xây dựng một mô hình tăng lipid huyết thực nghiệm bằng chế độ ăn giàu lipid

LỜI MỞ ĐẦU

1. LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay bệnh tim mạch có nguồn gốc mạch vành ngày
càng trở nên phổ biến trên thế giới. Nguyên nhân
chính là do sự gia tăng bất thường của lipid máu, do
nhiều yếu tố nguy cơ như di truyền, tiểu đường , hoặc do
sự gia tăng của bệnh béo phì, …. trong số đó chế độ
dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng trong việc gia tăng lipid
máu. Tại Việt Nam, tần suất của bệnh này có khuynh
hướng gia tăng nhanh chóng cùng với sự đa dạng trong
thức ăn hàng ngày. Việc cần thiết là phải đưa mức
cholesterol và triglycerid trở về bình thường. Do đó, nhu
cầu hiện tại là phải tiến hành những nghiên cứu để
tìm ra những phương thuốc mới có hiệu quả trong lónh vực
điều trò bệnh này cũng như cần có những mô hình thực
nghiệm liên quan đến tăng lipid huyết.
Trong những nghiên cứu trước đây được thực hiện tại khoa
Dược- Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, chúng tôi
đã sử dụng chất tẩy rửa Triton 1339-Tyloxapol để gây
tăng lipid huyết trên chuột. Mô hình này rất có hiệu
quả trong vòng 24 giờ sau khi tiêm Tyloxapol. Tuy nhiên, 48
giờ sau khi tiêm nồng độ cholesterol và triglycerid giảm
đáng kể. Do đó, việc tăng lipid huyết gây bởi Tyloxapol
chỉ thích hợp trong trường hợp chọn lọc sớm những hoạt
chất hoặc những thuốc có tác dụng hạ lipid huyết
(screening). Vì vậy, mục tiêu chính của nghiên cứu này là
xây dựng một mô hình tăng lipid huyết thực nghiệm
bằng chế độ ăn giàu lipid để tạo ra một tình trạng bệnh
lý kéo dài hơn, ổn đònh hơn trên chuột.

1


LỜI MỞ ĐẦU

Nghiên cứu này được tiến hành tại Bộ môn Dược lýDược lâm sàng – Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ
Chí Minh, bao gồm những mục tiêu chuyên biệt sau đây :
-

Gây tăng lipid huyết bằng chế độ ăn giàu lipid
trên chuột

-

Đánh giá tính khả dụng của mô hình thử nghiệm
với việc sử dụng tác nhân làm hạ lipid huyết
(Simvastatin)

4. KẾT QUẢ
4.1. THĂM DÒ MÔ HÌNH GÂY TĂNG LIPID
HUYẾT BẰNG CHẾ ĐỘ ĂN GIÀU LIPID


Giai đoạn 1 : Chuột thử nghiệm được chia làm 2

nhóm :
∗ Nhóm chứng : được nuôi theo chế độ ăn bình thường.
∗ Nhóm tăng lipid huyết : được nuôi bằng chế độ ăn
đặc biệt giàu lipid.
Sau 2, 3 và 4 tuần, những chuột thử nghiệm sẽ được lấy

máu để xác đònh nồng độ cholesterol và nồng độ
triglycerid huyết tương.
Nồng độ cholesterol và triglycerid huyết của những chuột
thử nghiệm trong 2 nhóm này được thể hiện trong những
bảng sau đây :
Bảng 7. Nồng độ cholesterol máu ở những nhóm thử
nghiệm sau 2,3 và 4 tuần theo chế độ ăn .

2


LỜI MỞ ĐẦU

Nhóm

n

Cholesterol huyết (mg%)
m±SEM

2 tuần

3 tuần

4 tuần

Chứng 10
Thử
20
n: số lượng chuột trong mỗi nhóm

88.77 ± 10.01
143.94 ± 27.18

101.78 ± 4.27
148.74 ± 11.20

92.14 ± 3.23
131.68 ± 8.03

Bảng 8. Nồng độ triglycerid máu ở những nhóm thử
nghiệm sau 2,3 và 4 tuần theo chế độ ăn .
Nhóm

n

Triglycerid huyết (mg%)
m±SEM

2 tuần

3 tuần

4 tuần

70.90 ±11.75
76.93±6.14

34.23 ± 8.26
66.17±22.84

Chứng
10
Thử
20
n: số lượng chuột trong mỗi nhóm
111.08 ± 20.14
85.14±6.73

Sau 2 tuần theo chế độ ăn giàu lipid, nồng độ cholesterol
huyết của nhóm thử bắt đầu tăng nhưng không khác
biệt so với nhóm chứng. Ở tuần lễ thứ 3, sự khác biệt
này đã có ý nghóa rõ rệt. Việc duy trì chế độ ăn trong
một tuần sau đó không làm thay đổi đáng kể nồng độ
cholesterol máu ở cả 2 nhóm.
Số lượng chuột tăng lipid huyết vào tuần lễ thứ 3 của
chế độ ăn vào khoảng 60 %, tỷ lệ này vẫn không thay
đổi vào tuần lễ thứ 4 của nghiên cứu.


Giai đoạn 2: Mục tiêu là để đánh giá tính ổn đònh

của mô hình sau khi ngưng chế độ ăn giàu lipid.
Những chuột thử nghiệm đã tăng nồng

độ cholesterol

huyết vào tuần lễ thứ 4 được chọn và chia thành 2
nhóm sau đây :
Nhóm 1 : Quay trở lại chế độ ăn bình thường.
Nhóm 2 : Duy trì chế độ ăn giàu lipid.

Xác đònh nồng độ cholesterol và triglycerid sau 3 tuần.
Bảng 9. Nồng độ lipid máu ở những nhóm thử nghiệm

3


LỜI MỞ ĐẦU

Nhóm
Nhóm 2
Nhóm 1

4 tuần
Chol
TG
159.49 ±
75.9 ±
6.47
17.21
160.09±
54.93 ±
22.09
9.57

7 tuần
Chol
203.72 ±
37.27
179.67 ±
39.01

TG
123.1 ±
73.145
72.35±
11.48

Chol : Cholesterol huyết, TG : Triglycerid huyết

Trong nhóm chuột được duy trì chế độ ăn giàu lipid (nhóm
2), nồng độ cholesterol huyết vẫn ở mức cao, trong khi đó
mức cholesterol huyết đã tăng cao ở nhóm 1 vẫn không
thay đổi sau 3 tuần ngưng chế độ ăn giàu lipid. Những
kết quả này cho thấy tính ổn đònh của mô hình .
Từ những kết quả thu được, chúng tôi quyết đònh tiến
hành giai đoạn đánh giá tính khả dụng của mô hình theo
tiến trình sau đây :
- Gây tăng lipid huyết.
- Chọn dân số thử nghiệm vào tuần lễ thứ 3 dựa theo
những tiêu chuẩn lựa chọn

đã đề cập ở trên (mức

cholesterol > 150 mg%).
- Sử dụng một tác nhân làm hạ lipid huyết để đánh giá
tính khả dụng của mô hình này.

3.2.1. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA MÔ HÌNH
THỬ

NGHIỆM

BẰNG

CÁCH

ÁP

DỤNG

TÁC

NHÂN LÀM HẠ LIPID HUYẾT
Trọng lượng
Trọng lượng của chuột xấp xỉ nhau ở nhóm chứng
và nhóm thử. Trong thời gian thử nghiệm, trọng
lượng chuột gia tăng tự nhiên không phụ thuộc vào
chế độ ăn giàu lipid và cũng như không phụ thuộc
vào việc điều trò với Simvastatin.

4


LỜI MỞ ĐẦU

Cholesterol et triglycerid huyết
Bảng 10. Nồng độ lipid máu sau 3 tuần theo chế độ
ăn giàu lipid
Nhóm
Chứng

Thử

Ngày 0
Chol
TG
68.07 ±
78.47 ±
13.26
10.44
125.78±
148.06± 28.
12.1
96

3 tuần
Chol
94.7 ±
14.88
176.7± 7.3
1

TG
151.75 ±
19.01
101.35±
14.88

Nhận xét :Sau 3 tuần theo chế độ ăn giàu lipid, chúng
tôi ghi nhận được sự khác biệt có ý nghóa (p < 0.05) về
nồng độ cholesterol huyết giữa nhóm thử so với nhóm

chứng nhưng không có sự khác biệt về nồng độ
triglycerid huyết.

Hình 5. Nồng độ cholesterol huyết sau 3 tuần theo chế độ
ăn giàu lipid

5


LỜI MỞ ĐẦU

250
*

200
150

Chứng

[C]
mg%

Thử

100
50
0
0

3

Tuần

(∗) P<0.05

Chỉ khoảng 60% chuột trong nhóm theo chế độ ăn giàu
lipid thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn của nghiên cứu
chúng tôi (nồng độ cholesterol huyết ≥ 150 mg%) Những
chuột này được chia thành 3 nhóm và được cho uống
Simvastatin theo trình tự như sau :
− Nhóm 1: simvastatin liều 8mg/kg × 1 lần/ngày.
− Nhóm 2: simvastatin liều 16mg/kg × 1 lần/ngày.
− Nhóm 3 (không điều trò): nước cất (0.1 ml /10 g
chuột).
Việc lấy máu được thực hiện vào tuần lễ thứ 1 và thứ
2 sau điều trò (Bảng 10 và 11). Chúng tôi nhận thấ
nồng độ cholesterol huyết sau 1 tuần điều trò đã bắt đầu
giảm. Tuy nhiên giá trò này lại tăng nhanh vào tuần lễ
thứ 2 của đợt điều trò. Hiện tượng này có thể là do cơ
chế bù sinh lý, thông qua việc tăng số lượng LDL-R dưới
tác động hạ lipid huyết của thuốc. Do đó,

chúng tôi

quyết đònh chia nhóm thứ 2 thành 2 nhóm nhỏ mà trong

6


LỜI MỞ ĐẦU

đó một nhóm vẫn tiếp tục điều trò với liều 16 mg/kg và
nhóm còn lại với liều 40 mg/kg. Máu chuột được lấy 1
tuần sau đó.
Hình 6. Tiến trình thí nghiệm
0

3

4

5

6
thời gian
(tuần)

Gây tăng
lipid huyết

Thời gian điều trò

Bảng 11. Theo dõi nồng độ cholesterol huyết ở những
nhóm chuột thử nghiệm
Tua

0

3

4

5

6

àn
ED1

125.78±1

167.76

Sim

2.1
125.78±1

6.1
32
3
1
205.54±11. 152.19±13. 177.9±18.9 145.37±16.

1
Sim

2.1
125.78±1

47
98
5
37
176.65±17. 145.17±16. 203.57±28. 145.57±28.

2
Sim

2.1
125.78±1

29
04
05
48
206.87±17. 165.4±16.8 203.8±20.1 134.66±18.

2.1

77

3

± 145.46±16. 175.8±22.8 232.96±23.

5

7

38

Bảng 12. Theo dõi nồng độ triglycerid huyết ớ những
nhóm chuột thử nghiệm
Tua

0
àn
ED1 148.06±28

3

4

5

6

114.9±16. 53.46±3. 57.13±6.7 121.46±33

Sim

.96
148.06±28

48
84
.55
90.47±11. 60.71±6. 57.86±4.4 67.89±9.2

1
Sim

.96
148.06±28

06
07
5
4
59.28±9.2 39.08±8. 50.68±12. 76.35±9.5

7


LỜI MỞ ĐẦU

2
Sim
3

.96
148.06±28

7
84.69±13

.96

94

13
7
60.07±6. 55.06±4.4 83.34±14.
7

3

86

ED 1 : Nước cất ; Sim 1: Simvastatin liều 8 mg/kg ;Sim 2 ::
Simvastatin liều 16 mg/kg ;Sim 3: Simvastatin liều 16 mg/kg →40 mg/kg

Nhận xét : Sau 6 tuần thử nghiệm, chúng tôi nhận thấy
nồng độ triglycerid huyết dao động một cách tự nhiên
không những không phụ thuộc vào chế độ ăn giàu lipid
mà cũng không phụ thuộc vào chế độ trò liệu bằng
simvastatin. Tuy nhiên, sự khác nhau về nồng độ triglycerid
huyết giữa nhóm chứng và nhóm thử là không có ý
nghóa.
Hình 7. So sánh nồng độ cholesterol huyết giữa nhóm
điều trò với simvastatin ở liều 8 mg/kg và nhóm không
điều trò
250.00
200.00
150.00

ED1

[C] mg%

Sim 1

100.00
50.00
0.00
0

3

4

5

6

Tuần

ED 1: nhóm không điều trò
Sim 1: nhóm điều trò với Simvastatine liều 8 mg/kg trong 3
tuần

Nhận xét : Biểu đồ này cho thấy sự khác nhau có ý
nghóa (p < 0,05) về nồng độ cholesterol huyết giữa nhóm

8


LỜI MỞ ĐẦU

không điều trò (ED1) và nhóm điều trò (Sim 1) sau 3 tuần

điều trò.

Hình 8. So sánh nồng độ cholesterol huyết giữa nhóm
điều trò với Simvastatin liều 16 mg/kg

và nhóm không

điều trò.
250.00
200.00
150.00

ED1

[C] mg%

Sim 2

100.00
50.00
0.00
0

3

4
Tuần

5

6

Sim 2: nhóm điều trò với liều 16 mg/kg trong suốt 3 tuần

Nhận xét :Sau 3 tuần điều trò, chúng tôi ghi nhận được
sự khác nhau có ý nghóa (p < 0,05) về nồng độ cholesterol
huyết ở nhóm không điều trò (ED1) và nhóm điều trò
(Sim 2).
Chúng tôi nhận thấy rằng mặc dù nồng độ cholesterol
huyết ở 2 nhóm điều trò (8 mg/kg và 16 mg/kg) có giảm
sau 3 tuần điều trò nhưng vẫn chưa có sự khác biệt có ý

9


LỜI MỞ ĐẦU

nghóa về nồng độ cholesterol huyết khi so sánh với nhóm
không điều trò.

Hình 9. So sánh nồng độ cholesterol huyết giữa nhóm
điều trò với simvastatine ở liều 16 → 40 mg/kg và nhóm
không điều trò
250.00
200.00
150.00

ED1

[C] mg%

Sim 3

100.00
50.00
0.00
0

3

4

5

6

Tuần

Sim 3: nhóm điều trò với Simvastatin ở liều 16 mg/kg trong 2 tuần
đầu, và ở liều 40 mg/kg vào tuần lễ thứ ba.

Nhận xét : Nồng độ cholesterol huyết gần như đã
xuống ở mức bình thường sau 1 tuần điều trò với
simvastatin ở liều 40 mg/kg. Dường như liều này hiệu quả
hơn liều 8 và 16 mg/kg.

10


LỜI MỞ ĐẦU

Lipoprotein
Bảng 13. Nồng độ LDL-C huyết
Tuần
ED 1
Sim 1
Sim 2
Sim 3

0
72.78± 10.09
72.78± 10.09
72.78± 10.09
72.78± 10.09

3
131.43± 16.48
172.43± 11.82
150.71± 19.10
184.33± 19.72

6
199.29± 20.01
123.73± 16.50
125.74± 29.31
109.73± 19.44

Sim: Simvastatin

Hình 10. Biểu đồ về nồng độ LDL-C huyết

250
200
150

[C] mg%

*

*

100
50

ED1
Sim 1
Sim 2
Sim 3

0
3

Tuần

6

(*) p < 0.05

Bảng 14. Nồng độ HDL-C huyết
Tuần
ED 1

Sim 1
Sim 2
Sim 3

0
20.68± 1.21
20.68± 1.21
20.68± 1.21
20.68± 1.21

3
6.67± 0.76
15.01± 2.02
7.04± 1.04
5.6± 1.16

Sim: Simvastatin

Hình 11. Biểu đồ về nồng độ HDL-C huyết

11

6
9.37± 1.3
10.6± 1.01
4.55± 0.94
8.26± 1.14


LỜI MỞ ĐẦU

15
ED1

10

Sim 1

[C]
mg%

*

5

Sim 2
Sim 3

0
3

6
Tuần

(*) p < 0.05

Nhận xét : Chúng tôi nhận thấy có một sự giảm có ý
nghóa về nồng độ LDL-C ở những nhóm điều trò so với
nhóm không điều trò. Đối với HDL-C, nhìn chung, không có
sự thay đổi nào có ý nghóa về nồng độ của nó.

Abstract:

In a recent study,we have established a hyperlipidemic model in mice using
Tyloxapol – Triton WR 1339. This model is suitable for preliminary screening of
remedies or compounds potential for hypolipidemic activity because
hypercholesterolemia occurs only about 24h after tyloxapol injection. To evaluate
better about an hypolipidemic agent, it demand a method causing a prolonged and
stable pathologocal state Therefore, the aim in this study was to establish a
hyperlipidemic model in mice under high lipids fed condition and using
simvastatine (cholesterol and triglycerides lowering drug) as a reference drug. Mice
were fed a diet which contains 1% cholesterol, 0,2% taurocholate, 5% fat every day.
The results show that after 3 weeks of diet, cholesterol level increased considerably
and about 60% of experimental mice had hypercholesterolemia. Cholesterol levels
decreased in Simvastatine treated groups (8mg/kg and 16 mg/kg) after 1 week
treatment but increased after 2 weeks. Thus, we divided simvastatine at dose of 16
mg/kg treated group into 2 sub-groups: one group remained the dose and another
group used the augmented dose (from 16 mg/kg to 40 mg/kg). Interestingly,
treatment with simvastatine at dose of 40 mg/kg reduced cholesterol level near to
the normal values after only 1 week treatment.

This ratio did not change after 1 week remained the diet.

5. BÀN LUẬN
12


LỜI MỞ ĐẦU

Mục tiêu chung của nghiên cứu chúng tôi là xây dựng
một mô hình tăng lipid huyết thực nghiệm để được áp

dụng vào việc đánh giá tác động hạ lipid huyết của
nhiều thuốc khác nhau.
Những kết quả thu được của nghiên cứu cho thấy mô
hình này chỉ ảnh hưởng đến mức cholesterol huyết mà
không ảnh hưởng đến mức triglycerid huyết. Những kết
quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây [23].
Việc tăng cholesterol huyết đóng vai trò quan trọng trong
việc phát triển bệnh mạch vành (Masserg et al.,2002) [36].
Cholesterol huyết của những chuột trong nhóm thử
nghiệm gia tăng một cách có ý nghóa so với nhóm
chứng sau 3 tuần gây bệnh.
Việc ngưng chế độ ăn giàu lipid sau 3 tuần không gây ra
sự thay đổi nào đối với mức cholesterol huyết đã tăng
cao, điều này có ý nghóa quan trọng đối với sự ổn đònh
của mô hình. Những kết quả này cho chúng ta thấy
tiềm năng áp dụng mô hình này để gây ra một tình
trạng bệnh lý thích hợp áp dụng vào những nghiên cứu
hiệu lực của thuốc hoặc những hoạt chất có hoạt tính
mà hiệu quả của thuốc thể hiện chậm.
Về việc đánh giá tính khả dụng của mô hình thử
nghiệm, chúng tôi sử dụng một tác nhân làm hạ lipid
huyết, simvastatin thuộc những dẫn chất statin đã được
sử dụng như một thuốc đối chứng trong những mô hình
tăng lipid huyết thử nghiệm khác. Cơ chế của simvastatin
là ức chế HMG CoA reductase.

13


LỜI MỞ ĐẦU

Sau 3 tuần điều trò, chúng tôi nhận thấy một sự giảm
có ý nghóa nồng độ cholesterol huyết của nhóm điều trò
với simvastatin liều 8 mg/kg và 16 mg/kg khi so sánh với
nhóm không điều trò. Tuy nhiên, lại không tồn tại sự
khác biệt có ý nghóa giữa nhóm điều trò với liều 8
mg/kg và nhóm điều trò với liều 16 mg/kg. Chúng tôi
cũng nhận thấy mặc dù tồn tại một sự giảm cholesterol
huyết ở 2 nhóm điều trò (8 mg/kg et 16 mg/kg) sau 3 tuần
điều trò, nhưng chúng tôi lại không nhận được sự khác
biệt có ý nghóa về nồng độ cholesterol huyết so với thời
điểm bắt đầu điều trò. Hiện tượng này có thể là do
thời gian điều trò điều trò chưa đủ để hiệu quả của
thuốc có thể thể hiện rõ hơn. Do đó, cần thời gian điều
trò dài hơn với 2 liều này.
Tác động hạ lipid huyết của simvastatin dường như phụ
thuộc liều. Quả vậy, trong nghiên cứu của chúng tôi,
nồng

độ

cholesterol

giảm

đáng

kể

khi

tăng

liều

simvastatin từ 16 mg/kg lên 40 mg/kg vào tuần lễ thứ 3.
Trong nhóm này, nồng độ cholesterol huyết giảm một
cách đáng kể vào cuối đợt điều trò và dẫn đến một sự
khác biệt có ý nghóa không những so với nhóm chứng
mà còn so với thời điểm bắt đầu điều trò.
Đối với các lipoprotein, kết quả đã chứng tỏ có sự
giảm nồng độ HDL-C và tăng LDL-C sau 3 tuần theo chế
độ ăn giàu lipid. Vào cuối thử nghiệm, nồng độ LDL-C
giảm đáng kể so với nhóm không điều trò trong khi
chúng tôi không ghi nhận sự thay đổi có ý nghóa về

14


LỜI MỞ ĐẦU

nồng độ HDL-C mặc dù theo đặc tính trò liệu của statin,
simvastatin có tác động lên HDL-C.

XÂY DỰNG MƠ HÌNH GÂY TĂNG LIPID HUYẾT
TRÊN CHUỘT NHẮT BẰNG
CHẾ ĐỘ ĂN GIÀU LIPID
Mai Phương Mai, Nguyễn Ngọc Văn , Huỳnh Ngọc Trinh
Bộ mơn Dược Lý – Dược Lâm Sàng
Khoa Dược, ĐH Y Dược Tp.Hồ Chí Minh

ĐT : 0913.888.053

15


LÔØI MÔÛ ÑAÀU

Abstract
Study of high lipids diet induced hyperlipidemic mice
Mai Phuong Mai, Nguyen Ngoc Van, Huynh Ngoc Trinh
Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and
Pharmacy at Hochiminh city.
In a recent study,we have established a hyperlipidemic model in mice using
Tyloxapol – Triton WR 1339. This model is suitable for preliminary screening of
remedies or compounds potential for hypolipidemic activity because
hypercholesterolemia occurs only about 24h after tyloxapol injection. To evaluate
better about an hypolipidemic agent, it demand a method causing a prolonged and
stable pathologocal state Therefore, the aim in this study was to establish a
hyperlipidemic model in mice under high lipids fed condition and using
simvastatine (cholesterol and triglycerides lowering drug) as a reference drug. Mice
were fed a diet which contains 1% cholesterol, 0,2% taurocholate, 5% fat every day.
The results show that after 3 weeks of diet, cholesterol level increased considerably
and about 60% of experimental mice had hypercholesterolemia. Cholesterol levels
decreased in Simvastatine treated groups (8mg/kg and 16 mg/kg) after 1 week
treatment but increased after 2 weeks. Thus, we divided simvastatine at dose of 16
mg/kg treated group into 2 sub-groups: one group remained the dose and another
group used the augmented dose (from 16 mg/kg to 40 mg/kg). Interestingly,
treatment with simvastatine at dose of 40 mg/kg reduced cholesterol level near to
the normal values after only 1 week treatment.

Tóm tắt
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu mô hình gây tăng lipid huyết bằng chế độ ăn
giàu lipid nhằm tạo một tình trạng bệnh ổn định và kéo dài. Chuột được cho ăn thực
phẩm
có
chứa
1%
cholesterol,
0.2% taurocholate, 5% mỡ. Kết quả cho thấy nồng độ cholesterol tăng đáng kể sau
3 tuần và có khoảng 60% chuột thử nghiệm có nồng độ cholesterol tăng cao. Tuy
nhiên, tỉ lệ này không tăng sau 1 tuần duy trì tiếp chế độ ăn. Trị liệu với
simvastatine (8mg/kg và 16 mg/kg) cho thấy nồng độ cholesterol giảm mạnh sau 1
tuần nhưng lại tăng nhanh sau 2 tuần. Do đó chúng tôi đã tăng liều simvastatine từ
16mg/kg lên 40 mg/kg. Sau 1 tuần điều trị với liều này, nồng độ cholesterol gần như
giảm xuống mức bình thường.

1. MỞ ĐẦU
Ngày nay, bệnh tim mạch có nguồn gốc mạch vành ngày càng trở nên phổ biến trên
thế giới. Nguyên nhân chính là do sự gia tăng bất thường của lipid máu, do nhiều
yếu tố nguy cơ như di truyền, tiểu đường , hoặc do sự gia tăng của bệnh béo phì, ….
trong số đó chế độ dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng trong việc gia tăng lipid
máu.

16


LÔØI MÔÛ ÑAÀU

Trong những nghiên cứu trước đây thực hiện tại Bộ môn Dược Lý, khoa Dược- Đại
học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh cho thấy việc gây tăng lipid huyết bằng

Tyloxapol thích hợp trong trường hợp chọn lọc ban đầu (screening) những hoạt chất
hoặc những bài thuốc có tác dụng hạ lipid huyết. Vì vậy, mục tiêu chính của nghiên
cứu này là xây dựng một mô hình gây tăng lipid huyết thực nghiệm bằng chế độ ăn
giàu lipid nhằm tạo một tình trạng bệnh lý kéo dài hơn và ổn định hơn trên chuột
nhắt.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
Chuột nhắt trắng chủng ddY nặng từ 18 đến 26 g, được mua từ Viện Pasteur thành
phố Hồ Chí Minh và được nuôi bằng thức ăn viên.
Natri taurocholat (Kanto chemical Co.-Cica, Japon)
Cholesterol (Kanto chemical Co.-Cica, Japon)
Simvastatine (ZOCOR 20mg- Merck Sharp & Dolme)
2.2. PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM
a. Thăm dò mô hình tăng lipid huyết gây bởi chế độ ăn giàu lipid
Chuột được gây tăng lipid bằng chế độ ăn giàu lipid, bao gồm các thành phần với tỷ
lệ như sau:
1% Cholesterol
0.2 % Natri taurocholat
5 % Mỡ heo
Pha trong 1kg thức ăn chuẩn dạng viên (được cung cấp bởi viện Pasteur
thành phố Hồ Chí Minh)
Theo dõi nồng độ cholesterol và triglycerid huyết của chuột thử nghiệm sau 2, 3 và
4 tuần cho ăn.
Sau đó, chọn những chuột thử nghiệm có nồng độ lipid huyết tăng cao và chia thành
2 nhóm:
Nhóm 1: trở lại chế độ ăn thường.
Nhóm 2: duy trì chế độ ăn giàu lipid.
Tiến hành lấy máu chuột sau 3 tuần để xác định nồng độ cholesterol và triglycerid
huyết bằng phương pháp đo enzyme – màu.

b. Đánh giá tính khả dụng của mô hình thực nghiệm
Chuột thử nghiệm được cho ăn chế độ ăn giàu lipid trong 3 tuần, sau đó những
chuột có nồng độ choleterol cao hơn 150 mg% được chọn và chia thành 3 nhóm lần
lượt như sau:
− Nhóm chứng không điều trị: PO nước cất (0.1ml/10g thể trọng)
− Nhóm 1 : PO simvastatin với liều 8 mg/kg × 1 lần/ngày.
− Nhóm 2 : PO simvastatin với liều 16 mg/kg × 1 lần/ ngày.
Sự biến thiên của nồng độ cholesterol huyết được đánh giá sau 1, 2 và 3 tuần điều
trị.

17


LÔØI MÔÛ ÑAÀU

2.3. Phương pháp đánh giá kết quả
Kết quả được đánh giá bằng Student test (two-tail) và được trình bày dưới dạng “
Trung bình ± SEM”. Sự khác biệt với P < 0.05 được xác định là có ý nghĩa.

3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. THĂM DÒ MÔ HÌNH GÂY TĂNG LIPID HUYẾT BẰNG CHẾ ĐỘ ĂN
GIÀU LIPID
Chuột thử nghiệm được chia làm 2 nhóm :
∗ Nhóm chứng : được nuôi theo chế độ ăn bình thường.
∗ Nhóm tăng lipid huyết : được nuôi bằng chế độ ăn đặc biệt giàu lipid.
Nồng độ cholesterol và triglycerid huyết của chuột thử nghiệm trong 2 nhóm này
sau 2, 3 và 4 tuần được thể hiện trong bảng sau đây :
Bảng 1. Nồng độ lipid máu của 2 nhóm chuột thử nghiệm sau 4 tuần cho ăn
Nhóm
Chứng

Thử

n
10
20

Cholesterol huyết (mg%)
m±SEM
2 tuần
3 tuần
4 tuần
88.77 ± 10.01
101.78 ±
92.14 ±
4.27
3.23
143.94 ±
148.74 ±
131.68
27.18
11.20
± 8.03

Triglycerid huyết (mg%)
m±SEM
2 tuần
3 tuần
4 tuần
111.08 ±
70.90

34.23 ± 8.26
20.14
±11.75
85.14±6.73 76.93±6.14 66.17±22.84

Sau 2 tuần theo chế độ ăn giàu lipid, nồng độ cholesterol huyết của nhóm thử bắt
đầu tăng nhưng không khác biệt so với nhóm chứng. Ở tuần lễ thứ 3, sự khác biệt
này đã có ý nghĩa rõ rệt. Có khoảng 60 % chuột tăng lipid huyết vào tuần lễ thứ 3,
tỷ lệ này vẫn không thay đổi vào tuần lễ thứ 4 của nghiên cứu.
Tiếp theo, để đánh giá tính ổn định của mô hình, những chuột thử nghiệm đã tăng
nồng độ cholesterol huyết vào tuần lễ thứ 4 được chọn và chia thành 2 nhóm sau
đây :
Nhóm 1 : Quay trở lại chế độ ăn bình thường.
Nhóm 2 : Duy trì chế độ ăn giàu lipid.
Xác định nồng độ cholesterol và triglycerid sau 3 tuần.
Bảng 2. Nồng độ lipid máu ở 2 nhóm chuột thử nghiệm
Nhóm

4 tuần

7 tuần

Chol
159.49 ± 6.47

TG
Nhóm 2
75.9 ± 17.21
Nhóm 1
160.09± 22.09

54.93 ± 9.57
Chol : Cholesterol huyết, TG : Triglycerid huyết

Chol
203.72 ± 37.27
179.67 ± 39.01

TG
123.1 ± 73.145
72.35± 11.48

Kết quả cho thấy nhóm chuột được duy trì chế độ ăn giàu lipid (nhóm 2) có nồng độ
cholesterol huyết vẫn ở mức cao, trong khi đó mức cholesterol huyết đã tăng cao

18


LÔØI MÔÛ ÑAÀU

của những chuột ở nhóm 1 vẫn không thay đổi sau 3 tuần ngưng chế độ ăn giàu
lipid. Những kết quả này cho thấy tính ổn định của mô hình.
Từ những kết quả thu được, chúng tôi tiến hành giai đoạn đánh giá tính khả dụng
của mô hình theo tiến trình sau đây :
- Gây tăng lipid huyết trong 3 tuần.
- Chọn chuột có mức cholesterol > 150 mg% vào tuần lễ thứ 3.
- Sử dụng một tác nhân làm hạ lipid huyết để đánh giá tính khả dụng của mô hình
này.
3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM BẰNG
CÁCH ÁP DỤNG TÁC NHÂN LÀM HẠ LIPID HUYẾT
Những chuột đáp ứng yêu cầu thử nghiệm sau 3 tuần gây tăng lipid huyết được chia

thành 3 nhóm như sau :
− Nhóm chứng (không điều trị): nước cất (0.1 ml /10 g chuột).
− Nhóm 1: simvastatin liều 8mg/kg × 1 lần/ngày.
− Nhóm 2: simvastatin liều 16mg/kg × 1 lần/ngày.


Cholesterol và triglycerids:

Kết quả được trình bày trong bảng 3 và 4 dưới đây.
Bảng 3. Nồng độ cholesterol huyết ở những nhóm chuột thử nghiệm
Tuần
Chứng
Sim 1
Sim 2
Sim 3

0
125.78±12.1
125.78±12.1
125.78±12.1
125.78±12.1

3
167.76 ± 6.1
205.54±11.47
176.65±17.29
206.87±17.77

4
145.46±16.32

152.19±13.98
145.17±16.04
165.4±16.85

5
175.8±22.83
177.9±18.95
203.57±28.05
203.8±20.17

6
232.96±23.1
145.37±16.37
145.57±28.48
134.66±18.38

Bảng 4. Nồng độ triglycerid huyết ớ những nhóm chuột thử nghiệm
Tuần
0
3
4
5
6
Chứng 148.06±28.96
114.9±16.48
53.46±3.84
57.13±6.7
121.46±33.55
Sim 1 148.06±28.96
90.47±11.06

60.71±6.07
57.86±4.45
67.89±9.24
Sim 2 148.06±28.96
59.28±9.27
39.08±8.94
50.68±12.13
76.35±9.57
Sim 3 148.06±28.96
84.69±13
60.07±6.7
55.06±4.43
83.34±14.86
Chứng: PO nước cất ; Sim 1: PO simvastatin liều 8 mg/kg ; Sim 2 : PO simvastatin liều 16
mg/kg ; Sim 3: PO simvastatin liều 16 mg/kg → 40 mg/kg

Nồng độ cholesterol huyết sau 1 tuần điều trị đã bắt đầu giảm so với nhóm chứng
nhưng chưa có sự khác biệt thống kê giữa hai nhóm điều trị. Tuy nhiên giá trị này
lại tăng nhanh vào tuần lễ thứ 2 của đợt điều trị. Hiện tượng này có thể là do cơ chế
bù sinh lý, thông qua việc tăng số lượng LDL-receptor dưới tác động hạ lipid huyết
của thuốc. Ở tuần thứ 3, nồng độ cholesterol hầu như vẫn còn cao và không khác so
với thời điểm ban đầu chưa điều trị. Điều này có thể do thời gian điều trị chưa đủ để
hiệu quả của thuốc được thể hiện rõ hơn nên cần có thời gian điều trị dài hơn với 2
liều này (8 mg/kg và 16 mg/kg).

19


LÔØI MÔÛ ÑAÀU

Do đó, chúng tôi đã chia nhóm thứ 2 thành 2 nhóm nhỏ trong đó một nhóm vẫn tiếp
tục điều trị với liều 16 mg/kg và nhóm còn lại tăng liều lên đến
40 mg/kg. Tiến hành định lượng nồng độ cholesterol và triglycerids sau 1 tuần điều
trị.
Kết quả định lượng cho thấy, nồng độ cholesterol huyết gần như đã giảm xuống ở
mức bình thường sau 1 tuần điều trị với simvastatin ở liều 40 mg/kg. Như vậy, liều
này dường như hiệu quả hơn liều 8 và 16 mg/kg.
Xét về nồng độ triglycerids, sau 6 tuần điều trị bằng simvastatine cho thấy nồng độ
triglycerids dao động một cách tự nhiên không phụ thuộc vào chế độ ăn giàu lipid
và không phụ thuộc vào chế độ trị liệu bằng simvastatin. Tuy nhiên, nồng độ
triglycerid huyết giữa nhóm chứng và nhóm thử không khác nhau có ý nghĩa.
Như vậy, mô hình gây tăng lipid huyết bằng chế độ ăn giàu lipid chỉ làm tăng nồng
độ cholesterol trong huyết tương nhưng lại không ảnh hưởng đến nồng độ
triglycerides. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trướnc đây về mô hình
gây tăng lipid bằng chế độ ăn.
 Lipoprotein
Ngoài phân tích cholesterol và triglycerid, chúng tôi cũng tiến hành phân tích sự
thay đổi trong thành phần các lipiproteins, bao gồm HDL và LDL.
Hình 10. Biểu đồ về nồng độ LDL-C huyết
250
200
150

[C] mg%

*

*

100

50

Chứng
Sim 1
Sim 2
Sim 3

0
3

Tuần

6

(*) p < 0.05

Nồng độ LDL-C ở những nhóm điều trị giảm đáng kể so với nhóm không điều trị
(P<0.05). Tuy nhiên nồng độ HDL-C hầu như không thay đổi.

4. KẾT LUẬN
Các kết quả thử nghiệm cho thấy mô hình gây tăng lipid huyết bằng chế độ ăn giàu
lipid là một mô hình khá ổn định và gần với tình trạng bệnh lý ở người, có thể áp
dụng để đánh giá hiệu quả của những tác nhân làm hạ lipid huyết sau giai đoạn
chọn lọc với chất tẩy rửa Triton WR 1339-Tyloxapol.

20


LỜI MỞ ĐẦU

6. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Sau 4 tháng tiến hành thử nghiệm, chúng tôi đã đạt
được những kết quả sau đây :
∗

Xây dựng được mô hình tăng cholesterol huyết
bằng chế độ ăn

giàu lipid trên chuột nhắt

trắng, chủng ddY.
∗

Đánh giá tính khả dụng của mô hình bằng
cách sử dụng tác nhân làm hạ lipid huyết
(Simvastatin)

Kết quả cho thấy rằng đây là một mô hình khá ổn
đònh và gần với tình trạng bệnh lý ở người, có thể áp
dụng để đánh giá hiệu quả của những tác nhân làm
hạ lipid huyết sau giai đoạn chọn lọc với chất tẩy rửa
Triton WR 1339-Tyloxapol . Tuy

nhiên, đây chỉ là một

nghiên cứu sơ khởi. Do đó, chúng tôi luôn hy vọng được
tiếp tục nghiên cứu này trong tương lai để nhận được
một mô hình chuẩn hoá mà sẽ được xem như một công
cụ nghiên cứu phát hiện những thuốc có tác khả năng
làm giảm nguy cơ những bệnh tim mạch, một trong những

nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới.

21


LỜI MỞ ĐẦU

3.NGUYÊN

VẬT

LIỆU

VÀ

PHƯƠNG PHÁP
3.1.NGUYÊN VẬT LIỆU
Chuột nhắt trắng chủng ddY nặng từ 18 đến 26 g, được
mua từ Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh và được
nuôi bằng thức ăn viên.
Natri taurocholat (Kanto chemical Co.-Cica, Japon)
Cholesterol nguyên chất (Kanto chemical Co.-Cica, Japon)
Mỡ heo
Simvastatine (ZOCOR 20mg- Merck Sharp & Dolme)
Thuốc thử cholesterol (I.S.E. S.r.l. , Rome, Italie)
Thuốc thử triglycerid (I.S.E. S.r.l. , Rome, Italie)
Thuốc thử HDL (Globe diagnostics S.r.l, Italie)

3.2. PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM
3.2.1. PHA CHẾ THỨC ĂN GIÀU LIPID

Tỷ lệ các thành phần sử dụng trong chế độ ăn giàu
lipid :
1% Cholesterol
0.2 % Natri taurocholat
5 % Mỡ heo
Thức ăn chuẩn dạng viên (được cung cấp bởi viện
Pasteur thành phố Hồ Chí Minh)

3.2.2. THĂM DÒ MÔ HÌNH TĂNG LIPID HUYẾT
GÂY BỞI CHẾ ĐỘ ĂN GIÀU LIPID


Giai đoạn 1 : Những chuột thỏa mãn điều kiện thí

nghiệm được chia thành 2 nhóm :

22


LỜI MỞ ĐẦU

∗ Nhóm chứng : chuột được nuôi bằng thức ăn chuẩn.
∗ Nhóm tăng lipid: chuột được nuôi bằng chế độ ăn
đặc biệt giàu lipid.
Nồng độ cholesterol và triglycerid huyết của chuột thử
nghiệm được theo dõi 2, 3 và 4 tuần sau chế độ ăn.


Giai đoạn 2: Giai đoạn này nhằm mục đích đánh giá

tính ổn đònh của mô hình sau khi ngưng chế độ ăn giàu
lipid.
Những chuột thử nghiệm có nồng độ lipid huyết tăng
cao được chọn và chia thành 2 nhóm sau đây:
Nhóm 1: quay trở lại chế độ ăn thường.
Nhóm 2: duy trì chế độ ăn giàu lipid.
3 tuần sau đó, chúng tôi tiến hành lấy máu chuột để
xác đònh nồng độ cholesterol và triglycerid huyết.

3.2.3. ĐÁNH GIÁ TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA MÔ HÌNH
THỰC NGHIỆM BẰNG CÁCH SỬ DỤNG TÁC
NHÂN LÀM HẠ LIPID HUYẾT
Những chuột đáp ứng tiêu chuẩn thử nghiệm được chia
thành 2 nhóm : nhóm chứng và nhóm tăng lipid huyết
với chế độ ăn bình thường và chế độ ăn tăng lipid
huyết lần lượt theo như đã nói ở trên.
Sau 3 tuần duy trì chế độ ăn giàu lipid, những chuột có
nồng độ choleterol cao hơn 150 mg%

được chọn và chia

thành 3 nhóm. Sau đó, tuỳ theo mỗi nhóm, chúng tôi
tiến hành cho uống thuốc :
− Nhóm 1 : simvastatin với liều
lần/ngày.

23

8 mg/kg ×

1


LỜI MỞ ĐẦU

− Nhóm 2 : simvastatin với liều 16 mg/kg × 1 lần/
ngày.
− Nhóm 3: nước cất (0.1 ml /10 g trọng lượng chuột).
Sự biến thiên của nồng độ cholesterol huyết được đánh
giá sau 1, 2 và 3 tuần điều trò.

2.2. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG LIPID HUYẾT [9]
Máu chuột thử nghiệm được lấy bằng đường tónh mạch
đuôi và ly tâm khoảng 4000 vòng trong 5 phút. Huyết
tương sau đó được tách ra và bảo quản trong tủ lạnh.
Chúng tôi áp dụng phương pháp so màu để xác đònh
nồng độ cholesterol và triglycerid huyết tương.
∗ Định lượng cholesterol
-Nguyên tắc
Cholesterol được đònh lượng bằng phương pháp so màu dưới
tác động của enzym dựa vào các phản ứng sau đây :
Cholestérol estérifie

Cholestero
l esterase Cholesterol +
+ H2O 

→

acid béo

Cholestero
l oxidase 4-Cholesten-3-on + H2O2
Cholesterol + O2 

→
Peroxidase

2H2O2 + Phenol + amino-4-antipyrine     → Red quinone +
4H2O
- Thuốc thử
Dung dòch đệm (pH= 6,9)
Phenol
Natri cholat
Cholesterol esterase
Cholesterol oxidase
Peroxidase

50 mmol/L
24 mmol/L
0,5 mmol/L
≥ 200 U/L
≥ 250 U/L
≥ 1000 U/L

24


LỜI MỞ ĐẦU

4-aminoantipyrine

> 180 U/L

∗ Dung dòch chuẩn:
Dung dòch cholesterol chuẩn

200mg%

2g/l
5,17 mmol/l
- Mẫu thử
− Huyết tương chuột
- Tiến hành
Mật độ quang : 500nm
Nhiệt độ : 57 °C
Cống đo: 1 cm
Đọc đối chiếu với mẫu trắng
Thuốc thử

Trắng
1 ml

Chuẩn
1 ml

Thử
1 ml

Nước cất

10µl

-

-

-

10µl

-

Dung dòch chuẩn 200 mg%

Huyết tương chuột
10µl
Trộn đều, ủ trong 5 phút. Đọc mật độ quang (OD). Màu
cuối cùng ổn đònh trong ít nhất 1 giờ.
- Calculs
Nồng độ cholesterol =

OD(Thử
)
×n
OD(Chuẩn
)

n: nồng độ dung dòch chuẩn
∗ Đònh lượng triglycerid
- Nguyên tắc

Triglycerid được đònh lượng bằng phản ứng với enzym như
sau:
Lipoprotei
nlipase glycerol + acid béo
Triglycerid + H2O 

→

25