Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định lượng clorpromazin trong huyết tương người

Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO

Bộ Y Tế

tRƯờNG đạI HọC dƯợC hà NộI

Nguyễn Trung Nghĩa

nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích
định lượng clorpromazin
trong huyết tương người

Luận văn Thạc sĩ Dược học
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất
Mã số : 60.73.15

Hà nội - 2006


Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO

Bộ Y Tế

tRƯờNG đạI HọC dƯợC hà NộI

Nguyễn Trung Nghĩa

nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích
định lượng clorpromazin
trong huyết tương người
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất

Mã số : 60.73.15

Luận văn Thạc sĩ Dược học
người hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS Trần Tử An
2. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

Hà nội - 2006


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Tử An và TS.
Nguyễn Thị Kiều Anh, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo
tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài.
Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn các thầy
cô Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng các Bộ môn khác
của trường Đại học Dược Hà nội đã tạo điều kiện tốt cho chúng tôi trong
thời gian học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo cùng các cán bộ Bộ môn
Hóa phân tích đã luôn quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn
thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu trong thời gian vừa qua.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã luôn động
viên, chia sẻ, khích lệ và giúp đỡ để tôi có thể có kết quả như ngày hôm
nay.

Hà Nội, ngày 26 tháng 12 năm 2006
Học viên cao học khóa 9, chuyên ngành
Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất

Nguyễn Trung Nghĩa


-I-

BẢNG CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CBZ
CPZ
HPLC

:
:
:

HT
LOQ
MS
PĐ
PA
RSD
SD
S/N
TƯ
t 1/2
t max
UV
VN

:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:

R

R

Carbamazepin
Clorpromazin
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
Huyết tương
Giíi h¹n ®Þnh l­îng (Limit of Quantification)
Khối phổ (Mass Spectrometry)
Pha động
Tinh khiết phân tích (Pure for Analysis)
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)

Trung Ương
thời gian bán hủy
thời gian đạt nồng độ thuốc cực đại
Tử ngoại (Ultra Violet)
Việt Nam


-II-

MC LC
Trang

T VN

1

Chng 1: TNG QUAN

2

1.1 Clorpromazin

2

1.1.1. Công thức

2

1.1.2. Tính chất

2

1.1.3. Động học, cơ chế và tác dụng dược lý

3

1.1.4. áp dụng lâm sàng

8

1.1.5. Một số dạng chế phẩm bào chế và biệt dược chứa CPZ

8

1.2. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng

9

1.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao

10

1.3.1. Nguyên lý

12

1.3.2. Thiết bị

15

1.4. Một số phương pháp HPLC định lượng clorpromazin

Chng 2: I TNG - PHNG PHP NGHIấN CU

19
22

2.1. Đối tượng nghiên cứu

22

2.2. Hoá chất - trang thiết bị

22

2.2.1. Hoá chất

22

2.2.2. Thiết bị - dụng cụ

23

2.3. Phương pháp nghiên cứu

23

2.3.1. Xây dựng quy trình định lượng

23

2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích

25

2.3.3. Định lượng thăm dò CPZ trong huyết tương bệnh nhân

27

2.3.4. Phân tích số liệu thực nghiệm

27

Chng 3: KT QU V BN LUN

28


-III-

3.1. Phương pháp định lượng clorpromazin trong huyết tương

28

3.1.1. Phương pháp chiết CPZ từ huyết tương

28

3.1.2. Các điều kiện sắc ký và chương trình HPLC để định lượng
CPZ

34

3.2. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng

38

3.2.1. Tính phù hợp của hệ thống sắc ký

38

3.2.2. Tính chọn lọc

40

3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính

43

3.2.4. Giới hạn định lượng dưới

48

3.2.5. Độ đúng - độ chính xác - độ tìm lại

49

3.2.6. Độ ổn định

53

3.3. Kết quả sơ bộ định lượng CPZ trong huyết tương bệnh nhân

54

3.4. Bàn luận

56

3.4.1. Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng CPZ/HT

56

3.4.2. Về kết quả sơ bộ định lượng CPZ/HT bệnh nhân

60

Chng 4: KT LUN V XUT

62

4.1 Kết luận

62

4.2. Đề xuất

63

TI LIU THAM KHO

DANH MC CC BNG TRONG LUN VN


-IV-

Bảng

Nội dung

Trang

1.1

Một số phương pháp HPLC định lượng clorpromazin..................

19

3.2

Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký...........................

32

3.3

Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ CPZ trong huyết tương

44

3.4

Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới ......................................

48

3.5

Kết quả xác định độ đ úng của phương pháp phân tích....................

49

3.6

Kết quả xác định độ lặp trong ngày của phép phân tích...................

50

3.7

Kết quả khảo sát độ lặp lại khác ngày.......................................................

51

3.8

Kết quả xác định hiệu suất chiết CPZ................................................

52

3.9

Kết quả khảo sát độ ổn định của CPZ trong thời gian phân tích......

53

3.10

Kết quả khảo sát độ ổn định của CPZ trong thời gian bảo quản.....

54

3.11

Kết quả đ ịnh lượng thăm dò CPZ trong huyết tương bệnh nhân....

55


-V-

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Hình

Nội dung

Trang

1.1

Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.........................................

15

3.2

Sơ đồ quy trình chiết CPZ trong huyết tương....................................

30

3.3

Kết quả khảo sát tìm dung môi chiết CPZ trong huyết tương............

31

3.4

Sắc ký đồ khảo sát thời gian lắc xoáy................................................

32

3.5

Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ cô bay hơi dung môi..............................

33

3.6

Kết quả khảo sát cột sắc ký và hệ pha động cho định lượng CPZ/HT....

36

3.7

Phổ hấp thụ UV của CPZ trong hệ pha động....................................

37

3.8

Sắc đồ khảo sát sự phù hợp của hệ thống sắc ký...............................

39

3.9

Các sắc ký đồ thể hiện tính chọn lọc của phương pháp.....................

42

3.10

So phổ UV của pic có R t = 4,820 phút với phổ của CPZ chuẩn........

43

3.11

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích và nồng độ CPZ trong

44

R

R

huyết tương.........................................................................................
3.12

Các sắc đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của CPZ trong
huyết tương.........................................................................................

47


1

đặt vấn đề
Clorpromazin là một dẫn chất của nhóm phenothiazin có tác dụng chính
là hướng thần kinh điển, hiện vẫn đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam.
Tuy nhiên, do sự liên quan giữa nồng độ thuốc trong huyết tương với liều
dùng rất khác nhau giữa các cá thể, mặt khác mối liên hệ giữa nồng độ thuốc
trong huyết tương với đáp ứng lâm sàng không rõ ràng nên quá liều
clorpromazin vẫn xảy ra khá phổ biến. Các triệu chứng ngộ độc nặng của
clorpromazin đã từng xảy ra với liều nhỏ hơn 0,1g/lần trong khi bệnh nhân có
thể phải dùng tới liều 1g/ngày thậm chí 2g/ngày hoặc cao hơn nữa [6], [19].
Nồng độ clorpromazin trong huyết tương với liều điều trị dao động từ 0,03 0,3g/mL, triệu chứng ngộ độc có thể xuất hiện ở nồng độ từ 0,5 - 2g/mL và

nồng độ 2g/mL có thể gây tử vong. Một nghiên cứu trên 8 ca tử vong cho
thấy nồng độ clorpromazin trong máu toàn phần dao động từ 3 - 35g/mL
(trung bình 17g/mL) [18], [28].
Với mục đích góp phần vào việc xác định nồng độ của thuốc
clorpromazin trong máu phục vụ cho việc theo dõi nồng độ thuốc trong máu
các bệnh nhân đang điều trị tại bệnh viện, chúng tôi tiến hành đề tài:
"Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định lượng
clorpromazin trong huyết tương người"
Để thực hiện mục đích trên, đề tài nghiên cứu gồm các nội dung sau:
- Khảo sát quy trình chiết clorpromazin trong huyết tương người và xây
dựng chương trình HPLC để định lượng clorpromazin.
- Thẩm định chương trình đã xây dựng và áp dụng định lượng
clorpromazin trong huyết tương bệnh nhân.
-


2

Chương 1: Tổng quan
1.1 Clorpromazin
1.1.1 Công thức
- Clorpromazin
CH3
N

CH3

N

Cl

S

C 17 H 19 ClN 2 S (M=318,9)
R

R

R

R

R

R

2-Chloro-10-(3-dimethylaminopropyl) phenothiazin [12], [17], [35], [36]
- Clorpromazin embonat
(C 17 H 19 ClN 2 S) 2 C 23 H 16 O 6 (M=1026.1)
R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

Trong thực tế thường gặp thuốc dưới dạng hydroclorid.
- Clorpromazin hydroclorid
C 17 H 19 ClN 2 S.HCl
R

R

R

R

R

R

1.1.2. Tính chất
- Clorpromazin
+ Dạng bột trắng đến trắng kem, không mùi, bị phân hủy dần dưới tác dụng
của ánh sáng (trở nên sẫm màu)
+ Thực tế không tan trong nước, tan trong ethanol và ether (1/3), tan trong
cloroform và benzen (1/2). Dễ tan trong các acid vô cơ loãng, thực tế không
tan trong các hydroxyd kiềm loãng.
+ Nhiệt độ nóng chảy: 560 - 600C
P

P

P

P


3

- Clorpromazin embonat
+ Dạng bột màu vàng nhạt
+ Rất ít tan trong nước, tan trong aceton.
- Clorpromazin hydroclorid (tên khác Aminazin)
+ Dạng bột kết tinh màu trắng đến trắng kem, không mùi, vị rất đắng. Bị phân
hủy dưới tác dụng của ánh sáng và không khí (chuyển màu dần sang vàng đến
hồng và cuối cùng là tím).
+ Nhiệt độ nóng chảy:

1950 - 1980C.
P

P

P

P

+ Rất dễ tan trong nước, dễ tan trong ethanol và thực tế không tan trong ether,
benzen.
+ Hằng số phân ly:

pK a = 9,3 (200C)

+ Hệ số phân bố:

LogP (octanol/nước pH 7,4) = 3,4

+ Hấp thụ UV:

max = 254nm và 306nm [4], [7], [11], [12], [17]

R

R

R

P

P

R

1.1.3. Động học, cơ chế và tác dụng dược lý
- Dược động học
Clorpromazin là một trong vài thuốc an thần chủ yếu được nghiên cứu
kỹ về dược động học.
+ Hấp thu: thuốc được hấp thu khá nhanh qua đường tiêu hóa nhưng
sinh khả dụng của thuốc dạng viên nén cũng thất thường, có thể cải thiện đôi
chút bằng sử dụng thuốc dưới dạng dung dịch lỏng. Tuy nhiên, sinh khả dụng
của clorpromazin vẫn khá thấp, khoảng 32 19% (với liều đơn) và có thể bị
giảm tới 20% ở các liều lặp lại (do hiện tượng cảm ứng). Thuốc đường uống
được hấp thu chủ yếu ở hỗng tràng và phụ thuộc vào pH. Trong một nghiên
cứu, khi bệnh nhân được dùng các thuốc kháng H2 (như cimetidin, famotidin,
R

R

nizatidin) thì nồng độ clorpromazin trong huyết tương giảm. Clorpromazin
dùng đường uống bị chuyển hóa qua gan lần đầu đáng kể, có thể dùng đường
tiêm bắp để khắc phục hiện tượng này. Sau khi uống thuốc dạng viên nén thì


4

sau 30 - 60 phút bắt đầu có tác dụng dược lý và tác dụng kéo dài từ 4 - 6 giờ.
Dạng thuốc đặt xuất hiện tác dụng chậm hơn và thời gian tác dụng ngắn hơn,
từ 3 - 4 giờ. Dạng tác dụng kéo dài có tác dụng trong khoảng 10 - 12 giờ.

Nồng độ clorpromazin huyết tương đạt đỉnh sau 2-4 giờ sau uống với liều
điều trị. Nồng độ đỉnh này kéo dài khoảng 3-4 giờ nữa và sau đó giảm dần
+ Phân bố: clorpromazin được phân bố rộng trong hầu hết các mô và
dịch của cơ thể, thuốc có thể qua hàng rào máu não và nồng độ trong não cao
hơn nồng độ trong huyết tương. Clorpromazin liên kết protein huyết tương
khoảng 95 - 98%, chủ yếu là liên kết albumin, có tài liệu cho rằng nó kết hợp
với albumin huyết tương tới 99%. Bình thường với liều điều trị, nồng độ
clorpromazin huyết tương từ khoảng 0,03 - 0,3àg/mL. Clorpromazin và các
sản phẩm chuyển hóa của nó có thể qua nhau thai và vào được sữa mẹ.
+ Chuyển hóa và thải trừ: clorpromazin được chuyển hóa chủ yếu tại
gan bởi các quá trình hydroxyl hóa và liên hợp glucuronic, N - oxy hóa, oxy
hóa nguyên tử sulfur và khử alkyl hóa, khử methyl hóa. Có hơn 15 chất
chuyển hóa của clorpromazin đã được xác định, nửa số đó thải trừ qua nước
tiểu và phân. Vài sản phẩm có hoạt tính như 7- hydroxyclorpromazin, còn sản
phẩm khác như clorpromazin sulfoxid thì bất hoạt. Bệnh nhân đáp ứng thuốc
có nồng độ cao các chất chuyển hóa có hoạt tính nhưng sulfoxid thì thấp. Có
hai nhóm sản phẩm chuyển hóa chính của clorpromazin được phát hiện trong
nước tiểu. Nhóm thứ nhất là các sản phẩn không liên hợp, gồm
demonomethylclorpromazin, dedimethylclorpromazin, các sản phẩm chuyển
hóa dạng sulfoxid, clorpromazin N-oxid và clorpromazin nguyên dạng, chiếm
khoảng 20%. Nhóm thứ hai là các sản phẩm liên hợp, chiếm khoảng 80%,
gồm chủ yếu các O-glucuronid và một số ít các ether sulfat của các dẫn chất
mono và dihydroxy của clorpromazin và các chất chuyển hóa sulfoxid của nó.
Hai chất chuyển hóa chủ yếu được tìm thấy trong nước tiểu là
monoglucuronid của N- dedimethylclorpromazin và 7- hydroxyclorpromazin.


5

Các sản phẩm chuyển hóa của phenothiazin thường là thân dầu, có thể tích

phân bố lớn, do vậy thời gian lưu tại các mô tăng và lâu thải trừ, mặc dù T 1/2
R

R

của clorpromazin khoảng 30 giờ nhưng các chất chuyển hóa vẫn có thể được
phát hiện trong nước tiểu ở tuần thứ sáu sau liều cuối cùng [3], [6], [18], [19].
- Cơ chế tác dụng
Sinh lý học của hoạt động thần kinh trung ương và sinh bệnh học của
rối loạn tâm thần (bệnh tâm thần phân liệt) còn chưa được biết rõ. Tuy nhiên,
người ta nhận thấy rằng sự cân bằng giữa hệ tiết dopamin trung ương và hệ tiết
serotonin trung ương có vai trò quyết định đến các triệu chứng của bệnh tâm
thần phân liệt.
+ Trên hệ tiết dopamin (DA) trung ương
Các thuốc cường hệ DA (amphetamin, cocain, DOPA...) đều làm tăng triệu
chứng bệnh.
Các thuốc hủy hệ DA, đặc biệt là các receptor thuộc nhóm D 2 (gồm D 2 , D 3 ,
R

R

R

R

R

R

D 4 ) như các thuốc an thần kinh đều làm giảm các triệu chứng của bệnh.

R

R

+ Trên hệ tiết serotonin (5HT) trung ương
Có tới 15 loại receptor 5HT, nhưng với bệnh tâm thần thì receptor
5HT 2 (đặc biệt là 5HT 2A ) có vai trò quan trọng hơn cả. Trong não, nhân tổng
R

R

R

R

hợp 5HT nhiều nhất (có thể là duy nhất) là các nhân Raphe (Raphe nuclei).
Các nhân này kiểm soát sự tổng hợp DA ở cả thân tế bào và sự giải phóng DA
ở trước synap của các nơron hệ DA. Nhìn chung, 5HT ức chế giải phóng DA.
Giả thuyết sinh hóa về bệnh tâm thần phân liệt cho rằng, các triệu chứng
dương tính là do tăng hoạt hệ DA ở hệ viền và mất cơ chế điều hòa ngược
trung ương, còn các triệu chứng âm tính là do rối loạn chức phận vùng trán
trước, làm giảm hoạt hệ DA não giữa - vỏ não do tăng hoạt hệ 5HT 2 .
R

R

Clorpromazin ức chế D 2 mạnh hơn 5HT nhiều nên tác dụng trên triệu chứng
R

R

6

dương tính mạnh, ít tác dụng trên triệu chứng âm tính, mặt khác lại gây tác
dụng phụ ngoài bó tháp [3], [6], [18], [19].
- Tác dụng dược lý
+ Trên hệ thần kinh trung ương
Clorpromazin gây trạng thái đặc biệt thờ ơ về tâm thần vận động và cũng
giống như nhiều thuốc an thần chủ yếu khác, clorpromazin cũng có tác dụng
an thần gây ngủ khá rõ. Tuy nhiên, các thuốc này không được dùng với mục
đích này vì các tác dụng phụ trên hệ thần kinh và hệ vận động. Nó làm giảm
các hoạt động vận động và các sự bận tâm, ưu tư mà vẫn giữ được tương đối
các hoạt động về trí tuệ và sự cảnh giác. Người dùng thuốc tỏ ra không quan
tâm đến môi trường xung quanh, không biểu lộ xúc cảm, trong khi phản xạ
tủy và phản xạ không điều kiện với kích thích đau vẫn giữ được.
Thuốc làm giảm được ảo giác, thao cuồng, vật vã do đó thuốc có tác dụng
với bệnh tâm thần phân liệt.
Clorpromazin gây hội chứng ngoại tháp, giống bệnh Parkinson, biểu hiện
bằng động tác cứng đơ, tăng trương lực cơ.
Gây hạ thân nhiệt do ức chế trung tâm điều nhiệt ở hạ khâu não.
Chống nôn do ức chế trung tâm nôn ở sàn não thất IV.
ức chế trung tâm trương lực giao cảm điều hòa vận mạch.
Trên vận động, liều cao gây trạng thái giữ nguyên thế (catalepsia).
+ Trên hệ thống thần kinh thực vật
Vừa có tác dụng hủy phó giao cảm, vừa có tác dụng phong toả receptor 1
R

R

adrenergic ngoại biên. Tác dụng hủy phó giao cảm thể hiện bằng nhìn mờ (do
giãn đồng tử), táo bón, giảm tiết dịch vị, giảm tiết nước bọt, mồ hôi. Tác dụng
hủy 1 adrenergic tương đối có ý nghĩa, có thể phong tỏa tác dụng tăng áp của
R

R

noradrenalin.
+ Trên hệ nội tiết


7

Làm tăng tiết prolactin, gây chảy sữa và chứng vú to ở đàn ông.
Làm giảm tiết FSH và LH, có thể gây ức chế phóng noãn và mất kinh.
+ Có tác dụng kháng histamin H 1 nhưng yếu [3], [6], [19].
R

R

- Tác dụng không mong muốn
+ Loại thường gặp, liên quan đến tác dụng dược lý
Rối loạn tâm lý: chóng mệt mỏi, suy nghĩ chậm chạp, trạng thái trầm cảm,
lú lẫn (nhất là người có tuổi).
Tụt huyết áp thế đứng và nhịp tim nhanh, nhất là khi tiêm.
Khô miệng, nuốt khó, bí đái, rối loạn điều tiết thị lực, cơn tăng nhãn áp cấp,
táo bón... là những dấu hiệu hủy phó giao cảm.
Rối loạn điều tiết và sinh dục: ức chế phóng noãn, vô kinh, chảy sữa, giảm
tình dục, tăng cân.
Hội chứng ngoại tháp: thay đổi tùy thuộc vào thời gian điều trị, vào liều

lượng, thuốc phối hợp và tuổi, giới...
+ Loại không phụ thuộc vào tác dụng dược lý
Giảm bạch cầu
Vàng da tắc mật, xuất hiện giữa tuần thứ 2 đến thứ 4, giảm dần khi ngừng
thuốc, nguyên nhân có thể là do phù nề các đường dẫn mật do phản ứng quá
mẫn vì không phụ thuộc vào liều.
Phản ứng ngoài da: dị ứng, mẫn cảm với ánh nắng, đọng sắc tố trong tiền
phòng của mắt.
Loạn nhịp tim: nhịp nhanh xoang (điều trị bằng propranolol), nhĩ thất phân
ly.
Hội chứng sốt cao ác tính: sốt cao, da tái nhợt, mồ hôi nhễ nhại, trạng thái
sốc.
Có thể gây đột tử, thường xuất hiện sau khi tiêm, chưa rõ nguyên nhân, có
thể liên quan đến huyết khối hay viêm tắc mạch [3], [6], [19].


8

1.1.4. áp dụng lâm sàng
Do có nhiều tác dụng đa dạng, clorpromazin được sử dụng ở rất nhiều
khoa khác nhau.
- Khoa tâm thần: loạn thần kinh, tâm thần phân liệt, thao cuồng, hoang tưởng,
ảo giác.
- Khoa sản: sản giật.
- Khoa gây mê: tiền mê, gây mê hạ thân nhiệt, hạ huyết áp.
- Khoa nội: chống nôn, chống đau, an thần, chống rung tim.
- Khoa da liễu: chống ngứa [3], [6], [11], [19].
1.1.5. Một số dạng chế phẩm bào chế và biệt dược chứa CPZ
Các dạng chế phẩm bào chế:
+ Viên nén hoặc bọc đường 10, 25, 50, 100 và 200 mg.

+ Viên nang tác dụng kéo dài 30, 75, 150, 200 và 300mg.
+ Sirô 2mg/mL, 5mg/mL, 20mg/mL.
+ Thuốc đạn 25, 50 và 100 mg.
+ Thuốc uống dạng giọt 4%.
+ ống tiêm 25mg/2mL và 50mg/5mL [6], [7], [12], [17], [36].
Một số biệt dược:
+ Aminazin (Nga)
+ Amplictil (Rhodia, Brasil)
+ Chloractil (DDSA, Anh)


9

+ Largactil (Pháp; Italia)
+ Plegomazine (Egis, Hungary)
+ Procalm (Bramble, Australia)
+ Promexin (Meiji, Nhật)
+ Promosol (Horner, Canada)
+ Prozil (Dumex, Đan Mạch)
+ Thorazine (Smith Kline & French)
1.2. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng
Chiết xuất là quá trình tách chất từ một pha bằng cách cho pha này tiếp
xúc với pha thứ hai không trộn lẫn với pha thứ nhất, nếu hai pha đều là lỏng ta
có chiết lỏng - lỏng (liquid - liquid extraction: LLE), nếu một pha lỏng và
một pha rắn ta có chiết lỏng - rắn (liquid - solid extraction: LSE). [1], [5]
Chiết lỏng - lỏng được sử dụng rộng rãi, các ưu điểm cũng như nhược
điểm của phương pháp này đã được biết rõ.
Ưu điểm là giá thành thấp, dịch chiết phù hợp với hệ thống sắc ký và có
thể dễ dàng thay đổi dung môi để có độ chọn lọc cao. Tuy nhiên, kỹ thuật này
cũng có một số nhược điểm liên quan đến việc sử dụng dung môi, như phải sử

dụng một lượng lớn dung môi, trong đó thường gặp nhiều dung môi độc và dễ
cháy, dẫn đến các vấn đề về xử lý chất thải và môi trường. Hơn nữa, trong
thực tế, chiết lỏng - lỏng có thể tạo thành dạng nhũ dịch, là một vấn đề khó xử
lý, đặc biệt khi nhũ bền và không thể phá nhũ bằng các kỹ thuật như làm
lạnh, lọc, ly tâm hay thêm một thể tích nhỏ dung môi hữu cơ khác.
- Cơ chế chiết xuất: là quá trình phân bố hay hòa tan đồng thời một
chất ở hai pha lỏng không trộn lẫn khi chúng tiếp xúc với nhau. Năng lượng
chuyển một chất từ pha này sang pha khác chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố


10

tồn tại giữa các phân tử dung môi và chất tan, cân bằng pha được thiết lập trên
cơ sở cân bằng của các tương tác đó. Có 3 yếu tố chính tác động lên quá trình
chiết xuất, đó là:
+ Lực Van der Waals
+ Quá trình solvat hóa
+ Tương tác hóa học
- Các thông số đặc trưng cho quá trình chiết:
+ Hằng số phân bố (D)
+ Hiệu suất chiết một lần (R 1 )
R

R

- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết:
+ Nhiệt độ
+ Tác động của các chất hòa tan khác
+ Các yếu tố liên quan đến chất tan
- Kỹ thuật chiết xuất: có thể chia ra làm 3 loại

+ Chiết gián đoạn
+ Chiết liên tục
+ Chiết ngược dòng [1], [5], [15], [28], [37].
1.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography:
HPLC)
Lịch sử của sắc ký: năm 1903, Tswett - nhà hóa sinh người Nga đã phát
triển một kỹ thuật tách mới bằng cách cho hỗn hợp cần tách qua một cột được
nhồi với chất hấp phụ dạng bột mịn. Hỗn hợp được đưa lên đỉnh cột, sau đó
rửa cột với dung môi hữu cơ. Cùng với quá trình rửa, các thành phần của hỗn
hợp trôi xuống với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Hầu hết các mẫu
của Tswett là chất màu thực vật, do đó các dải màu tạo thành khi các hợp chất


11

tách ra trên cột được nhìn thấy dễ dàng, trông giống như một sắc đồ và vì vậy
phương pháp này được mang tên sắc ký (Chromatography, trong tiếng Hy
Lạp, chroma là màu, graphein là viết). Tên gọi này ngày nay vẫn được sử dụng
mặc dù phương pháp này còn được dùng tách các chất không màu. Tswett
giải thích sự tách là do các phân tử chất rửa giải được hấp phụ trên bề mặt của
bột nhồi trong cột, các chất này có ái lực mạnh với chất rắn và không dễ bị
giải hấp phụ bởi dung môi do đó các hợp chất di chuyển chậm trong cột. Các
chất hấp phụ yếu hơn di chuyển với tốc độ lớn hơn, do đó sự tách đạt được do
ái lực khác nhau giữa chất rửa giải với dung môi và chất rắn hấp phụ.
Công trình của Tswett là dạng sắc ký hấp phụ trên cột. Ngày nay, nhiều
phương pháp sắc ký đã được phát triển và hoàn thiện như sắc ký lớp mỏng, sắc
ký giấy, sắc ký khí, sắc ký lỏng; nhưng chúng đều dựa trên nguyên tắc đơn
giản là: sự tách đạt được là do tốc độ di chuyển khác nhau gây nên bởi ái lực
tương đối khác nhau giữa hai pha. Năm 1952, máy sắc ký khí đầu tiên được
ra đời dưới sự chủ trì của giáo sư Keulemann và các cộng tác viên, bài báo đầu

tiên về sắc ký khí được công bố bởi James và Martin cũng cùng năm đó.
Phương pháp này được phát triển mạnh vào những năm 60 và ngày nay đã trở
nên hoàn thiện và được sử dụng rộng rãi. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời
muộn hơn vào cuối những năm 60, khi công nghệ sản xuất được chất nhồi cột
có cỡ hạt 10m, có hiệu suất tách rất cao, nhưng cỡ hạt bé đòi hỏi phải dùng
bơm để nén dung môi qua cột và với loại chất nhồi mới này ta có phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hay sắc ký lỏng cao áp). Sắc ký lỏng hiệu
năng cao tuy ra đời muộn hơn nhưng ngày nay cũng đã được hoàn thiện và
dần thay thế sắc ký khí trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong phân tích dược
phẩm.


12

1.3.1. Nguyên lý
HPLC dựa trên nguyên lý sắc ký nói chung, là kỹ thuật tách các chất
trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất với hai pha: pha tĩnh rắn
và pha động lỏng. Quá trình tách theo các cơ chế phân bố, hấp phụ hay trao
đổi ion tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích và pha tĩnh sử dụng.
Đặc trưng của kỹ thuật là cột được nhồi với các tiểu phân có kích thước nhỏ
(thường từ 3 - 10m), quá trình rửa giải dung môi diễn ra dưới áp suất cao và
đạt được hiệu quả tách tốt hơn so với sắc ký lỏng thông thường, vì vậy kỹ
thuật được gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao cũng tương tự như các dạng sắc ký khác, có một
pha tĩnh (có thể là chất rắn hoặc lỏng) và một pha động (là chất lỏng) và sự
tách cũng dựa trên nguyên tắc cơ bản là do có sự phân bố của chất phân tích
trong hai pha tĩnh và động. Các chất có ái lực lớn với pha tĩnh thì lưu giữ lâu
hơn và ngược lại, do đó sự tách đạt được là do các thành phần trong hỗn hợp
di chuyển với tốc độ khác nhau do có hệ số phân bố giữa hai pha khác nhau.
Trong sắc ký lỏng có thể xảy ra cả 4 cơ chế tách là phân bố, hấp phụ, trao đổi

ion hoặc loại theo cỡ.
* Sắc ký phân bố
- Sắc ký phân bố lỏng - lỏng (liquid - liquid partitioning): pha tĩnh cũng
là chất lỏng và được bao trên bề mặt của các hạt chất mang (support) tức là
được hấp phụ trên chất mang. Trong sắc ký này, pha tĩnh thường bị dung môi
hòa tan và mất dần (hiện tượng "chảy máu cột") và làm cột mất dần hiệu lực.
Phương pháp này hiện nay ít được sử dụng.
- Sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography: BPC): pha tĩnh
được sử dụng là các hạt silicagel có đường kính 3 -10àm, các hạt phải đồng
đều, có dạng hình cầu và phải xốp, bề mặt của hạt có các nhóm silanol và các
tạp kim loại. Silicagel có thể được sử dụng trực tiếp để tách sắc ký, trong
trường hợp này cơ chế tách chủ yếu là hấp phụ kết hợp với liên kết phân cực,


13

ta có sắc ký pha thuận. Sử dụng phổ biến hơn là gắn hóa học silicagel với một
alkylsilan tạo nên hợp chất cơ siloxan. Nếu gốc gắn vào có tính phân cực tạo
nên pha tĩnh có tính phân cực thì sử dụng pha động là các dung môi ít phân
cực ta có sắc ký pha thuận (normal phase); ngược lại, nếu gốc gắn vào là ít
phân cực ta thu được pha tĩnh kỵ nước và khi sử dụng pha động là dung môi
phân cực ta có sắc ký pha đảo (reversed phase). Trong thực tế, thường gặp sắc
ký pha đảo vì một số ưu điểm như: tính linh động cao, độ chọn lọc cao; cân
bằng phân bố xảy ra nhanh, có thể sử dụng các cân bằng phụ để tăng cường độ
chọn lọc của phương pháp; hiệu quả tách cao, pic cân đối; pha động thường là
hỗn hợp của nước và các dung môi phân cực nên rẻ tiền. Tuy nhiên phương
pháp cũng còn một số nhược điểm như: độ lặp lại kém, hoạt động của pha tĩnh
có hiệu quả trong khoảng pH hẹp (pH: 2 - 8) và cơ chế tách phức tạp.
* Sắc ký hấp phụ: là phương pháp được phát triển sớm nhất và dùng phổ
biến. Trong phương pháp này, chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh (chất hấp

phụ) và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ). Pha tĩnh thường dùng là bột mịn
của silicagel hoặc nhôm oxyd nhưng silicagel được ưa dùng hơn. Các chất
càng phân cực càng bị lưu giữ mạnh và ra chậm hơn trong quá trình rửa giải,
các dung môi càng phân cực càng có sức rửa giải mạnh.
* Sắc ký trao đổi ion: các nhựa trao đổi ion được dùng làm pha tĩnh
dưới dạng bột mịn.
- Nhựa trao đổi ion (ionid): là những hợp chất cao phân tử có chứa
nhóm chức có khả năng trao đổi ion.
+ Nhựa trao đổi cation (cationid): có 2 loại là cationid acid mạnh (chứa
nhóm

-HSO 3 ) và cationid acid yếu (chứa nhóm -COOH)
R

R

+ Nhựa trao đổi anion (anionid): cũng có 2 loại là anionid base mạnh
(chứa nhóm amoni bậc 4) và anionid base yếu (chứa nhóm amin bậc 2 hay 3).
Cách phân loại khác có thể tùy theo hoạt độ của ionid chia thành 4 loại:


14

+ Ionid loại 1: thể hiện tính chất như 1 acid mạnh hoặc 1 base mạnh. Có
thể làm việc ở mọi giá trị pH và hấp dung ít thay đổi theo pH, thường là ionid
đơn chức.
+ Ionid loại 2: thể hiện tính chất như 1 acid yếu hoặc 1 base yếu. Đặc
điểm là làm việc ở một giá trị pH nhất định, hấp dung ít thay đổi theo pH và
cũng thường đơn chức.
+ Ionid loại 3: thể hiện tính chất như 1 hỗn hợp acid mạnh và yếu hoặc

1 hỗn hợp base mạnh và yếu. Thường đa chức, có 2 giá trị hấp dung.
+ Ionid loại 4: thể hiện tính chất như một hỗn hợp nhiều acid yếu có K a
R

R

khác nhau hoặc một hỗn hợp base yếu có K b khác nhau, vì vậy hấp dung của
R

R

ionid thay đổi dần.
Các ionid không tan trong nước, khi tiếp xúc với dung dịch hỗn hợp ion
thì xảy ra sự trao đổi, sau đó dùng dung dịch acid hoặc base làm dung dịch rửa
giải thì sẽ phản hấp phụ các ion và xảy ra quá trình hồi nguyên (tái sinh)
ionid.
Có 3 loại chất nhồi cột trao đổi ion trong sắc ký lỏng hiệu năng cao:
+ loại hạt xốp nhựa ionid có khung polystyren
+ loại hạt xốp silicagel có gắn các nhóm trao đổi ion
+ loại hạt thủy tinh gắn chất trao đổi ion
* Sắc ký loại theo cỡ: là phương pháp mới được phát triển và chủ yếu áp
dụng cho phân tích các chất có phân tử lượng lớn. Chất nhồi chủ yếu là các
gel, trong gel có các lỗ xốp, các phân tử lớn nằm ngoài lỗ xốp di chuyển dễ
dàng theo dung môi, các phân tử nhỏ hơn có thể nằm một phần trong lỗ xốp,
các phân tử nhỏ nữa có thể chui hoàn toàn vào trong lỗ xốp và khó di chuyển
theo dung môi do đó khi rửa giải các phân tử sẽ ra lần lượt theo cỡ từ lớn đến
nhỏ. Các gel ưa nước được dùng với pha động là dung dịch nước và phương
pháp được gọi là sắc ký lọc trên gel. Nếu các gel kỵ nước thì dùng pha động là

15

các dung môi hữu cơ không phân cực và phương pháp gọi là sắc ký thẩm thấu
trên gel.
1.3.2. Thiết bị
Bình chứa
dung môi

Bộ phận
tiêm mẫu

Bơm

Cột

Detector

Máy ghi
tín hiệu

Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
U

U

* Bình chứa dung môi: thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không
gỉ. Dung môi cần được lọc loại các hạt vẩn và phải đuổi khí hòa tan ngay
trước khi sử dụng. Khí hòa tan có thể làm biến dạng các pic, sinh bọt khí trong
bơm và detectơ, làm nhiễu đường nền và có thể làm xuất hiện các pic lạ. Có
thể đuổi khí bằng nhiều cách như: siêu âm, đun nóng và khuấy, sục khí trơ

(He), lọc dưới áp suất giảm... nhưng chú ý tránh làm thay đổi nồng độ các
dung môi dễ bay hơi của pha động. Nên đặt bình chứa dung môi ở vị trí cao
hơn so với bơm để tạo áp suất dương.
* Hệ thống bơm: lưu lượng dòng qua cột thường từ 0,1 - 3mL/phút do
đó bơm phải tạo được áp suất cao (3000 - 6000 psi hay khoảng 200 - 250
atm). Vật liệu làm bơm có thể bằng thép không gỉ hay các polymer như PTFE
hoặc PEEK, thép không gỉ chịu được áp suất tới 6000 psi nhưng nhược điểm
là có thể sinh các tạp ion kim loại và các protein có thể bị hấp phụ vào bề mặt
kim loại, các polymer không có các nhược điểm này, có thể chịu được các pha
động có tính ăn mòn (như HCl) nhưng chỉ chịu được áp suất từ 2000 - 4000
psi và lại rất đắt tiền. Bơm có thể là "áp suất hằng định" hay "tốc độ dòng
hằng định", loại "tốc độ dòng hằng định" thuận tiện hơn do dễ thay đổi cột có
kháng áp khác nhau và các loại dung môi có độ nhớt khác nhau. Loại bơm
được sử dụng rộng rãi nhất có pit-tông điện, có dòng hằng định được kiểm


16

soát bởi mô tơ tốc độ, các bơm chỉ có 1 pit-tông thì dòng bị dao động, để có
dòng ổn định bơm cần có 2 hoặc 3 pit-tông.
* Hệ tiêm mẫu:
- Xy lanh tiêm (syringe injection): có thể tiêm trực tiếp qua một tấm
đệm đàn hồi (septum injection) giống như trong sắc ký khí, bị giới hạn áp suất
do đó thường tiêm dưới áp suất thấp hoặc dùng phương pháp "dừng dòng"
(stop flow), tuy nhiên phương pháp vẫn có độ lặp lại kém và không ổn định
- Van tiêm (valve injectors): gồm van chuyển nối với vòng chứa mẫu
(sample loop), khi van ở vị trí "nạp" (load) mẫu được đưa vào vòng chứa
(loop) và dòng dung môi từ bơm tới cột đi qua một đoạn khác của van; khi van
chuyển sang vị trí "tiêm" (inject), vòng chứa mẫu được nối vào dòng giữa bơm
và cột. Vòng chứa mẫu có dung tích xác định và chính xác, độ lặp lại tốt khi

thể tích hoàn toàn chứa mẫu.
- Tiêm tự động (autoinjector hay autosampler): có khả năng tiêm nhiều
mẫu theo chương trình định sẵn một cách chính xác, tuy nhiên nhược điểm là
đắt tiền.
* Cột: thường bằng thép không gỉ có mặt trong nhẵn, ưu nhược điểm
của thép không gỉ giống như đã nói ở phần bơm nên khi tách các protein
thường dùng cột thủy tinh hoặc trong sắc ký trao đổi ion thường dùng cột
bằng polymer (PEEK hay teflon). Cả cột polymer và cột thủy tinh đều chịu áp
suất kém do đó không nên sử dụng ở áp suất cao hơn áp suất nhà sản xuất
khuyên dùng. Cột thường dài 5 - 30cm, đường kính trong 2 - 5mm, cột càng
dài thì hiệu lực phân giải càng lớn tuy nhiên thời gian sắc ký kéo dài hơn, các
cột có đường kính trong 1 - 2mm (narrow bore or microbore columns) hoặc
nhỏ hơn được sử dụng khi yêu cầu độ nhạy cao, lượng mẫu có ít. Chất nhồi cột
khác nhau phụ thuộc loại sắc ký như đã nói ở phần nguyên lý sắc ký lỏng, tuy
nhiên được sử dụng phổ biến là các dạng silicagel, cỡ hạt thường từ 3 - 10m.


17

* Detector: có 4 loại detector được sử dụng rộng trong HPLC là
detector quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV - VIS), detector huỳnh quang
(fluorescene), detector đo chỉ số khúc xạ (refractive index: RI) và detector
điện hóa (electrochemical)
- Detector quang phổ UV - VIS: sử dụng trong phân tích các chất có
khả năng hấp thụ bức xạ tử ngoại hoặc khả kiến, độ hấp thụ thay đổi tỷ lệ với
nồng độ chất theo định luật Lambert - Beer. Detector dạng này có thể được
phân loại theo tần số bức xạ đo: detector tử ngoại (: 190 - 400nm), detector
khả kiến (: 400 - 800nm). Cách phân loại nữa dựa vào khả năng cho các bước
sóng đo:
+ Detector có bước sóng cố định (fixed wavelength): là loại đơn giản

nhất, đèn thủy ngân thường được sử dụng trong detector này, = 254 là bước
sóng sử dụng phổ biến nhất, thống kê cho thấy gần 2/3 các hợp chất hữu cơ
trong phân tích HPLC có khả năng hấp thụ bức xạ này, đặc biệt là các hợp
chất thơm.
+ Detector có bước sóng thay đổi (variable wavelength): có khả năng
cho các bước sóng khác nhau để điều chỉnh theo đặc điểm hấp thụ khác nhau
của các chất (điều chỉnh về cực đại hấp thụ của chất để tăng độ nhạy). Để có
khả năng này, người ta sử dụng một nguồn sáng liên tục (thường là đèn D2) và
bộ đơn sắc phù hợp (thường dùng cách tử).
+ Detector quét (scanning): là một dãy các bước sóng thay đổi cho một
phổ hấp thụ của một chất rửa giải để kiểm tra khi 2 chất rửa giải ra đồng thời
như 1 pic. Phổ hấp thụ đo được bằng cách dừng dòng pha động khi chất rửa
giải nằm trong detector và quét dải sóng đo độ hấp thụ.
+ Detector mảng diod (photodiode array detector: PDA): cho khả năng
quét cực nhanh dải sóng để thu được phổ hấp thụ ngay cả khi dòng pha động
vẫn liên tục chạy.