Thực hành di truyền đại cương cô Trà Mi (có đáp án)

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

LABORATORY & TUTORIAL MANUAL

ANIM 2503

ANIMAL BREEDING
AND MOLECULAR GENETIC
MSc. BUI THI TRA MI


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG
MỤC LỤC
Bài 1. Tách chiết ADN 1
Phần I. Thao tác với Micropipette 1
Phần II. Tách chiết ADN từ máu heo 4
Bài 2. Polymerase Chain Reaction (PCR) 7
Phần I. Pha loãng nồng độ ADN 7
Phần II. Chạy phản ứng PCR 7
Bài 3. Điện di kết quả 10
Phần I. Điện di 10
Phần II. Phân tích kết quả 11
Bài tập tổng hợp

Hướng dẫn và thực hành


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

Bài 1: TÁCH CHIẾT ADN
Phần 1: Thao tác với micropipette
Micropipette là thiết bị dùng để thao tác thể tích ở cấp độ micro lit (µl). Trong bài thực
hành này, các bạn sẽ tập làm quen với cách sử dụng micropipette: cách cầm, điều chỉnh
thể tích, hút và nhả dung dịch sao cho chính xác.
A. Cách sử dụng:
Mỗi 1 micropipette có thể tích đo lường khác nhau. Biên độ đo thể tích này được ghi rõ
trên pipette. Khi điều chỉnh hút dung dịch phải chú ý chọn pipette phù hợp và điều chỉnh
thể tích nằm trong biên độ cho phép. Tuyệt đối không được điều chỉnh thể tích vượt
ngoài biên độ.
a. Cái móc: cầm Pipet nghiêng về một phía hơi cách lỏng lẻo trên sống bàn tay khi
không sử dụng, như vậy sẽ làm cơ tay ít bị quá sức.
b. Cầm chặt bằng cả bàn tay. Tránh cầm pipet quá chặt để giảm mỏi cơ tay và cơ vai
sau khi sử dụng pipet lâu.
c. Để lộ phần ghi số thể tích: có thể nhìn trong suốt thời gian để có thể kiểm soát thể
tích lấy ngay cả khi đang sử dụng.
d. Nút nhấn lớn: nhấn để đẩy đầu tip ra khỏi pipette.
e. Vặn điều chỉnh thể tích; nhấn/thả để hút/đẩy dung dịch.

e


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

B. Cách lấy mẫu
Mỗi micropipette có biên độ đo thể tích khác nhau sẽ sử dụng đầu tip khác nhau.

Dung tích đo lường của
từng loại đầu tip:
Tip trắng: 0 – 10 µl
Tip vàng: 10 – 200 µl
Tip xanh: 100 – 1000 µl

-

Chọn đúng loại đầu tip cho pipette tương ứng. Ấn pipette vào đầu tip kết hợp
xoay nhẹ. Nếu không xoay có thể có khe hở giữa đầu tip và pipette dẫn đến thể
tích hút thực bị sai và pipette bị nhỏ giọt.

Cầm pipet
ở tư thế
thắng đứng.

Ấn tới nấc
dừng thứ
nhất. Nhúng
đầu pipet tip
khoảng 3 – 4
mm vào dung
dịch.

Thả pittông
ra từ từ.

Để cho mẫu,
ấn tới nấc
dừng thứ

nhất

Chuyển tất cả
phần còn lại
của chất lỏng ở
đầu pipet tip
ra, ấn tới nấc
dừng thứ hai
(để phụt hết
dung dịch ra


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành
khỏi pipet tip).

Dưới đây là 1 số kích thước pipette thường sử dụng
Pipette
P10
P20
P40

Biên độ đo
lường (µl)
0.0 – 10.0
2,0 – 20,0
5,0 – 40,0

P100

10 - 100

P200

20 - 200

P1000

100 - 1000

Lưu ý
Không được điều chỉnh thể tích dưới 0 hoặc trên 10
Không được điều chỉnh thể tích dưới 2 hoặc trên 20
Không được điều chỉnh thể tích dưới 5 hoặc trên 40
Không được điều chỉnh thể tích dưới 10 hoặc trên
100
Không được điều chỉnh thể tích dưới 20 hoặc trên
200
Không được điều chỉnh thể tích dưới 100 hoặc trên
1000

a. Dựa vào pipette thực tế của nhóm, hãy chọn pipette và đầu tip cho phù hợp để đo
lường các thể tích sau đây:
Thể tích
2.3 µl
154.6 µl
783 µl
36,2 µl
19.0 µl

Loại pipette
P10
P200 (150) + P10 (4.6)
P1000
P20 (18 + 18.2)
P20

Biên độ đo lường (µl)
0.5 - 10
40 - 200; 0.5 - 10
100 - 1000
2 - 20
2 - 20

Màu sắc tip tương ứng
Trắng
Vàng; Trắng
Xanh
Vàng
Vàng

C. Thực hành thao tác với micropipette:
Mỗi 4 sinh viên sẽ được cung cấp 1 bộ dụng cụ gồm 3 pipette kích cỡ khác nhau, 3 đĩa
petrie có lót sẵn giấy thấm kích thước khác nhau, màu nhuộm.
2 sinh viên/ nhóm: làm chung mẫu.
Mỗi nhóm hãy hút dung dịch và nhỏ vào 1 bên của đĩa petrie theo các kích thước cho
bên dưới và quan sát dung dịch trong cùng đĩa petrie của nhóm đối diện.
A: 250 µl

B: 90 µl

C: 5µl

b. Quan sát và ghi nhận vòng thấm lan trên giấy của 2 nhóm?


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

Kết quả ở 2 nhóm như nhau:
A: Vòng thấm lan thành hình elip chiếm gần 3/4 tờ giấy.
B: Vòng thấm lan thành hình elip chiếm khoảng 1/4 tờ giấy.
C: Vòng thấm hình tròn có đường kính khoảng 1 cm.

Phần 2. Tách chiết ADN từ máu heo
A. Tách lọc bạch cầu
Thông thường khi lấy mẫu về, trước khi tách chiết ADN, thường có các bước đầu thao
tác nhằm loại bỏ các thành phần tạp chất hay thành phần không có chứa ADN, nhằm
góp phần giúp thu được ADN tinh sạch sau khi hoàn tất quy trình tách chiết.
Trong phần thực hành này, sinh viên sẽ thao tác tách chiết các thành phần không có
chứa ADN trong máu động vật hữu nhũ (heo)
Lưu ý: mặc áo blue và đeo găng tay khi thao tác (tự chuẩn bị)
2 SV làm chung 1 mẫu
Rửa các ống nghiệm dơ sau khi thao tác
Dụng cụ, thiết bị: Máy ly tâm, Ống nghiệm chứa 15ml chứa mẫu, micropippete các loại,
đầu tip các loại, lọ chứa dung dịch bỏ
Hóa chất: dung dịch NaCl 0,2%
Thao tác:

1. Hút 5ml NaCl 0,2% vào ống nghiệm có chứa sẵn 1ml máu heo, trộn đều, ly tâm
với vận tốc 3000 vòng/phút trong 3 phút
2. Hút bỏ phần nổi. Tiếp tục cho vào 5ml NaCl 0.2%, trộn đều, ly tâm 3000
vòng/phút trong 3 phút.
3. Lập lại thao tác 1 và 2 bốn lần.
a. Thành phần của máu bao gồm những gì?
-

Các tế bào máu: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG
-

Hướng dẫn và thực hành

Huyết tương

b. Với mẫu là máu heo, ADN nằm ở đâu trong các thành phần kể trên?
Bạch cầu

B. Tách chiết ADN
Lưu ý: mặc áo blue và đeo găng tay khi thao tác (tự chuẩn bị)
2 SV làm chung 1 mẫu
Rửa các ống nghiệm dơ sau khi thao tác
Dụng cụ, thiết bị: Máy ly tâm, ống nghiệm chứa mẫu, micropippete các loại, đầu tip các
loại, lọ chứa dung dịch bỏ.
Hóa chất: Lysis Buffer, Proteinase K, Phenol, CIAA (Chloroform/Isoamyl Alcohol), Ethanol
95%, Ethanol 70%, TE 1X
Thao tác:

1. Cho 3ml Lysis Buffer + 30 µl Proteinase K vào ống mẫu ở trên, trộn đều, ủ 550C
qua đêm ( tối thiểu 8 tiếng)
c. Proteinase K (PK) là gì? Tác dụng của PK?
Proteinase K (PK) là một serine protease phổ rộng. Enzyme này có tác dụng phân
cắt protein, làm vỡ màng tế bào giải phóng ADN ra môi trường.
2. Cho vào 3ml Phenol, trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút.
d. Ở bước này xuất hiện hiện tượng kết tủa? Kết tủa này là gì? Tại sao xuất hiện kết
tủa?
Kết tủa đó là protein biến tính và bạch cầu còn lại.
Phenol không tan trong nước nhưng nhờ trộn đều sẽ tạo thành nhũ tương giọt
dầu trong nước. Protein sẽ bị biến tính bởi phenol trong khi ADN vẫn còn nguyên
trong nước. Khi ly tâm, hai lớp phenol và nước tách nhau ra, phenol nặng nên lắng


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

xuống dưới, protein biến tính và bạch cầu còn sót sẽ nằm tại ranh giới của phenol
và nước.
3. Hút phần nổi chuyển vào ống nghiệm mới, sau đó thêm vào 3ml Phenol/CIAA,
trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút.
e. ADN sẽ nằm ở đâu? Phần loại bỏ bao gồm những gì?
ADN tan trong nước và nằm ở trên. Phần loại bỏ gồm protein biến tính còn sót và
các thành phần trong Lysis Buffer bị hòa tan trong CIAA.
4. Hút phần nổi chuyển vào ống nghiệm mới, sau đó thêm vào 3ml CIAA
(Chloroform/Isoamyl Alcohol), trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút.
f. ADN lúc này nằm ở đâu? Phần loại bỏ bao gồm những gì?
ADN tan trong nước và nằm ở lớp trên. Phần loại bỏ là Lysis Buffer bị hòa tan
trong CIAA.

5. Hút phần nổi chuyển vào ống nghiệm có chứa sẵn 5ml Ethanol 95% lạnh.
g. Hiện tượng kết tủa sẽ xuất hiện. Chất kết tủa đó là gì?
ADN

6. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 3 phút. Hút cạn phần dung dịch bỏ đi. Lưu ý đừng
loại bỏ ADN.
7. Cho vào 3ml Ethanol 70%. Trộn đều. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút.
h. Tác dụng của EtOH 70% trong bước này là gì?
Cho EtOH 70% vào để loại bỏ muối NaCl còn lại.

8. Hút cạn phần dung dịch bỏ đi. Làm ráo mẫu
9. Cho vào 200 µl TE 1X. Ủ 370C qua đêm.
i. Tác dụng của dung dịch TE 1X?
Tách sợi ADN trong môi trường
Bảo quản mẫu


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

10. Chuyển dung dịch ADN vào eppendorf 1.5ml.
11. Trữ mẫu ở 40C

Bài 2: POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Phần I. Pha loãng nồng độ ADN
Tùy theo lượng mẫu và thao tác, nồng độ ADN thu được sẽ không giống nhau sau khi
tách chiết (thường nồng độ này rất đậm đặc). Và trong mỗi một phản ứng PCR, lượng
ADN mẫu đưa vào cũng sẽ có sự khác biệt. Vì vậy chúng ta cần phải pha loãng ADN theo
một nồng độ phù hợp trước khi thực hiện PCR nhằm đơn giản thao tác và phản ứng sẽ

xảy ra chính xác hơn.
Chuẩn bị: ống eppendorf, micropipette, nước cất hoặc TE 1X
Thao tác:
1. Ghi nhận kết quả đo nồng độ mẫu ADN của nhóm vào cột C. (Giáo viên sẽ cung
cấp số liệu cho bạn)
2. Hãy tính toán lượng ADN và lượng nước/TE 1X bạn cần thêm vào để có được
tổng thể tích mẫu là 200µl với nồng độ 100ng ADN/µl theo công thức sau:
Nồng độ ban đầu x thể tích mẫu gốc = nồng độ cần pha loãng x thể tích mẫu cần
pha
Hay ta có D = (A x B)/C
Lượng nước/TE 1X bạn cần thêm vào để có tổng thể tích 200µl với nồng độ 10ng
ADN/µl? E = B – D
Mẫu A
B
C
D
E
Nồng độ cần Thể tích mẫu Nồng độ
Thể tích mẫu Thể tích
pha loãng
cần pha
gốc ban
gốc cần
nước/TE 1X
đầu
thêm vào
cần thêm vào
Hiệu 100ng/ µl
200 µl
chỉnh 10ng/ µl

156 µl
520ng/ µl 3 µl
153 µl


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

3. Trộn đều lượng nước tính được từ cột E với lượng ADN từ cột D vào ống
eppendorf.

Phần II. Chạy phản ứng PCR
Để phản ứng PCR xảy ra tốt hoặc có thể dễ dàng dự đoán điều chỉnh thành phần
để kết quả thu được rõ ràng hơn, chúng ta cần phải tính toán và trộn lượng hỗn hợp
tổng cho chính xác. Hỗn hợp tổng được chuẩn bị sẽ bao gồm luôn cả mẫu đối chứng
(N).
1. Chuẩn bị 1 ống eppendorf 1,5ml để trộn hỗn hợp tổng. Ghi số nhóm thực hiện
lên trên nắp ống.

-

2. Tính toán các thành phần để chạy 4 phản ứng + 1 phản ứng đối chứng (N).
a. Tính toán thể tích từng thành phần cho 1 phản ứng. Điền kết quả vào cột C
Sử dụng các công thức sau để tính thể tích từng thành phần :
Công thức tam suất
C = B x V∑/A
H2O = V∑ - Các thành phần đã biết
b. Tính toán và điền kết quả từng thành phần tổng vào cột D

Thành phần

A (Nồng độ gốc)

ADN
Nước cất
Dung dịch đệm
dNTPs
Mồi xuôi F
Mồi ngược R
MgCl2
Enzyme (Taq DNA

10ng/ µl

B (Nồng độ
phản ứng)
50ng (**)

10X
1.0mM
10pmol/µl
10pmol/µl
25mM
5UI/ µl

1X
150µM
30pmol
30pmol

2,25mM
1UI

C (Thể tích cho
1 phản ứng)
5µl
2µl
2µl
3µl
3µl
3µl
1,8µl
0,2µl

D (Thể tích cho
4 phản ứng +1)
25µl
10µl
10µl
15µl
15µl
15µl
9µl
1µl


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

polymerase)*
Tổng (V∑)
20 µl(**)
100µl
*: đưa vào hỗn hợp cuối cùng; **: số liệu có thể thay đổi tùy theo nhóm thực hành
3. Hút các thành phần đã tính vào ống eppendorf 1,5ml. Trộn nhẹ nhàng cho
đều.
4. Chuẩn bị 5 ống eppendorf 200 µl. Đánh số từ 1->4 và 1 eppendorf ghi chữ N
5. Dùng micropipette hút …15…. µl hỗn hợp vào từng eppendorf 200 µl
6. Thêm …5…… µl ADN vào mỗi eppendorf. Không cho ADN vào ống N
7. Phản ứng PCR sẽ được chạy theo quy trình sau:
Bước 1: tiền biến tính
940C, 10phút
Bước 2: Biến tính
940C, 30 giây
Bước 3: Ủ bắt cặp
550C, 45 giây
Lặp lại 35 lần
0
Bước 4: Kéo dài
72 C, 45 giây
Bước 5: Bù thêm
720C, 5phút
Bước 6: Giữ mẫu
4 0C
a. Tổng thời gian chạy phản ứng PCR ở trên kéo dài ít nhất bao lâu?
1 tiếng 25 phút
b. Tại sao cần phải có mẫu đối chứng N? Mẫu đối chứng này có thành phần
gì khác so với các mẫu thí xét nghiệm?
Ở đây mẫu đối chứng N là chứng âm (Negative control): Phân biệt có ngoại

nhiễm hay không.
Đối chứng N này không cho ADN mà thay bằng nước cất.
Ngoài ra còn có chứng dương (Positive control): Đảm bảo phản ứng tốt. Có một
lượng ADN đã biết trong phản ứng.
Tóm lại, phản ứng cần có cả chứng âm và chứng dương để loại trừ hiện tượng
âm tính giả hay dương tính giả.


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

Bài 3: ĐIỆN DI KẾT QUẢ
Phần I. Điện di
A. Pha agarose nồng độ 1%
1. Cân 1g agarose + 100ml dd TAE 1X
Nếu muốn pha 100ml dd agarose có nồng độ 1,5%, cần bao nhiêu gram agarose?
1,5g
2. Microwave cho agarose tan đều, sôi khoảng 3 lần.
3. Đợi dd agarose nguội, khoảng 500C, thêm 6 µl ETBr vào. Chú ý lắc nhẹ bình
chứa agarose trên đá bào theo cùng chiều kim đồng hồ rồi lắc ngược lại để ETBr tan đều
trong gel và tránh bọt khí.
a. ETBr là gì? Tác dụng của ETBr?

ETBr (Ethidium bromide) là chất nhuộm sử dụng để phát hiện ADN/ARN trong điện
di trên gel agarose. ETBr được kích thích bởi đèn UV và phát ra ánh sáng huỳnh
quang màu cam đỏ, quan sát được bằng mắt thường. ETBr có thể phát hiện được
1 ng ADN trên 1 băng. (Lưu ý: ETBr có khả năng gây đột biến mạnh)

b. Tại sao phải tránh tạo bọt khí trong quá trình đổ gel?

Nếu để bọt khí xảy ra mà không làm nó vỡ trước khi gel đông cứng nó sẽ tạo
những biến dạng làm ảnh hưởng đến đường chạy của mẫu không còn thẳng đều –
tránh bọt, dẫn đến việc đo đạc, ước lượng kích thước của các phân tử ADN không
chính xác.

4. Đổ gel vào khuôn đã gắn lược, chờ gel đông đặc.


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

B. Load mẫu:
1. Hút 5 µl Ladder 100 (ABM) cho vào giếng giữa
c. Ladder là gì? Tác dụng của ladder? Ý nghĩa của con số 100?

Ladder (Marker), đây là tập hợp những đoạn ADN có kích thước xác định và biết
trước dùng làm thang chuẩn để ước lượng kích thước của phân tử ADN chưa rõ
khi tiến hành điện di.
Ladder 100, con số 100 cho biết Ladder được thiết kế để đo kích thước của phân tử
ADN trong phạm vi là 100bp-1000bp (số 1000 tùy vào Ladder thiết kế), và độ chia
nhỏ nhất của dải tham chiếu là 100bp, tức 2 vạch chênh nhau 100bp.

d. Theo hình, Ladder 100 là giếng:……………1 và 10……………………………
e. Xem hình bên dưới và hãy điền kích thước tương ứng với các band của ladder

2. Hút 5 µl mỗi mẫu cho vào các giếng khác nhau
-

Điện di ở 100 V trong 30 phút.

Phần II. Phân tích kết quả
Mỗi nhóm sẽ được nhận 1 kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm xác định vật nuôi có
nhiễm 1 trong 2 bệnh sau: PRRS và PED


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

f. PRRS là viết tắt của:……… Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome………….
PRRS là bệnh: ……tai xanh……………………………………………………………………………………………….
Có tên gọi khác là……Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp..……………………………………… .
xảy ra trên………heo (lợn)……………………………………………..do virus……PRRS (PRRSV) ………
……… ……gây ra.
g. PED là viết tắt của………Porcine Epidemic Diarrhoea ……………………………………………
PED là bệnh: ………tiêu chảy cấp………………………………………… xảy ra trên……heo (lợn)..…...
………………………………………………………………………………..do virus………PED (PEDv) ……………….
……………………..gây ra.
Để xác định bệnh, phản ứng PRC sẽ được thực hiện với 1 trong 2 cặp primer sau:
h. F là viết tắt của……forward ……………………………….
R là viết tắt của…………reverse……………………………..
i. Hãy tìm và gạch dưới trình tự Nucleotid quy định mồi xuôi và mồi ngược trong
đoạn gien được giải mã dưới dây:
(Lưu ý: Khi xác định trình tự mồi ngược, trước tiên các nhóm phải viết lại trình tự
Nucleotid bắt cặp theo chiều 3’.)
LOCUS

AY612613

14281 GCAAAGTTGA GGTCGAAGGT CATCTGATCG ACCTCAAAAG AGTTGTGCTT GATGGTTCCG
14341 TGGCAACCCC TATAACCAGA GTTTCAGCGG AACAATGGGG TCGTCCTTAG ATGACTTCTG
14401 TCATGATAGC ACGGCTCCAC AAAAGGTGCT TTTGGCGTTT TCTATTACCT ACACGCCAGT

Primer

Trình tự (5’ – 3’)

ORF6-F

GTGGCAACCCCTATAACCAGAG

ORF6-R

ACGACAGACACAATTGCCGCTCAC

E pro-F

CGCAGTTTACACACCTATAGGG

M pro-R

CCTGCGCCACAACCGAATGCTATT

Đối tượng
phát hiện

Vùng gen
khuếch

đại

Kích
thước
sản phẩm

PRRSV

ORF6

780 bp

Coronavirus

E&M

412 bp


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

14461 GATGATATAT GCCCTAAAGG TGAGTCGCGG CCGACTGCTA GGGCTTCTGC ACCTTTTGAT
14521 CTTCCTGAAT TGTGCTTTCA CCTTCGGGTA CATGACTTTC GCGCACTTTC AGAGTACAAA
14581 TAAGGTCGCG CTCACTATGG GAGCAGTAGT TGCACTCCTT TGGGGGGTGT ACTCAGCCAT
14641 AGAAACCTGG AAATTCATCA CCTCCAGATG CCGTTTGTGC TTGCTAGGCC GCAAGTACAT
14701 TCTGGCCCCT GCCCACCACG TTGAAAGTGC CGCAGGCTTT CATCCGATTG CGGCAAATGA
14761 TAACCACGCA TTTGTCGTCC GGCGTCCCGG CTCCACTACG GTCAACGGCA CATTGGTGCC
14821 CGGGTTAAAA AGCCTCGTGT TGGGTGGCAG AAAAGCTGTT AAACAGGGAG TGGTAAACCT

14881 TGTCAAATAT GCCAAATAAC AACGGCAAGC AGCAGAAGAG AAAGAAGGGG GATGGCCAGC
14941 CAGTCAATCA GCTGTGCCAG ATGCTGGGTA AGATCATCGC TCAGCAAAAC CAGTCCAGAG
15001 GCAAGGGACC GGGAAAGAAA AATAAGAAGA AAAACCCGGA GAAGCCCCAT TTTCCTCTAG
15061 CGACTGAAGA TGATGTCAGA CATCACTTTA CCCCTAGTGA GCGGCAATTG TGTCTGTCGT
15121 CAATCCAGAC CGCCTTTAAT
//

LOCUS

JQ282909

25561 GCTTCACTTG TCACCGGTTG TGTAATAGCG CAGTTTACAC ACCTATAGGG CGTTTGTATA
25621 GAGTTTATAA GTCTTACATG CAAATAGACC CCCTCCCTAG TACTGTTATT GACGTATAAA
25681 CGAAATATGT CTAACGGTTC TATTCCCGTT GATGAGGTGA TTCAACACCT TAGAAACTGG
25741 AATTTCACAT GGAATATCAT ACTGACGATA CTACTTGTAG TGCTTCAGTA TGGCCATTAC
25801 AAGTACTCTG CGTTCTTGTA TGGTGTCAAG ATGGCTATTC TATGGATACT TTGGCCTCTT
25861 GTGTTAGCAC TGTCACTTTT TGATGCATGG GCTAGCTTTC AGGTCAATTG GGTCTTTTTT
25921 GCTTTCAGCA TCCTTATGGC TTGCATCACT CTTATGCTGT GGATAATGTA CTTTGTCAAT
25981 AGCATTCGGT TGTGGCGCAG GACACATTCT TGGTGGTCTT
//

j. Sau khi khuếch đại đoạn gien bằng cặp mồi đã cho ở trên, kích thước sản phẩm


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

PCR phát hiện PRRSv là…………………….bp và PEDv là………………………………..bp.
Dựa theo kết quả nhận được, mẫu xét nghiệm*………………….:

Dương tính hay âm tính:………………………………………………………………
Kích thước sản phẩm:…………………………bp
Dương tính với bệnh:……………………………………………………………………………………………………….
(*: các nhóm sẽ nhận kết quả từ giáo viên)
k. Nếu có 1 hoặc nhiều kích thước trong giếng đối chứng âm tính, điều đó có ý nghĩa
như thế nào?

l. Nếu có nhiều hơn 1 kích thước ở mẫu xét nghiệm PRRS/ PED điều đó có ý nghĩa
như thế nào?
PCR đơn mồi: Nhân bản không đúng hay tách chiết sai.
Ở trường hợp PCR đa mồi, có thể là mẫu xét nghiệm có cả 2 chủng PRRS và PED.

BÀI TẬP TỔNG HỢP
Nhóm thực hành:……N12/01..…..Học kỳ:………1………….Năm học:………2018 – 2019……...
Họ tên SV:………..VÕ PHẠM DANH………………MSSV:……17111020………Lớp:…DH17CN……
…………NGUYỄN HẢI ĐĂNG………….MSSV:……17111018………Lớp:…DH17CN……

Dựa vào bài báo (Giáo viên cung cấp), hãy trả lời và điền thông tin (bằng tiếng Việt) vào
các nội dung sau:
1. Tên bài báo, tên tác giả


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

-

Hướng dẫn và thực hành

Tên bài báo: Phát hiện các đột biến lặn (BLAD và CVM) trên đàn bò Holstein

Friesian ở Cộng hòa Macedonia.
-

Nhóm tác giả: Nikola Adamov, Dine Mitrov, Igor Esmerov, Peter Dovc.

-

Address URL: />
2. Mục đích của nghiên cứu?

Mục đích của nghiên cứu này là để tối ưu hóa và thực hiện một thử nghiệm đáng
tin cậy và hiệu quả về chi phí để phát hiện hai alen BLAD và CVM trong phòng thí
nghiệm, cũng như để có được kết quả sơ bộ về sự có mặt của chúng trong quần
thể bò HF ở Macedonia.

3. Đối tượng lấy mẫu và số lượng mẫu được thực hiện trong nghiên cứu?

Mẫu máu được lấy từ 84 gia súc thuộc giống HF được nuôi ở một số trang trại khác
nhau ở Macedonia và từ 6 liều tinh trùng đông lạnh từ 6 con bò HF khác nhau
được sử dụng cho việc thụ tinh nhân tạo ở Macedonia.

4. Điền các thành phần/thông tin cần thiết để thực hiện phản ứng PCR vào bảng
sau:
Đối với khuếch đại alen BLAD
Thành phần tham
gia phản ứng
ADN
Nước cất
Dung dịch đệm

Nồng độ/thể
tích phản ứng
50-100 ng
1X

Quy trình chạy
phản ứng
Tiền biến tính
Biến tính
Ủ bắt cặp

Nhiệt độ
95°C
94°C
58°C

Thời gian
3 phút
1 phút
1 phút


DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG
dNTPs
Mồi xuôi F
Mồi ngược R
MgCl2
Enzyme (Taq DNA
polymerase)*
Tổng (V∑)

200 μM
0.2 μM
0.2 μM
2.0 mM
0,6 UI

Hướng dẫn và thực hành
Kéo dài
Bù thêm
Số chu kỳ

72°C
72°C

1 phút
5 phút
35

Tổng thời gian chạy hết phản ứng:
……1…giờ……53…phút…00…giây…00……

25 µl

Đối với khuếch đại alen CVM
Thành phần tham
gia phản ứng
ADN
Nước cất
Dung dịch đệm

dNTPs
Mồi xuôi F
Mồi ngược R
MgCl2
Enzyme (Taq DNA
polymerase)*
Tổng (V∑)

Nồng độ/thể
tích phản ứng
50-100 ng
1X
200 μM
0.2 μM
0.2 μM
2.0 mM
0,6 UI

Quy trình chạy
phản ứng
Tiền biến tính
Biến tính
Ủ bắt cặp
Kéo dài
Bù thêm
Số chu kỳ

Nhiệt độ

Thời gian

94°C
94°C
54°C
72°C
72°C

5 phút
1 phút
1 phút
35 giây
7 phút
35

Tổng thời gian chạy hết phản ứng:
……1…giờ……42…phút…25…giây…00……

25 µl

5. Kích thước sản phẩm được khuếch đại:…………341………..bp đối với BLAD
…………287………..bp đối với CVM
6. Kết luận của tác giả về nghiên cứu:
Phương pháp phát hiện dựa trên phân tích PCR – RFLP là một công cụ mạnh mẹ để
xác định cả hai chất mang BLAD VÀ CVM.
Đây là báo cáo được công bố đầu tiên vệ sự tồn tại của BLAD và CVM trong quần
thể bò HF ở Macedonia. Mặc dù chúng được tìm thấy ở tần suất thấp, nghiên cứu
này cho thấy cần phải kiểm tra thêm về mức độ phân tán của các alen gây hại này,
đồng thời khẳng định sự cần thiết phải kiểm tra bắt buộc đối với những con bò

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hướng dẫn và thực hành

đực trước khi đưa vào chương trình thụ tinh nhân tạo để ngăn chặn sự lây lan của
chúng đến một số lượng lớn bò ở thế hệ tiếp theo.