Bước đầu nghiên cứu dược động học của glycyl funtumin trên động vật thí nghiệm bằng LC MSMS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DS. LÊ THỊ THU HUYỀN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU DƯỢC ĐỘNG HỌC
CỦA GLYCYL FUNTUMIN TRÊN ĐỘNG VẬT
THÍ NGHIỆM BẰNG LC-MS/MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2011

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
DS. LÊ THỊ THU HUYỀN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU DƯỢC ĐỘNG HỌC
CỦA GLYCYL FUNTUMIN TRÊN ĐỘNG VẬT
THÍ NGHIỆM BẰNG LC-MS/MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 607315

Người hướng dẫn khoa học: TS.Phùng Thị Vinh

HÀ NỘI, NĂM 2011

2


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phùng
Thị Vinh, Ths. Tạ Mạnh Hùng- Trung tâm đánh giá Tương đương sinh họcViện Kiểm nghiệm thuốc TW và TS. Nguyễn Hoàng Anh- Bộ môn Dược
lực- Trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ của Trung tâm đánh giá
Tương đương sinh học- Viện Kiểm nghiệm thuốc TW và các kỹ thuật viên của
Bộ môn Dược lực- Trường Đại học Dược Hà Nội, đã cộng tác và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc- Viện Kiểm nghiệm thuốc TW đã tạo điều
kiện cho tôi được tham gia chương trình đào tạo thạc sỹ Dược tại trường Đại
học Dược Hà nội.
Tôi chân thành cảm ơn Ban giám hiệu và các thầy cô giáo của trường
Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được trau dồi những kiến thức
và kinh nghiệm quí báu trong suốt quá trình học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình, cùng toàn
thể bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên
cứu.
Hà nội, ngày 10 tháng 10 năm 2011
Lê Thị Thu Huyền

3

MỤC LỤC

NỘI DUNG
ĐẶT VẤN ĐỀ
Phần 1. TỔNG QUAN
1.1. HOẠT CHẤT GLYCYL FUNTUMIN
1.1.1. Công thức cấu tạo
1.1.2. Tính chất hóa lý
1.1.3. Tác dụng dược lý

TRANG
1
3
3
3
3
4

1.1.4. Chỉ định và liều dùng
1.1.5. Tác dụng không mong muốn
1.1.6. Tình hình nghiên cứu về hoạt chất GF
1.2. XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ DĐH TRÊN ĐỘNG VẬT

4
4
4
6

THÍ NGHIỆM
1.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH

9

SINH HỌC
1.3.1. Kỹ thuật xử lý mẫu
1.3.1.1. Kỹ thuật tủa protein

10
10

1.3.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng
1.3.1.3. Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE- solid phase extraction)
1.3.2. Kỹ thuật phân tích định lượng
1.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học
1.3.3.1. Độ chọn lọc
1.3.3.2. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
1.3.3.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
1.3.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày
1.3.3.5. Tỷ lệ thu hồi
1.3.3.6. Nghiên cứu độ ổn định của AN
1.4. HỆ THỐNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LOẠI TỨ CỰC

11
12
13
14
14
14

15
15
15
16
16

CHẬP BA

4


1.4.1. Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt (HESI)
1.4.2. Bộ phận vận chuyển ion (ion transfer tube)
1.4.3. Bộ phận thấu kính hội tụ (tube lense)
1.4.4. Bộ phận phân tích khối loại tứ cực chập ba
1.4.5. Bộ phận phát hiện (detector)
1.4.6. Hệ thống bơm chân không
PHẦN 2. NGUYÊN VẬT LIỆU- ĐỐI TƯỢNG- NỘI DUNG

17
19
20
20
21
22
23

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

23

2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Xây dựng phương pháp phân tích

24
24
24

2.3.1.1. Xây dựng điều kiện khối phổ xác định GF và chuẩn nội
2.3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký

24
25

2.3.1.3. Khảo sát qui trình xử lý mẫu huyết tương
2.3.1.4. Nghiên cứu khảo sát sự biến thiên nồng độ GF trong
huyết tương chó
2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích
2.3.2.1. Thẩm định độ chọn lọc của phương pháp
2.3.2.2. Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
2.3.2.3. Xây dựng đường chuẩn
2.3.2.4. Thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

25
26

2.3.2.5. Xác định tỷ lệ thu hồi của chuẩn và chuẩn nội
2.3.2.6. Nghiên cứu độ ổn định của GF

2.3.3. Xác định một số thông số DĐH cơ bản của GF trên chó
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

26
27
27
27
27
28
28
29
31
31

3.1.1. Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng GF và chuẩn nội
3.1.1.1. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ định lượng GF

31
31

3.1.1.2. Khảo sát lựa chọn chuẩn nội
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký

34
35

5

3.1.3. Xây dựng qui trình xử lý mẫu huyết tương
3.1.4. Kết quả khảo sát sự biến thiên nồng độ GF trong
huyết tương chó
3.2. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
3.2.1. Độ chọn lọc của phương pháp
3.2.2. Xác định giới hạn định lượng dưới
3.2.3. Xây dựng đường chuẩn

37
41
43
45
47
48

3.2.4. Độ đúng- độ chính xác trong ngày và khác ngày
3.2.5. Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất và nội chuẩn

50
52

3.2.6. Nghiên cứu độ ổn định
3.2.6.1. Độ ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn
3.2.6.2. Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông

53
54
54

3.2.6.3. Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong autosampler)

3.2.6.4. Độ ổn định dài ngày
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ DĐH CỦA GF
TRÊN CHÓ
PHẦN 4. BÀN LUẬN
4.1. Phương pháp phân tích định lượng GF trong huyết tương chó
4.1.1. Phương pháp xử lý mẫu
65
4.1.2. Phương pháp định lượng GF
4.2. Kết quả xác định thông số DĐH của GF trên chó
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
68

55
56
57
64
64
64
66

68
KẾT LUẬN
1. Về xây dựng phương pháp phân tích

68

2. Về thẩm định phương pháp phân tích
3. Xác định thông số DĐH của GF trên chó
KIẾN NGHỊ

68
69
69

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

6


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Giải thích

AML

Amlodipin besylat

AN

Chất phân tích

ASEAN

Hiệp hội các nước Đông Nam Á

AUC

Diện tích dưới đường cong

Autosampler

Hệ thống tiêm mẫu tự động

CC

Đường chuẩn

Cl

Hệ số thanh thải

Cmax

Nồng độ đỉnh

CV

Hệ số biến thiên

DĐH

Dược động học

DIL

Diltiazem hydroclorid

EMEA

Cơ quan quản lý Dược Châu Âu

FDA-Mỹ

Cơ quan quản lý thực dược phẩm Mỹ

GF

Glycyl Funtumin

HESI

Ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt

HPLC

Sắc ký lỏng cao áp

HQC

Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao

IM

Tiêm bắp

IS

Chuẩn nội

IV

Tiêm tĩnh mạch

LC-MS

Sắc ký lỏng khối phổ

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng khối phổ hai lần

LLOQ

Giới hạn định lượng dưới

LQC

Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp

7


MeCN

Acetonitril

MeOH

Methanol

MQC

Mẫu kiểm tra ở nồng độ giữa

m/z

Khối lượng/điện tích

QC

Mẫu kiểm tra

SAL

Salbutamol sulphat

SD

Độ lệch chuẩn

SPE

Chiết pha rắn

T

Thời gian

T1/2

Thời gian bán thải

TB

Trung bình

Tmax

Thời gian đạt nồng độ đỉnh

Triple quadrupole

Tứ cực chập ba

Vd

Thể tích phân bồ

VKNTTW

Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương

v/v

Thể tích/thể tích

8

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN
TÊN BẢNG

TRANG

Bảng 3.1- Điều kiện khối phổ để định lượng GF và IS..........

41

Bảng 3.2- Nồng độ GF (ng/mL) trong huyết tương chó sau ..

42

khi tiêm bắp và tiêm tĩnh mạch với liều 0,6mg GF ...............
Bảng 3.3- Cách chuẩn bị các dung dịch CC-W .....................

44

Bảng 3.4- Cách chuẩn bị các dung dịch QC-W .....................

44

Bảng 3.5- Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời

46

gian lưu của GF .....................................................................
Bảng 3.6- Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời

46

gian lưu của IS ......................................................................
Bảng 3.7- Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới ...........

47

Bảng 3.8- Kết quả khảo sát đường chuẩn ..............................

48

Bảng 3.9- Sự tương quan giữa nồng độ GF trong huyết tương

49

và tỷ lệ đáp ứng pic GF/IS .....................................................
Bảng 3.10- Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày

50

Bảng 3.11- Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác khác ngày

51

Bảng 3.12- Kết quả xác định tỷ lệ thu hồi của IS ..................

52

Bảng 3.13- Kết quả xác định tỷ lệ thu hồi của GF .................

53

Bảng 3.14- Độ ổn định ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ ............

54

Bảng 3.15- Kết quả nghiên cứu độ ổn định của GF trong mẫu

55

huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã đông ..............................
Bảng 3.16- Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý trong

56

autosampler ...........................................................................
Bảng 3.17- Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương

57

Bảng 3.18- Nồng độ GF (ng/mL) trong huyết tương chó sau

60

9


khi tiêm bắp liều 0,6mg .........................................................
Bảng 3.19- Nồng độ GF (ng/mL) trong huyết tương chó sau

61

khi tiêm tĩnh mạch liều 0,6mg ...............................................
Bảng 3.20- Một số thông số DĐH của GF trên chó ở đường
tiêm bắp và tiêm tĩnh mạch với liều 0,6mg ............................

10

63


DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN
TÊN HÌNH
TRANG
Hình 1.1- Công thức cấu tạo của Glycyl Funtumin Hydroclorid ..........
3
Hình 1.2- Mô tả qui trình xử lý mẫu bằng kỹ thuật tủa protein ............
11
Hình 1.3- Mô tả qui trình xử lý mẫu bằng kỹ thuật SPE ......................

12

Hình 1.4- Mô tả cấu tạo hệ LC-MS loại tứ cực chập ba .......................

17

Hình 1.5- Cấu tạo nguồn ion hóa HESI................................................

18

Hình 1.6- Mô tả cơ chế ion hóa kiểu phun điện tử ...............................

18

Hình 1.7- Cấu tạo bộ phận vận chuyển ion ..........................................

19

Hình 1.8- Mô tả bộ phận phân tích khối loại tứ cực chập ba ................

20

Hình 3.1- Phổ khối của dung dịch chuẩn GF .......................................

31

Hình 3.2- Giản đồ điện thế của bộ phận thấu kính hội tụ .....................

33

Hình 3.3- Giản đồ cường độ tín hiệu của các mảnh ion con tạo thành..

33

từ [GF-H]+ ...........................................................................................
Hình 3.4- Phổ khối khi phân mảnh [GF-H]+ ở mức thế 32V ................

34

Hình 3.5- Sắc ký đồ mẫu chuẩn chứa GF và IS với điều kiện sắc ký ...

37

đã xây dựng ..........................................................................................
Hình 3.6- Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng khi xử lý bằng phương pháp

39

tủa protein....................................................................................................
Hình 3.7- Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng khi xử lý bằng phương pháp

39

chiết lỏng- lỏng............................................................................................
Hình 3.8- Sắc ký đồ mẫu huyết tương chuẩn chứa GF và IS khi xử lý .....

39

bằng phương pháp chiết lỏng- lỏng ............................................................
Hình 3.9- Sắc ký đồ mẫu huyết tương chuẩn chứa GF và IS khi xử lý ....

45

bằng phương pháp chiết lỏng- lỏng ............................................................
Hình 3.10- Sắc ký đồ mẫu chuẩn GF trong huyết tương ở nồng độ ......

45

0,5ng/mL ..............................................................................................
Hình 3.11- Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó trước khi dùng thuốc có ...

11

58


chứa IS .................................................................................................
Hình 3.12- Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó ở thời điểm 15 phút sau ...

58

khi tiêm bắp..........................................................................................
Hình 3.13- Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó ở thời điểm 10 phút sau ...
khi tiêm tĩnh mạch ................................................................................
Hình 3.14- Đường cong trung bình nồng độ- thời gian của 06 chó trên 62
đường tiêm tĩnh mạch và tiêm bắp........................................................

12

59


ĐẶT VẤN ĐỀ
Glycyl Funtumin Hydroclorid (GF.HCl) là một aminoacyl steroid, được
nghiên cứu tổng hợp từ pregnenolon qua trung gian phtalimid bởi tập thể các
nhà khoa học Dược Việt Nam. Hoạt chất này có tác dụng kích thích miễn dịch
dịch thể qua trung gian tế bào và khá an toàn đối với tế bào[2][3]. Sau gần
năm mươi năm nghiên cứu và phát triển, năm 2002, chế phẩm thuốc tiêm
miễn dịch Aslem (Glycyl Funtumin hydroclorid 0,3mg) đã ra đời. Chế phẩm
này được công ty cổ phần Dược phẩm Vĩnh Phúc sản xuất theo công nghệ

chuyển giao của trường Đại học Dược Hà Nội. Khi đó, để đáp ứng nhu cầu
điều trị, Cục quản lý Dược Việt nam đã cấp phép lưu hành cho Aslem (số
đăng ký VD-0105-06), mặc dù chưa có đủ nghiên cứu về Dược động học
(DĐH) của thuốc.
Thông tin về DĐH của thuốc không chỉ quan trọng đối với bác sĩ lâm
sàng trong việc hướng dẫn sử dụng thuốc mà còn là những gợi ý tốt cho các
nhà bào chế trong giai đoạn nghiên cứu phát triển thuốc. Hiện nay, khi qui
chế về đăng ký thuốc ngày càng thắt chặt thì đó là một nội dung bắt buộc,
không thể thiếu trong bộ hồ sơ đăng ký thuốc đặc biệt đối với các thuốc mới.
Chính vì vậy, nhu cầu về nghiên cứu DĐH cho hoạt chất GF là thực sự cần
thiết.
Để triển khai các nghiên cứu DĐH của một thuốc, điều quan trọng là
phải xây dựng được một phương pháp định lượng đủ độ nhạy và đủ độ tin
cậy. Đối với GF, ở mức liều dự định thử trên người là 0,6mg, nồng độ GF
trong máu được dự đoán ở nồng độ rất thấp – khoảng ng/mL. Vì vậy, không
thể sử dụng các thiết bị thông thường như máy quang phổ, sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) với các detector UV-VIS, huỳnh quang… do không đủ
nhạy.

13


Hiện nay, bằng việc phối hợp hai kỹ thuật: sắc ký và phân tích khối phổ
hai lần, có thể giải quyết được vấn đề về độ chọn lọc và độ nhạy của phương
pháp phân tích định lượng GF trong dịch sinh học. Giới hạn phát hiện của hệ
thống LC-MS-MS có thể đến 10-14 gam [8].
Nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn về nghiên cứu DĐH của GF và dựa trên
điều kiện trang thiết bị hiện có tại Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh
học- VKNTTW, chúng tôi tiến hành đề tài “Bước đầu nghiên cứu Dược
động học của Glycyl Funtumin trên động vật thí nghiệm bằng LC-MS/MS”

với mục đích tạo cơ sở cho các nghiên cứu DĐH của GF trên người tình
nguyện.
Mục tiêu cụ thể của đề tài là:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng GF trong huyết tương chó
bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần LC-MS/MS.
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định một số thông số Dược động
học của GF trên chó sau khi dùng liều đơn ở đường tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch
và sinh khả dụng tuyệt đối đường tiêm bắp.

14


Phần 1. TỔNG QUAN
1.1. HOẠT CHẤT GLYCYL FUNTUMIN
1.1.1. Công thức cấu tạo[3]

Hình 1.1- Công thức cấu tạo của Glycyl Funtumin Hydroclorid
- Công thức phân tử: C23H38O2N2.HCl
- Trọng lượng phân tử: 410,5 Da
- Tên khoa học: N- (aminoethanoyl)- 3α- pregnan- 20- on hydroclorid.
1.1.2. Tính chất hóa lý[3]
Glycyl Funtumin bản chất là một aminoacyl steroid, được tổng hợp dưới
dạng muối với HCl hoặc HBr.
- Tính chất vật lý:
+ Bột kết tinh màu trắng, vị hơi đắng và chát nhẹ;
+ Bị phân huỷ ở nhiệt độ 220-230°C;
+ Dễ tan trong nước nóng và methanol, tan trong chloroform, khó tan
trong nước nguội;
+ Năng suất quay cực: dung dịch 0,5% trong MeOH ở 250C có [α]D = 88980.
- Tính chất hóa học:

+ GF có tính chất hóa học của một amin, tham gia phản ứng tạo muối
với các acid HCl, HBr (dạng dược dụng là GF.HCl); tham gia các phản ứng
alkyl hóa và dễ bị oxy hóa;

15


+ GF có bản chất là một phân tử amid nên dễ bị thủy phân khi đun nóng;
+ Có tính chất hóa học của một ceton, tham gia phản ứng cộng hợp vào
nhóm carbonyl, phản ứng oxy hóa khử nhóm carbonyl…
1.1.3. Tác dụng dược lý
Các kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy: thuốc có tác dụng kích thích
miễn dịch dịch thể và qua trung gian tế bào theo cơ chế hoạt hóa chức năng
thực bào của đại thực bào và tăng chuyển dạng lympho bào. Ngoài ra nó còn
có tác dụng tăng cường sức đề kháng và chống nhiễm khuẩn ở mô hình
invitro và mô hình thực nghiệm gây viêm phúc mạc bởi trực khuẩn mủ xanh
kháng kháng sinh[3].
1.1.4. Chỉ định và liều dùng
- Chỉ định: Aslem được chỉ định kết hợp với phẫu thuật, hoá trị liệu và xạ
trị để điều trị bổ trợ ung thư đường tiêu hoá (gan, dạ dày, đại trực tràng, tuỵ),
ung thư phổi và ung thư vú. Kết hợp hiệp đồng với kháng sinh nhằm mục
đích điều trị và ngăn ngừa nhiễm trùng trước và sau phẫu thuật [3].
- Liều dùng: từ 0,3 đến 1,0 mg/lần, cách 3 ngày tiêm 1 lần.
1.1.5. Tác dụng không mong muốn
Ở liều điều trị, chưa có báo cáo nào về tác dụng phụ nguy hiểm. Một số
biểu hiện như: mẩn ngứa, mề đay, nôn, buồn nôn, táo bón có xảy ra nhưng rất
hiếm gặp[3].
1.1.6. Tình hình nghiên cứu về hoạt chất GF
- Trên thế giới:
Từ những năm 1957-1958, Funtumin được Giáo sư Khương Hữu Quý và

cộng sự tại Pari nghiên cứu chiết tách từ lá cây Funtumia latifolia stapf,
Apocynaceae, có nguồn gốc Châu Phi. Năm 1965, tại Viện nghiên cứu hóa
học các hợp chất tự nhiên ở Gif-Sur-Yvette, Giáo sư Nguyễn Đăng Tâm đã
dùng Funtumin để bán tổng hợp một dãy các aminoacyl steroid, trong đó có

16


GF dưới dạng muối với hydrobromid (LH1) và thử tác dụng dược lý của hoạt
chất này. Sau đó, do thiếu nguồn nguyên liệu nên quá trình bán tổng hợp GF
bị hạn chế và dừng lại[3].
Như vậy, trên thế giới chưa có nhiều tác giả nghiên cứu về hoạt chất này
đặc biệt là các nghiên cứu về Dược động học, các nghiên cứu về phương pháp
định lượng trong dịch sinh học…
- Ở Việt Nam:
Năm 1973, Giáo sư Tôn Thất Tùng đã sử dụng GF trong điều trị bổ trợ
cho bệnh nhân ung thư gan tại bệnh viện Việt Đức. Từ đó các nghiên cứu về
độc tính, tác dụng dược lý, cơ chế tác dụng cũng như các thử nghiệm theo dõi
phản ứng bất lợi, hiệu quả điều trị trên bệnh nhân ung thư vú, ung thư phổi và
ung thư đường tiêu hóa được triển khai khá nhiều và thu được những kết quả
khả quan[3][9].
Đến năm 1984, nhằm chủ động về nguồn nguyên liệu phục vụ điều trị,
nhóm nghiên cứu gồm Giáo sư Đặng Hanh Phức và Phó giáo sư Đào Kim
Chi đã tổng hợp thành công GF từ pregnenolon qua trung gian phtalimid. Sau
gần 50 năm nghiên cứu và phát triển, năm 2002, chế phẩm thuốc tiêm miễn
dịch Aslem (Glycyl Funtumin 0,3mg) đã ra đời. Chế phẩm này do công ty cổ
phần Dược phẩm Vĩnh Phúc sản xuất. Khi đó, để đáp ứng nhu cầu điều trị,
Cục quản lý Dược đã cấp số đăng ký lưu hành cho Aslem (Số đăng ký: VD0105-06) mặc dù chưa có đủ những nghiên cứu về DĐH của thuốc[3].
Hiện nay không chỉ ở Việt Nam mà trên toàn thế giới, qui chế về đăng ký
thuốc ngày càng thắt chặt. Do vậy những thông tin về DĐH của một thuốc là

phần không thể thiếu trong bộ hồ sơ đăng ký thuốc. Ngoài ra những thông tin
này thực tế rất hữu ích cho các nghiên cứu trong lĩnh vực bào chế, chuyển hóa
thuốc… và cho việc hướng dẫn sử dụng thuốc an toàn hiệu quả. Chính vì vậy,

17


nghiên cứu DĐH cho hoạt chất GF là một nhu cầu thực tiễn cần được giải
quyết.
Năm 2005, tác giả Phạm Như Quỳnh- Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành
đề tài “Ứng dụng LC-MS để khảo sát Dược động học của Glycyl Funtumin ở
động vật thí nghiệm”[11]. Đề tài đã đưa ra một số thông số: Cmax: 0,16µg/mL,
AUC0-24giờ: 1,245µg.mL-1.giờ, Tmax: 12,25giờ sau khi tiêm bắp trên chó với
liều 0,6mg. Tuy nhiên, nghiên cứu mới dừng lại trên số lượng chó là 02 con
và phương pháp định lượng cũng còn nhiều điểm hạn chế như:
- Phương pháp được xây dựng dựa trên kỹ thuật phân tích khối phổ một
lần- nhận diện chất phân tích thông qua số khối của ion chất phân tích- ion mẹ
(parent ion) nên độ chọn lọc và độ nhậy chưa cao;
- Thời gian phân tích khá dài: 15 phút/mẫu, chưa phù hợp để có thể phân
tích nhiều mẫu trong cùng một ngày;
- Quá trình đánh giá, thẩm định phương pháp phân tích chưa tuân thủ
theo những hướng dẫn hiện hành về thẩm định phương pháp phân tích trong
dịch sinh học, nên chưa đảm bảo được độ tin cậy của phương pháp.
Vì vậy để có thể đưa ra những dữ liệu tin cậy, cần thiết phải thực hiện
những nghiên cứu chuẩn mực hơn nhằm xây dựng phương pháp phân tích
định lượng GF trong huyết tương chó có độ chọn lọc, độ tin cậy cao hơn và
có thể ứng dụng cho các nghiên cứu DĐH của GF trên chó.
1.2. XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ DĐH TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM
Dược động học là khái niệm phản ánh số phận thuốc trong cơ thể. Đó là
quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hoá và thải trừ thuốc. Các thông số DĐH

cơ bản của một thuốc thường bao gồm: Cmax, Tmax , AUC0-t, T1/2, Vd, Cl[16].
Để nghiên cứu DĐH của một thuốc, người ta thường tiến hành rất nhiều
thử nghiệm trên các đối tượng khác nhau như: mô; các cơ quan cô lập; động
vật thí nghiệm; người tình nguyện khỏe mạnh; bệnh nhân ở các lứa tuổi, giới

18


tính và chủng tộc khác nhau…[20]. Vì thế đây là quá trình nghiên cứu kéo
dài, tốn nhiều thời gian, công sức, tiền bạc nhưng đóng một vai trò rất quan
trọng trong quá trình phát triển thuốc.
Nghiên cứu DĐH trên động vật thí nghiệm là bước ban đầu cho quá trình
nghiên cứu DĐH của thuốc. Các kết quả thực nghiệm trên động vật sẽ là định
hướng tốt cho việc triển khai nghiên cứu DĐH trên người tình nguyện về thiết
kế chế độ liều, bố trí lấy mẫu… và ý nghĩa hơn là có thể dự đoán các thông số
DĐH trên người dựa trên mối tương quan về mặt giải phẫu, sinh lý, sinh hóa
giữa người và động vật thí nghiệm.
Cũng như các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh
học của thuốc trên người, quá trình xác định các thông số DĐH của thuốc trên
động vật thí nghiệm thường trải qua những bước sau[22]:
Bước 1: Chuẩn bị về mặt phương pháp: tiến hành xây dựng và thẩm
định phương pháp phân tích theo các hướng dẫn hiện hành.
Bước 2: Thiết kế nghiên cứu, lựa chọn đối tượng thử, xác định liều
thử.
Bước 3: Cho dùng thuốc, lấy mẫu, xử lý và bảo quản mẫu.
Bước 4: Phân tích xác định nồng độ thuốc có trong mẫu thử.
Bước 5: Xây dựng đường cong biến thiên nồng độ thuốc theo thời
gian.
Bước 6: Tính toán các thông số DĐH dựa trên kết quả phân tích thu
được.

Trong qui trình trên, xây dựng phương pháp phân tích được coi là bước
quyết định đến tính khả thi, khả năng thành công của nghiên cứu và đồng thời
cũng là bước khó nhất. Phương pháp phân tích được xây dựng phải đảm bảo
đủ độ nhạy, độ tin cậy để có thể áp dụng trong việc định lượng nồng độ thuốc

19


trong dịch sinh học. Chính vì vậy việc xây dựng và thẩm định phương pháp
phân tích luôn được ưu tiên đầu tư về thời gian, công sức và tiền bạc.
Về việc lựa chọn động vật thí nghiệm, theo nhiều tài liệu tham
khảo[12][15][24], các loài gặm nhấm như chuột và thỏ ít được dùng do kích
thước cơ thể nhỏ, không phù hợp để lấy một thể tích mẫu lớn (đặc biệt là mẫu
máu). Ngoài ra, cấu tạo đường tiêu hóa của loài này khác về cơ bản so với
người nên khi thử với các thuốc dùng qua đường tiêu hóa thì kết quả dao động
nhiều. Khỉ là loài động vật có kích thước lớn hơn, có đường tiêu hóa rất giống
với người nhưng có hệ mạch tương đối nhỏ nên khó khăn trong quá trình lấy
máu. Trong khi đó, theo một số tài liệu tham khảo, cấu tạo đường tiêu hóa của
chó cũng gần giống với người, các loại thuốc dùng cho người đều có thể dùng
cho chó, có thể lấy máu và nước tiểu với thể tích đủ cho nghiên cứu, có thể
lưu giữ cho nghiên cứu đa liều hoặc nghiên cứu chéo (một chó cân nặng trung
bình khoảng 10kg có thể lấy từ 10-15 lần, 3-5 mL/lần trong vòng 24 giờ sau
khi dùng thuốc mà không ảnh hưởng đến chức năng sinh lý bình thường)[15].
Thực tế ở Việt Nam đã có nhiều tác giả dùng chó trong nghiên cứu và kết quả
thu được khá khả quan. Chính vì vậy, chó được xem là loài động vật thích
hợp nhất cho các nghiên cứu DĐH của thuốc.
Về loại mẫu lấy, mẫu máu là phổ biến nhất trong các loại mẫu dịch sinh
học như nước tiểu, nước bọt, dịch não tủy… đặc biệt đối với các nghiên cứu
trên động vật thí nghiệm. Vì quá trình thao tác lấy mẫu dễ dàng, chủ động hơn
và có thể lấy được lượng mẫu đủ cho phân tích định lượng. Thông thường,

mẫu máu sau khi lấy sẽ được ly tâm ngay để tách lấy lớp huyết tương và bảo
quản trong tủ đá (-800C đến -200C) đảm bảo độ ổn định của thuốc trong suốt
quá trình lấy mẫu đến khi được phân tích xong.
Về thiết kế chương trình lấy mẫu, các thời điểm lấy mẫu phải được thiết
lập sao cho có thể ước lượng tương đối chính xác giá trị Cmax và thu được

20


đường cong nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian phản ánh đúng
nhất đặc điểm DĐH của thuốc. Đối với các thuốc dùng theo đường uống, lấy
ít nhất 4 điểm trước Tmax và ít nhất 6 điểm sau Tmax. Đối với thuốc dùng theo
đường tiêm tĩnh mạch, do thuốc được đưa thẳng vào hệ tuần hoàn nên lấy
mẫu ngay sau khi dùng thuốc. Thời điểm lấy mẫu cuối cùng bằng khoảng 7
lần thời gian bán thải của thuốc (T1/2)[13][22].
Tuy nhiên khi triển khai nghiên cứu DĐH cho các chế phẩm thuốc mới,
do chưa có giá trị ước lượng của Tmax hay T1/2 nên sẽ rất khó khăn trong việc
bố trí lấy mẫu. Vì vậy người ta thường tiến hành nghiên cứu khảo sát nhằm sơ
bộ xác định sự biến thiên nồng độ thuốc trong dịch sinh học từ đó có thể thiết
kế chương trình lấy mẫu phù hợp cho nghiên cứu chính thức. Ngoài ra, từ kết
quả khảo sát có thể dự đoán được giá trị Cmax giúp cho việc xác định khoảng
nồng độ tuyến tính phù hợp cho phương pháp phân tích (nghĩa là khoảng
nồng độ của đường chuẩn bao phủ được toàn bộ khoảng nồng độ thuốc có
trong các mẫu thử).
1.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC
Trong các nghiên cứu về Dược động học, Sinh khả dụng, Tương đương
sinh học… phương pháp định lượng hoạt chất/ chất chuyển hóa trong dịch
sinh học đóng một vai trò rất quan trọng, quyết định đến khả năng thành công
của các nghiên cứu này. So với các phương pháp phân tích thuốc trong chế
phẩm bào chế, phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học có nhiều

điểm khác biệt. Đó là: nền mẫu phức tạp (thường chứa muối, lipid,
protein…), khoảng nồng độ biến thiên rộng, nồng độ hoạt chất thấp có thể đến
cỡ ng/mL. Ngoài ra, lượng mẫu thường rất ít nên không thể tiến hành định
lượng lặp lại nhiều lần và số lượng mẫu phân tích lớn có thể tới vài trăm mẫu.
Chính vì vậy đòi hỏi phương pháp phải có độ nhạy, độ chọn lọc cao, độ tái lặp
tốt và thời gian phân tích cho một mẫu đủ ngắn.

21


Trên cơ sở đó, khi tiến hành xây dựng một phương pháp phân tích thuốc
trong dịch sinh học cần chú trọng ba vấn đề cơ bản, đó là: kỹ thuật xử lý mẫu,
kỹ thuật phân tích định lượng và cách tiến hành thẩm định phương pháp phân
tích nhằm đảm bảo độ tin cậy của phương pháp.
1.3.1. Kỹ thuật xử lý mẫu
Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu…) thường chứa
một tỷ lệ lớn các protein làm cản trở khả năng phát hiện và định lượng dược
chất. Vì vậy mẫu phải được loại tạp trước khi tiến hành phân tích. Hiện nay,
để xử lý mẫu huyết tương người ta hay áp dụng ba kỹ thuật cơ bản đó là: tủa
protein, chiết lỏng- lỏng, chiết pha rắn.
1.3.1.1. Kỹ thuật tủa protein
Nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng tác nhân tạo tủa để loại đi phần
lớn lượng protein có trong nền mẫu. Một số kỹ thuật để gây tủa hoặc loại
protein[17], đó là:
- Thêm acid mạnh như acid tricloroacetic, percloric để làm thay đổi pH
của nền mẫu;
- Thêm muối như ammoni sulfat hoặc ion kim loại như Zn+2 để làm thay
đổi lực ion;
- Thêm dung môi hữu cơ như methanol, acetonitrile làm giảm hằng số
điện môi của dung dịch;

- Thay đổi nhiệt độ: đun nóng mẫu làm biến tính protein;
- Lọc hoặc siêu lọc.
Thực tế, để xử lý mẫu huyết tương dùng cho phân tích định lượng, người
ta hay dùng phương pháp acid hóa và thêm dung môi hữu cơ. Với 2-3 mL
dung môi hữu cơ hoặc 200-500 µL acid 10%, có thể kết tủa được trên 99%
lượng protein có trong 1 mL mẫu huyết tương. Sau khi kết tủa protein, tiến
hành ly tâm với tốc độ cao để thu được dịch nổi, lọc và tiêm sắc ký.

22


Hình 1.2- Mô tả qui trình xử lý mẫu bằng kỹ thuật tủa protein
Kết tủa protein là kỹ thuật đơn giản, kinh tế và dễ tiến hành. Tuy nhiên
nhược điểm của kỹ thuật này là nền mẫu thu được thường không sạch (vì
trong mẫu còn các thành phần không phải protein chưa được loại đi), mẫu bị
pha loãng khi tủa bằng dung môi hữu cơ hoặc hoạt chất bị biến đổi khi thêm
acid vào trong mẫu. Đặc biệt khi tiến hành phân tích định lượng bằng kỹ thuật
khối phổ, các tạp chất còn lại trong nền mẫu có thể đồng rửa giải với chất
phân tích gây nên hiện tượng khử ion (ion suppression) và làm suy giảm
cường độ tín hiệu thu được. Ngoài ra do mẫu không sạch nên cột hay bị tắc và
tuổi thọ của cột bị giảm.
Như vậy, tùy thuộc vào bản chất hóa lý của hoạt chất và điều kiện phân
tích cụ thể mà xem xét đến việc lựa chọn kỹ thuật này.
1.3.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng
Nguyên tắc của kỹ thuật chiết lỏng- lỏng trong xử lý mẫu huyết tương là
chuyển chất phân tích từ nền mẫu huyết tương (pha nước) sang dung môi hữu
cơ không đồng tan với nước. Các bước thực hiện cơ bản [17] là:
- Chuyển chất phân tích sang dạng trung tính (các chất có bản chất base
sẽ được kiềm hóa, các chất có bản chất acid sẽ được acid hóa);
- Dùng dung môi hữu cơ thích hợp để chiết chất phân tích;

- Lắc, ly tâm và hút lấy lớp dung môi hữu cơ;

23


- Bốc hơi dung môi để thu được cắn.
- Hòa tan cắn trong pha động để tiêm sắc ký.
Như vậy, so với kỹ thuật tủa protein thì xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết
lỏng- lỏng phức tạp hơn và trong một số trường hợp cho tỷ lệ thu hồi thấp
hơn. Nhưng ưu điểm của kỹ thuật này là mẫu thu được tương đối sạch và có
thể làm giàu mẫu (hòa tan cắn trong một lượng nhỏ pha động để làm tăng
nồng độ hoạt chất có trong mẫu). Trên thực tế, người ta có thể phối hợp giữa
kỹ thuật tủa protein với kỹ thuật chiết lỏng- lỏng để tăng hiệu quả của quá
trình chiết tách mẫu (tăng độ sạch và khả năng thu hồi hoạt chất của mẫu).
Điểm quan trọng khi áp dụng kỹ thuật chiết lỏng- lỏng là chọn được hệ
dung môi thích hợp, hòa tan được chất phân tích nhưng không/ hoặc hòa tan
rất ít tạp chất và dễ bay hơi. Trong thực nghiệm, các dung môi như
dicloromethan, diethylether, tertbutylether, cloroform …hay được lựa chọn.
Các dung môi này có thể dùng riêng rẽ hoặc phối hợp với tỷ lệ thích hợp tùy
theo từng chất phân tích.
1.3.1.3. Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE- solid phase extraction)
Đây là kỹ thuật được phát triển dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật tách sắc
ký (chất phân tích được lưu giữ trên cột và sau đó được rửa giải nhờ một hệ
dung môi thích hợp)[12].

Hình 1.3- Mô tả qui trình xử lý mẫu bằng kỹ thuật SPE

24

Các bước thực hiện cơ bản là: hoạt hóa cột, nạp mẫu, rửa tạp và rửa giải
chất phân tích. Tiến hành bay hơi dung môi có trong dung dịch rửa giải để thu
được cắn. Hòa tan cắn trong pha động, lọc và tiêm sắc ký.
Ngoài ra người ta cũng có thể chiết tách mẫu theo kiểu lưu giữ tạp chất
trên cột và cho hoạt chất đi qua.
Như vậy, tùy thuộc vào đặc điểm hóa lý của từng chất phân tích mà
người ta sử dụng các loại cột có bản chất khác nhau (như cột pha thuận, pha
đảo, cột dùng cho các chất có bản chất acid, base…) và các hệ dung môi khác
nhau để chiết tách.
So với hai kỹ thuật trên, kỹ thuật SPE phức tạp nhất, đòi hỏi người phân
tích phải được đào tạo và có kinh nghiệm trong việc chọn cột và dung môi
thích hợp để rửa tạp và rửa giải. Tuy nhiên kỹ thuật này có ưu điểm là nền
mẫu thu được tương đối sạch, có thể làm giàu mẫu.
Hiện nay, mặc dù trên thế giới kỹ thuật SPE được áp dụng khá phổ biến
nhưng trong các phòng thí nghiệm ở Việt Nam, kỹ thuật này chưa được áp
dụng nhiều do chi phí nghiên cứu còn tương đối cao.
1.3.2. Kỹ thuật phân tích định lượng
Như đã đề cập ở trên, nền mẫu dịch sinh học rất phức tạp, nồng độ dược
chất thấp… nên các phương pháp phân tích sắc ký hay được ứng dụng để định
lượng nồng độ dược chất có trong mẫu[13]. Tùy thuộc vào nồng độ dược
chất, cấu trúc phân tử, tính chất hóa lý, khả năng hấp thụ UV-VIS, khả năng
phát huỳnh quang… của chất phân tích mà lựa chọn kỹ thuật sắc ký phù hợp.
Các hệ sắc ký hiện đang được ứng dụng phổ biến là:
+ Sắc ký lỏng cao áp kết nối với detector PDA, huỳnh quang;
+ Sắc ký khí kết nối với detector dẫn nhiệt, ion hóa ngọn lửa;
Đối với những mẫu dịch sinh học có nồng độ dược chất ở ngưỡng thấp
(ng/mL), hiện nay người ta hay dùng kỹ thuật phân tích khối phổ, đặc biệt là

25