Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12

bộ giáo dục và đào tạo

bộ y tế

trường đại học dược hà nội

lê xuân hoành

phân lập, tuyển chọn, phân loại
một số chủng Lactobacillus
sinh acid lactic mạnh và
nhạy cảm với Vitamin b12

luận văn thạc sĩ dược học

hà nội -2006


bộ giáo dục và đào tạo

bộ y tế

trường đại học dược hà nội

lê xuân hoành

phân lập, tuyển chọn, phân loại
một số chủng Lactobacillus
sinh acid lactic mạnh và
nhạy cảm với Vitamin b12
Chuyên ngành: Công nghệ Dược phẩm và Bào chế

Mã số:
60 73 01

luận văn thạc sĩ dược học

người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Từ Minh Koóng

hà nội -2006


Lời cảm ơn
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin chân thành cảm ơn tới
PGS.TS Từ Minh Koóng- người thầy đã trực tiếp tận tình hướng
dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS. TS Cao Văn Thu, TS Đàm
Thanh Xuân, đã đóng góp những ý kiến quí báu cho tôi trong quá
trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn TS Vũ Nguyên ThànhViện công nghiệp thực phẩm cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của thâỳ
cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Hoàn thành luận văn này, tôi cũng đã nhận được nhiều sự giúp
đỡ của các thầy cô và đồng nghiệp bộ môn Công nghiệp Dược,
phòng Đào tạo Sau đại học trường Đại học Dược Hà Nội.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè
những người đã luôn khích lệ và động viên tôi đạt được những
thành công ngày hôm nay.

Hà Nội, tháng 12 năm 2006

DS. Lê Xuân Hoành

Đặt Vấn đề
Công nghệ sinh học đang ngày càng có nhiều ứng dụng trong đời sống con
người, đặc biệt trong lĩnh vực y học, dược học. Tuy vậy ở Việt Nam nói
chung, trường Đại học Dược Hà Nội nói riêng, việc ứng dụng các kỹ thuật
sinh học phân tử trong nghiên cứu, sản xuất thuốc, nguyên liệu làm thuốc vẫn
chưa được chú ý và phát triển mạnh mẽ.
ở Việt Nam, do đặc điểm khí hậu nên nhóm vi khuẩn lactic có ở khắp mọi
nơi. Vì thế mà ngành công nghiệp thực phẩm dùng các quá trình lên men
lactic để chế biến, bảo quản thực phẩm, ngành dược nghiên cứu quá trình lên
men lactic và sử dụng vi khuẩn lactic vào nhiều mục đích khác nhau. Ví dụ
sản xuất acid lactic từ Lactobacillus chiếm 35% trong các nguồn sản xuất acid
này, tạo calcilactat, sữa chua có chứa calcilactat và vitamin B12 làm thực
phẩm chức năng điều trị còi xương. Thêm vào đó nhóm vi khuẩn lactic còn
được dùng sản xuất nhiều chế phẩm thuốc như: Antibio, Lactomin Đặc biệt
nhóm vi khuẩn này còn được dùng làm vi khuẩn kiểm định để định lượng
vitamin B12 ở nồng độ thấp và trong dạng hỗn hợp nhiều thành phần mà các
phương pháp phân tích hoá lý không thực hiện được. Chính vì vậy, chúng tôi
chọn đề tài: Phân lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng Lactobacillus
sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin B12 theo các mục tiêu:
1. Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus cho hiệu suất tổng hợp
acid lactic mạnh.
2. Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus nhạy cảm vitamin B12.
3. Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử chủng Lactobacillus
tuyển chọn được.
Nhằm tìm nguồn nguyên liệu cho công nghiệp lên men lactic và chủng
Lactobacillus để định lượng vitamin B12 bằng phương pháp vi sinh vật.


1

chương I: Tổng quan
1.1. Quá trình lên men lactic
1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn lactic
Vi khuẩn sinh acid lactic nằm chủ yếu trong các chi

Lactobacillus,

Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobarterium, Lactococcus. Việc
phân loại vi khuẩn lactic được mô tả khá rõ trong khoá phân loại của Bergey và
khoá phân loại Prokaryot. Ngoài ra một số loài nấm thuộc chi Rhizopus cũng có
khả năng tạo acid lactic từ các nguồn khác nhau. Nhìn chung tất cả các vi khuẩn
lactic đều là những chủng ưa nhiệt, hô hấp yếm khí hoặc vi hiếu khí. Đa số các vi
khuẩn trong nhóm này là Gram dương, chúng không có khả năng di động và hầu
hết không tạo bào tử [10],[1].
Hình dạng và kích thước của vi khuẩn lactic tương đối đa dạng, có thể là hình
cầu, hình que, có thể là các tế bào đơn độc hoặc liên kết tạo chuỗi. Nhóm vi
khuẩn này có thể sinh trưởng tốt trong điều kiện pH thấp, pH tối thích của chúng
là từ 3,5-5, chúng có khả năng đồng hoá nhiều loại đường khác nhau như đường
glucose, lactose, mantose, saccarose... Nhờ những đặc điểm này mà nhóm vi
khuẩn lactic có nhiều ưu thế trong bảo quản thực phẩm, đã có từ rất lâu đời trong
lịch sử phát triển của loài người [12],[1]. Cho đến những năm đầu của thế kỷ 20,
các nghiên cứu về quá trình lên men lactic mới được nghiên cứu nhiều và áp
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là thực phẩm và dược
phẩm. Đến nay, những nghiên cứu về sự lên men lactic vẫn tiếp tục được nghiên
cứu trên thế giới.
1.1.2. Chi Lactobacillus
Đây là chi lớn nhất trong họ vi khuẩn lactic với rất nhiều các chủng đã được
nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất. Dựa trên cơ sở về sự chuyển hoá gluxit

2

trong tế bào và sản phẩm tạo ra trong quá trình lên men mà chia chi này thành ba
nhóm chính.
Nhóm I: Là các chủng vi khuẩn lactic lên men đẳng hình hay còn gọi là đồng
hình. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là acid lactic, chiếm khoảng 9098% các sản phẩm khác chỉ xuất hiện dưới dạng vết rất nhỏ. Trong quá trình
chuyển hoá, acid lactic được tạo thành thông qua chu trình EMP. Hình thái và
kích thước của nhóm này phụ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy, thông
thường có dạng hình que, hình sợi, sinh sản theo hình thức phân chia tế bào.
Nhiệt độ thích hợp cho nhóm này phát triển là 40-60oC đối với loài ưa nhiệt và
28-35oC với loài ưa ấm. Đại diện điển hình cho nhóm này là L. acidophillus, L.
bulgaricus, L. delbrueckii [12],[17].
Nhóm II: Gồm những chủng thuộc loại lên men lactic dị hình không bắt buộc,
sản phẩm quá trình lên men có thể là acid lactic, acid acetic, acid formic, và
ethanol. Việc lên men là đồng hình hay dị hình tuỳ thuộc vào loại đường cung
cấp trong môi trường. Nếu là đường sáu C như glucose, hexose, frutose thì được
lên men đồng hình, còn nếu là các đường khác như pentose thì lên men dị hình
tạo acid lactic nhờ sự cảm ứng của enzym phosphoketolase. Tuy nhiên nhiều
nghiên cứu cho thấy nhóm này có xu thế sử dụng quá trình lên men đồng hình
hơn và một số loài có thể tồn tại cả hai quá trình lên men theo hai cơ chế khác
nhau. Đại diện cho nhóm này là các chủng L. plantarum, L. casei, L. helvesticus,
L. leichmanii [30],[10].
Nhóm III: Nhóm này là các chủng lên men dị hình bắt buộc, chuyển hoá
glucose theo con đường ED, tạo ra sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là
acid lactic, acid acetic, CO 2 , ethanol trong đó đường 5C được chuyển hoá thành
acid lactic và acid acetic. Các vi khuẩn trong nhóm này chủ yếu dạng hình que
dài hoặc mảnh, không tạo bào tử, có khả năng tồn tại ở nhiệt độ khá rộng là 2-

3

52oC, nhiệt độ phát triển tối ưu là 30-40oC. Nhóm này phân bố khá rộng trong tự
nhiên, thường có trong đất, nước, rau quả, trong ruột người và động vật. Đại diện
điển hình trong nhóm này là L. brevis, L. buchneri, L. fermentum [30],[2].
Bảng 1.1: Một số chủng Lactobacillus dùng trong sản xuất lactic
STT
1
2
3
4
5

Chủng
L. acidophillus
L. bulgaricus
L. delbrueckii
L. plantarum
L. casei

Nhiệt độ
ưa thích
37-45oC
40-45oC
48-52oC
30-35oC
28-32oC

Khả năng chuyển
hoá đường

lactose
lactose
saccarose
glucose, pentose
mantose, lactose

Sản phẩm
L(+) lactic
L(+) lactic
L(+) lactic
L() lactic
L(-) lactic

Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn Lactobacillus

1.1.3. ứng dụng của vi khuẩn lactic trong đời sống
Trong thực tế, vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều nhất trong lên men lactic
để bảo quản thực phẩm. Bản chất là việc tạo ra môi trường acid giúp ngăn cản sự
phát triển của các vi sinh vật gây thối, đồng thời tạo hương vị chua phù hợp với
khẩu vị. Acid lactic và vi khuẩn lactic còn giúp kích thích tiêu hoá, tạo sự ngon
miệng và góp phần duy trì sự cân bằng hệ vi khuẩn có lợi trong đường ruột. Lên
men lactic được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm như làm nem
chua, hoa quả muối, công nghiệp sữa và các sản phẩm từ sữa - điển hình là sữa
chua, bơ, pho mát [13],[14],[21].


4

Trong ngành dược acid lactic thường được sử dụng dưới dạng calci lactat
hoặc natrilactat, một thành phần chủ yếu trong dịch truyền Ringerlactat để bù

nước và điện giải cho bệnh nhân. Ngoài ra calcilactat còn là nguyên liệu chủ yếu
cho các thuốc giàu calci để bổ xung cho bệnh nhân bị thiếu calci dẫn đến co giật,
rối loạn tâm thần... hoặc bồi bổ cho phụ nữ có thai và trẻ nhỏ để tránh còi xương,
chậm lớn.
Chủng Lactobacillus acidophillus còn được sử dụng nhiều trong các chế
phẩm men tiêu hoá như Antibio, Lactomin để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu
hoá do loạn khuẩn ruột vì dùng kháng sinh dài ngày. Sản phẩm này sẽ giúp lập
lại hệ cân bằng vi sinh trong ruột [10].
Acid lactic cũng đóng một vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp
như dệt, sản xuất sơn và acid lactic tinh khiết còn sử dụng để sản xuất các sản
phẩm cao cấp khác.
1.1.4. Một số nghiên cứu và ứng dụng mới của chi Lactobacillus
Mặc dù các nghiên cứu về lên men lactic đã được triển khai rộng rãi và ứng
dụng nhiều trong sản xuất acid lactic phục vụ cho nhiều ngành công nghiệp khác
nhau song các nghiên cứu về lên men lactic vẫn tiếp tục được tiến hành trên thế
giới. Đã có thêm rất nhiều chủng vi khuẩn lactic mới được phân lập, định tên và
đưa vào sản xuất acid lactic [31]. Không chỉ vậy, hiện nay các nghiên cứu về lên
men liên tục để thay thế cho lên men gián đoạn đã được triển khai. Điển hình là
các nghiên cứu về bất động tế bào như bất động L. delbrueckii, Rhiropus oryzea
để sản xuất acid lactic bằng lên men liên tục [16],[26].
Lactobacillus còn được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất một số
enzym như phospho glycosidase từ chủng L. delbrueckii, purine 2
deoxyribosyltransferase từ chủng L. leichmanii, sản xuất xylo-oligo saccharides
từ chủng L. plantarum [22].


5

Một nghiên cứu mới khác về Lactobacillus là khả năng kháng khuẩn nhờ các
kháng sinh có bản chất peptid đã và đang được triển khai tại Thái Lan. Nghiên

cứu này cho thấy có khá nhiều chủng nằm trong chi Lactobacillus có khả năng
ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn ví dụ như S. aureus, E. coli,
Shigella...Các kháng sinh điển hình được chiết suất và nghiên cứu là: caseicin từ
chủng L. casei, plantaricin tử chủng L. plantarum, curvacin từ chủng L. curvatus,
brevicin từ chủng L. bravis [30]
Một mảng nghiên cứu lớn khác thuộc lĩnh vực công nghệ gen, rất nhiều các
chủng thuộc chi Lactobacillus đã được giải trình tự gen tổng hợp ARN ribosom
16S, một số gen tổng hợp các enzym như phospho glycosidase,
deoxyribosyltransferase cũng đã được nghiên cứu sâu [33]. Một vài plasmid của
vi khuẩn nhóm này cũng được tách chiết để làm vector biểu hiện gen. Đặc biệt
hơn nữa là lập bản đồ gen của một số chủng như L. plantarum, L. acidophillus
phục vụ cho các nghiên cứu di truyền vi sinh vật [20].
1.2.Các phương pháp định lượng vitamin B12.
1.2.1. Phương pháp đo quang phổ.
Những mẫu vitamin B12 thử tương đối tinh khiết thường được định lượng
bằng phương pháp đo quang phổ hoặc phương pháp so màu. Các dược điển
USP27, BP2001, dược điển Việt Nam III đều sử dụng phương pháp đo quang phổ
dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng của vitamin B12 ở bước sóng = 361nm
trong vùng tử ngoại và bước sóng =550nm trong vùng nhìn thấy
[4],[11],[9],[32]. Phương pháp này tương đối đơn giản, nhanh nhưng trong dung
dịch vitamin B12 đo quang có rất nhiều tạp chất, có thể là sản phẩm của những
quá trình oxi hoá, sản phẩm thuỷ phân hay những chất có công thức hoá học
tương tự. Những chất này có thể có quang phổ hấp thụ tương tự như vitamin B12


6

nhưng lại không có hoạt tính sinh học làm phép đo mất chính xác. Mặt khác, có
thể có một vài chất cobalamin tương tự như cyanocobalamin về tác dụng sinh học
và hiệu quả điều trị nhưng lại hấp thụ ở quang phổ cực đại có bước sóng khác. Vì

vậy, nồng độ dung dịch vitamin B12 đo được chưa hẳn đã chính xác.
1.2.2. Phương pháp hoá học
Phương pháp định lượng hoá học đầu tiên được thực hiện bởi Fantes, trong đó
vitamin B12 được thuỷ phân bằng dung dịch HCl đặc, nóng. Dung dịch acid màu
đỏ thu được sẽ được este hoá với alcol octylic. Những tạp chất sẽ được tách ra
bằng cách lắc nhẹ sản phẩm tạo thành với xăng nhẹ rồi sau đó rửa bằng acid
hydrocloric metanoic. Cuối cùng vitamin B12 sẽ được định lượng bằng phương
pháp so màu. Tuy nhiên phương pháp so màu cũng sẽ không chính xác nếu dung
dịch có những chất tương tự như vitamin B12 đồng thời các sản phẩm phân huỷ
cũng làm ảnh hưởng tới kết quả dù cho acid sinh ra trong quá trình thuỷ phân có
thể bị loại bỏ hết trong một số giai đoạn tinh chế [24]. Phương pháp này hiện nay
không được dùng để định lượng vitamin B12 mà chỉ có ý nghĩa lịch sử.
1.2.3. Định lượng vitamin B12 bằng phương pháp vi sinh vật
Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, một số vi sinh vật không phát triển
hoặc phát triển chậm trong môi trường không có vitamin B12, hay nói cách khác,
vitamin B12 là nhân tố phát triển của một số loài vi sinh vật. Kỹ thuật định lượng
bằng phương pháp vi sinh vật hay thực hiện nhất hiện nay là tiến hành trong các
ống nghiệm ở môi trường vô khuẩn như sau: Dung dịch vitamin B12 chuẩn và
dung dịch vitamin B12 thử với những nồng độ khác nhau được cho vào các ống
nghiệm sau khi đã cấy vi khuẩn được lựa chọn để thử nghiệm và ủ ở nhiệt độ
thích hợp trong vòng 24h. Mức độ phát triển của vi khuẩn được đo bằng máy đo
độ đục. Mật độ quang phản ánh nồng độ trung bình vi khuẩn khi có vitamin B12.


7

Ngoài ra các ống nghiệm này còn có thể đựơc ủ trong vòng 72h với nhiệt độ
thích hợp rồi định lượng bằng cách đo lượng acid đã được tạo thành trong quá
trình phát triển của vi khuẩn [1],[21],[23].
Một phương pháp khác cũng được sử dụng phổ biến là tiến hành trên đĩa

Petri, phương pháp này đối ngược với phương pháp định lượng kháng sinh. Trong
phương pháp này môi trường dinh dưỡng được làm đặc với agar và trộn với vi
khuẩn rồi đổ vào đĩa Petri. Dung dịch vitamin B12 thử và dung dịch vitamin B12
chuẩn được nhỏ vào các lỗ đục sẵn trong môi trường thạch. Sau một thời gian ủ,
vitamin B12 sẽ khuyếch tán ra môi trường xung quanh và kích thích vi khuẩn
phát triển. Đo đường kính vòng vi khuẩn phát triển của cả hai loại dung dịch rồi
tính kết quả nồng độ vitamin B12 cần xác định.
Trong cả hai phương pháp, sự phát triển của vi khuẩn tỉ lệ với logarit nồng độ
của dung dịch vitamin B12 và được biểu diễn bằng đường cong logarit trên đồ
thị. Mặc dù vậy, phương pháp này không phải lúc nào cũng dễ thực hiện vì một
số vitamin B12 liên kết với protein huyết tương hoặc không chọn được chủng vi
sinh vật kiểm định phù hợp [7],[3],[18]. Tuy nhiên phương pháp định lượng vi
sinh vật tương đối nhạy và được sử dụng trong trường hợp không áp dụng được
phương pháp so màu hoặc phương pháp hoá học. Đặc biệt việc định lượng bằng
phương pháp vi sinh còn cho phép phân biệt vitamin B12 có hoạt tính sinh học và
các chất tương tự trong mẫu thử một cách chính xác, đây là ưu điểm mà các
phương pháp khác không có được. Dưới đây là một số chủng vi khuẩn thường
dùng để định lượng vitamni B12 bằng phương pháp vi sinh vật:
Lactobacilii: Chủng đầu tiên được Shorp sử dụng là Lactobacillus lactic
Donner. Chủng này sau đó được thay thế bằng chủng Lactobacillus leichmanii
đưa ra kết quả chính xác hơn. Phương pháp này đã được Campell thẩm định lại
cẩn thận và ông nhận thấy rằng độ dày của môi trường có ảnh hưởng đến mức độ


8

phát triển của vi khuẩn. Song phương pháp này cũng có một số khó khăn là do
Lactobacilii không chỉ đáp ứng với vitamin B12 mà còn với thymidin và một số
deoxyribonucleosid khác [7],[1].
Eescherichia coli: Dracis và Mingioli đã thu được một số chủng E.coli đột

biến cần có vitamin B12 trong môi trường phát triển. Công trình của họ được
phòng thí nghiệm Glaxo Laboratories thử nghiệm định lượng vitamin B12 với
chủng E.coli đột biến M.1133 trong hộp Petri. Burkholder cũng thử nghiệm với
phương pháp định lượng trong ống nghiệm và cho kết quả khả quan. E. coli có
phần kém nhạy cảm hơn Lactobacilii nhưng môi trường định lượng đơn giản hơn
nhiều và cho kết quả đáng tin cậy trong những định lượng thông thường [7],[10].
Euglena gracis: Hunter và cộng sự đã đưa ra một loại vi khuẩn hoàn toàn mới
để định lượng vitamin B12 khi phát hiện thấy Euglena gracis cần có vitamin B12
trong quá trình quang hợp. Vi khuẩn này phát triển trong môi trường khá đơn
giản và rất nhạy trong các phản ứng định lượng vitamin B12. Tuy vậy, tốc độ
phát triển của vi khuẩn rất chậm nên phải cần tới 4-5 ngày để định lượng. Mặt
khác Robbins còn nhận thấy rằng Euglena gracis không đặc hiệu, nó còn nhạy
cảm với cả những chất tương tự vitamin B12 [10].
1.3. ứng dụng sinh học phân tử trong định tên vi sinh vật.
Phương pháp phân loại vi sinh vật trước đây chủ yếu dựa vào hệ thống phân
loại cổ điển căn cứ vào đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hoá còn thiếu tính ổn
định. Ngày nay, công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen đã giúp cho việc
định tên các loài nhanh, chính xác với độ tin cậy cao hơn. Hàng loạt các ứng
dụng trong phân tích trình tự ADN đã được triển khai trên thế giới để định tên
virus, vi khuẩn, nấm men ở Việt Nam, một số phòng nghiên cứu sinh học phân
tử đầu ngành hay các trung tâm sưu tập giống vi sinh vật đã sử dụng phương pháp


9

phân tích trình tự ADN ribosom để định tên vi sinh vật [8],[5]. Cho đến nay các
chuyên gia phân loại vi sinh vật đều cho rằng, phương pháp tốt nhất để định tên
vi sinh vật và thành lập cây phát sinh chủng là dựa trên trình tự ADNr kết hợp
với phương pháp phân loại kinh điển.
1.3.1. Trình tự ARN ribosom [5;2]

Hiện nay đa số các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tương
đồng về trình tự ARNr phản ánh mối quan hệ tiến hoá giữa các cá thể vi sinh vật.
Tất cả các loài vi sinh vật trong sinh giới đều sử dụng cách thức tổng hợp protein
nhờ ribosom. Vì vậy, tiến hành so sánh trình tự nucleotid của gen mã hoá ARNr
ở các vi sinh vật khác nhau để xác định mối quan hệ họ hàng và sự tiến hoá giữa
chúng. ARNr là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của vi sinh vật
và mối quan hệ giữa chúng bởi vì chúng là thành phần cơ bản có trong mọi tế bào
vi sinh vật. Vai trò và chức năng của chúng là giống nhau ở các ribosom. Các
nghiên cứu cũng cho thấy rằng, cấu trúc không gian của phân tử ARNr rất giống
nhau giữa các loài vi sinh vật khác nhau. Tức là cấu trúc của chúng thay đổi rất
chậm theo thời gian, hay nói khác đi là các gen mã hoá cho chúng được bảo tồn
rất bền vững và chặt chẽ trong quá trình tiến hoá. Tốc độ thay đổi các gen này
trong quá trình tiến hoá là rất chậm, nguyên nhân có lẽ là bởi vì sự ổn định là tính
chất quan trọng nhất của chúng.
Nhìn chung, các gen mã hoá cho ARNr rất bền vững (bảo thủ), tuy vậy ngay
trong bản thân các gen bền vững cũng chứa những vùng có mức độ bền vững cao
hơn và các vùng có mức độ bền vững thấp hơn (vùng biến đổi). Điều này xảy ra
là do các vùng gen đó mã hoá cho những vùng không gian khác nhau của phân tử
ARNr. Trong quá trình tiến hoá, các vùng gen đó có thể bị những đột biến nhất
định nhưng quá trình chọn lọc tự nhiên chỉ giữ lại những đột biến trung tính, ít


10

làm thay đổi và ảnh hưởng tới cấu trúc không gian của ARNr, ít ảnh hưởng đến
quá trình sinh tổng hợp protein của sinh vật. Còn những đột biến trong những
vùng không gian quan trọng làm ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein
của cơ thể thì ngay lập tức sẽ bị chọn lọc tự nhiên đào thải.
Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho phân tử ARNr các nhà
khoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuyếch đại các vùng biến

đổi. So sánh sự khác biệt giữa các vùng này để chỉ ra được những sự khác biệt
giữa các loài gần gũi. Theo Robert W. Bauman nếu hai loài vi khuẩn có sự khác
biệt về trình tự gen ARNr 16S lớn hơn 3% thì có thể xem là hai loài khác nhau.
Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23S là
lớn hơn so với phân tử ARN 16S. Tuy vậy trình tự đã xác định hoàn chỉnh của
gen ARNr 23S là rất ít trong khi đó trình tự gen của ARN 16S là khá phong phú
và được công bố rộng rãi trên ngân hàng gen thế giới. Chính vì vậy phương pháp
giải trình tự gen mã hoá ARNr 16S để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh chủng
loại của vi sinh vật vẫn là lý tưởng nhất.
Lần xuất bản thứ tư của cả Bergey manual of Systemmatic Bacteriology và
The Prokaryote đều dựa vào tiêu chuẩn ARN 16S làm tiêu chuẩn phát sinh loài
tương ứng của vi sinh vật. Chính vì vậy có thể nói phương pháp xác định trình tự
gen ARNr 16S là phương pháp phân tử phổ biến nhất được dùng để định loại vi
khuẩn.
Cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) được xây dựng dựa trên các khoảng
cách đã tính toán. Nó đang trở thành một công cụ đắc lực cho nghiên cứu phân
loại ở các cấp độ cao hơn chi. Sự tương đồng giữa phép phân loại dựa trên các
đặc điểm kiểu hình và cây phát sinh đã và đang được nghiên cứu một cách rộng
rãi. Nhìn chung các đặc điểm khoá phân loại đã đề cập ở trên cho thấy mối tương
quan tốt với cây phát sinh chủng loại.


11

1.3.2. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
1.3.2.1. Nguyên lý
Phản ứng PCR được phát hiện vào những năm 1980, đã tạo một bước đột phá
trong cuộc cách mạng di truyền học phân tử. Đây là phương pháp hoàn toàn mới
trong việc nghiên cứu và phân tích gen, hệ gen.
PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá

trình sao chép ADN có sự tham gia của enzym ADN-polymerase chịu nhiệt với
hai đoạn ngắn ADN một sợi làm mồi và dùng các đoạn ADN mạch đơn làm
khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ xung với nó. Do vậy để khởi đầu quá trình
tổng hợp ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotid (6-30 nucleotid). Đoạn này
sẽ gắn kết với ADN khuôn tại điểm khởi đầu quá trình sao chép và được ADNpolymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADN đặc thù. Chuỗi xoắn kép
ADN được nâng nhiệt độ lên trên 90oC (92-98o C) sẽ bung ra thành các sợi đơn
để làm khuôn [16],[6],[9].
Cả hai sợi ADN đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp ADN nếu
các đoạn mồi (primer hoặc oligonucleotid) được cung cấp đủ và bám vào vị trí
tương ứng ở cả hai sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở hai
đầu của đoạn ADN nhân lên để cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu tại
mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm nằm
giữa hai đoạn mồi
Độ dài của sản phẩm PCR có thể vài trăm đến vài chục ngàn cặp nucleotid.
Sau mỗi chu kỳ, các điểm bám mới cho đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN
vừa được tổng hợp mới, hỗn hợp phản ứng lại được gia nhiệt tới nhiệt độ thích
hợp để các sợi ban đầu tách ra và bắt đầu một chu kỳ tiếp theo [6],[9].


12

Sau n chu kỳ của phản ứng, sẽ có 2n bản sao các phân tử ADN mạch kép. Với
những ưu điểm như vậy, PCR đã nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi trong việc
chẩn đoán các bệnh về vius, vi khuẩn, các bệnh kí sinh trùng... Mặt khác, việc
phân tích thành phần, trình tự nucleotid trên phân tử ADN trong hệ gen có giá trị
quan trọng trong phân loại các loài sinh vật.
1.3.2.2. Tiến hành phản ứng PCR [6],[33]
PCR là một kỹ thuật tương đối dễ làm, vật liệu khởi đầu là ADN có chứa đoạn
cần nhân lên. Không phải lúc nào cũng cần thiết phải tách chiết đoạn cần nhân
lên vì công việc này có thể được các đoạn mồi dùng trong phản ứng xác định.

ADN làm khuôn tinh khiết thì phản ứng PCR rất nhạy và đặc hiệu, hàm lượng
ADN làm khuôn thường khoảng 1-100 ng ADN tổng số của hệ gen là đủ.
Nguyên liệu
ADN khuôn
Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN
Enzym chịu nhiệt ADN-polymerase, hay dùng là taq, chiết xuất từ vi
khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus
Hỗn hợp của tất cả 4 tiền chất deoxynucleotid (ở dạng dNTP)
Môi trường đệm cung cấp ion Mg++ và nước tinh khiết (không có
ADNase, ARNase...). Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR thông
thường là 50àl hoặc 20àl.
Các giai đoạn của phản ứng PCR
Bung liên kết của ADN (denaturation): Được thực hiện ở nhiệt độ
90-98oC trong vài giây đến vài phút. ở nhiệt độ này, các phân tử ADN
mạch kép sẽ bị tách ra tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các
đoạn mồi bám vào và enzym ARN-polymerase xúc tác tổng hợp.


13

Mồi bám: Hay còn gọi là ủ mồi (annealing), sau bước đầu tiên, ngay
lập tức, nhiệt độ hạ xuống còn 37- 68oC để các đoạn mồi bám vào các trình
tự bổ xung tương ứng trên các phân tử ADN làm khuôn.
Tổng hợp: Hay còn gọi là kéo dài (extension), nhiệt độ ngay lập tức
được nâng lên 68-72oC trong vài chục giây đến vài chục phút để các sợi
ADN vừa tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép, chính là sản phẩm
PCR.
Phản ứng xảy ra với 25-40 chu kỳ và tiếp tục cho đến chu kỳ cuối cùng. Sau
chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72oC trong 5-10 phút để tất cả sợi ADN
trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR. Cuối cùng nhiệt độ hạ xuống 4oC

để bảo quản. Phương pháp PCR không đòi hỏi ADN với số lượng lớn, nên có thể
sử dụng trực tiếp ADN mẫu vật để làm khuôn mà không cần phải nuôi cấy.
1.3.2.3. Kiểm tra và phát hiện sản phẩm PCR [6],[2],[5]
Sử dụng phương pháp điện di trên gel (thạch) agarose 0,8-2% để phát hiện và
đánh giá các sản phẩm PCR. Phương pháp này cho phép các acid nucleic hiển thị
trực tiếp và dựa trên một đặc điểm là các acid nucleic ở pH trung tính tích điện
âm nhờ các nhóm photphat nằm trên gốc photphodiester của các sợi acid nucleic.
Khi nằm trong một điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển về cực dương.
Khả năng chuyển dịch của các acid nucleic phụ thuộc vào kích thước, các acid có
phân tử lượng lớn sẽ chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ di chuyển nhanh hơn.
Loại gel sử dụng trong điện di đóng vai trò quan trọng đối với mức độ phân
tách các phân tử acid nucleic, phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ các lỗ có trong
gel. Có hai loại cơ bản là thạch agarose và thạch polyacrylamid, gel agarose
thường được dùng chạy trong máy điện di còn gel polyacrylamid thường được
dùng để phân tách các acid nucleic có kích thước nhỏ hơn.


14

Quá trình điện di được thực hiện bằng cách đưa mẫu acid nucleic vào gel và
đặt một điện áp vào đó cho đến khi chất nhuộm đánh dấu (thường là xanh
bromophenol) chạy tới đầu cuối của gel. Các acid nucleic ở trên gel thường được
hiển thị khi nhuộm bằng ethidium bromid và được quan sát dưới ánh sáng tử
ngoại. Các acid nucleic sẽ hiện lên ở dải băng màu trắng, kích thước các băng
ADN so sánh với chỉ thị di truyền (ADN marker) được cho vào cùng lúc với sản
phẩm PCR ở một lỗ riêng biệt cạnh các lỗ dùng phát hiện sản phẩm PCR.
ADN marker hay dùng nhất là ADN của thực khuẩn thể Lamda có chiều dài
43kb, được cắt bằng enzym giới hạn HindIII. ADN của thực khuẩn thể này được
enzym giới hạn cắt thành 8 phân đoạn có độ dài: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb;
2,3kb; 2,0kb; 0,56kb; 0,125kb. Tuy nhiên trên thực tế chỉ nhìn thấy 7 băng, còn

băng có chiều dài 0,125kb thì rất khó phát hiện. Nhờ các chỉ thị di truyền này mà
người ta xác định được độ dài của đoạn PCR sản phẩm.
1.3.2.4. Độ tin cậy của phương pháp PCR [6],[2]
Giống như quá trình sinh học trong tự nhiên, tái bản ADN là một quá trình
không hoàn hảo, đôi khi enzym ADN polymerase cũng nhân nhầm một nucleotid
không bổ xung vào chuỗi đang kéo dài của mình, tỷ lệ này trong tự nhiên khoảng
10-6. Trong tế bào, các bazơ không bổ xung này được một hệ thống sửa sai ngay
nhưng trong invitro Taq-polymerase không có khả năng sửa chữa những bazơ
nhân nhầm. Do vậy cứ tổng hợp 2*104 nucleotid bằng PCR thì có thể có một
nucleotid không chính xác. Tuy nhiên sai sót này không thực sự đáng ngại vì
trong ống nghiệm cùng một lúc có nhiều tập hợp phản ứng cùng nhân một đoạn
ADN giống nhau nên số ADN có một nucleotid sai sót là không lớn và sẽ được
điều chỉnh chính xác sau khi so sánh các chuỗi khác nhau của cùng đoạn gen.
Nhưng nếu dùng đoạn ADN này để làm vật liệu di truyền ban đầu để nhân tiếp


15

qua vector trong vi khuẩn E. coli cũng có thể gây nguy hiểm sai khác với vật liệu
ban đầu.
1.3.3. Xác định trình tự nucleotid của ADN
Xác định trình tự của các bazơ nucleotid trong ADN là phần trung tâm của
sinh học phân tử hiện đại, nó cung cấp những thông tin cấu trúc quan trọng. Các
phương pháp phân tích nhanh trình tự đã được hoàn thiện vào cuối những năm 70
và kỹ thuật này ngày nay được sử dụng rộng rãi [9],[2],[25].
Có thể xác định trình tự nucleotid thông qua trình tự acid amin. Tuy nhiên, bộ
ba mã hoá của 20 acid amin thường có một số nucleotid trùng lặp cho nên trình
tự ADN thu được chỉ đúng tương đối.
Kỹ thuật điện di phân đoạn đánh dấu đầu cuối cho phép xác định chính xác
trình tự chuỗi ADN sợi đơn. Có hai phương pháp chính để giải trình tự ADN là

phương pháp hoá học và phương pháp enzym.
1.3.3.1. Phương pháp xác định trình tự Maxam Gilbert (phương pháp hoá học)
Phương pháp này đòi hỏi phải có một đoạn ADN xác định để làm vật liệu
khởi đầu. Đoạn này không cần thiết phải tách dòng trong một vector Plasmid, kỹ
thuật có thể cho bất kỳ đoạn ADN nào. ADN sẽ được đánh dấu phóng xạ bởi
32

P tại đầu 5 của mỗi sợi và các sợi được biến tính tách nhau ra, tinh sạch để

cho một tập hợp các sợi được đánh dấu dùng trong các phản ứng xác định trình tự
[9].
Bước tiếp theo là sửa đổi hoá học với các bazơ trên sợi ADN. Việc này được
thực hịên nhờ 1 trong 4 phản ứng đặc hiệu khác nhau. Sau đó các bazơ bị sửa đổi
được loại khỏi nhóm đường của chúng và các sợi bị cắt tại vị trí này bằng
pipericlin. Nguyên lý ở đây là một số lượng lớn các phân tử trong các phản ứng
khác nhau sẽ tạo ra các đoạn có một đầu kết thúc tại các bazơ khác nhau và có
chiều dài chỉ khác nhau một nucleotid. Người ta gọi đó là đoạn xếp [2].


16

1.3.3.2.Phương pháp xác định trình tự Sanger Coulson (Phương pháp
enzym hay dicleoxy).
Mặc dù kết quả cuối cùng cũng hoàn toàn như phương pháp hoá học nhưng kỹ
thuật laị hoàn toàn khác nhau. Trong trường hợp này, bản sao của ADN cần xác
định trình tự được tạo ra từ klenom của ADN polymeraza. Khuôn dùng cho phản
ứng là ADN sợi đơn và đoạn mồi cần được dùng để cung cấp đầu 3 cho ADN
polymeraza nhằm bắt đầu tổng hợp đoạn sao.
Việc sản xuất các đoạn xếp được thực hiện bằng cách xen deoxynucleotid tri
photphat (dNTP) trong mỗi phản ứng. Các dNTP này thiếu nhóm hydroxyl tại vị

trí 3 của deoxyribose, yếu tố này cần thiết cho quá trình kéo dài chuỗi khi tổng
hợp ADN. Các dNTP được sửa đổi như vậy gọi là các dideoxynucleotid tri
photphat (ddNTP). Bốn ddNTP là A,T, G, C được đưa cả vào 4 phản ứng và mỗi
phản ứng đều diễn ra với 4 dNTP bình thường. Nồng độ của các dạng dideoxy
phải ở mức để chúng có thể đính vào chuỗi ADN đang tổng hợp một cách liên
tục. Như vậy, mỗi phản ứng tạo ra hàng loạt các đoạn kết thúc tại một nucleotid
đặc thù và 4 phản ứng gộp lại sẽ cung cấp một bộ các đoạn xếp [2],[29].
Chiều ADN được đánh dấu bằng cách gắn một dNTP phóng xạ trong hỗn hợp
phản ứng. Đó thường là [ - 35S]dATP, nó cho phép đọc một đoạn trình tự dài hơn
từ mỗi gen riêng biệt so với đánh dấu bằng 32P như vẫn dùng trước đây.
1.3.3.3. Điện di và đọc trình tự
Các đoạn xếp ADN sinh ra trong các phản ứng trên được tách nhau ra bằng
cách điện di trên gel polyacrylamid. Các gel này thường chứa 6-20%
polyacrylamid và 7 M ure, chất này tác động như một nhân tố biến tính làm giảm
hiệu quả hình thành cấu trúc bậc hai của ADN. Điều này là quan trọng vì các
đoạn có chiều dài chỉ khác nhau một nucleotid được tách nhau ra trên gel. Các
gel hết sức mỏng (<0,5mm) và được đặt trong hiệu điện thế cao có thể nung nóng


17

chúng lên tới 60-700C. Điều này góp phần duy trì các điều kiện biến tính [27],
[29].
Khi gel đã chạy xong, tách ra khỏi máy và được sấy khô trên giấy để dễ vận
chuyển. Sau đó chúng được áp vào phim nhạy phóng xạ. Sự phát xạ của mỗi mẫu
đánh dấu sẽ hoạt hoá các hạt bọc trên phim làm cho chúng biến thành màu đen
khi tráng rửa trên phim. Kết quả tạo ra biểu đồ phóng xạ. Biểu đồ được đọc từ
dưới lên trên, từ đoạn nhỏ nhất về phía trên. Trong phương pháp này trình tự hàng
trăm bazơ có thể được xác định trên một gel riêng biệt. Sau đó các thông số về
trình tự được xem xét trên máy vi tính, máy này có thể thực hiện các phép phân

tích như dịch sang trình tự các acid amin, xác định các điểm cắt của enzym giới
hạn, các đoạn tương đồng và cấu trúc khác nhau như khởi điểm và các đoạn có
chức năng điều khiển.
1.4. áp dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu về chi
Lactobacillus
Các kĩ thuật gen thông thường được sử dụng nhiều trong nghiên cứu vi sinh
vật là PCR, multiplex PCR, sequencing. Có nhiều bài báo của các tạp chí uy tín
trên thế giới đã công bố những kết quả nghiên cứu về chi Lactobacillus rất đáng
quan tâm. Các nghiên cứu này đều tập trung đi sâu vào nghiên cứu sự khác nhau
ở mức độ phân tử của cấu trúc gen, đặc biệt là các chủng có quan hệ họ hàng
thân thích để lập nên cây phát sinh chủng giống trong tiến hoá.
Qua phân tích trình tự của một số gen quan trọng, người ta đã tiến hành xác
định các gen quí hiếm và các gen có ích để thực hiện bảo tồn và phát triển công
nghiệp hoá sinh. Một số chủng đã xác định xong bản đồ gen, vị trí các gen quan
trọng, điểm khởi đầu quá trình sao chép ADN và trình tự các đoạn bảo thủ để
thiết kế các đoạn mồi đặc hiệu cho kỹ thuật PCR [33],[17]. Cấu trúc protein của
một số enzym như purine 2 deoxyribosyltransferase cũng đã xác định ở mức


18

ph©n tö. D­íi ®©y lµ c©y ph¸t sinh chñng gièng cña chi Lactobacillus ®· ®­îc
c«ng bè:
H×nh 1.2. C©y ph¸t sinh chñng gièng dùa trªn tr×nh tù ADNr 16S


19

chương II: NGUYÊN LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất
- Bromo cresol purple (BCP)

- dung dịch SDS

- Acid lactic chuẩn

- dung dịch đệm TAE

- Pepton, cao nấm men

- ethidium bromid

- Glucose

- phenol/cloroform(1:1)

- Mồi cho phản ứng PCR: primer MST 1 /MST 2
- Vi khuẩn Lactobacillus được phân lập từ nước muối dưa, cà, các loại trái cây
như: chuối, dứa, khế, đào, mận, xoài
2.1.2. Máy móc, thiết bị
- Box cấy

Sanyo ( Nhật)

- Nồi hấp

Nga

- Tủ ấm CO 2

Sanyo (Nhật)

- Máy li tâm

Rotofix (Hettich)

- Máy siêu li tâm

Sigma (Sartorius)

- Máy đo pH

Thụy sỹ

- Máy chạy PCR

Perkin AM 9700 (Mỹ)

- Điện di

Bio-rad (Mỹ)

- Máy sequencing ABI prism 3100 Avant

Mỹ

- Đĩa Petri, pipetman các loại, ống eppendorf, ống nghiệm, đầu côn các loại

20

2.1.3. Mét sè m«i tr­êng sö dông trong nghiªn cøu
M«i tr­êng ph©n lËp vi khuÈn sinh acid (m«i tr­êng BCP)
Cao nÊm men

2,5g

Pepton

2,5g

Glucose

5g

Tween80

1g

L-cystein

0,1g

Bromo cresol purple

0,06g

Th¹ch

18g

N­íc cÊt

1000 ml
pH= 6,8-7

M«i tr­êng nu«i cÊy vi khuÈn lactic (m«i tr­êng MRS)
Pepton

10g

Glucose

20g

Cao thÞt

10g

Cao nÊm men

5g

Triamoni citrat

2g

Acetat natri

5g

Tween 80

1g

K 2 HPO 4

2g

MgSO 4 .7H 2 O

0,2g

MnSO 4 .4H 2 O

0,05g

CaCO 3

5g

Th¹ch

18g

N­íc cÊt

1000ml

pH = 6,8-7


21

Môi trường thử độ nhạy cảm của vi khuẩn Lactobacillus với vitamin B12 [10]
KH 2 PO 4

1g

MnSO 4 .4H 2 O

0,5g

Glucose

10g

Thạch

15g

Nước cất

1000ml
pH = 6,5

Các môi trường đều được thanh trùng ở 121oC; 0,6 atm trong 20 phút
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập vi khuẩn sinh acid

Môi trường sử dụng cho phân lập là môi trường BCP, đây là môi trường chủ
yếu được sử dụng để phát hiện các vi khuẩn sinh acid do khả năng đổi màu của
chỉ thị từ màu tím ở pH trung tính sang màu vàng ở pH acid (<4,5).
Phương pháp phân lập được sử dụng là phương pháp hai lớp thạch. Cân
khoảng 5g mẫu trái cây rồi cắt nhỏ cho vào ống falcon chứa 20ml nước cất vô
trùng, ngâm và lắc trong vòng 15 phút. Lần lượt pha loãng ở nồng độ 10-2 10-5
và cấy trên đĩa Petri có chứa môi trường phân lập với độ dày từ 2-3mm. Sau đó
đổ tiếp lớp thạch có nồng độ 1,5% đã đưa về nhiệt độ khoảng 45oC với độ dày
khoảng 1-2mm. Để các đĩa thạch trên vào tủ ấm 42oC trong 2-3 ngày rồi quan
sát.
Đĩa thạch sau khi quan sát các khuẩn lạc có sự biến đổi môi trường xung
quanh màu từ tím sang vàng sẽ được làm thuần khiết trên môi trường BCP. Dùng
kim mũi mác lật nhẹ lớp thạch trắng phía trên sao cho gọn, dùng que cấy lấy
khuẩn lạc vi khuẩn sinh acid rồi cấy ziczac nhiều lần trên đĩa Petri cho đến khi