Nghiên cứu quy trình chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học từ lá cây Lá đắng (Vernonia Amygdalina Del.) và thử hoạt tính ức chế enzym αglucosidase in vitro

NTTU-NCKH-05

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

--------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CÁC CHẤT
CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CÂY LÁ ĐẮNG
(VERNONIA AMYGGDALINA DEL.)
VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG α-GLUCOSIDASE IN VITRO
Số hợp đồng: 2017.01.26/HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Chi
Đơn vị công tác: Khoa Dược
Thời gian thực hiện: 09 tháng

TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 201


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-----------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 201 -201

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CÁC CHẤT
CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CÂY LÁ ĐẮNG
(VERNONIA AMYGGDALINA DEL.)
VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG α-GLUCOSIDASE IN VITRO
Số hợp đồng : 2017.01.26/HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Chi
Đơn vị công tác: Khoa Dược
Thời gian thực hiện: 09 tháng

Các thành viên phối hợp và cộng tác:
STT

Họ và tên

Chuyên ngành

Cơ quan công tác

Ký tên



MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................... i, ii
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................................v
DANH MỤC PHỤ LỤC ................................................................................................vi
TÓM TẮT KẾT QUẢ……………………………………………………………...…vii
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN................................................................................................ 2
1.1.

Tìm hiểu về cây Lá đắng ....................................................................................2

1.2.

Thành phần hóa học ...........................................................................................4

1.3.

Hoạt tính sinh học ............................................................................................ 13

1.3.1.

Kháng khuẩn ............................................................................................. 13

1.3.2.

Tiểu đường ................................................................................................ 15

1.3.3.

Kháng oxy hóa ..........................................................................................15

1.3.4.

Chống ung thư ........................................................................................... 16

Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................18
2.1.

Mục tiêu nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu ................................................18

2.2.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................18

2.3.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................19

2.3.1.

Xử lý nguyên liệu ......................................................................................19

2.3.2.

Phương pháp đo độ ẩm..............................................................................19

2.3.3.

Chiết cao tổng và cao phân đoạn............................................................... 20

2.3.4.

Khảo sát sơ bộ thực vật .............................................................................22
i


2.3.5.

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học.............................................23

2.3.6.

Khảo sát điều kiện chiết ............................................................................27

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................................29
3.1.

Đánh giá nguyên liệu .......................................................................................29

3.2.

Chiết cao ..........................................................................................................29

3.2.1.

Chiết cao tổng ethanol ...............................................................................29

3.2.2.

Chiết cao tổng nước ..................................................................................29

3.2.3.

Chiết cao phân đoạn ..................................................................................30

3.3.

Khảo sát sơ bộ thực vật ....................................................................................30

3.4.

Khảo sát hoạt tính sinh học ..............................................................................31

3.4.1.

Khả năng kháng oxy hóa DPPH................................................................ 31

3.4.2.

Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase ..................................................32

3.4.3.

Khả năng kháng viêm................................................................................33

3.5.

Khảo sát điều kiện chiết ...................................................................................34

3.5.1.

Khảo sát yếu tố dung môi..........................................................................34

3.5.2.

Khảo sát yếu tố nhiệt độ ............................................................................35

3.5.3.

Khảo sát yếu tố tỉ lệ lỏng rắn ....................................................................36

3.5.4.

Khảo sát yếu tố thời gian...........................................................................37

3.5.5.

Khảo sát yếu tố số lần chiết.......................................................................38

3.5.6.

Khảo sát hoạt tính sinh học cao tối ưu ......................................................39

3.6.

Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao dichloromethane ...42

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ............................................................................................. 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 45
PHỤ LỤC ......................................................................................................................47

ii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Lá, hoa và cây Lá đắng ...................................................................................3
Hình 1.2: Luteolin và luteolin 7-O-β-glucoside .............................................................. 7
Hình 1.3: Sesquiterpene lactones phân lập từ V. amygdalina .....................................10
Hình 1.4: Các vernonioside được phân lập từ cây lá cây Lá đắng ............................... 12
Hình 2.1: Tóm tắt nội dung nghiên cứu .......................................................................19
Hình 2.2: Quy trình chiết phân đoạn ............................................................................21
Hình 2.3: Phản ứng của gốc tự do DPPH và chất chống oxy hóa ................................ 23
Hình 2.4: Quy trình đánh giá khả năng kháng oxy hóa DPPH ....................................24
Hình 2.5: Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase .................................26
Hình 3.1: Bột lá cây Lá đắng ........................................................................................29
Hình 3.2: So sánh IC50 của các mẫu cao và vitamin C .................................................31
Hình 3.3 : So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao .......................33
Hình 3.4: So sánh IC20 của các mẫu cao ......................................................................34
Hình 3.5: So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao theo dung môi 35
Hình 3.6: So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao theo nhiệt độ ...36
Hình 3.7: So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao theo tỉ lệ rắn –
lỏng ................................................................................................................................ 37
Hình 3.8: So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao theo thời gian ..38
Hình 3.9: So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao theo số lần chiết
.......................................................................................................................................39
Hình 3.10: Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao tối ưu .............................. 40
Hình 3.11: Khả năng kháng oxy hóa DPPH của cao tối ưu ..........................................40
Hình 3.12: Khả năng kháng viêm của cao tối ưu ..........................................................41
Hình 3.13: Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các phân đoạn .......................43

iii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Flavonoid có trong cây....................................................................................5
Bảng 1.2: Diterpenoid lactone trong cây .........................................................................7
Bảng 1.3: Các vernonioside phân lập bằng HPLC ........................................................11
Bảng 1.4: Các hợp chất có trong lá cây Lá đắng ........................................................... 12
Bảng 3.1: Kết quả lượng cao tổng ethanol thu được .....................................................29
Bảng 3.2: Kết quả chiết cao phân đoạn .........................................................................30
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát thực vật sơ bộ ....................................................................30
Bảng 3.4: Sơ bộ thực vật của các cao phân đoạn ..........................................................32
Bảng 3.5: Giá trị IC50, IC20 của cao tối ưu và cao tổng EtOH, nước. ........................... 41
Bảng 3.6: Các phân đoạn của cao dichloromethane sau khi chạy cột ........................... 42

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BuOH

n- butanol

DCM

Dichloromethane

DMSO

Dimethylsulfoxide

DPPH

1,1-diphenyl - 2 - picrylhydrazyl

EtOAc

Ethyl acetate

EtOH

Ethanol

GC-MS

Gas chromatography-Mass spectrometry

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

IR

Infrared Spectroscopy

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

MeOH

Methanol

p-NPG

para-nitrophenyl α-D-glucopyranoside

p-NP

para-nitrophenol

v


DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Hoạt tính kháng DPPH của cao EtOH tổng .................................................47
Phụ lục 2: Hoạt tính kháng DPPH của cao Hexane ......................................................47
Phụ lục 3: Hoạt tính kháng DPPH của cao DCM..........................................................47
Phụ lục 4: Hoạt tính kháng oxy hóa DPPH của cao EtOAc ..........................................48
Phụ lục 5: Hoạt tính kháng oxy hóa DPPH của cao n-Butanol .....................................48
Phụ lục 6: Hoạt tính kháng oxy hóa DPPH của cao phân đoạn nước ........................... 48
Phụ lục 7: Hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng nước ................................................49
Phụ lục 8: Hoạt tính kháng oxy hóa của vitamin C .......................................................49
Phụ lục 9: Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các cao ...................................50
Phụ lục 10: Khả năng kháng viêm của cao tổng EtOH .................................................50
Phụ lục 11: Khả năng kháng viêm của cao DCM .........................................................50
Phụ lục 12: Khả năng kháng viêm của cao EtOAc .......................................................51
Phụ lục 13: Khả năng kháng viêm của cao BuOH ........................................................51
Phụ lục 14: Khả năng kháng viêm của cao phân đoạn nước .........................................51
Phụ lục 15: Khả năng kháng viêm của cao tổng nước ..................................................52
Phụ lục 16: Khảo sát yếu tố dung môi (1) .....................................................................52
Phụ lục 17: Khảo sát yếu tố dung môi (2) .....................................................................52

Phụ lục 18: Khảo sát yếu tố nhiệt độ .............................................................................53
Phụ lục 19: Khảo sát yếu tố tỉ lệ rắn – lỏng ..................................................................53
Phụ lục 20: Khảo sát yếu tố thời gian ............................................................................54
Phụ lục 21: Khảo sát yếu tố số lần chiết ........................................................................54
Phụ lục 22: Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao tối ưu ............................. 55
Phụ lục 23: Khả năng kháng oxy hóa DPPH của cao tối ưu .........................................55
Phụ lục 24: Khả năng kháng viêm của cao tối ưu .........................................................56
Phụ lục 25: Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các phân đoạn ......................56

vi


TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Sản phẩm thực đạt được

STT

Sản phẩm đăng kí tại thuyết minh

1

Lá dược liệu khô đạt độ ẩm: 9,2%.

Lá dược liệu khô độ ẩm: < 12%.

2

Cao tổng ethanol: 43,6 g

Cao tổng ethanol 20 g.

Cao hexane, dichloromethane, etylacetat, butanol,

Cao hexane, dichloromethane,
etylacetat, butanol, nước: 2 g.

3

nước: 19,8 g.
Hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH:

4

Cao dichloromethane hoạt tính cao nhất IC50: 176,7
µg/mL.

5

6

7

Hoạt tính ức chế enym α-glucosidase: Cao phân Giá trị IC50 của cao tổng và cao thành
đoạn dichloromethane có khả năng ức chế cao nhất: phần.
I% = 94,3%.
Hoạt tính kháng viêm: Cao phân đoạn
dichloromethane có hoạt tính cao nhât IC20 = 74
µg/mL.
Phân lập được 7 phân đoạn từ cao dichloromethane
và thử hoạt tính ức chế enym α-glucosidase, trong

đó phân đoạn F2 có khả năng ức chế cao nhất ( ở
nồng độ 500 µg/mL với I% = 57%).
Khảo sát điều kiện chiết thích hợp:
+ Độ cồn: 40o.

8

+ Tỉ lệ lỏng-rắn: 5/1 (ml/g).
+ Số lần chiết: 3 lần.
+ Thời gian chiết: 40 phút
Cao tối ưu:
+ Hoạt tính kháng oxy hóa: IC50 = 51,9 µg/mL.

9

+ Hoạt tính kháng viêm: IC20 = 164 µg/mL.
+ Hoạt tính ức chế enym α-glucosidase: IC50 = 480
µg/mL.

Thời gian đăng kí: Từ tháng 4/2017 đến tháng 1/2018
Ngày nộp báo cáo: 18/01/2018
vii


LỜI MỞ ĐẦU
Nước ta có điều kiện khí hậu thuận lợi, đất đai màu mỡ là điều kiện để phát triển
hệ thực vật phong phú, đa dạng. Bên cạnh các thuốc hóa dược, đây là nguồn dược liệu
quý giá có giá trị sử dụng cao và giá trị kinh tế to lớn.
Từ lâu, con người đã biết tận dụng nguồn dược liệu quý giá từ thiên nhiên. Các bài
thuốc cổ truyền được bào chế từ các loại thảo mộc khác nhau đã được truyền lại qua các

thời kỳ. Ngày nay, các nhà khoa học đang nỗ lực tách chiết, phân lập các hoạt chất trong
cây cỏ tự nhiên, đồng thời tiến đến việc nghiên cứu tổng hợp và tìm cách sản xuất đại
trà để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về dược phẩm cho việc bảo vệ sức khỏe của người
dân.
Lá đắng là một loài cây dân dã, mọc ở nhiều nơi trên Thế Giới, đặc biệt là châu
Phi và các nước Đông Nam Á. Ở Việt Nam, Lá đắng được trồng nhiều ở các tỉnh Tây
Nguyên, Trung Bộ, Nam Bộ như Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng,
Quảng Nam, Bình Phước, Bình Dương, Đồng Nai, Tây Ninh, Bà Rịa-Vũng Tàu, Thành
phố Hồ Chí Minh, Thành phố Cần Thơ,. Y học dân gian các nước đã dùng Lá đắng để
trị các bệnh đường tiêu hóa, sốt, cảm cúm, tiểu đường, sốt rét, giun sán, đau lưng, đau
thần kinh do phong thấp, cao huyết áp, viêm họng, viêm phổi, viêm amidan… Ngày
nay, Lá đắng được biết đến với khả năng kháng viêm, kháng oxy hóa cao, trị bệnh tiểu
đường và chống ung thư tốt thông qua một số công trình nghiên cứu của các nhà khoa
học trên Thế Giới.
Ở Việt Nam, hiện nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu hoàn chỉnh nào về hoạt
tính sinh học của cây Lá đắng. Vì thế, đó là một điều đáng tiếc nếu chúng ta bỏ qua một
nguồn dược liệu thiên nhiên sẵn có và nhiều tiềm năng như vậy. Đó là lý do tôi chọn đề
tài “Nghiên cứu quy trình chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học từ lá cây Lá đắng
(Vernonia Amygdalina Del.) và thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase in vitro” được
trồng tại Đăk Lăk” với những mục tiêu:
-

Xây dựng quy trình chiết xuất tối ưu các loại cao chiết.

-

Đánh giá và so sánh các hoạt tính sinh học trong các cao chiết của lá cây Lá đắng.

-

Ứng dụng quy trình để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo và nâng cao giá trị
sử dụng trong lĩnh vực thực thẩm chức năng và định hướng trong dược phẩm
1


Chương I: Tổng quan

Chương 1.TỔNG QUAN
Tìm hiểu về cây Lá đắng

1.1.

Tên gọi
Cây Lá đắng có tên khoa học là Vernonia Amygdalina Del.
Giới: Plantae
Ngành: Angiosperms
Bộ: Asterales
Họ: Asteraceae
Chi: Vernonia
Loài: V. amygdalina
Loài này được Delile miêu tả khoa học lần đầu vào năm 1826, có tên Tiếng Anh
là Bitter Leaf hay Vernonia Tree. Dân gian thường gọi là cây Lá đắng do vị đắng của
nó, hay cây mật gấu miền Nam.
Phân bố
Là cây bụi mọc nhiều ở châu Phi, châu Á, vùng có khí hậu nhiệt đới như Nam Phi,
Nigeria, Cộng hòa Trung Phi, Congo, Angola, Ethiopia, Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc,
Việt Nam. Cây có nguồn gốc từ châu Phi, di thực đến nước ta qua các nước châu Á. Ở
nước ta, Lá đắng được trồng nhiều ở các tỉnh Tây Nguyên, Trung Bộ, Nam Bộ như
Quảng Nam, Bình Phước, Bình Dương, Đồng Nai, Tây Ninh, Bà Rịa-Vũng Tàu, Thành
phố Hồ Chí Minh, Thành phố Cần Thơ, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm

Đồng.
Mô tả khoa học
Là loại cây bụi rậm, mọc thẳng đứng, sống nhiều năm, phần gốc phân nhánh, trên
nhánh thông thường không phân chia thành các cành con, cành khi còn non có bì không
rõ rệt, phủ một lớp lông mềm mịn ngắn màu trắng, về sau lớp lông này dần rụng hết,
thân cây cứng, chi nhánh giòn, có màu xanh, cây có thể cao tới 4 m.

2


Chương I: Tổng quan

Lá hình mũi mác, thuôn dài, màu xanh đậm vừa, đỉnh và đáy lá thon, diện tích có
thể lên tới 28×10 cm, nhưng thường là 10-15×4-5 cm, mặt trên lá có lông thưa thớt, mặt
dưới lá lông mềm, nhạt và nhiều, mép lá có răng thưa rất nhỏ, có khi gần như liền mạch,
cuống lá ngắn.
Hoa: cụm hoa hình rổ, đường kính 3 – 5 mm, tụ thành cụm nơi đầu cành, hoa màu
trắng cho đến trắng phấn nhạt, đôi khi có cả màu tím hoặc phớt tím, hồng phớt hoặc
hồng phấn, cuống hoa mảnh, dài khoảng 10 mm, có lông mềm ngắn màu trắng, có mùi
thơm ngọt ngào, đặc biệt vào buổi tối. Hoa lưỡng tính. Cây nở hoa giữa tháng 12- tháng
3 và tháng 7, tháng 8.

Hình 1.1: Lá, hoa và cây lá đắng
Mùa thu hoạch
Vào mùa mưa, người ta thu hoạch bằng cách cắt chồi lá để cây ra chồi mới, chồi
mới ra sẽ được thu hoạch vài tuần sau đó. Vào mùa nắng, chỉ lá được thu hoạch.
Công dụng dân gian
Trong y học dân gian của nhiều nước, cây Lá đắng được sử dụng để trị các loại
bệnh khác nhau: [1]
Người Nigeria dùng Lá đắng để nấu soup. Ngoài ra lá và rễ được dùng để trị đau

bụng, rối loạn tiêu hóa, vệ sinh răng miệng, ngứa, nhiễm ký sinh trùng, nấm ngoài da,
sốt thương hàn, đau đầu, tiểu đường, táo bón, trĩ.
-

Ở Trung Quốc người ta cho rằng lá cây này có vị đắng, tính hàn, có công dụng
thanh nhiệt giải độc, tiêu thũng chỉ thống, trừ phong làm cho hết ngứa. Thường
được dùng hỗ trợ điều trị một số bệnh như: viêm phổi, cổ họng sưng đau, cổ
họng khô ngứa, viêm gan, viêm dạ dày tá tràng, xuất huyết dạ dày, bệnh trĩ
3


Chương I: Tổng quan

sưng đau, đau thần kinh do phong thấp, đau sưng do trật đả, lưng xương đau
buốt, đau mắt đỏ, cao huyết áp, đái tháo đường, mỡ máu cao.
-

Người dân nhiều nước ở Đông Nam Á còn sử dụng thường xuyên lá cây này
để trị liệu nhiều loại ung thư như: ung thư vú, ung thư hầu họng, ung thư tiền
liệt tuyến, ung thư phổi, ung thư kết tràng.

-

Nam Phi: Lấy bộ phận rễ để chữa rối loạn kinh nguyệt và hiếm muộn.

-

Ấn Độ: Dùng lá cây để chữa tiểu đường. Họ dùng cành và rễ hỗ trợ điều trị sốt,
cảm cúm, ho khan.

-

Tại Congo: Lấy lá và vỏ rễ chữa bệnh kiết lỵ, viêm loét dạ dày, nhiễm giun, sốt
rét.

-

Khu vực Tây Phi: Lá cây Lá đắng giúp lợi tiểu, chữa tiểu đường, táo bón, nhiễm
trùng da.

-

Ethiopia: dùng lá để trị các bệnh rối loạn dạ dày, vết thương ở da, tiêu chảy,
ghẻ, viêm gan, viêm amiđan, sốt, sán dây và nhiễm giun.

-

Người Cameroon dùng lá ngâm uống mỗi ngày để trị sốt rét và các bệnh đường
ruột

-

Ở Uganda: lá và rễ dùng để trị co giật, ho, đau tử cung, gây co tử cung, chảy
máu sau sinh, nạo phá thai, kinh nguyệt không đều, vô sinh, đau bụng nhiễm
trùng do vi khuẩn và nấm.

1.2.

Thành phần hóa học
Theo như các nghiên cứu trước đây, trong cây Lá đắng có chứa các chất như

alkaloid, flavonoid, sesquitertene, tannin, saponin, terpene, steroid, coumarin, phenolic
acid, lignan, xanthone, anthraquinone, edotide.
Theo như kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả trường Đại học Calabar, trong dịch
chiết thân và rễ của cây Lá đắng ước tính có chứa saponin (13.21±21 và 28.52±0.03 %),
flavonoid (1.02±0.04 và 0.51±0.05 %), alkaloid (7.02±0.04 và 6.11±0.02 %)
hydrocyanic acid (3.41±0.02 và 1.18±0.05 %). Phân tích nồng độ vitamins có trong dịch
chiết thân và rễ là: vitamins A (21.5±0.35 và 30.90±0.20 IU/100 g), C (49.00±4.4 và
10.30±2.5 mg/ 100 g) và E (106.20 ±1.90 và 35.83±1.90 IU/100 g), thiamin (0.50±0.00
và 0.37±0.00 mg/100 g) và niacin (0.03±0.005 và 0.05±0.002 mg/100 g). Các yếu tố
khoáng chất như selen, đồng, crom, kẽm và sắt cũng có mặt với số lượng nhỏ [2].
4


Chương I: Tổng quan

Flavonoids
Các flavonoids đã được tìm thấy trong cây Lá đắng là:
Bảng 1.1: Flavonoid có trong cây [3]
Hợp chất

Loại

Công thức
OMe
MeO

5, 7, 2’, 3’tetramethoxyflavonone

Flavonone

MeO

O

OMe

O
OMe
MeO

5-hydroxy-7, 2’, 3’trimethoxy flavones

Flavone

MeO

O

OH

O
MeO

5-hydroxy-7,2’,6’trimethoxyflavone

MeO

O

Flavone
OMe

OH

O

H3C
O
O

7-O-methyldihydrowogonin

Flavonone

O

H3C

OH

O

OCH3
H3CO

7-O-methylwogonin

O

Flavone
O

5


Chương I: Tổng quan
OMe
MeO

Flavone-1’, 2’-methylether

O

Flavone

O
OCH3
H3CO

7-O-methylwogonin-5glucoside

O

Flavone
O

O

O

HO

HO

OH
OH

OCH3
H3CO

Dihydroskullcapflavone

O

Flavone
OH

OH

O

Nhóm các tác giả của trường đại học Ibadan, Nigeria nghiên cứu dịch chiết cây Lá
đắng được thu hái ở khu vực Ibadan, Nigeria đã định tính được 3 flavones là luteolin,
luteolin 7-O-β-glucuronoside và luteolin 7-O-β-glucoside. 600 g bột dược liệu được
chiết với 3-4 L hệ dung môi methanol:nước (3:7), cao chiết được phân lập bằng sắc kí
cột LiChroprep RP18 thu được 3 phân đoạn: phân đoạn 1 MeOH:nước (3:7), phân đoạn
2 MeOH: nước (4:6), phân đoạn 3 MeOH: nước (5:5). Phân đoạn 1 tiếp tục thực hiện
sắc kí cột LiChroprep RP18 thu được phân đoạn 1A, 1A trích ly với EtOAc, phân đoạn
EtOAc tiếp tục chạy sắc kí cột Polyamide, sau đó kết tinh lại trong MeOH thu được 240

mg luteolin 7-O-β-glucuronoside. Phân đoạn 2 tiếp tục thực hiện sắc kí cột LiChroprep
RP18 thu được phân đoạn 2A, 2A tiếp tục chạy cột Polyamide thu được 2B, 2B được
trích ly với EtOAc sau đó kết tinh lại trong MeOH thu được 48 mg luteolin 7-O-βglucoside. Phân đoạn 3 được chiết với EtOAc sau đó nạp vào cột Cellulose, phân đoạn
40% MeOH được trích ly lại với EtOAc sau đó kết tinh lại trong MeOH thu được 8 mg
luteolin nằm trong pha EtOAc [4].

6


Chương I: Tổng quan
OH

OH
OH

OH

OH
O

HO

O

HO

O

O

HO
OH

OH

OH

O

Luteolin

O

Luteolin 7-O-ß-glucoside

Hình 1.2: Luteolin và luteolin 7-O-β-glucoside
Diterpenoid lactone
Các diterpenoid lactone đã được tìm thấy trong Vernonia Amygdalina Del. là:
Bảng 1.2: Diterpenoid lactone trong cây [3]
Tên

Loại

Công thức
O

O

HO

Andrographolide

Diterpenoid
lactone
HO
H

HO
O

O

Neoandrographolide

Diterpenoid

HO

CH3
CH2

lactone

HO
O

HO

O

CH3

HO

7


Chương I: Tổng quan
O

O

14-deoxyandrographolide

Diterpenoid

H

lactone
HO
H
OH

O
HO
O

Andrographoside

Diterpene

HO
H
OH
O

O

14-deoxy-11, 12-

Diterpenoid

didehydroandrographolide

lactone

H

HO
H
OH
O

andrographolactone

O

Diterpenoid
lactone

O

O

Andrograpanin.

CH3

Diterpene

H

H3C
HO

8


Chương I: Tổng quan

Sesquiterpene lactone
Nhiều loại sesquiterpene lactones đã được phân lập từ Vernonia Amygdalina Del.
như: vernolide, vernodalol, vernolepin, vernodalin, vernomygdin, hydroxyvernolide,
vernodalinol,

vernomenin,

vernolic,

7,24(28)-stigmastadien-3β-ol;

11,

13-

dihydrovernodalin; 11, 13-dihydrovernorodeline; 4, 15-dihydrovernodalin; 1, 2, 3, 15,
11, 13, 2’, 3’-octahydrovernodalin and epivernodalol [1, 3, 5].
Tác giả Xuan Luo đã phân lập và tinh chế vernodalinol (hay (4aR,5R,6S,7S,8aR)8a-ethenyloctahydro-5-hydroxy-7-[[2-(hydroxymethyl)-1-oxo-2-propen-1-yl]oxy]-α,4bis(methylene)-3-oxo-1H-2-benzopyran-6-acetic acid) bằng cách chiết 6 kg bột lá khô
bằng 30 L ethanol 85%, sau đó thực hiện quá trình chiết phân đoạn bằng các dung môi:
n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và nước, thu được 88,6 g cao n-butanol, cao n-butanol
được phân lập bằng sắc kí cột Silicagel (300-400 Mesh), dung môi sử dụng đi từ
Chloroform đến methanol, ở phân đoạn 80% chloroform 20% methanol phát hiện có vết
màu nâu trên sắc kí bản mỏng (Rf =0,6), phân đoạn này được kết tinh trong MeOH thu
được 120 mg tinh thể, dùng các phương pháp 1D, 2D NMR, IR, UV, HR-MS để xác
định cấu trúc của vernodalinol [6].
Ngoài ra, nhóm các tác giả của trường Đại học Wisconsin, Madison cũng đã tìm
được hai sesquiterpene lactone là vernodalin và vernomygdin bằng cách chiết 400 g bột
lá bằng chloroform, sau đó chiết phân đoạn bằng các dung môi ether dầu hỏa và
methanol, phân đoạn methanol thu được (7,8 g) tiếp tục chạy sắc kí cột silicAlt CC-7
(Mallinckrodt, 600 g) thu được các phân đoạn: E (86 mg), F (359 mg), G (132 mg), H
(866 mg), I (64 mg), J (187 mg), and K (177 mg). Phân đoạn H chạy sắc kí cột Silicagel
(Merck, 200 g), ở phân đoạn methanol-acetone-chloroform (1: 10: 190) thu được một
chất không màu (730 mg) được xác định bằng phổ MS là Vernodalin. Phân đoạn F chạy
sắc kí cột silicagel (100 g), ở phân đoạn methanolacetone-chloroform (1: 10: 90) thu
được hai chất, chất thứ nhất (200 mg) được kết tinh trong acetone-petroleum ether, được
xác định đó là vernolide bằng các phổ IR và NMR, chất thứ hai cũng được kết tinh trong
acetone-petroleum được xác định là vernomygdin (30 mg) [7].

9

Chương I: Tổng quan

O
O

Vernolide R =

O

O

O
O

O

O

OH

O

O

H

Hydroxyvernolide R =
O

R

OH

O

O

OH

Vernodalin

O

OH

O

O
O

O

O

O

OH

O

O

H

O
H

OH

H
OH

O
O

OCH3
O

Vernodalol

Vernomenin

Vernodalepin

O

O

O

O

O
O

O

OH

O

O
O

H

O
O

H

O

H
O

O

O

O

4,15-dihydrovernodalin

O

1,2,2',3'-tetrahydrovernodalin

1,2,11,13,2',3'-hexahydrovernodalin

O
O

O

O

O

O
O

OH

OH

O

O
O

H

O

H
O

O

O
O

1,2,3,15,11,13,2',3'-octahydrovernodalin

O
11,13-dihydrovernodalin

Vernomygdin

Hình 1.3: Sesquiterpene lactones phân lập từ V. amygdalina
Steroid Glucoside
Một trong những loại steroid glucoside chính có trong cây lá cây Lá đắng là
vernonioside bao gồm: vernonioside A1 (C35H52O10),vernonioside A2 (C35H52O10),
vernonioside A3(C35H50O10), vernonioside A4 (C35H52O11), vernonioside B1 (C35H52O10),
vernonioside B2(C36H52O12), vernonioside B3 (C37H54O11), vernonioside D (C35H52O12),
venonioside D2 (C35H50O10) và vernonioside E (C37H58O11) . Vernonia Amygdalina Del
10

OH

Chương I: Tổng quan

có vị đắng đặc trưng, vernonioside A1,vernonioside A2, vernonioside A3, vernonioside
A4 là thành phần đóng góp vào đặc điểm này trong khi vernonioside B1, B2, B3 không
gây ra vị đắng [1].
Nghiên cứu của nhóm tác giả Mitsuo Jisaka đến từ Nhật đã tìm thấy trong dịch
chiết của Vernonia Amygdalina Del các loại vernonioside là vernonioside A1,
vernonioside A2, vernonioside A3 và vernonioside B1. Nhóm tác giả thực hiện ngâm
dầm 800 g bột lá khô bằng methnol ở nhiệt độ thường thu được 94,9 g cao, tiếp tục phân
tán cao trong hệ dung môi n-hexane:MeOH:nước (5: 9: 1) lấy phân đoạn nặng hơn và
tiếp tục chiết với EtOAc:nước (1:1), phân đoạn nặng hơn tiếp tục chiết với n-butanol,
phân đoạn butanol được phân lập bằng sắc kí cột pha đảo ODS sillicagel với hệ MeOHNước thu được các phân đoạn chính và chạy HPLC để được các vernonioside tinh khiết
ở các phân đoạn như sau: [8]
Bảng 1.3: Các vernonioside phân lập bằng HPLC [8]
Tên chất

Vernonioside A4

Phân lập

Đặc trưng

HPLC phân đoạn

Rf: 0,47 methanol-nước (18:7)

methanol-nước 6:4

Vết màu vàng sau khi phun vanillin-

(Fr2)

sulphuric acid và cấp nhiệt

HPLC phân đoạn
Vernonioside B3

methanol-nước 8:2

Rf: 0.35, methanol-nước (3:1), màu vàng

(Fr4)

Vernonioside B2

HPLC phân đoạn
(Fr1)

Rf: 0.20, methanol-nước (3:1)
Vết màu xanh dương sau khi phun
vanillin-sulphuric acid và cấp nhiệt

11


Chương I: Tổng quan

O

OH

O

O

O

O

OH
R3

R3

R2
OH

Vernonioside A4: R=OGlc
Vernoniol A4: R=OH
R1

R1

OH

Vernonioside A1: R1=OGlc;
R2=beta-OH, H; R3=H

O

HO
OMe

A2: R1=OGlc
R2=alpha-OH, H; R3=H
A3: R1=OGlc;
R2=O; R3=H
Vernonioside B1: R1=OGlc;
R2=H2; R3=OH
Vernoniol B1: R1=OH
R2=H2; R3=OH
Vernoioside B3: R1=OGlc;
R2=alpha-OAc, H; R3=H

O

OH

Vernonioside B2

GlcO

Hình 1.4: Các vernonioside được phân lập từ lá cây Lá đắng
Các chất khác
Bảng 1.4: Các hợp chất có trong lá cây Lá đắng [3]
Tên

Loại

Công thức

OH

1, 8-dihydroxy-3, 7dimethoxy-xanthone

O

OH

MeO

xanthone
O

OH

4,8-dihydroxy-2,7dimethoxy-xanthone

OMe

O

MeO

OMe

xanthone
O
OH
OMe

1,2-dihydroxy-6, 8dimethoxy-xanthone

OH

O

OMe

hydroxy-xanthone

OH

xanthone
MeO

3,7,8-trimethoxy-1-

O

O

OH

MeO

xanthone
O

OMe

12


Chương I: Tổng quan
OH
OH
O

andrographidoid A

noriridoid

OMe
O
H

OH
OH
O

andrographidoid B

noriridoid

OMe
O
H

OH
OH

O

andrographidoid C

noriridoid

OMe
O
H

OH
OH
O

andrographidoid D

noriridoid

OH
O
H

OH

O

andrographidoid E

O

noriridoid
O

O

Nghiên cứu của E.M.Ilondu trên dịch chiết cồn của lá cây Lá đắng đã tìm được
một số terpenoid, acid béo và ester như sau: Isoamyl acetate, 1,1-diethoxy-3methylbutane; 3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol; hexadecanoic acid; methyl
ester của hexadecanoic acid và ethyl ester của hexadecanoic acid; phytol; 9,12octadecadienoic acid và ethyl ester của 9,12-octadecadienoic acid; linolenic acid và
ethyl ester của linolenic acid; eicosanoic acid và ethyl ester của eicosanoic acid [9].
1.3.

Hoạt tính sinh học

1.3.1. Kháng khuẩn
Kháng khuẩn là khả năng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các
chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một
13


Chương I: Tổng quan

nồng độ thường rất nhỏ. Những tính chất này thường có thể nhiều hợp chất khác nhau
như alkaloid, tannin, flavonoid, tinh dầu. Một số nghiên cứu cho thấy Lá đắng có hoạt
tính kháng khuẩn cao.
Theo nghiên cứu của Akinpelu, dịch chiết methanol 60% của cây Lá đắng được
trồng ở Nigeria, có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn gram dương như
B.cereus, B. pumilus, B. subtilis, E. cloacae, S. aureus và M. kristinae, đồng thời cũng
có khả năng chống lại các vi khuẩn gram âm như Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae và E.coli . Dịch chiết ethanol từ cây
cũng cho thấy hoạt tính chống lại vi khuẩn gram âm (E. coli và Salmonella typhi) và

gram dương (Clostridium sporogenes, Staphylococcus pyogenes và S. aureus) [10].
Các chất như saponins, flavonoids, alkaloids được tìm thấy trong cây cũng có khả
năng kháng khuẩn trong việc làm lành vết thương. Theo nghiên cứu của Jisaka cho thấy
vernolepin và vernomenin sở hữu tác dụng kháng khuẩn đối với B. subtilis và M. lutea.
4, 15 dihydrovernodalin chứng minh hoạt động kháng khuẩn cao nhất đối với B. subtilis
và M. lutea khi so sánh với vernolepin, vernolide, vernodalin và vernomenin. Vernodalol
cũng có khả năng kháng khuẩn đối với B. cereus, S. epidemidus, S. aureus, M. kristinae
và S.pyrogens (vi khuẩn gram dương) [3].
Hai loại sesquiterpene lactones được tìm thấy trong Vernonia Amygdalina Del là:
vernolide và vernodalol được thử nghiệm chống lại 10 chủng vi khuẩn và 5 loài nấm, cả
hai hoạt chất đều thể hiện khả năng diệt khuẩn đáng kể khi chống lại các vi khuẩn gram
dương, tuy nhiên lại thiếu hiệu quả với các vi khuẩn gram âm. Trong thử nghiệm kháng
nấm, vernodile thể hiện khả năng hoạt động cao với giá trị LC50 là 0,2; 0,3 và 0,4 mg/mL
với Penicillium notatum, Aspergillus flavus, Aspergillus niger và Mucor hiemalis,
vernodalol thể hiện khả năng ức chế Aspergillus flavus, Penicillium notatum và
Aspergillus niger với giá trị LC50: 0,3, 0,4 và 0,5 mg/mL tương ứng. Cả hai hợp chất
không có hiệu quả chống lại Fusarium oxysporum, một loại vi khuẩn được biết đến là
có khả năng chống lại nhiều tác nhân hóa học [11].
Theo nghiên cứu của Aliyu Ibrahim Yar’adua, Lawal Shuaibu và Abdullahi Nasir,
dịch chiết nước nóng từ cây Lá đắng có khả năng kháng khuẩn đối với vi khuẩn theo
thứ tự như sau: Klebsialla pneumonia >Pseudomonas aeroginosae > Staphylococcus
aureus, Salmonella typhi > Escherichia coli >Streptococcus [12].

14


Chương I: Tổng quan

1.3.2. Tiểu đường
Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng cây lá cây Lá đắng có thể trị bệnh tiểu

đường, cụ thể như sau:
Nghiên cứu của J. Atangwho trên dịch chiết lá Vernonia Amygdalina Del thử
nghiệm trên chuột cho thấy lượng đường trong máu giảm nhiều nhất khi sử dụng dịch
phân đoạn chloroform (33,3%). Sau 14 ngày thử nghiệm ở chuột mắc bệnh, đáp ứng cao
nhất của phân đoạn chloroform ở máu (23,5%) và huyết thanh (21,4%). Bằng phương
pháp GC-MS, người ta tìm thấy trong dịch chiết chloroform các hợp chất: linoleic acid
(4.72%), α-linolenic acid (10.8%) and phytols (12.0%) [13].
Thử nghiệm in vitro trên dịch chiết cây lá cây Lá đắng có khả năng ức chế hai loại
enzyme gây ra tiểu đường tuýp 2 là α-glucosidase và α-amylase ở nồng độ 4-16 μg/mL.
Khả năng ức chế α-glucosidase của dịch chiết cây Lá đắng là cao hơn so với khả năng
ức chế α-amylase của dịch chiết cây Lá đắng [14].
Một nghiên cứu khác trong việc giảm hàm lượng đường trong máu của dịch chiết
nước từ lá Vernonia Amygdalina Del trên thỏ cho thấy: lượng đường huyết lúc đói ở thỏ
đã giảm từ 96 mg% xuống còn 48 mg% trong vòng 4 giờ. Ở thỏ đã bị tiểu đường, lượng
đường trong máu giảm từ giá trị 520 mg% xuống còn 300 mg% trong vòng 8 giờ. Sự
giảm đường huyết này không liên quan đến sự tiết insulin [15].
1.3.3. Kháng oxy hóa
Nhiều nghiên cứu cho thấy lá Vernonia Amygdalina Del có khả năng kháng oxy
hóa khá cao trong thử nghiệm in vitro cụ thể như sau:
Nghiên cứu của nhóm tác giả Mbang A. Owolabi đánh giá hoạt tính kháng oxy
hóa in vitro của dịch chiết nước và ethanol từ lá Vernonia Amygdalina Del. Khả năng
chống oxy hóa của mỗi dịch chiết được đánh giá bằng các phương pháp khác nhau. Tổng
lượng phenolic và flavonoid và khả năng kháng oxy hóa của nó cũng được đánh giá.
Khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết cồn (10.09 ± 1.63 mM) cao hơn so với butylated
hydroxyanisole (BHA) (9.31 ± 1.17 mM ) và dịch chiết nước (8.75 ± 1.28 mM) [16].
Nhóm các tác giả của trường đại học Ibadan, Nigeria sau khi đã định tính được 3
flavones là luteolin, luteolin 7-O-β-glucuronoside và luteolin 7-O-β-glucoside đã đo
hoạt tính chống oxy hóa của nó, so sánh với BHA ở cùng một nồng độ 15 μg/mL thì
lutein cho khả năng kháng oxy hóa cao hơn, luteolin 7-O-β-glucuronoside và luteolin 7O-β-glucoside có khả năng kháng oxy hóa thấp hơn BHA. Kết quả cho thấy khả năng
15