................................ 20

3.1.2.

Tác động giảm đau trung ương ............................................................................... 22

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 24
4.1.

Kết luận .......................................................................................................................... 24

4.2.

Kiến nghị ........................................................................................................................ 24

i

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cách lấy nọc rắn............................................................................................................................ 4
Hình 1.2Rắn cạp nong Bungarus fasciatus ................................................................................................... 7
Hình 1.3Sắc ký trao đổi ion nọc rắn cạp nong .............................................................................................. 8
Hình 1.4 Đường dẫn truyền cảm giác đau ................................................................................................. 13
Hình 3.1Sắc ký nọc rắn cạp nong trên cột lọc gel Superdex HR75. ........................................................... 19
Hình 3.2. Số lần đau quặn của các lô chuột ở các thời điểm khảo sát. ....................................................... 20
Hình 3.3tiềm thời giật đuôi chuột ở các lô tại thời điểm khảo sát .............................................................. 22

ii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Một số thuốc chữa bệnh và chẩn đoán bệnh có nguồn gốc từ nọc rắn .......................................... 5

iii


MỞ ĐẦU
Xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu chăm sóc sức khỏe của mọi người ngày càng được
chú ý. Các nghiên cứu khoa học, kỹ thuật y dược học phát triển nhằm tìm ra các giải pháp
không chỉ điều trị an toàn, ít tác động phụ mà còn đạt hiệu quả cao.
Như đã nói ở trên, vì thuốc hóa dược có nhiều tác dụng không mong muốn cho nên vấn
đề cấp thiết hiện nay đối với ngành y tế là phải tìm ra những dẫn chất mới hoặc phương
pháp điều trị mới để giúp bệnh nhân giảm đau, kháng viêm, cải thiện được triệu chứng
bệnh.
Rắn cạp nong Việt Nam Bungarus fasciatus là loài được phân bố rộng rãi ở nước ta
nhưng hiện nay loài này vẫn chưa được đưa vào nghiên cứu nhiều. Rắn cạp nong
Bungarus fasciatus là một loài thuộc họ rắn hổ Elapidae và ở nghiên cứu trước chúng tôi
đã chứng minh được rằng nọc rắn cạp nong có tác dụng giảm đau tốt [2].

Vì vậy, với mục tiêu tìm kiếm các nguồn nguyên liệu mới từ tự nhiên có tác động trị liệu
tốt và ít tác dụng phụ, đồng thời xác định thành phần chính thực sự có tác động dược lý,
từ đó hướng tới xác định cấu trúc, cơ chế tác động của thành phần này, chúng tôi tiến
hành sắc ký lọc gel Superdex HR75 nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus thu được 5
phân đoạn và tiến hành nghiên cứu tác động giảm đau ngoại biên và trung ương của nọc
thô và của các phân đoạn của nọc rắn trên 02 mô hình :gây đau quặn bằng acid acetic và
mô hình nhúng đuôi chuột.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giới thiệu về nọc rắn

1.1.1. Nguồn gốc, đặc điểm và phân loại
Loài rắn được cho là tiến hóa từ loài thằn lằn trong khoảng thời gian giữa kỉ Phấn Trắng.
Hóa thạch có niên đại lâu nhất được tìm thấy có nguồn gốc cách đây 112 triệu năm. Đặc
điểm chung của loài rắn là thân dài, có vảy nhỏ, bụng có vảy lớn, không chân, di chuyển
bằng cách trườn bụng. Miệng có xương hàm trên, xương hàm dưới, xương cánh, xương
ngang đều có khớp đóng và dây chằng rất đàn hồi làm cho rắn có thể há rất to, dễ dàng
nuốt mồi lớn, lưỡi chẻ đôi [28].
Phân loại: rắn được chia làm hai loại - có nọc độc và không có nọc độc. Trên thế giới
hiện có 15 họ, 456 chi và 2900 loài rắn được công nhận. Trong số đó, chỉ có khoảng 300
loài có nọc độc [20]. Ở Việt Nam hiện có khoảng 140 loài rắn và 32 loài có nọc độc [2].
Loài có nọc độc thường tập trung vào những họ như: Colubridae, Elapidae,
Hydrophidae, Viperidae và Crotalidae [20].
1.1.2. Phân bố
Loài rắn sinh sống ở khắp nơi trên thế giới trừ Nam Cực, Ấn Độ Dương, Thái Bình

Dương, một số đảo lớn như Ireland, New Zealand, nhiều đảo nhỏ ở Đại Tây Dương và
trung tâm Thái Bình Dương [10].
Ở Việt Nam, rắn phân bố ở khắp nơi từ vùng núi, trung du, đồng bằng. Thường gặp trong
rừng thưa, bờ bụi, gò đống hay đôi khi gần nơi ở của con người [2].
1.1.3. Đặc tính loài
Rắn thuộc nhóm bò sát, động vật máu lạnh. Chúng thường ẩn mình trong hang để ngủ
trong mùa đông. Thức ăn của rắn thường là ếch, nhái, sâu bọ, thằn lằn, chim, trứng chim
hay đôi khi là các loại rắn khác. Những loài có nọc độc thường hoạt động vào ban đêm,
dùng nọc độc để chế ngự con mồi, loài không có nọc độc thường hoạt động vào ban ngày,
săn mồi bằng cách xiết chặt con mồi cho đến chết. Sau khi ăn, chúng trở nên thụ động và
lười biếng. Bộ máy tiêu hóa của chúng làm việc rất hiệu quả, có thể tiêu thụ mọi thứ trừ
lông và móng vuốt của con mồi. Rắn thường ghép đôi vào tháng 4, giao phối vào tháng 5
2


và đẻ trứng vào tháng 6. Rắn con trưởng thành sau nhiều lần lột xác. Việc lột xác này
cũng giúp chúng loại bỏ kí sinh trùng. Trung bình 2-3 tháng rắn lột xác một lần [2].
1.1.4. Nọc rắn
Nọc rắn là hỗn hợp các thành phần có hoạt tính sinh học cao với chức năng chính là tiêu
diệt hoặc bất động và tiêu hóa con mồi. Nọc rắn bao gồm các chất có bản chất protein và
các chất không có bản chất protein. Thành phần các chất có bản chất protein bao gồm
các enzym, các protein không có tính enzym, các polypeptid. Thành phần không có bản
chất protein gồm các chất hữu cơ và các chất vô cơ [27]. Trong đó, khoảng 95% khối
lượng khô của nọc rắn là polypeptid như: enzym, toxin, các peptid nhỏ. Trong nọc rắn,
các nhà khoa học đã xác định được hơn 20 enzym và 12 trong số đó là thành phần chính
của nọc. Trong đó, hyaluronidase là thành phần luôn có mặt trong tất cả các nọc, có tác
dụng giúp cho các thành phần nọc dễ dàng xâm nhập vào mô của con mồi [20].
Sự thay đổi về thành phần cũng như độc tính của nọc rắn không chỉ phụ thuộc vào loài
mà còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác như: địa lí phân bố, mùa, thói quen, con mồi, độ
tuổi và giới tính. Một nghiên cứu cho thấy nọc rắn lấy vào mùa thu thì độc hơn nọc rắn

lấy vào mùa xuân [17].
Nọc rắn được lấy bằng cách để rắn cắn vào đĩa petri, dùng tay xoa bóp nhẹ vào hai tuyến
nọc ở sau tai, nọc sẽ chảy vào đĩa. Khi lấy nọc cần chú ý nếu bóp mạnh quá nọc sẽ hòa cả
dãi lẫn máu sẽ làm giảm chất lượng nọc. Nọc mới chảy ra có màu vàng nhạt, hơi sánh.
Sau đó, nọc có thể được đông khô hoặc làm khô trong bình hút ẩm chứa silicagen hay
CaCl2. Nọc khô có thể bảo quản hàng chục năm vẫn còn hoạt tính nhưng khi pha với
nước thì không dùng được lâu [3].

3


Hình 1.1. Cách lấy nọc rắn
Một số cơ chế gây độc chính của nọc rắn [26]
- Enzym trợ đông máu (procoagulant enzymes): thường gặp ở họ rắn lục Viperidae,
những enzym này kích thích quá trình đông máu nhưng không tạo được cục máu đông.
Nó thường tạo ra fibrin trong máu nhưng hầu hết đều bị phá vỡ nhanh chóng bởi hệ thống
ly giải fibrin trong cơ thể. Vì vậy khoảng 30 phút sau khi bị rắn cắn thì nồng độ của các
yếu tố gây đông giảm xuống và không thể hình thành cục máu.
- Enzym gây xuất huyết (haemorrhagins): như zinc metalloproteinase, enzym này làm tổn
thương thành mạch máu và gây xuất huyết tự nhiên.
-Toxin gây hoại tử tế bào (cytolitic): đây là những enzym tiêu hóa thuộc loại polypeptid
hydroxylase (enzym thủy phân protein và phospholipase A) và những yếu tố khác làm gia
tăng tính thấm gây nên hiện tượng sưng phù. Chúng có thể dẫn đến hủy diệt màng và mô
tế bào.
- Phospholipase A2: gây tan máu và tiêu cơ. Những enzym này làm tổn thương màng tế
bào, lớp nội mạc, cơ xương, tế bào thần kinh và hồng cầu.
- Độc tố thần kinh (neurotoxin) tiền synap: thường gặp ở họ rắn hổ Elapidae và vài họ rắn
lục Viperidae. Đây là những phospholipase A2 làm tổn thương thần kinh tận cùng, ban
đầu giải phóng chất dẫn truyền acetylcholin, sau đó can thiệp vào quá trình giải phóng
acetylcholin.

4


- Độc tố thần kinh (neurotoxin) hậu synap: thường gặp ở họ rắn hổ Elapidae. Những
polypeptid này cạnh tranh với acetylcholin tại các receptor ở khớp nối thần kinh - cơ dẫn
tới hiện tượng liệt kiểu cura.
1.1.5. Các ứng dụng trong y học
Y học cổ truyền đã sử dụng nhiều bộ phận của rắn dùng làm thuốc như:
- Thịt rắn (nhục xà): có vị ngọt, mặn, tính ôn, có độc, quy kinh can. Có công dụng chữa
những bệnh đau nhức thần kinh, tê liệt, bán thân bất toại, các cơn co giật, chữa nhọt độc,
bị cảm trợn mắt miệng méo [3].
- Mật rắn (xà đởm): thường dùng phối hợp với nhiều vị thuốc khác để chữa ho, đau lưng,
nhức đầu khó chữa, có khi dùng ngâm rượu uống [3].
- Xác rắn (xà thoái): tính bình, vị ngọt, mặn không độc, quy vào kinh can. Có tác dụng trị
chứng kinh, sát trùng, đau cổ [3].
- Nọc rắn: có nhiều tác dụng dược lý quan trọng như hạ huyết áp [2], chống đông máu,
chống kết tập tiểu cầu, kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau [27]. Nọc rắn còn có hiệu quả
trong việc điều trị bệnh ung thư thông qua cơ chế gây độc tế bào hay ức chế sự tạo mạch
máu nuôi tế bào ung thư dẫn đến ức chế sự phát triển của các tế bào này. Những nghiên
cứu cho thấy nọc rắn hiện đang có hiệu quả trên các loại ung thư như u sắc tố, bệnh bạch
cầu. Điều đáng lưu ý là chúng có khả năng tác dụng lên các tế bào ung thư hơn các tế bào
bình thường [23].
Khi tiêm nọc rắn thì không sát khuẩn bằng dung dịch cồn iod vì cồn có thể làm phân hủy
nọc [3].
Y học hiện đại sử dụng nọc rắn và các thành phần trong nọc rắn để làm thuốc chữa bệnh
và chẩn đoán bệnh.
Bảng 1.1 Một số thuốc chữa bệnh và chẩn đoán bệnh có nguồn gốc từ nọc rắn [12]

Thuốc/tên thương mại

Cơ chế /điều trị

Nguồn gốc

Captopril, enalapril

Ức chế ACE/tăng huyết áp

Bothrops jaracusa

Ức chế kết tập tiểu cầu/hội

Sisturus miliarus

chứng mạch vành cấp

barbouri

Ức chế GPIIb-IIIa/nhồi máu cơ

Echis carinatus

Integrilin (eptifibatide)
Aggrastat (tirofiban)

5


tim, thiếu máu cơ tim cục bộ

Ancrod (Viprinex)

Ức chế fibrinogen/ đột quỵ

Agkistrodon rhodostoma

Ức chế thrombin và
prothrombin/tai biến mạch máu

Defibrase

não cấp, đau thắt ngực không

Bothrops moojeni

chuyên biệt
Tác động theo kiểu
Hemocoagulase

thromboplastin/ngăn ngừa và

Bothrops atrox

điều trị xuất huyết
Protac/hoạt hóa protein C
Reptilase

Agkistrodon contortix

rối loạn cầm máu

contortix

Chẩn đoán rối loạn đông máu

Bothrops jaraca

Hoạt hóa prothrombin/chẩn

Ecarin

đoán

Exanta, ximelagatran

Thuốc chống đông/chống đông
máu, ức chế thrombin
Giảm đau/đau khớp, viêm

Cobratox

1.2.

Hoạt hóa protein C/chẩn đoán

khớp

E.carinatus

Cobra

Cobra

Loài rắn cạp nong

1.2.1. Đặc điểm loài
Tên khoa học:

Bungarus fasciatus Schneider, 1801

Pseudoboa fasciatus Schneider, 1801
B. annularis Daudin, 1863
Họ:

Rắn hổ Elapidae

Bộ:

Có vảy Squamata

Tên gọi: rắn cạp nong, rắn cạp nong vàng, rắn đen vàng, rắn vòng vàng (miền Bắc), rắn
mai gầm (miền Nam), ngũ tăm tàn (Thái), Tô ngù cẳm poong (Thổ), khớp đồng, Cáp
đống (Thổ Bắc Kạn) [3].
6


Mô tả: Rắn cạp nong là loài rắn cỡ lớn. Đầu hơi phân biệt với cổ, không có vảy má. Mắt
nhỏ, giữa sống lưng có một gờ dọc rất rõ. Vảy thân 15 hàng, hàng vảy sống lưng hình 6
cạnh, lớn hơn vảy bên. Thân có khoanh đen và khoanh vàng xen kẽ, khoanh đen, khoanh
vàng xấp xỉ nhau, đuôi tù. Chiều dài cơ thể khoảng 1 m trở lên [1].

Phân bố: vùng Đông Dương, bán đảo và quần đảo Malaysia và miền nam Trung Quốc
[16]. Ở Việt Nam, chúng phổ biến ở vùng đồng bằng, trung du và miền núi [1].
Sinh thái và đặc tính loài: Thường sống trong rừng hoặc những nơi gần chỗ ở của người,
trong các hang chuột hay hang mối đã bỏ ở bờ ruộng, gò đống, bờ sông, bờ đê, vườn
tược, bụi tre, bờ ao. Chúng kiếm ăn chủ yếu vào ban đêm. Ban ngày, rắn cạp nong
thường chậm chạp, ít cắn người song người bị rắn cạp nong cắn có thể bị tử vong. Thức
ăn chủ yếu của chúng là các loài rắn khác. Ngoài ra, chúng còn ăn ếch nhái, cóc, thằn lằn,
trứng rắn, chuột, cá... Rắn cạp nong đẻ trứng vào cuối tháng 5 đến giữa tháng 6 hàng
năm, khoảng 2 - 15 trứng, cỡ khoảng 6,25 x 3,75 cm [1].
Giá trị: Trong y học cổ truyền, rắn cạp nong được xem như một vị thuốc bổ quý. Một số
bài thuốc cổ truyền có rắn cạp nong còn được sử dụng như “Tam xà tửu” (rượu gồm rắn
cạp nong, rắn hổ mang và rắn ráo có tác dụng chữa tê thấp, viêm đau khớp) hay “Tam xà
đởm trần bì” (được điều chế từ mật của 3 loài rắn ráo, cạp nong hoặc cạp nia, hổ mang
phối hợp với trần bì và một số vị thuốc khác có tác dụng chữa ho và tiêu chảy rất hiệu
quả) [2]. Ngoài ra, rắn cạp nong sống còn là một mặt hàng xuất khẩu [1].
Tình trạng bảo tồn: Số lượng còn rất ít do bị săn bắt triệt để. Mức độ đe dọa: bậc T [1].

Hình 1.2Rắn cạp nong Bungarus fasciatus [1]

7


1.2.2. Nọc rắn cạp nong
Các thành phần trong nọc rắn cạp nong gồm các neurotoxin, cardiotoxin, diotoxin, Lamino acid oxidase [18], phospholipase A2, lectin, cathelicidin, protease và chất ức chế
protein. Trong số đó, người ta đã xác định trình tự acid amin của hơn 20 protein. Những
protein này gồm 8 đồng dạng của phospholipase A2, 4 đồng dạng của các toxin ba ngón
tay (3FTx), ít nhất một chất Kunitz ức chế proteinase, chất hoạt hóa yếu tố X,
acetylcholin esterase và các enzym khác [16]. Nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy nọc rắn
cạp nong độc hơn nọc rắn hổ mang [18]. Độc tố chính của nọc rắn cạp nong là
neurotoxin, khi bị rắn cạp nong cắn con mồi bị trụy hô hấp dẫn đến tử vong [19].

Các nghiên cứu về tác dụng dược lý trên nọc rắn cạp nong: tính đến thời điểm tháng 7
năm 2012, những công trình nghiên cứu về phân lập và xác định tác dụng dược lý của
một số thành phần của nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus (B.fasciatus) như:

Hình 1.3Sắc ký trao đổi ion nọc rắn cạp nong
Kết luận này phù hợp với những nghiên cứu khác được công bố [16], [17]. Cũng trong
nghiên cứu này, lần đầu tiên nhóm nghiên cứu đã tách được 17 toxin có khối lượng phân
tử nằm trong khoảng 7-8 kDa. Khi tiến hành khảo sát hoạt tính của 17 toxin này cho thấy
có 16 toxin tương tác mạnh với thụ thể nicotinic acetylcholin loại cơ và có hai toxin
tương tác với thụ thể nicotinic acetylcholin loại cơ và loại α - 7. Hai loại toxin này thuộc
8


loại toxin yếu hay không bình thường, còn các toxin khác được xếp vào loại α neurotoxin mạch ngắn [5].
- Một nghiên cứu khác cho thấy chất Cathelicidin phân lập từ nọc B.fasciatus
(cathelicidin – BF ) có tác dụng kháng khuẩn. Nghiên cứu cho thấy, Cathelicidin – BF đã
chống lại 40 chủng vi sinh vật được kiểm tra. Cathelicidin – BF có thể diệt được vi khuẩn
và nấm, bao gồm cả những vi khuẩn kháng thuốc trên lâm sàng. Cathelicidin – BF có
nhạy cảm đặc biệt với vi khuẩn Gram âm. Hơn nữa cathelicidin – BF cũng có hoạt tính
chống lại các nấm hoại sinh. Cathelicidin – BF không thể hiện tính tán huyết hay độc tế
bào ở liều lên đến 400 µg/ml. Chất này có thể tồn tại trong huyết tương chuột ít nhất 2,5
giờ. Cathelicidin – BF có tiềm năng trở thành một trong những kháng sinh dùng trong
lâm sàng và nông nghiệp hiệu quả. Đây cũng là nghiên cứu đầu tiên xác minh sự có mặt
của cathelicidin ở loài bò sát [28].
- Một nghiên cứu trên L - amino acid oxidase của B. fasciatus (BF-LAAO) thấy rằng nó
chống lại rất tích cực với 1-Tyr, l-Asp, l-Phe, l-Glu, l-Trp, l-His, l-Gln, l-Ile, l-Met, l-Leu
và chống lại tích cực vừa phải l-Lys, l-Arg, l-Ala và l-Asn. BF-LAAO gây độc trên tế
bào A549 làm tế bào này chết theo chương trình apotosis lên đến 41,2% sau 12 giờ. Chất
này còn kích thích sự gia tăng của các neutrophil, các tế bào lympho, đại thực bào [18].
Ngoài ra, nhiều công trình nghiên cứu khác cho thấy các chất trong nọc rắn B.fasciatus

còn có các tác dụng dược lý khác như: phân giải protein [18], ức chế alpha chymotrypsin
[11], gây viêm cục bộ [18]…
1.3.
1.3.1.
1.3.1.1.

Đại cương về đau
Định nghĩa và phân loại
Định nghĩa

Hiệp hội nghiên cứu đau quốc tế (International Association for the Study of Pain – IASP)
đã định nghĩa: đau là một cảm giác khó chịu, xuất hiện cùng lúc với sự tổn thương của
các mô tế bào. Đau là kinh nghiệm được lượng giá bởi nhận thức chủ quan tùy theo từng
người, từng cảm giác về mỗi loại đau, là dấu hiệu của bệnh tật. Tiến trình gây đau được

9


điều chỉnh bởi chất truyền thần kinh ức chế và chất truyền thần kinh kích thích cũng như
các đáp ứng về sinh lý và tâm lý [6].
1.3.1.2.

Phân loại

Đau có thể được phân loại theo nhiều cách khác nhau. Có thể phân loại đau dựa vào vị
trí, thời gian, tần suất, nguyên nhân, cường độ đau [9].
Sau đây là một số cách phân loại đau phổ biến trong điều trị:
 Phân loại theo thời gian và tính chất đau:
- Đau cấp tính: được định nghĩa là sự đau diễn ra trong vòng 30 ngày. Đau cấp tính gồm:
+ Đau sau phẫu thuật

+ Đau sau chấn thương
+ Đau sau bỏng
+ Đau sản khoa
Đau cấp tính được xem là có lợi, giúp bảo vệ cơ thể [9].
- Đau mạn tính: đau tồn tại hơn 6 tháng. Đau mạn tính bao gồm:
+ Đau mạn tính liên quan đến ung thư: có thể là do sự xâm lấn và chèn ép của
các tế bào ung thư vào mô lành gây tổn thương mô.
+ Đau mạn tính không liên quan đến ung thư: loạn dưỡng giao cảm phản xạ, đau
sau herpes, đau thần kinh do tiểu đường…[9]
- Đau bán cấp: cơn đau tiếp diễn xảy ra từ cuối tháng thứ nhất đến đầu tháng thứ 7 [9].
 Phân loại theo nguyên nhân gây đau:
- Đau thực thể: do kích hoạt các cơ chế cảm nhận đau bình thường, đau thường khu trú
rõ. Đau thực thể thường được điều trị có hiệu quả bằng một liệu trình ngắn dùng các
thuốc giảm đau kháng viêm, hoặc giảm đau gây ngủ thích hợp [9].
- Đau nội tạng: thường ít khu trú hơn đau thực thể, bao gồm các loại đau như tắc ruột,
táo bón,đau màng trong tử cung…[9]
- Đau do nguyên nhân thần kinh: không có một kích thích rõ ràng nào gây đau cả và
thường khó định vị được. Dùng thuốc giảm đau gây ngủ chỉ giảm đau một phần [9].
1.3.1.3.

Cơ chế gây đau
10


Đường cảm giác đau gồm 3 nơron:
Nơron 1: nơron lưỡng cực (nơron hình T) tận cùng tại bộ phận cảm giác đau ở da, nội
tạng (receptor đau) đi đến sừng lưng tủy sống.
Nơron 2: đi từ tủy sống lên đồi thị (bắt chéo ở tủy sống).
Nơron 3: từ đồi thị lên vỏ não.
Tủy sống là nơi khuếch đại hoặc ức chế cảm giác đau. Đồi thị là nơi chọn lọc cảm giác

đau để đưa lên vỏ não và xác định những phản ứng thực vật có tính bảo vệ như giãn đồng
tử, tăng nhịp tim và hô hấp, co mạch hoặc giãn mạch, bài tiết dịch và tất cả tạo thành dấu
hiệu của sự đau. Vỏ não phân tích cảm giác đau và xác định hướng đối phó (kêu, bỏ chạy,
rụt tay lại…). Cảm giác đau chỉ phát khởi khi tần số xung lực rời tế bào T trên ngưỡng
[6].
Từ khi chịu kích thích đến khi nhận biết cảm giác đau trải qua 4 quá trình cơ bản: sự tải
nạp (transduction), sự dẫn truyền (transmission), sự điều hòa (modulation) và sự nhận
biết cảm giác đau (perception) [6].
- Sự tải nạp:
Là tiến trình mà kích thích có hại được chuyển thành tín hiệu điện tại receptor đau. Có
hai loại receptor đau:
+ Receptor nhiệt cơ học: kích thích receptor này tạo xung lực truyền theo sợi Aδ
myelin hóa gây đau có định vị, dữ dội, nhanh, có thể tạo phản xạ co cơ vân để
tránh sự tổn thương nhiều hơn.
+ Receptor đa hình: xung lực của hệ này được dẫn truyền dọc theo sợi C không
myelin hóa và tạo kiểu đau không định vị, âm ỉ và khởi đầu chậm. Sợi C tận cùng
ở sừng lưng tủy sống và phóng thích acid amin kích thích như chất P,
neurokininA, somatostatin, galanin và peptid liên quan đến gen calcitonin (CGRP)
[6].
- Sự dẫn truyền:
Là quá trình phát tán tín hiệu dọc theo màng tế bào thần kinh nhờ các chất kích thích như
prostaglandin và các chất trung gian gây viêm khác làm thay đổi tính thấm của màng tế
bào thần kinh tạo dòng Na+ đi vào và K+ đi ra gây khử cực màng. Xung lực điện được

11


truyền từ receptor đau đến sừng lưng tủy sống rồi đến đồi thị, cuối cùng đến vỏ não và
các phần khác của não để được xử lý [6].
- Sự điều hòa:

Nơron từ đồi thị và cuống não phóng thích chất truyền ức chế như norepinephrin,
serotonin, GABA, lycerin, endorphin và encephalin để ức chế chất P và các chất truyền
thần kinh kích thích khác của sợi truyền vào.
- Nhận biết cảm giác đau:
Sự nhận biết cảm giác đau không những chịu ảnh hưởng của sự sản sinh hoặc xử lý các
tín hiệu đau bất thường mà còn của các đáp ứng xúc cảm về tâm lý và kinh nghiệm đau
có trước. Vì vậy, điều trị đau ngoài việc dùng thuốc để thay đổi đáp ứng đau còn cần kết
hợp với thay đổi các đáp ứng tâm lý, thư giãn, sự tưởng tượng để đạt hiệu quả cao hơn là
chỉ dùng thuốc.
Sự nhạy cảm hóa ở ngoại biên và trung ương: trong điều kiện dẫn truyền bình thường có
sự cân bằng giữa chất dẫn truyền kích thích và chất truyền ức chế. Tuy nhiên, sự cân
bằng này có thể thay đổi ở ngoại biên và trung ương dẫn đến nhạy cảm và đáp ứng quá
độ. Ví dụ trong ca đau mạn tính có thể giảm ngưỡng đau (allodynia) nên đáp ứng với kích
thích không độc hại tăng cảm giác đau (hyperalgesia), đáp ứng quá độ với kích thích độc
hại hay tác dụng đau kéo dài (pyperpathia). Ở ngoại biên có những receptor đáp ứng với
kích thích cơ học mạnh trong khi các receptor khác là receptor “yên lặng”. Các receptor
“yên lặng” trải qua sự nhạy cảm hóa do tiếp xúc với prostaglandin, bradykinin, serotonin,
histamin, ATP và cytokin, trở nên đáp ứng cao ngay cả với các kích thích cơ học yếu. Ở
trung ương cũng có những receptor mà trong các ca đau mạn tính chúng đáp ứng cao với
các kích thích yếu, chẳng hạn receptor NMDA (N – metyl -D - aspartat).

12


Vỏ não

Đồi thị

Cấu trúc lưới

Đường tủy
sống – đồi thị
Đường dẫn truyền lên
Đường dẫn truyền
xuống

Nơron Aδ

Sừng

Đường tủy sống

lưng

- cấu trúc lưới
Đoạn bắt chéo tại
tủy sống

Nơron C

Hình 1.4 Đường dẫn truyền cảm giác đau [9]
1.3.2.

Thuốc điều trị đau và những mặt hạn chế

Các thuốc giảm đau chia làm hai loại chính: thuốc giảm đau gây ngủ và thuốc giảm đau
không gây ngủ [6].
- Thuốc giảm đau gây ngủ: cơ chế tác động của thuốc là do sự tương tác với các receptor
trung ương hay ngoại biên như: receptor mu (µ), kappa (κ), delta (δ). Một khi các
receptor này được kích thích sẽ gây tác động giảm đau mạnh. Vì vậy, chúng được dùng

trong các trường hợp đau nặng cấp và mạn tính như đau ung thư, sỏi thận, sỏi mật, đau
hậu phẫu, sản khoa. Các dẫn xuất của opioid tương tác với các receptor theo các mức độ
khác nhau như:
+ Chất chủ vận opioid mạnh như morphin và các chất tương tự morphin như
diamorphin, hydromorphon, methadon, pethidin, oxycodon, levorphanol, fentanyl
và alfetanil.
+ Các chất chủ vận opioid yếu như: codein, propoxyphen, tramadol.
13


+ Chất chủ vận từng phần: buprenorphin, dezocin, butorphanol, nalbuphin,
pentazocin [6].
- Thuốc giảm đau không opioid: cơ chế tác động của thuốc có lẽ là do ức chế
cyclooxygenase gây nên ức chế thành lập prostaglandin (PG) đặc biệt là PGE2. Chúng
được dùng trong các trường hợp giảm đau nhẹ và trung bình, cấp và mạn tính do nhiều
nguyên nhân khác nhau như chấn thương sau phẫu thuật, viêm khớp, ung thư. Các thuốc
trong nhóm gồm có acetaminophen, aspirin và các NSAIDs.[6]
- Ngoài hai loại thuốc cơ bản trên, trong lâm sàng người ta còn phối hợp thêm những loại
thuốc khác nhằm làm tăng hiệu quả giảm đau như:
+ Thuốc chống trầm cảm: TCA, IMAO, SSRI.
+ Thuốc trị động kinh: phenytoin, carbamazepin, valproat.
+ Thuốc chống loạn nhịp tim: mexiletin, flecainid.
+ Corticosteroid: dexamethason, metylprednisolon, prednisolon.
+ Thuốc làm giãn cơ vân: benzodiazepin, baclofen, dadrolen.
+ Thuốc chống co thắt: hyoscin trị đau do ung thư nội tạng gây trướng
+ Thuốc điều chỉnh xương: calcitonin, bisphosphat [6].
- Các mặt hạn chế:
Thuốc giảm đau gây ngủ: tuy có tác dụng giảm đau mạnh nhưng cũng có nhiều tác động
độc tính như: gây an thần, khoan khoái, co đồng tử, suy hô hấp, táo bón, bí tiểu, dung nạp
và lệ thuộc thuốc.

Thuốc giảm đau không opioid: không gây dung nạp và lệ thuộc thuốc như nhóm opioid
nhưng thuốc này cũng gây nhiều tác dụng phụ như: loét dạ dày - tá tràng, xuất huyết dạ
dày, rối loạn đông máu, dị ứng, suy gan, suy thận…
Ngoài ra, các thuốc phối hợp để điều trị đau cũng có những tác dụng phụ riêng [6].

1.3.3.

Tác dụng giảm đau của nọc rắn

Dựa trên những sự thay đổi sinh lý học thần kinh xảy ra trong sự dẫn truyền thông tin
đau, nhiều mô hình đã được phát triển để phục hồi trạng thái cân bằng nội mô và gây
giảm đau hoặc chống lại sự đau bằng cách sử dụng các chất đối kháng với kênh Ca 2+, các

14


kênh cổng proton, các kênh cổng điện thế Na+, các thụ thể NMDA và các chất chủ vận
với thụ thể GABA, thụ thể cholinergic và các thụ thể opioid. Dựa trên cơ chế này, các
chất độc có nguồn gốc động vật đã được chứng minh là có tác dụng giảm đau thông qua
các kênh ion hoặc thụ thể. Trong đó, nọc rắn là một điển hình. Nhiều báo cáo cho thấy
rằng nọc độc của họ rắn lục (Viperidae) và họ rắn hổ (Elapidae) có tác dụng giảm đau
nhờ vào neurotoxin và myotoxin như cobrotoxin, crotamin, hannalgesin… [27]
Rắn cạp nong B.fasciatus có thành phần chính là các neurotoxin, hơn nữa bước đầu
nghiên cứu cho thấy 16/17 toxin có khối lượng phân tử từ 7 đến 8 KDa tương tác mạnh
với thụ thể nicotinic acetylcholin loại cơ và có hai toxin tương tác với thụ thề nicotinic
acetylcholin loại cơ và loại α - 7 [5]. Đây là cơ sở cho việc tiến hành nghiên cứu tác dụng
giảm đau trên nọc rắn cạp nong B.fasciatus.

15

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Động vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng đực trưởng thành, chủng Swiss albino, khỏe mạnh, không dị tật do Viện
vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp.
Chuột mua về được nuôi ổn định ít nhất hai ngày trước khi tiến hành thử nghiêm. Những
chuột có trọng lượng từ 19 đến 26 gam được đưa vào thử nghiệm.
Khi thử nghiệm độc tính cho chuột nhịn đói 12 giờ nhưng vẫn cung cấp nước đầy đủ.
Thử nghiệm giảm đau, chuột được cung cấp thức ăn và nước uống đầy đủ.
Tất cả các thử nghiệm được tiến hành từ 8 giờ đến 17 giờ mỗi ngày.

2.2. Dụng cụ
Cân phân tích AND model HR 2000, Nhật
Cân kỹ thuật Sarito model CP4202S, Nhật
Bể siêu âm model T840DH, model ELMA, Đức.
Bếp cách thủy Memmert, model WB14, Đức.
Micropipet 5- 50 µl,100- 1000 µl.
Nhiệt kế
Đồng hồ bấm giây.
Bocal thủy tinh, bocal nhựa, kéo mổ, cốc có mỏ, kim tiêm, kim cho uống.

2.3. Hóa chất
Nọc rắn cạp nong B. fasciatus: nọc đông khô, có màu vàng ánh, được bảo quản ở -20 oC,
tan tốt trong nước.
Nọc rắn được nghiền mịn, cho trương nở hoàn toàn trong nước muối sinh lý 0,9% khoảng
20 phút. Sau đó lắc đều để nọc hòa tan hoàn toàn. Dung dịch được sử dụng cho các thử
nghiệm độc tính và dược lý.
Chất gây đau quặn acid acetic băng (CH3COOH) (Fuangdong Guanghua Chemical
Factory). Acid acetic đạt tiêu chuẩn phân tích là một acid hữu cơ yếu, có tính ăn mòn, dễ
bay hơi. Nhiệt độ nóng chảy 17 oC. Nhiệt độ sôi 116 – 118 oC. Tỷ trọng 1,05.

16


Chất đối chứng trong thử nghiệm giảm đau trung ương morphin chlorhydrat (công ty cổ
phần dược phẩm TW2): Morphin là thuốc giảm đau gây ngủ mạnh, tác động chủ yếu lên
hệ thần kinh trung ương. Morphin dễ gây nghiện và dễ lệ thuộc thuốc.
Chất đối chứng trong thử nghiệm giảm đau ngoại biên Aspirin (Aspegic®, Sanofi
Sythelabo): gói chứa 180 mg Acetylsalicylat DL-Lysin tương đương với 100 mg acid
acetylsalicylic. Thuốc giảm đau hạ sốt nhóm salicylat.

2.4. Phương pháp thử nghiệm tác dụng giảm đau
2.4.1. Mô hình giảm đau trung ương bằng phương pháp nhúng đuôi chuột
Chuột đủ tiêu chuẩn thử nghiệm được chia ngẫu nhiên thành nhiều nhóm, mỗi nhóm từ 8
- 10 con, cho thuốc với lượng 0,1 ml/ 10 g thể trọng.
- Lô chứng: tiêm dưới da dung dịch muối sinh lý 0,9%.
- Lô đối chứng: tiêm dưới da dung dịch morphin chlorhydrat 5 mg/kg.
- Lô thử nghiệm liều 0,34 mg/kg: tiêm dưới da dung dịch nọc nọc rắn liều 0,34 mg/kg.
Chuột được cố định vào lồng với đuôi được thả tự do ra ngoài. Đuôi chuột được nhúng
vào bocal nước nóng duy trì ở nhiệt độ 50 ± 0,5 ºC bằng bếp cách thủy Memmert. Nhiệt
độ nước được kiểm soát bằng nhiệt kế. Thời gian phản ứng, tính từ lúc nhúng đuôi vào
nước đến khi chuột giật mạnh đuôi ra khỏi nước, được ghi nhận bằng đồng hồ bấm giây.
Chuột được chọn làm thử nghiệm là chuột có thời gian phản ứng không quá 5 giây. Ghi
nhận thời gian phản ứng của chuột trước khi cho dùng thuốc và vào các thời điểm 30, 60,
90, 120 phút sau khi cho thuốc. Tại mỗi thời điểm, thời gian phản ứng được đo 2 lần liên
tiếp và ghi nhận thời gian dài hơn. Lau khô đuôi chuột bằng bông gòn sau mỗi lần đo,
nếu chuột không phản ứng sau 10 giây thì nhấc chuột ra để tránh bỏng đuôi chuột.
So sánh thời gian xuất hiện phản ứng giật mạnh đuôi chuột giữa các nhóm, sự kéo dài
thời gian có phản ứng của nhóm thử so với nhóm chứng cho thấy tác động giảm đau
trung ương của chất thử nghiệm.

17


2.4.2. Mô hình giảm đau ngoại biên với phương pháp gây đau quặn bằng acid
acetic
Chuột được chia ngẫu nhiên thành nhiều nhóm, mỗi nhóm từ 8 - 10 con, cho thuốc với
lượng 0,1ml/10 g thể trọng.
- Lô chứng: tiêm dưới da dung dịch muối sinh lý 0,9%.
- Lô đối chứng: uống dung dịch aspirin liều 50 mg/kg.
- Lô thử nghiệm liều 0,34 mg/kg: tiêm dưới da dung dịch nọc rắn liều 0,34 mg/kg.
Sau khi dùng thuốc 30 phút, tất cả các chuột được tiêm phúc mô dung dịch acid acetic
0,7%.
Mỗi chuột được đặt vào các bocal riêng, ghi nhận số lần đau quặn (chuột hóp bụng và
đồng thời duỗi ít nhất một chân sau) trong từng 5 phút một đến phút thứ 40. So sánh số
lần đau quặn của chuột giữa các nhóm trong cùng thời điểm. Sự giảm số lần đau quặn của
chuột nhóm thử so với nhóm chứng cho thấy tác động giảm đau ngoại biên của chất thử
nghiệm.

2.5. Phân tích thống kê kết quả
Các số liệu về tác dụng giảm đau được trình bày ở dạng số trung bình

SEM (standard

error of mean – sai số chuẩn của số trung bình). Sự khác biệt giữa các lô được phân tích
bằng phép kiểm Kruskal – Wallis và sau đó là Mann - Whitney với phần mềm Minitab
15.0, P < 0,05 được cho là có ý nghĩa thống kê.
Biểu đồ được vẽ bằng phần mềm SigmaPlot 12.0

18

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.

Tách các phân đoạn của nọc rắn bằng phương pháp sắc ký trên cột
Superdex HR75

Nọc rắn toàn phần được phân tách bằng sắc ký lọc gel trên cột Superdex HR75. Kết
quả cho thấy nọc toàn phần tách ra làm 5 phân đoạn . Các phân đoạn này được thu lại,
đông khô và dùng để khảo sát tác động giảm đau của chúng lên chuột.

Hình 3.1Sắc ký nọc rắn cạp nong trên cột lọc gel Superdex HR75.

19