Nghiên cứu đột biến gen BRCA 1 và BRCA 2 ở bệnh nhân ung thư vú ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI
HỌC
■
■

BỘ Y TẾ

Dược HÀ NỘI
■

■

LÊ THỊ MINH CHÍNH

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN BRCA1 VÀ BRCA2 ở
CÁC BỆNH
NHÂN UNG THƯ v ú ở VIỆT
NAM
■
■
■

LUẬN VĂN THẠC s ĩ Dược HỌC
CHUYÊN NGÀNH: Dược LÝ-DƯỢC LÂM SÀNG
MÃ SỐ: 60.73.05

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS ĐINH DUY KHÁNG
GS TSKH ĐÁI DUY BAN

HÀ NỘI 2003


L Ờ I C Ả M ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và lời cảm ơn sâu sắc tới:

TS.

Đinh

Duy Kháng - Trưởng phòng Vỉ sinh vật học phân tử và GS.TSKH. Đái Duy BanPhòng Miễn dịch, Viện Công Nghệ Sinh học - những người thầy đã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của TS. Phùng Hoà Bình, phụ trách Phòng
Đào tạo sau đại học Trường Đại học Dược Hà Nội.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu; PGS, TS Phạm Quang Tùng,
nguyên trưởng phòng đào tạo sau đại học; Phòng Đào tạo sau đại học; các thầy cô
trong Bộ môn Dược lâm sàng; các bộ môn thuộc trường Đại học Dược Hà Nội đã
giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm luận văn.
Trong quá trình thu thập mẫu và làm thực nghiệm tại phòng thí nghiệm, tôi đã
nhận được sự giúp đỡ rất nhiệt tình và có hiệu quả. Tôi xin chân thành cảm ơn:
CN Bạch Thị Như Quỳnh, CN Trịnh Quý Bôn, CN Dương Hổng Quân và các
bạn đồng nghiệp phòng Vi sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học.
-

Thạc sĩ Hoàng Thị Minh Châu- Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh
học.

-

Khoa giải phẫu Bệnh viện K, Hà Nội.

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến gia đình, tất cả các anh
chị đồng nghiệp và bạn bè đã động viền, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 12 năm 2003

Lê Thị Minh Chính


MỤC LỤC

PHẨN 1- ĐẶT VẤN ĐỀ
PHẦN 2- T ồN G QUAN
Một số vấn đề về ung thư và ung thư vú
Một số vấn đề về ung thư
Ung thư vú
Dịch tễ học ung thư vú
Các yếu tố nguy cơ gây ung thư vú
Bệnh sử tự nhiên của ung thư vú
Chẩn đoán ung thư vú
Điều trị ung thư vú
Gen BRCA trong các trường hợp ung thư vú
Kỹ thuật PCR
Real-time PCR
Khái quát chung
Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR
ứng dụng của Real-time PCR
Vector tách dòng
Khái niệm về vector tách dòng

Plasmid pCR 2.1

1
3
3
3
4

4
7
9
10
11
12
15
17
17
17

20
22
22
23

PHẨN 3 - NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU

25

Nguyên liệu nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Hoá chất, thiết bị
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tách chiết ADN
Tách ADN từ sinh thiết ung thư vú
Tách ADN từ máu
Phương pháp xác định nồng độ và độ tinh sạch của
AND bằng đo quang phổ OD 260/280.
Phương pháp điện di
Phương pháp PCR
Phương pháp tinh chế sản phẩm PCR
Phương pháp tạo dòng
Gắn ADNvào plasmid

25
25
26
27
27
27
27
28
28
29
30
31
31
32

Tách chiết ADNplasmid từ vi khuẩn E.coli
Phương pháp xác định trình tự ADN

32
32

PHẦN 4 - KẾT QUẢ BÀN LUẬN VÀ THựC NGHIỆM
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Kết quả tách chiết ADN từ sinh thiết khối u, máu của
bệnh nhân ung thư vú và những phụ nữ cùng huyết
thống
Kết quả tách chiết AND từ mẫu sinh thiết khối u của
bệnh nhân ung thư vú

36
36
36

Kết quả tách chiết ADN, từ mẫu máu của 15 bệnh nhân
ung thư vú và 36 mẫu máu của chị em gái ruột các bệnh
nhân.

39

Kết quả thực hiện phản ứng PCR
Kết quả tách dòng
Tinh chế đoạn ADN mang đột biến
Kết quả biến nạp ADN Plasmid vào tế bào E.Coli chủng
INVaF ’

Kết quả tách chiết ADN Plasmid từ vi khuẩn E.Coli
Kết quả tinh sạch vector tái tổ hợp
Kết quả xác định trình tự gen

44
47
47
49

Thực hiện phản ứng giải trình tự
Kết quả giải trình tự đoạn ADN mang đột biến 185
delAG exon 2 BRCA 1
Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến 6174 del T
exon 11 BRCA 2

55
57

36

50
54
55

59

Kết quả thực hiện phản ứng Real time PCR

60

Thực hiện phản ứng Real time PC
Kết quả phát hiện đột biến 185delAG exon 2 BRCA1

60
64

Kết quả phát hiện đột biến 6174 del T exon 11 BRCA 2
4.2.BÀN LUẬN CHUNG
PHẦN 5 - KET LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
PHẦN 6 - TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN 7 - PHỤ LỤC

65
67
71
73
84


NHŨNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

ADN
APS
ARN
ATP
bp
BRCA
CTP
DNTP

Acid Desoxyribonucleic
Amonium persulfate
Acid Ribonucleic
Adenine Triphosphat
base pair
Breast cancer sussepbility gene(gen ung thư vú)
Cytosine Triphosphat
Hỗn hợp deoxynucleotid triphosphat
(dATP+dTTP+dGTP+dCTP)
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EtBr
Ethidium bromide
GTP
Guanine Triphosphat.
Kb
Kilo base
LB
Môi trường thịt để nuôi cấy
MWM
Molecular weight marker (yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử)
PCR
Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase để nhân
bản các đoạn ADN trong phòng thí nghiêm
PMC
Prophylactic Contratateral Mastectomy (Phương pháp cắt bỏ
tuyến vú còn lại)
PO
Prophylactic Oophorectomy (Phương pháp dự phòng cắt 2 buồng
trứng)

RAPD-PCR Random Amplified Polymorphic ADN(kỹ thuật phân tích ADN
được nhân bản ngẫu nhiên)
RT-PCR
Revers transcriptase- PCR ( phản ứng PCR ngược)
SDS
Dung dịch Sodium clodecyl sulfate
TAE
Đệm TAE (Tris-HCl, Boric acid, EDTA-pH8,5)
TBE
Dung dịch đệm (Tris-HCl, Boric acid, EDTA- pH 8,5)
TE
Dung dịch đệm TE (Tris-HCl, EDTA)
TEDMED Tetramethylenethylen diamin
TTP
Thimine Triphosphat
ƯTV
Ung thư vú
YAC
Yeast Artificial Chromosomes (nhiễm ịỉắc thể nhân tạo của nấm
men)


1

PHẦN 1
ft

ĐẶT VẤN ĐÊ
Ung thư vú là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở nhiều
nước trên thế giới. Đày là nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư ở phụ

nữ. Tỷ lệ tử vong thay đổi từ 2- 5/100.000 người tại Nhật Bản, Mêxico,
Venezuela đến 25- 35/100.000 người tại Anh, Đan Mạch, Hà Lan, Hoa Kỳ
và Canada [10]. Tại Việt Nam, theo điều tra ung thư ở Hà Nội năm 1998, tỷ
lệ số người mắc ung thư vú là 20,3/100.000 người, đứng đầu trong các loại
ung thư ở nữ. Theo thống kê của Bệnh viện K, Hà Nội năm 2000, tỷ lệ ung
thư vú là 17,4/100.000 người. Ở các tỉnh phía nam, tỷ lệ ung thư vú ở phụ
nữ là rất cao chỉ sau ung thư cổ tử cung và chiếm tới 27% trong tất cả các
trường hợp ung thư ở phụ nữ [5], [10].
Tỷ lệ ung thư vú trên thế giới có chiều hướng gia tăng, nhưng tỷ lệ tử
vonơ lại có chiều hướng giảm do được chẩn đoán và điều trị sớm. Ngoài các
phương pháp chẩn đoán bằng tế bào học, mô học, gần đây các phương pháp
chẩn đoán trên cơ sở kỹ thuật sinh học phân tử cũng được ứng dụng rất
nhiều trong nghiên cứu và chẩn đoán ung thư vú [3], [11], [17]. Hai gen có
liên quan mật thiết tới quá trình phát triển ung thư vú đã được thế giới
nghiên cứu rất nhiều là BRCA1 và BRCA2. Có nhiều bằng chứng cho thấy
sự đột biến ở hai gen này có thể làm cho nguy cơ ung thư vú gia tăng [26],
[35], [55], [63].
Sự đột biến này rất phức tạp, nhưng hay gặp nhất là đột biến 185
delAG thuộc exon 2 của BRCA1 và 6174 delT thuộc exon 11 của BRCA2
[65], [73], [74]. Chúng tôi tiến hành đề tài: “N ghiên cứu đột biến gen
BRC A1 và BRCA2 ở các bệnh nhân ung th ư vú ở Việt N am ” để góp phần
tìm hiểu mối liên quan giữa ung thư vú và đột biến gen BRCA1,
BRCA2 ở người Việt Nam.


2

Trong khuôn khổ của đề tài này chúng tôi tập trung nghiên cứu đột
biến tại các điểm 185 delAG thuộc exon 2 của BRCA1 và 6174 delT thuộc
exon 11 của BRCA2.

Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên ở nước ta về vấn đề này. Hy vọng
kết quả của đề tài sẽ giúp chúng ta hiểu biết thêm về mối liên quan giữa một
số đột biến di truyền với bệnh ung thư vú ở người Việt Nam, để có các biện
pháp chẩn đoán, dự phòng và gợi mở cho những nghiên cứu tiếp theo.

*


3

PHẦN 2

TỔNG QUAN
2.1. MỘT SỐ VẤN ĐỂ VỂ UNG THƯ VÀ UNG THƯ v ú

2.1.1. Một

Số

vấn đề về ung thư [2], [8], [13]

Ung thư là bệnh gây ra bởi sự tăng sinh nhanh và lộn xộn của một
dòng (clone) tế bào bất thường, thoát ly khỏi sự kiểm soát của các cơ chế
điều hoà tự động trong tế bào. Hậu quả là tạo ra trong cơ thể một mô lạ
gồm những tế bào non, chuyển hoá mạnh, lấn át các mô xung quanh và gây
ra các biến đổi bệnh lý cho toàn bộ cơ thể.
Theo quan điểm hiện đại, quá trình ung thư hoá có thể chia làm hai giai
đoạn: khởi phát và tiến triển. Giai đoạn khởi phát (initiation) là giai đoạn bị
các yếu tố tấn công vào vật liệu di truyền (ADN) với ngưỡng thấp hoặc dưới
ngưỡng. Giai đoạn tiến triển (promotion) là giai đoạn bắt đầu có các tế bào u

xuất hiện một cách thầm lặng. Những yếu tố tấn công gây ung thư
(carcinogen) như rượu, thuốc lá, các tia bức xạ ion hoá...., thường tác động
nhiều lần với một nsưỡng nhất định. Giai đoạn nàv kéo dài hàng chục năm
cho tới khi khối tế bào ung thư phát triển tới kích thước có thể phát hiện được
trên lâm sàng. Thông thường, khi đó đã là giai đoạn muộn, thời gian sống của
người bệnh không còn được bao lâu. Trong thời gian gần đây, với sự phát triển
của khoa học kỹ thuật y học, khá nhiều bệnh ung thư được phát hiện sớm, điều
trị kịp thời đã kéo dài đáng kể sự sống của người bệnh [5], [11].
Năm 1976, Dominique Stehelin (Pháp) cùng với Michael và Hazold
(Mỹ) đã tìm thấy các tiền gen có khả năng gây ra ung thư (protooncogen) ở .
người. Dưới ảnh hưởng của một số yếu tố, các tiền gen sẽ chuyển thành gen
gây ung thư (oncogen). Hiện nay, người ta đã phát hiện được trên 40 loại
oncogen [2], [13]. Tế bào invitro của người bình thường được cấy các gen gây
ung thư này sẽ chuyển thành tế bào ung thư.


4

Quá trình sinh ung thư được trình bày tóm tắt ở hình 2.1 [2].
Các yếu tố môi trường
độna gồm:
- Các tác nhân hoá học
- Các tia vật lý.

Thay đổi bộ gen

Các yếu tố

của tế bào thân

di truyền

- Các virus gây u

H ình 2.1. Sơ đồ quá trình hình thành ung thư
2.1.2. Ung thư vú
2.1.2.1. Dịch tễ học ung thư vú [5], [ 8], [10].
Ưng thư vú (ƯTV) là loại ung thư thường thấy nhất ở phụ nữ, chiếm
25% tỷ lệ tử vong do ung thư ở các nước phát triển. Tại Mỹ, năm 1998 có
178.000 trường hợp mới mắc UTV, chiếm 30% trong tổng số các loại ung
thư và là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ hai sau các bệnh tim mạch.
Đâv là một vấn đề sức khoẻ cộng đồng quan trọng ở nhiều khu vực trên thế
giới, đặc biệt là ở các nước phát triển.


5

Theo Parkin D.M, và cs., ở các nước phát triển ƯTV đứng hàng thứ 4
trong số các loại ung thư hay gặp, hàng năm có 347.900 trường hợp mắc mới,
còn ở các nước đang phát triển UTV đứng hàng thứ 5 và có 224.200 trường
hợp mắc mới hàng năm. Nhìn chung, UTV có tỷ lệ mắc cao nhất ở các nước
châu Âu. Châu Phi và châu Á có tỷ lệ mắc thấp nhất [10].
T r u n g MT. N a m M ĩ v à C a r i b ẻ
B ra z il
P u e r t o R ico
C o lo m b ia
C o s t a R ica
8 ầ c Mĩ
Mĩ, d a t r ấ n g

Ị
B

62
4 5 .7

5

38. s

sa 2 8 . 8

m

SO.7

E

Mĩ. d a đ e n
C a n a d a 33
Mĩ g ố c N hật
Mĩ g ố c T B N
C h â u Âu
Icelan d
P h á p , S a s-R h in
Italia
Đ an M ạch
T h ụ y Đ iể n
S co tlan d
Anh v ả x ứ W a le s

P h ấ n Lan
N a Uv
Đ ông Đức
4 3 .2

Tây B an Nha
Ba Lan
T r u n g Đ ỏ n g v a V iễ n Đ ô n g
isra e l

4 0 .4

'7 ,4

2 8 .2
Ấn Độ
2 6 .5
T rung Q u ố c
N h ậ t B à n ■UBHBliaUH 2 4 , 3
h â u Đại Đ ư ơng
Niu Di Lãn ~ ỊaM B g B EB B B B B B EB B B SB aB g M 7 7 , 2

0

10 2 0

30 40

ÕQ 6 0

70 3 0

90

H ình 2.2. Tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi (ASR)Ì100.000 dân
ở một s ố nước

100


6

Trong những thập kỷ qua, tỷ lệ ƯTV ngày càng có xu hướng gia tăng.
Theo thống kê của Hiệp hội Ung thư Mỹ, tỷ lệ UTV ở người Mỹ đã tăng từ
80/100.000 người trong năm 1975 tới 105/100.000 người trong năm 1985
và 178/100.000 người trong năm 1998 [55] [63], Nghiên cứu của Nazario
C.M. và cs. cho thấy tỷ lệ mắc ƯTV ở Puerto Rico đã tăng từ 15,3/100.000
người trong giai đoạn 1960-1964 lên 43,3/100.000 trong giai đoạn 19851989 và tỷ lệ chết do ung thư tương ứng với các giai đoạn này tăng từ
5,7/100.000 người lên 10,6/100.000 người[55] Tại vùng Vaud, Thuỵ Sĩ, tỷ
lệ ƯTV đã tăng từ 2,1/100.000 phụ nữ (1977-1979) lên 9,4/100.000 phụ nữ
(1992-1994) [52]. Nghiên cứu của Goelen và cs cho thấy ở Australia tỷ lệ
mắc UTV là 37,0/100.000 người, tỷ lệ này táng theo tuổi (ở nhóm tuổi 5069 là 78,0/100.000 người).
*

Theo báo cáo của Khoo u s và c.s. những năm gần đây, tỷ lệ mắc UTV
ở một số nựớc châu Á có xu hướng tăng nhanh, đặc biệt là ở Nhật Bản,
Hồng Kông và Singapore, nơi có lối sống phương Tày hoá. Điều này gợi ý
đến các yếu tố môi trường, lối sống và đặc biệt là chế độ ăn đóng một vai
trò quan trọng trong sự phát triển ƯTV. Tỷ lệ mắc UTV ở phụ nữ Hồng
Kông hiện là 2,6/1.000 phụ nữ trên 40 tuổi [5] và ở Singapore là 4,8/1.000

phụ nữ ở độ tuổi 50-64 tuổi [10].
Ở phần lớn các nước, tỷ lệ tử vong do UTV tăng chậm dần do tuổi
thọ trung bình tăng. Tuy vậy, sau khi điều chỉnh theo lứa tuổi, tử vong do
UTV tại 28 nước công nghiệp đã tăng đáng kể từ năm 1960 đến năm 1980.
UTV ít gặp ở người dưới 25 tuổi và tần số mắc tăng dần theo tuổi. Đối với
các nước Âu, Mỹ, tỷ lệ UTV tăng vọt ở tuổi mãn kinh (lứa tuổi 40- 60).
Riêng tại Mỹ, tỷ lệ mắc UTV tăng từ 30/100.000 dân ở nhóm dưới 35 tuổi
lên đến 150/100.000 dân ở nhóm trên 35 tuổi [55].


7

Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi tại Hà Nội là
20,3/100.000 nsười, đứng đầu trong số các loại ung thư ở nữ. Tỷ lệ này tại
thành phố Hồ Chí M inh là 17,1/100.000 người, đứng hàng thứ hai sau ung
thư cổ tử cung [8], [10]. Tuổi mắc UTV trung bình ở phụ nữ Việt Nam tập
trung chủ yếu ở độ tuổi 50- 59 tuổi, hiếm gặp ở lứa tuổi dưới 30. Tỷ lệ mắc
UTV dao động ít ờ độ tuổi ngay trước và sau mãn kinh [10].

Bảng 2.1. Tỷ lệ mắc ung thư vú nữ ở Hà Nội
giai đoạn ỉ 996 - 1999 [10]
Nhóm

< 20

20-29

30-39

40-49

50-59

60-69

70 -79

> 80

0,2

4,3

21,1

119,7

142,1

112,5

110,3

24,7

tuổi
Tỷ lệ
mắc

2.1.2.2. Các yếu tố nguy cơ gây ung thư vú [2], [5], [10], [26].

Mặc dù bệnh sinh của UTV còn chưa được biết rõ, nhưng có một số
yếu tố làm tăng nguy cơ phát sinh UTV. Các yếu tố này gồm:
* Tiền sử gia đình:
Nguy cơ bị UTV tăng từ 1,5-3 lần nếu người phụ nữ có mẹ hoặc chị
em gái mắc bệnh này. Đặc biệt khi phụ nữ có mẹ và các chị em gái bị UTV
ở tuổi tiền mãn kinh, thì nguy cơ mắc ƯTV của họ gần như tuyệt đối [12],
[17]. Nghiên cứu của Hamel N. và cs. cho thấy nguy cơ UTV đối với con
gái sẽ tăng từ 1,7 lần nếu người mẹ bị UTV một bên lên đến 3,28 lần nếu


8

người mẹ bị UTV cả hai bên. Vì vậy yếu tố di truyền đóng vai trò quan
trọng trong nguy cơ mắc UTV.
* Tiền sử sinh sản
Tuổi có kinh, tuổi mãn kinh và tiền sử mang thai là những yếu tố liên
quan chặt chẽ với UTV. Người ta đã chứng minh rằng ở những phụ nữ có
kinh lần đầu sớm thì thường có hàm lượng estradiol cao hơn so với phụ nữ
bình thường, hormon này đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển
UTV. Một số nshiên cứu bệnh - chứng khác c ũ n s cho thấy cứ chậm kinh
lần đầu một năm thì nsuy cơ phát triển UTV sẽ giảm 20% [10], [18]. Mãn
kinh muộn sau tuổi 55 và tổng thời gian có kinh nguyệt trong cuộc đời
người phụ nữ cũng là những yếu tố quan trọng trong nguy cơ gây ƯTV. Phụ
nữ chưa mang thai có nguy cơ mắc UTV cao gấp 1,4 lần so với phụ nữ có
mang thai. Sinh con sau tuổi 30 có nguy cơ bị UTV cao gấp 2-5 lần so với
*

nhóm sinh con trước tuổi 19 [10], [17], [26].
* Thuốc tránh thai và điểu trị các hormon thay th ế
Nhiều nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa dùng thuốc tránh thai

trong thời gian dài với ƯTV. Nếu dùng thuốc tránh thai trên 8 năm, nguy cơ
mắc UTV tăng 1,7 lần, còn nếu dùng trên 10 năm thì nguy cơ tăng đến 4,1
lần. Dùng hormon thay thế ở phụ nữ mãn kinh là an toàn khi dùng trong
thời gian ngắn. Nhưng dùng với liều trung bình trong thời gian từ 10-20
năm nguy cơ mắc ƯTV tăng từ 1,5-2,0 lần [9], [10].
* C h ế độ ăn
Liên quan giữa UTV với chế độ ăn, đặc biệt là chất béo trong khẩu
phần ăn vẫn còn nhiều tranh cãi. Uống rượu 1-2 lần/ngày có nguy cơ phát

0


9

triển ƯTV gấp 1,2 lần. Rượu có ảnh hưởng nhiều nhất trong phát triển UTV
ở phụ nữ dưới 30 tuổi[2].
* Cấc yếu tố môi trường
Sự tiếp xúc với tia bức xạ ion hoá từ nguồn tự nhiên hay nhân tạo sẽ
làm tăng nguy cơ phát triển ƯTV. Sự phát sinh UTV có liên quan tới liều
bức xạ, tuổi tiếp xúc. đặc biệt là ở độ tuổi thanh niên.
2.1.2.3. Bệnh sử tự nhiên của ung thư vú
* Đặc điểm tự nhiên của ung thư vú
UTV là loại bệnh diễn biến chậm, chỉ có < 3% số bệnh nhân ƯTV
tiến triển nhanh, dẫn đến tử vong trong vòng vài tháng. Người ta ước tính từ
khi tế bào chuyển biến ác tính đầu tiên đến khi phát hiện được khối u có
ỷ

kích thước lcm thì mất khoảng 7- 8 năm. Nhưng khối u từ 1 cm phát triển
đến 2 cm thì thời gian trung bình chỉ khoảng 4 tháng, ớ thời điểm này, nếu
không được phát hiện và điều trị thì sau 2 năm tế bào uns thư đã di căn vào

các hạch bạch huyết, vào máu và đi khắp cơ thể [5], [8], [21].
* Giai đoạn xâm nhiêm tại chỗ
Khối u nguyên phát nằm ở biểu mô của ống tuyến hay của tiểu thuỳ
tuvến vú, xâm lấn vào mô lân cận, xô đẩy tuyến vú, rồi vượt khỏi mô tuyến
vú xâm nhiễm vào mô xuns quanh như da, làm co rút da, sần da cam, phù
nề da, đỏ và loét da. Các tế bào ung thư xâm nhiễm đến cân cơ ngực, cơ
ngực và thành nsực tạo nên một khối dính cứng [9], [10].
* Giai đoạn lan tràn


10

Tế bào ung thư theo đường bạch huyết đến các hạch để vào máu. Các
hạch này như một cái lọc, khi tế bào ung thư rời khỏi khối u nguyên phát sẽ
theo mạng bạch huyết nông để đến các tầng hạch nách theo thứ tự tầng
dưới, tầns giữa và tầng trên của hạch nách, tiếp theo là hạch thượng đòn, rồi
hoà nhập vào tuần hoàn tĩnh mạch dưới đòn. Tuy nhiên, cũng có một số
trường hợp (khoảng 3,0-3,8% các trường hợp UTV) di căn theo kiểu nhảy
cóc (skip metastasis). Ngoài ra, tế bào ung thư còn theo mạng bạch huyết
sâu để đến chuỗi hạch vú trong nằm ở khoang liên sườn 2, 3, 4 dọc theo
động mạch vú trong, từ đó vào mạch bạch huyết trung thất [8], [10], [54],
2.1.2.4. Chẩn đoán ung thư vú
* Sàng lọc và phát hiện sớm
Để sàng lọc và phát hiện sớm UTV, người ta áp dụng các phương
pháp tự khám vú, khám lâm

sàng và chụp X quang tuyến vú

(mammography) [5], [8], [9]. Việc sàng lọc UTV bằng chụp X quang có thể
phát hiện được UTV thể ống tại chỗ, giảm được hơn 50% tỷ lệ số người bị

UTV chết do bệnh này. Các biện pháp dự phòng UTV đối với các phụ nữ có
nguy cơ cao do yếu tố di truyền là rất có hiệu quả.
* Chẩn đoán xác định:
Chẩn đoán xác định UTV nhất thiết phải có sự khẳng định của tế bào
học và/ hoặc giải phẫu bệnh học [5], [8], [10]. Trên thực tế lâm sàng, UTV
thường được chẩn đoán dựa vào 3 phương pháp: lâm sàng, tế bào học và
chụp X quang tuyến vú. Nếu một trong ba yếu tố này còn nghi ngờ thì bệnh
nhân sẽ được tiến hành làm sinh thiết tức thì để chẩn đoán xác định.
* M ột s ố phương pháp mới chẩn đoán UTV [1], [3], [4].


11

Hiện nay, đã phát triển được một số phươns pháp chẩn đoán và theo dõi
điều trị un 2 thư vú mới như:
- Theo dõi sự biến đổi sinh học của CA 15-3 trong quá trình điều trị
để có cơ sờ dự đoán chính xác mức độ tái phát và di căn của ung thư vú.
- Dựa vào sự biểu hiện và khuếch đại gen Her-2/neu trong ung thư vú
nguyên phát để chẩn đoán và lựa chọn phác đồ điều trị cho thích hợp.
-

Liên quan giữa sự đột biến gen P53 với độ ác tính, di căn và đáp
ứng với phác đồ điều trị.

-

Gen BRCA1 và BRCA2 cũng đang được các nhà nghiên cứu rất
quan tâm. Đột biến 2 gen này dẫn đến ƯTV ở phụ nữ trẻ tuổi
mang tính di truyền.

Tuy tỷ lệ đột biến 2 gen này là hiếm nhưng mức độ xuất hiện ung thư là rất
cao. Do vậy, việc phát hiện được đột biến ở 2 gen này rất có ý nghĩa trong
việc phòns, phát hiện, điều trị dự phòng ung thư vú ở những người có tiền
sử gia đình bị uns thư vú. Phươns pháp được áp dụns nhiều nhất trons
nghiên cứu 2 gen này là kỹ thuật PCR, tách dòns và giải mã gen nhằm phát
hiện đột biến
2.I.2.5. Điều trị ung thư vú [8], [9], [70].
Điều trị ung thư vú phụ thuộc vào độ tuổi, sức khoẻ cũns như tiên
lượns bệnh, ung thư vẫn còn khu trú ở vú hay đã di căn. Điều trị có thể
bằng phẫu thuật, chiếu xạ, hoá trị liệu, hoóc môn trị liệu hay phối hợp
nhiều biện pháp điều trị. Điều trị dự phòng cho các phụ nữ có nauy cơ
UTV cao do yếu tố di truyền là rất có hiệu quả.
Năm 2000, Schrag D. và cs. đã khái quát lợi ích của chiến lược dự
phòng đối với những phụ nữ bị ung thư vú và mang đột biến gen BRCA1


12

hoặc BRCA2. Solomon J.S. và cs (2000) đã đánh giá quá trình điều trị cho
những người được chẩn đoán là BRCA dươns tính và đưa ra những nhận xét
sau đây. Những phụ nữ ung thư vú có liên quan tới biến đổi gen BRCA1
hoặc BRCA2 thườn 2 có nsuy cơ cao với ung thư ở một bên vú và một bên
buồng trứng. Như vậv biện pháp để phòng ngừa ung thư thứ cấp xẩy ra ở
phía đối diện là cần thiết. Bằng phương pháp thống kê, người ta đã đánh giá
tác dụng của các phương thức điều trị như điều trị bằng tamoxifen, các
phương pháp dự phòns như phẫu thuật cắt bỏ cả hai bên buồng trứng (PO),
cắt bỏ nốt bên vú còn lại hay (PMC) phối hợp các phương pháp điều trị để
kéo dài tuổi thọ cho những nsười bị ung thư vú xẩy ở một bên và có đột
biến gen BRCA1 hoặc BRCA2. Với mô hình Markov, người ta đã đánh giá
xác suất tiến triển thành ung thư ở vú và buồng trứng đối diện và tử vong

do các ung thư này, tử vong do ung thư tiên phát và sự giảm tỉ lệ ung thư và
tử vong do các phươns pháp dự phòng bằng phẫu thuật, phẫu thuật phối hợp
với trị liệu bằng tamoxifen hoặc chỉ dùns tamoxifen.
Các phươns pháp được thực hiện dự phòns bao gồm: Dùng tamoxifen
5 năm, PO, PMC và phối hợp các phương pháp , sau đó so sánh hiệu quả
của phương pháp này. Kết quả cho thấy, ở những bệnh nhân lứa tuổi 30 bị
ung thư vú ở giai đoạn sớm với các đột biến BRCA thì có thể kéo dài tuổi
thọ trung bình 0,4 đến 1,3 năm với điều trị bằng tamoxifen, 0,2 đến 0,8
năm với PO và 0.6 đến 2,1 năm với PMC...
2.2. GEN BRCA TRONG CÁC TRƯỜNG HỢP UNG THƯ v ú

Cornelisse C.J. và cs. (1996) cho rằng một trong những yếu tố nguy cơ
quan trọng của ung thư vú là yếu tố di truyền. Các tác giả cũng cho rằng gen
quan trọng nhất chịu trách nhiệm đối với ung thư vú là BRCA1 và BRCA2. Từ
đầu thập kỷ 90, các nghiên cứu về gen liên quan tới ung thư đã bắt đầu được
tiến hành. Hiện có 6 gen BRCA1, BRCA2, P53, Cowden, AR (ADNrogen


13

receptor gene) và TA (ataxia telangiectasia gene), có liên quan nhiều đến ung
thư vú đang được chú trọng nghiên cứu (bảng 2)
Bảng 2.2. Những gen liên quan tới nguy cơ mắc UTV có tính di truyền [10]
Liên quan

Vị trí trên

tới UTV

nhiễm sắc thể

Tỷ lệ
Gen

Ưng thư đang xác định

BRCA1

Hiếm

Cao

17q21

Vú nữ, buồng trứng

BRCA2

Hiếm

Cao

13q 12-13

Vú nữ, nam, buồng trứng

P53

Hiếm

Cao

17p 13.1

Cowden

Hiếm

Cao

10q22-23

Vú

AR

Hiếm

Chưa rõ

X ql 1.2-12

Vú nam

TA

Thườn 2 2 ặp

Thấp

1lq22-23

Tăng sinh lympho

Sarcom vú, thượng thận,
não, bạch cầu

Tuỵ tỷ lệ đột biến gen BRCA1 và BRCA2 là hiếm, nhưng nếu có đột
biến trong gen nàv dẫn tới mất allele thì nguy cơ ung thư trong gia đình sẽ
tăng (Casey G. và cs. 1993, Lalle p. và cs. 1994). Đột biến gen BRCA1 và
BRCA2 hiếm gặp trong ung thư vú đơn phát [12]. Thống kê cho thấy có từ
50- 60% phụ nữ mang đột biến của 2 gen sẽ bị ung thư vú ở độ tuổi 70. Do
vậy, những khám phá về gen BRCA1 và BRCA2 đã có ảnh hưởng rất lớn tới
nghiên cứu ung thư vú. Gil F., 1996 cho rằng việc xác định các marker di
truyền quyết định tính ung thư là một công việc nghiên cứu mang ý nghĩa
quyết định trong ngành ung thư học. Việc kiểm tra gen BRCA1 và BRCA2


14

kết hợp với việc tự kiểm tra thường xuyên để phát hiện sớm là phương pháp
dự phòng ung thư vú rất tốt.
Gen BRCA1 nằm trên nhiễm thể 17q 12-21 được phát hiện vào năm
1990 sau đó được Miki và cs., Wooster và cs., xác định trình tự vào năm
1994. Người có thể đột biến dòng tế bào phôi của gen BRCA1 thường có
nguy cơ ung thư biểu mô buồng trứng cao hơn và nguy cơ mắc các ung thư
tuyến tiền liệt, đại tràng. Một số nshiên cứu khác cho rằng gen BRCA1 rất
dễ bị tổn thương, chiếm 71% trong số các đột biến gen này gây nguy cơ
ung thư vú. Phụ nữ bị đột biến gen BRCA1 ước tính nguy cơ ung thư vú là
20% ở tuổi 40, 51% ở tuổi 50, 62% ở tuổi 60, 81% ở tuổi 70 và có nguy cơ

ung thư buồng trứng là 11% ở tuổi 60. Những biến đổi gen BRCA1 ở đàn
ông cũng làm tăna nguy cơ phát triển ung thư tuyến liệt. Easton và cs ước
tính tỷ lệ đột biến gen BRCA1 là 1/700 phụ nữ. .
Một điều đáng chú ý là BRCA1 biểu hiện ở tuổi trẻ hơn (tuổi trung
bình là 42,8 so với ung thư vú chung là 62,9). Những u này thường biểu
hiện tỷ lệ tăng sinh cao và thường có dị bội thể. Tỷ lệ tái phát đối với nhữns
bệnh nhân ung thư vú có đột biến sen BRCA1 thấp hơn so với những ung
thư vú khác.
Có 5 loại đột biến với tỷ lệ cao, chiếm 40% các biến đổi thuộc gen
BRCA1, trong đó đột biến 185 delAG là loại hay gặp nhất, chiếm khoảng
12%. Nếu có đột biến này thì nguy cơ u n ơ thư vú là 16% và ung thư buồng
trứng là 39% ở tuổi 50. Tuy nhiên, Jara L. và cs (2002) nghiên cứu đột biến
185delAG ở 382 trường hợp thuộc các gia đình có tiền sử ung thư vú ở Chilê
thì chỉ tìm thấy 1/382 trường hợp có đột biến 185delAG, chiếm 0.26%.
Laplace- Marieze V. và cs. (1999) đã xác định trình tự vùng m ans mã
thuộc gen BRCA1 để phát hiện đột biến ở 70 gia đình người Pháp có nguy


15

cơ ung thư cao. Đột biến BRCA1 phát hiện thấy ở 24 % các gia đình được
xét nghiệm, ở các gia đình này các trường hợp ung thư vú và ung thư
buồng trứng xuất hiện ở phụ nữ còn tươns đối trẻ, và tồn tại cả hai loại ung
thư là ung thư vú và ung thư buồng trứng ở cùng một bệnh nhân có thể giả
định về khả năn 2 có mặt của các đột biến BRCA1. Tuv nhiên, kết quả cho
thấy tần suất xuất hiện đột biến BRCA1 thấp, như vậy có thể giả định rằng
có một số biến đổi gen không thể phát hiện được trong một số gia đình có
thể là đột biến BRCA2 hoặc BRCAx nào đó chưa xác định được.
Gen BRCA2 nằm trên nhiễm sắc thể 13 q ỉ2 -ỉ 3, được phát hiện vào
tháng 9 năm 1994. Nó là một gen lớn có 27 exon, mã hoá một protein có

3418 acid amin. BRCA2 liên quan đến 35- 40% ung thư vú, mang tính di
truyền trong những gia đình bị ung thư vú, gặp cả ở nam và nữ. Nghiên cứu
đột biến gen BRCA2 (Schubert E.L và cs.,1997) cho biết đột biến BRCA2
gây nguy cơ ung thư vú là 32% đối với người ở tuổi 50, 67% đối với người
ở tuổi 70 và tới 80% đối với những nsười ở lứa tuổi 90. Ngoài ra, một số
nghiên cứu cho thấy các đột biến BRCA2 làm tăng nguy cơ phát sinh ung
thư vú nam giới, buồng trứng, tuyến tiền liệt, tụy và thanh quản [16].
Cho đến nay, chức năng của BRCA1 và BRCA2 chưa được xác định
đầy đủ. Các sản phẩm protein của cả hai gen này đều khu trú ở trong nhân
và được cho là tham gia vào điều hoà phiên mã. Một số bằng chứng gợi ý
là BRCA1 và BRCA2 tham gia vào sửa chữa ADN. Kết luận này dựa trên
nhận xét là các protein của BRCA1 và BRCA2 tác động qua lại với Rad
51, một protein tham gia vào điều hoà việc tái tổ hợp và sửa chữa ADN
chuỗi xoắn kép. Theo quan điểm này, những đột biến của gen BRCA làm
tiền đề cho những sai sót trong mã ADN, dẫn đến những đột biến trong
những gen khác ảnh hưởng trực tiếp tới sự phát triển của tế bào.Sự phức
tạp của vấn đề này hiện nay đang được nghiên cứu tích cực.


16

2.3. KỸ THUẬT PCR
«

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) được Kary Mullis và cs.
hoàn thiện vào giữa nhữns năm 80 đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di
truyền học phân tử. PCR cho phép phân lập và nhân bản một cách nhanh
chóng, chính xác các đoạn ADN mong muốn trong một hệ gen phức tạp,
khổng lồ nếu biết một phần nhỏ trình tự ở 2 đầu của đoạn ADN cần phân lập.
Đến nay nhiều kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu sinh học và ứng dụng

sinh y đều được phát triển trên cơ sở kỹ thuật PCR như: kỹ thuật RT-PCR để
nhân bản sợi bổ sung của ARN, RAPD- PCR, Real-time PCR... Một đặc tính
tuyệt vời khác của PCR là có độ nhậy và độ chính xác rất cao, thành phần hỗn
hợp PCR đơn giản.
Nguyên Ịý của PCR tương tự quá trình sao chép ADN trong tế bào, thực
chất là quá trình tổn 2 hợp ADN invitro nhờ enzvm ADN polymerase chịu
nhiệt. Các bước cơ bản của PCR gồm:
- Biến tính ADN khuôn sợi đôi nhờ nhiệt độ cao: ADN sợi đôi trong đó
có đoạn ADN đích cần phân lập và nhân bản sẽ tách thành 2 sợi đơn ở nhiệt
độ cao (thường ở 94- 96°C), tạo điều kiện cho mồi bám vào.
- Lai mồi (primer) với khuôn ADN sợi đơn: khi nhiệt độ hạ thấp, cặp
mồi (là các oligonucleotide thường có trên dưới 20 nucleotide) có khả năng
bám (lai) vào ADN sợi đơn. Điều khiển nhiệt độ bám thích hợp sẽ tạo khả
năng cho mồi bám vào đúng vị trí mong muốn. Số lượng mồi rất lớn sẽ cạnh
tranh tốt với sự bám trở lại của sợi đôi ADN khuôn ban đầu.
- Tổng hợp sợi ADN mới: ngay sau khi mồi bám vào ADN khuôn,
enzym ADN polvmerase sẽ tổng hợp sợi ADN mới trên cơ sở kéo dài đầu 3 ’
của mồi, bằng cách gắn liên tiếp 4 loại nucleotide theo nguyên tắc bổ xung
theo sợi ADN đơn làm khuôn mẫu. Nhiệt độ sẽ nâng cao dần đến nhiệt độ tối


17

ưu cho enzym ADN polymerase hoạt động (thườns trong phạm vi 68- 72°C)
trong một thời gian ngắn. Sau đó nhiệt độ sẽ tăng lên cho quá trình biến tính
ADN khuôn đê’ bắt đầu một chu kỳ mới.
Chu kỳ trên lặp lại nhiều lần (thường từ 25 - 40 lần). Các sợi mới tổng
hợp trong chu kỳ trước sẽ đóng vai trò sợi ADN khuôn trons chu kỳ sau và tốc
độ tổng hợp sợi ADN mới sẽ tăng theo cấp số nhân, tạo hàng triệu bản sao sợi
ADN mới trong một thời gian ngắn, đáp ứng số lượng cho yêu cầu nahiên cứu.

Độ dài đoạn ADN cần nhân bản nằm giữa vị trí bám của cặp mồi trên 2
sợi của ADN khuôn (mỗi mồi chỉ bám vào một sợi nhất định). Thiết kế trình
tự mồi và điều khiển nhiệt độ lai mồi là yếu tố cơ bản để mồi bám đúng vị trí
trên sợi khuồn và nhân bản đúng đoạn ADN mong muốn. Kết quả cuối cùng
của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết, ta sẽ có 2n
bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi. Đó là đặc điểm
quan trọn2 thứ hai của kỹ thuật PCR, nó dẫn đến kết quả là một đoạn ADN
định trước được "nhân lên" với một lượng rất lớn. Ví dụ sau 28 chu kỳ (228) số
lượng bản sao ADN của PCR sẽ là: 1073741824.
2.4. REAL-TIME PCR

2.4.1. Khái quát chung
Real-time PCR do Higuchi R. và cs. phát minh năm 1992. Nguyên lý của
Real-time PCR về cơ bản là giống với PCR, tuy nhiên Real-time PCR có sự
khác biệt lớn so với PCR ở những điểm cơ bản sau đây:
-

Đối với Real-time PCR, người ta có thể nhận biết được lượng sản phẩm
PCR trong từng thời điểm của quá trình khuếch đại. Vì vậy đây là kỹ
thuật rất hữu hiệu cho việc định lượng ADN hoặc ARN.

*

-

Có thể tự động hoá vì vậy xét nghiệm được số lượng mẫu lớn
cần điện di để phát hiện sản phẩm sau khi tiến hành PCR.


18

-

Đây là phương pháp rất hữu hiệu để phát hiện nhanh các đột biến.

2.4.2. Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR
+ Sử dụng SYBR Green I:
Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR sử dụng SYBR Green I được
nêu ở hình 2.3.
SYBR Green I là một hợp chất hoá học đặc biệt, chỉ có thể liên kết với
ADN khi ADN ở dạng sợi kép, chúng nằm trong khe hở được tạo ra giữa 2 sợi
ADN. Chỉ ở dạng liên kết, SYBR Green I mới phát quang. Dạng tự do hầu như
không phát quang. Trong ống phản ứng, khi ADN ở dạng sợi đơn thì SYBR
Green I tồn tại ở dạng tự do và không phát quang (A). Sau khi primer bắt cặp
với sợi khuôn, SYBR Green I bắt đầu liên kết với ADN và phát quang (B).
Trong quá trình kéo dài chuỗi, đoạn ADN sợi kép dài dần, lượng SYBR Green
I liên kết cũng tăng dần kéo theo sự tăng dần của mức độ phát quang (C). sản
phẩm PCR tăng theo cấp số nhân vì vậy cường độ phát quang cũng tăng theo
theo chu kỳ của phản ứng (D). Bộ detector trong máy chuyên dụng sẽ nghi
nhận và xử lý nhờ phần mềm. Lượng sản phẩm PCR sẽ được nhận biết theo
từng thời điểm trên màn hình máy tính và lưu vào bộ nhớ.
>1 B_*»|s«p2ltaaB«d|S*l>3*<*••]

wwr I I / ^
" “' C ị í ^ .

Hình 2.3. Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR sử dụng SYBR Green I.


19

+ Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR dựa trên sự bắt cặp của các
mẫu dò đặc hiệu
Nguyên lý bắt cặp của các mẫu dò đặc hiệu (hay còn gọi là nguyên lý
phát quang nhờ chuyển năng lượng cộng hưởng) được mô tả ở hình 2.4. Hai
mẫu dò đặc hiệu số 1 và số 2 được gắn hai hợp chất phát quang khác nhau.
Fluorescein ở đầu 3’ của mẫu dò số 1 và LC Red ở đầu 5’ của mẫu dò số 2.
Khi mẫu dò số 1 và mẫu dò số 2 ở dạng tự do thì LC Red không phát quang vì
ở xa Fluorescein và không nhận được năng lượng từ Fluorescein (A). Sau khi
mẫu dò số 1 và mẫu dò số 2 bắt cặp vào khuôn thì LC Red phát quang vì nhận
được năng lượng từ Fluorescein (B). Quá trình tổng hợp chuỗi được tiến hành
qua mỗi chu kỳ của PCR làm cho lượng sản phẩm PCR tăng dần (C,D). Số
lượng mẫu dò số 1 và 2 bắt cặp vào khuôn cũng tăng dần và cường độ phát
quang của LC Red cũng tăng theo. Detector của máy chuyên dụng sẽ nhận túi
hiệu phát quang của LC Red nhờ bộ lọc thích hợp với bước sóng của LC Red.

*

p y 00 2

mwr inmnTl

Itinim

MTTfflfM

/

Hình 2.4. Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR, dựa trên sự bắt cặp của
các mẫu dò (Probes) đặc hiệu.

+ Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR dựa trên khả năng thủy phân
mẫu dò (TaqMan probe) nhờ hoạt tính exonuclease đầu 5’ của Taq DNA
polymerase.


20

Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR, dựa trên khả năng thủy phân
mẫu dò nhờ hoạt tính exonuclease đầu 5 ’ của Taq DNA polymerase được nêu
ở hình 5. Theo nguyên lý này, hợp chất phát quang (Repoter, R) và hợp chất
dập tắt (Quencher, Q) cùng nằm trên một mẫu dò ở một khoảng cách nhất
định. Ở khoảng cách này, khi được kích hoạt R sẽ chuyển năng lượng cho Q
làm cho Q phát quang và R không còn khả năng phát quang với bước sóng đặc
hiệu của mình. Khi R chưa được tách khỏi Q thì dù mẫu dò ở dạng tự do (A)
hay bắt cặp (B), R cũng không phát quang. Nhờ hoạt tính exonuclease đầu 5’
của Taq DNA polymerase, R sẽ được thủy phân và tách khỏi mẫu dò. Ở dạng
tự do, R sẽ phát quang vói bước sóng đặc hiệu của mình (C). Lượng sản phẩm
PCR tăng dần theo chu kỳ phản ứng, lượng mẫu dò bắt cặp và được thủy phân
cũng tăng kéo theo sự gia tăng cường độ phát quang (D). Detector của máy
chuyên dụng sẽ nhận tín hiệu phát quang của R nhờ bộ lọc thích hợp với bước
sóng của R.

Hình 2.5. Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR, dựa trên khả năng thủy
phân mẫu dò nhờ hoạt tính exonuclease đầu 5 ’ của Taq AD N polymerase.
2.4.3. ứng dụng của Real-time PCR
Real-time PCR là một phương tiện rất hữu hiệu để chẩn đoán nhanh
bệnh ở người, vật nuôi mà không cần điện di sản phẩm PCR như các bệnh
nguy hiểm do virut: vữut cúm (Matsuzaki Y., 2003), cytomegalovirus
t