NGHIÊN cứu PHÁT HIỆN các BIẾN THỂ ở một số BỆNH NHÂN tự kỷ VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH tự TOÀN bộ VÙNG mã hóa (EXOME) (tt)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ
Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ
TOÀN BỘ VÙNG MÃ HÓA (EXOME)
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 9420116

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018
Công trình được hoàn thành tại


2
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN
Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Nguyễn Huy Hoàng
Viện Nghiên cứu hệ gen
2. GS. TS. Phan Văn Chi
Viện Công nghệ sinh học
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án phiên chính
thức
Họp tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Vào hồi: giờ phút, ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc Gia


3
-

Thư viện Viện Công nghệ sinh học
Website:
MỞ ĐẦU
Tự kỷ (Autism Spectrum Disorders -(ASD)) thuộc một nhóm các
rối loạn phát triển, không đồng nhất về mặt di truyền. Tự kỷ được biểu
hiện ra ngoài bằng những khiếm khuyết về tương tác xã hội, khó khăn
về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động
mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Một số bệnh thường thấy đi kèm với
ASD bao gồm rối loạn lo âu, rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa và các
phản ứng bất thường gây kích thích cảm giác. Điều đáng nói là hiện nay
chưa có phương pháp chữa trị dứt điểm cho bệnh nhân tự kỷ. Các biện
pháp được áp dụng hiện nay chỉ để giảm các rối loạn hành vi, các loại
thuốc nhằm giảm sự hung hăng, lo âu, trầm cảm,…. Ước tính mới nhất
cho thấy rằng ASD ảnh hưởng đến khoảng 1 trong 68 trẻ em và tỷ lệ
mắc bệnh ở bé trai chiếm ưu thế so với bé gái. Nguy cơ di truyền của
bệnh được đề xuất có liên quan đến ảnh hưởng kết hợp của các biến thể

khác nhau. Trong những nghiên cứu ở những cặp song sinh, sự đồng
nhất kiểu hình của ASD ở những cặp song sinh cùng trứng chiếm 7090%, trong khi tỉ lệ này ở những cặp song sinh khác trứng chỉ 0-30%.
Yếu tố môi trường cũng có sự tương tác với yếu tố di truyền và gây ra
những thay đổi bất thường trong sự phát triển tế bào thần kinh, phát
triển trí não. Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (WES) đã được sử dụng
rộng rãi trong các nghiên cứu lâm sàng vài năm gần đây, đặc biệt trong
việc xác định các gen bệnh di truyền theo Mendel. Hàng chục nghìn
biến thể gen có thể được xác định trong mỗi exome trong nhiều bệnh
phức tạp như: tim mạch, thần kinh,... Đối với con người, trí tuệ là một
tính trạng cực kỳ phức tạp do nhiều gen quy định. WES đang được coi
là hướng đi đúng đắn để nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ. Phương pháp
này giúp xác định điều kiện di truyền cụ thể với những trường hợp còn
nghi ngờ về mặt lâm sàng, cho thấy tầm quan trọng của các biến đổi di
truyền trên gen trong hội chứng tự kỷ. Hiện nay, tại Việt Nam việc
nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ còn khá mới, và đặc biệt chưa có
nghiên cứu nào sử dụng kỹ thuật phân tử cao. Xuất phát từ thực tiễn đó,
luận án “Nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số bệnh nhân tự


4
kỷ Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa
(exome)” được thực hiện sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu di truyền học
giải thích được cơ chế gây bệnh và các bác sĩ lâm sàng điều trị bệnh
hiệu quả, đúng hướng để nâng cao chất lượng cuộc sống.
Mục tiêu của đề tài:
1. Giải trình tự và phân tích toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở một số
bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.
2.
Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh
tự kỷ ở một số người bệnh tự kỷ Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu:
Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ.
Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân
và gia đình.
3. Giải trình tự toàn bộ exome của một số bệnh nhân tự kỷ tự Việt Nam.
4.
Phân tích số liệu tìm các biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự
kỷ ở người Việt Nam.
Những đóng góp mới của luận án:
1. Đưa ra số liệu các biến thể mới ở người bệnh tự kỷ Việt Nam.
2. Xác định 02 biến thể mới (p.L111P và p.R3048C) trên gen RYR3
ở 01 bệnh nhân.
3. Xác định 02 biến thể mới (p.R801C và p.W819C) trên gen RYR2
ở 01 bệnh nhân.
4. Xác định 06 biến thể mới trên gen MUC16 (p.A2224S;
p.W13569C;
p.Val13167Met;
p.L13171F;
p.E12869K;
p.D13229E) ở 06 bệnh nhân.
5. Xác định đa hình rs7725785c.507+53G>T trên gen HTR4 ở 04
bệnh nhân.
Cấu trúc của luận án:
Luận án được trình bày trong 119 trang (không kể tài liệu tham khảo và
phần phụ lục). Luận án được chia thành các phần:

1.
2.

-

Mở đầu: 03 trang
Chương 1. Tổng quan tài liệu: 29 trang


5

-

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 13 trang
Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 43 trang
Chương 4. Bàn luận: 22 trang
Kết luận và Kiến nghị: 01 trang
Các công trình công bố của tác giả: 01 trang

Tóm tắt luận án bằng tiếng Anh: 07 trang
Luận án gồm 23 bảng, 37 hình, sử dụng 233 tài liệu tham khảo gồm
tiếng Việt, tiếng Anh và một số trang Web. Phần phụ lục Danh sách 101
gen liên quan đến bệnh tự kỷ của hãng Illumina; Kết quả tạo thư viện
DNA; Chất lượng dữ liệu của fastq của các mẫu; Thông tin hồ sơ DBCP và CARS của bệnh nhân.


6
NỘI DUNG LUẬN ÁN
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU BỆNH TỰ KỶ
Tự kỷ là một dạng rối loạn trong Rối Loạn Phát Triển Lan Toả
(Rối Loạn Phổ Tự Kỷ), bệnh khởi phát sớm trong 3 năm đầu tiên của
cuộc đời, tác động đến sự phát triển của trẻ trong 3 lĩnh vực chính như:
tương tác xã hội, ngôn ngữ, hành vi. Tự kỷ là một rối loạn mãn tính, ảnh

hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển trí tuệ và hành vi cũng như khả
năng học tập, sinh hoạt và khả năng thích ứng của trẻ sau này. Tự kỷ hay
rối loạn phổ tự kỷ là một nhóm các hội chứng không đồng nhất về mặt
di truyền. Tự kỷ được biểu hiện ra ngoài bằng những khiếm khuyết về
tương tác xã hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành
vi, sở thích và hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Ngoài những
triệu chứng lâm sàng cổ điển cụ thể, có khoảng 31% bệnh nhân bị
khuyết tật trí tuệ, 20-25% có triệu chứng co giật. Một số bệnh thường
thấy đi kèm với ASD bao gồm rối loạn lo âu, rối loạn giấc ngủ, rối loạn
tiêu hóa, các phản ứng bất thường gây kích thích cảm giác. Cơ sở di
truyền của bệnh được đề xuất có liên quan đến sự ảnh hưởng kết hợp
của các biến thể khác nhau.
1.2. NHỮNG YẾU TỐ GÂY BỆNH Ở CẤP ĐỘ DI TRUYỀN HỌC
1.2.1. Các biến thể số lượng bản sao (CNVs)
Nghiên cứu ban đầu (Jacquemont ML, Sanlaville D et al. 2006;
Sebat J, Lakshmi B et al. 2007; Christian SL, Brune CW et al. 2008;
Marshall CR, Noor A et al. 2008) cho thấy sự gia tăng tần số của CNVs
trong quần thể người ASD so với đối chứng (trung bình 6-10 % so với
1-3%, tương ứng). Gần đây, nhiều bằng chứng cho rằng vị trí CNV và
sự phù hợp chức năng của nó có thể đóng một vai trò quan trọng hơn số
lượng và kích cỡ của CNV. Phân tích chức năng của những thể CNVs
hiếm đã cho thấy sự tham gia của các locus trong phát triển khớp thần
kinh, sợi trục và tế bào thần kinh vận động.
1.2.2. Các gen “khớp thần kinh”- neuroligins, SHANK và neurexins
Một vài gen neurologin, SHANK và neurexin mã hóa cho các
protein quan trọng dẫn đến sự ổn định, trưởng thành và hình thành khớp
thần kinh đã và đang được tìm thấy, đột biến trên các gen này gây ra các


7

hành vi đặc trưng cho kiểu hình của bệnh tự kỷ (Craig AM and Kang Y
2007; Südhof TC 2008; Betancur C, Sakurai T et al. 2009).
1.2.3. Các gen định hình chất nhiễm sắc (MECP2)
Gen MECP2 rất cần thiết cho sự phát triển và đảm bảo thực hiện
đúng chức năng của não. Mất MeCP2 sẽ trì hoãn sự hoàn thiện của tế
bào nơron thần kinh và khớp nối thần kinh. Các đột biến mất chức năng
của MECP2 là nguyên nhân của hội chứng Rett (Chahrour M and HY.
2007). Tuy nhiên, đột biến mới của MECP2 đôi khi có thể dẫn đến các
kiểu hình như: chậm phát triển, tâm thần nhẹ và các biến thể Rett bằng
lời nói, phụ thuộc vào sự biến đổi cụ thể (Lam CW, Yeung WL et al.
2000). Đột biến MECP2 cũng được tìm thấy ở các bé gái mắc chứng tự
kỷ không điển hình.
1.2.4. Các gen điều khiển sự phát triển và hình thái - (HOXA1,
PTEN, EIF4E)
Nhiều bệnh nhân hội chứng tự kỷ thường có biểu hiện hình thái
mặt như có các dị tật nhỏ hoặc lớn, đầu nhỏ hoặc to. Những đứa trẻ với
biểu hiện tự kỷ thường có hình thái khuôn mặt nhỏ (Tripi G, Roux S et
al. 2008) và tỷ lệ phát triển đầu/cơ thể không bình thường (Sacco R,
Militerni R et al. 2007; Chawarska K, Campbell D et al. 2011). Khoảng
20% trẻ tự kỷ có đầu to (Sacco R, Militerni R et al. 2007), với sự phát
triển đầu vượt trội trong những năm đầu khi mới sinh ra (Courchesne E,
Pierce K et al. 2007). Ngược lại một nhóm nhỏ các bệnh nhân mắc
chứng tự kỷ nguyên phát có cơ thể nhỏ và đầu nhỏ (Sacco R, Militerni R
et al. 2007). Một số gen quan trọng trong nhóm này như HOXA1, PTEN,
EIF4E đều được tìm thấy ở những bệnh nhân tự kỷ có sự bất thường về
hình thái.
1.2.5. Các gen liên quan tới Ca2+
Một nghiên cứu gần đây cho thấy trong một số trường hợp tự kỷ
có thể là do sự bất thường nội cân bằng Ca2+trong quá trình phát triển
thần kinh (Krey J and R. 2007). Ngoài ra, một số nghiên cứu di truyền

đã xác định được gen liên quan đến bệnh tự kỷ mã hóa protein hoặc trực
tiếp hoặc gián tiếp kiểm soát Ca2+nội bào hoặc quy định cytosolic
Ca2+quá độ. Các phân tử này bao gồm các kênh ion, các thụ thể và các


8

•
•

protein truyền tín hiệu điều khiển Ca2+liên quan tới sự phát triển thần
kinh trung ương.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng được lựa chọn là 07 trẻ trên 3 tuổi được chẩn đoán
lâm sàng mắc bệnh tự kỷ bởi các bác sĩ chuyên khoa tại Khoa Tâm bệnh
- BV Nhi TƯ có sự tham gia của phụ huynh.
2.2. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
Thủ tục lấy mẫu được tuân theo tiêu chuẩn của Hội đồng Y đức
tại Viện Nghiên cứu hệ gen số 02/QĐ-NCHG và Tuyên bố Helsinki của
Hội đồng Y khoa thế giới.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Giải trình gen thế hệ mới, giải trình tự gen bằng phương pháp
Sanger, khuếch đại gen bằng phản ứng PCR, điện di DNA.
Phân tích dữ liệu bằng các phần mềm tin sinh chuyên sâu:
Burrows–Wheeler Alignerv 0.7.10, Picard v1.118, …
2.3.1. Giải toàn bộ vùng gen mã hóa
Phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa bao gồm 3 bước
chính: thiết lập thư viện DNA; giải trình tự trên máy; xử lý và phân tích
dữ liệu (Schuster SC. 2008).

Sử dụng SureSelect target enrichment system for Illumina paired-end
multiplexed sequencing.
Toàn bộ quá trình tạo thư viện DNA gồm 5 bước chính: cắt
DNA thành các đoạn ngắn theo bộ kit; Các đoạn DNA đã cắt được gắn
với các adaptors và indexes cho từng mẫu; Lai các đoạn DNA với các
trình tự exon được biotin hóa và gắn hạt từ đã được phủ streptavidin;
Loại bỏ những phân tử không liên kết, các trình tự exon đã byotin hóa
và thu lại các đoạn chứa exon; Khuếch đại các đoạn exon mẫu.
2.3.2. Phân tích dữ liệu
Thư viện DNA sau đó được giải trình tự trên máy giải trình tự
mới. Dữ liệu trình tự được sắp xếp và so sánh với ngân hàng gen người
(hg19) bằng phần mềm BWA phiên bản 0.7.10. (Li, Durbin, 2009). Bản
sao phân tử được loại bỏ bằng cách sử dụng Picard v1.118. Dữ liệu sau
đó được phân tích bằng Genome Analysis Toolkit v3.4 để tìm tất cả
những vị trí có sự thay đổi alen với tần số thống kê cao, bao gồm SNPs,
đoạn thêm, mất ngắn và CNVs (McKenna, Hanna et al. 2010). Biến thể


n biến thể
ng SNP
ến thể đồng
hĩa
ến thể sai
hĩa
êm bộ mã
a kết thúc
ất bộ ba mã

9
được chú giải bằng phần mềm SnpEff v4.1 và các cơ sở dữ liệu dbSNP

v142, 1000Genome, ClinVar, ESP nhằm xác định ảnh hưởng của biến
thể (Cingolani et al., 2012) . Để chọn lọc được những biến thể tiềm
năng, dữ liệu được lọc qua các bước lọc như sau. Đầu tiên, các biến thể
có giá trị MQ < 40 bị loại bỏ. Thứ hai, các biến thể có giá trị Sift_Pred
được đánh dấu là “Damaging (D)” hoặc “NA (‘.’)” được giữ lại. Thứ
ba, chọn lọc các biến thể thay thế. Thứ tư, loại bỏ những biến thể đã
được được biết đến trong ngân hàng dữ liệu SNPs 142.
2.3.7. Phân tích các gen trong mối tương tác
Để phân tích các gen liên quan đến ASD, dữ liệu các gen chứa
biến thể ở từng bệnh nhân được đưa vào hệ thống ASD@Princeton của
trường đại học Princeton. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích các
mối tương quan của các gen liên quan đến các đặc điểm đặc trưng nhất
ở người bệnh tự kỷ bao gồm: biểu hiện hành vi, giao tiếp, tương tác xã
hội.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 XÁC ĐỊNH BIẾN THỂ DI TRUYỀN Ở BỆNH NHÂN TỰ KỶ
3.1.1. Xác định và chú giải biến thể
Sử dụng bộ công cụ GATK để xác định biến thể, phần mềm
SnpEff sử dụng để phân chia các biến thể thành các nhóm theo mức độ
ảnh hưởng chức năng của biến thể. Từ bảng kết quả 3.1 cho thấy, mẫu
số T01 cho tổng số SNP là 103.840, tổng số Indel là 14.843 và % tìm
thấy trên dbSNP142 là 97,3%. Tương tự như thế 6 mẫu bệnh nhân còn
lại lần lượt có các chỉ số như trên được tổng kết và trình bày trong bảng
3.1. Ngoài ra, kết quả thu được từ 7 nhóm biến thể thì trong đó có đến
hơn 97% số biến thể là đã được đăng ký trong ngân hàng dbSNP142
(Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Kết quả xác định và chú giải biến thể
Mẫu T01
103.840
11.488

Mẫu T02
105.091
11.539

Mẫu T03
103.809
11.322

Mẫu T06
104.497
11.417

Mẫu T07
104.022
11.276

Mẫu T08
103.954
11.447

Mẫu T09
107.192
11.664

10.546

10.734

10.540

10.456

10.423

102.000

10.644

78
38

80
31

95
36

95
38

84
39

34
37

97
42

t thúc
ng số biến
ể thêm mất
ột biến lệch
ung đọc
êm bộ ba mã
a
ất bộ ba mã
a
tìm thấy trên
SNP142

10
14.843

15.581

14.898

15.077

14.943

14.793

16.192

284

279

273

283

276

275

306

163

156

148

148

158

155

154

207

207

174

178

185

185

198

97,3

97,2

97,4

97,3

97,3

97,3

97,1

Sau quá trình lọc, những gen/biến thể được giữ lại thỏa mãn các điều
kiện:
• Gen có khả năng gây ra bệnh liên quan thần kinh
• Có chỉ số MQ>40 (mapping quality)
• SIFT_Pred=D, PolyPhen 2 _ Pred =D (Damaging)
• Biến thể không có trong cơ sở dữ liệu dbSNP 142

Bảng 3. 2. Số lượng biến thể sau các bước lọc của 07 bệnh
nhân
Tên
mẫu

Dữ liệu
gốc

T01
T02
T03
T06
T07
T08
T09

118.687
120.672
118.707
119.574
118.965
118.774
123.386

Thuộc gen
có tiềm
năng gây
bệnh và
MQ>40
164.980

164.780
164.950
163.250
161.180
163.890
167.470

SIFT_Pred=D
Và PolyPhen 2 _
Pred =D

Không có
trong
dbSNP 142

Thuộc 101
gen ASD

330
342
309
319
305
319
304

14
16
8
19

11
14
12

16
17
16
17
17
15
22

Ở bảng kết quả 3.2 cho thấy, dữ liệu gốc của mẫu T01 là 118.687
biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh thần kinh thì trải qua bước
lọc chỉ số MQ >40 (thuộc các gen có tiềm năng gây bệnh) còn 164.98
biến thể. Tiếp tục lọc qua bước các biến thể bị đánh giá là có ảnh hưởng
đến chức năng protein (SIFT_Pred=D và PolyPhen 2 _ Pred =D
(Damaging)) được giữ lại còn 330, Trong đó có 14 biến thể quan tâm
không có trong cơ sở dữ liệu dbSNP142, 16 biến thể trên các gen đã biết
liên quan đến ASD. Tương tự như thế với 6 mẫu còn lại trải qua các
bước lọc thì số lượng biến thể còn lại được trình chi tiết trong bảng 3.2.
3.1.2. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T01


11
3.1.2.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân
T01

Sau quá trình phân tích và chọn lọc bằng các phần mềm tin sinh
học, ở bệnh nhân T01, chúng tôi đã thu được bảng dữ liệu các biến thể

nằm trên các gen có trong danh sách 101 gen ASD gồm 16 biến thể trên
12 gen: DPP6, GRIN2B, MED12, NEGR1, PDE10A, PTCHD1, PTEN,
SMC1A, ST7, TSC2, CACNA1E, SCN8A.
Từ kết quả giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa, các gen được phân
tích sâu hơn bằng các ứng dụng về dự đoán, tương tác của các gen nhạy
cảm với ASD của trường Đại học Princeton (asd.priceton.edu). Các gen
và các mối liên kết chức năng trong các biểu hiện bệnh đặc trưng của
các bệnh nhân tự kỷ như khiếm khuyết trong các lĩnh vực: Hành vi, giao
tiếp, tương tác xã hội được phân tích. Kết quả phân tích sự tương tác của
các gen liên quan đến ba biểu hiện đặc trưng nhất ở bệnh nhân T01 cho
thấy, các gen tham gia là tương đối giống nhau, và ở cả 3 biểu hiện
nghiên cứu, 2 gen chứa biến thể ở bệnh nhân T01 là DPP6 và CASK đều
tham gia (Hình 3.1).

Hình 3.1 Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T01
Trong đó, chỉ số tin cậy của mối tương tác giữa gen DPP6 và
NTRK3 là 0,65, chỉ số tin cậy của mối tương tác giữa gen CASK và
ATP2B2 là 0,6


12
3.1.2.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T01
Từ kết quả giải trình tự exome của các bệnh nhân qua phân tích
và sàng lọc những biến thể tiềm năng này sẽ được phân tích tiếp bằng 2
công cụ là SIFT (sorting intolerant from tolerant) và PolyPhen
(polymorphism phenotyping). Kết quả bệnh nhân T01 có 14 biến thể
quan tâm không có trong cơ sở dữ liệu dbSNP142 trên các gen:
ATP2B3, BCL11A, CDK13, CSMD2, DNAH9, HIP1R, KNDC1, LRRC7,
MUC5B, MYCBP2, PITPNM3, SMTN và ZDBF2 .
3.1.3. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T02

3.1.3.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh
nhân T02
Kết quả sau các bước lọc, bệnh nhân T02 có 17 biến thể nằm trên
15 gen đã biết liên quan đến ASD: CASK, CDKL5, FOXP1, KLHL3,
MED12, SCN2A, SHANK2, SHANK2, SLC6A4, TCF4, VPS13B, ZEB2,
CACNA1I, SCN3A, SCN5A
Kết quả phân tích mối tương quan cho thấy trong các gen chứa
biến thể của bệnh nhân T02, có 2 gen quan trọng, tham gia vào các biểu
hiện đặc trưng trong nghiên cứu này là SHANK 2 và CASK. Trong biểu
hiện hành vi, có 3 gen được xác định trong hệ thống ASD@Princeton là
CDCY1, ATP2B2, EFNB3 (Hình 3.2). Theo đánh giá của hệ thống, chỉ
số tin cậy của mối tương tác giữa gen SHANK2 và 2 gen OLFM1,
LARGE lần lượt là 0,53, 0,58


13

Hình 3.2. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T02
3.1.3.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T02
Sau khi loại bỏ các biến thể được đánh giá là an toàn, không gây
bệnh và các biến thể nằm trong ngân hàng db142SNP, số lượng các biến
thể nằm trên các gen mới ở bệnh nhân T02 là 16 biến thể. Các biến thể
này nằm trên 15 gen: RP1L1, MYOM3, PDIA5, ADCY2, DST, PKD2L1,
CTBP2, MYO1E, MYH13, SDK2, MUC16, INPP5J, EYS, ATP2B3,
GPRASP1.
3.1.4. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T03
3.1.4.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh
nhân T03
Sau khi chọn lọc bằng các phần mềm chuyên dụng, 16 biến thể
nằm trên 15 gen liên quan đến ASD được tìm thấy ở bệnh nhân T03.

Các gen này gồm có: NTNG1, ZEB2, MBD5, FOXP1, KLHL3, HOXA1,
ST7, DPP6, DLGAP2, GRIN2B, TRPM1, SOX5, UBE3A, RBFOX1,
CACNA1C.


14

Hình 3.3. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T03
Kết quả phân tích mối tương quan của các gen trong các biểu
hiện bệnh, cho thấy, đối với bệnh nhân T03, chỉ có gen DPP6 tham gia
và mối tương quan với các gen liên quan đến 3 biểu hiện trong nghiên
cứu này (Hình 3.3)
3.1.4.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T03
Bệnh nhân T03 có 8 biến thể trên 8 gen mới FLNC, ADAMTS9,
NIN, ASB16, MUC16, TMPRSS15, KDELR3, ALPI.
3.1.5. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T06
3.1.5.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh
nhân T06
Sau các bước chọn lọc, kết quả thu được ở bệnh nhân T06 bao
gồm 17 biến thể trên 15 gen đã biết liên quan đến ASD: ANKRD11,
AUTS2, CASK, DOCK4, DPP6, KATNAL2, KLHL3, NIPBL, RBFOX1,
RELN, SHANK2, SOX5, TCF4, TSC1, TSC2. Kết quả phân tích các gen
ở bệnh nhân T06 cho thấy, bệnh nhân này có 5 gen quan trọng, tham gia
vào mối tương tác với các gen liên quan đến các biểu hiện hành vi, giao
tiếp, tương tác xã hội. Đó là TSC1,TSC2, NIPBL, SHANK2, DPP6 (Hình
3.4). Trong đó gen TSC1, TSC2 nằm trong danh sách gen của hệ thống,
chứng tỏ sự quan trọng của gen này liên quan đến biểu hiện giao tiếp.


15

Theo tính toán chỉ số tin cậy của mức độ tương tác giữa 2 gen TSC1,
TSC2 là 0,62. Chỉ số tin cậy của mức độ tương tác giữa gen NIPBL với
các gen khác đều trên 0,7.

Hình 3.4. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T06
3. 1.5.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T06
Bệnh nhân T06 có 18 biến thể trên 19 gen: BRF1, ABCA13,
ATP2B3, CCNL2, CIT, CLTCL1, CTBP2, DISP1, FNDC7, MUC16,
MUC5B, RSL1D1, RYR3, SGSM3, TTYH1 và WDFY4.
3.1.6. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T07
3.1.6.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh
nhân T07
Bệnh nhân T07 mang 17 biến thể trên 16 gen liên quan đến ASD
đã được biết: ATRX, AUTS2, DLGAP2,FOXP1, KDM5C, KIRREL3,
MED12, PTEN, SHANK2, SMG6, KCNJ10, SOX5, SPAST, ST7,
VPS13B, CACNA1H. 16 gen này được đưa vào hệ thống phân tích dữ
liệu của trường Đại học Princeton để phân tích mối tương quan giữa các
gen. Kết quả phân tích cho thấy, ở cả 3 biểu hiện hành vi, giao tiếp,


16
tương tác xã hội, có 4 gen trong số 16 gen này tham gia đó là ATRX,
SPAST, KDM5C, SHANK2. Ngoài ra, gen ATRXN1, PCLB1 những gen
có vai trò rất quan trọng, thể hiện kích thước và màu xanh của vòng tròn
đại diện (Hình 3.5). Chỉ sộ độ tin cậy của mức độ tương tác giữa gen
SPAST và PPP1R12A là 0,55. trong khi chỉ số này của sự tương tác giữa
gen ATN1 và KDM5C là 0,61.

Hình 3.5. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T07
3.1.6.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T07

Bệnh nhân T07 có 11 biến thể mới nằm 10 gen: HECW2, RYR2,
PLCH2, SPEN, ADAMTS9, RBM47, IQCE, MUC5B, MUC16,
UMODL1
3.1.7. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T08
3.1.7.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh
nhân T08
Kết quả chọn lọc cho thấy, ở bệnh nhân T08 có 15 biến thể, các
biến thể này nằm trên 14 gen liên quan dến ASD: CASK, DLGAP2,


17
DOCK4, FOXP1, GABRB3, RBFOX1, RELN, SCN1A, SHANK2,
SHANK3, SOX5, CACNA1D, CACNA1F, KCNMA1. Sau khi đưa dữ liệu
các gen này vào hệ thống phân tích mối tương quan, kết quả cho thấy sự
quan trọng của 2 gen và CACNA1F khi tham gia vào cả 3 biểu hiện. Gen
SHANK2 có mối tương quan với gen PLCB1, EFNB2 là những gen quan
trọng trong hệ thống, biểu hiện ở hình tròn đại hiện màu xanh. Gen
CACNA1F liên quan đến gen ACRV1 (Hình 3.6), với chỉ số độ tin cậy là
0,63.

Hình 3.6. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T08
3.1.7.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T08
Đối với kết quả chọn lọc các biến thể trên những gen mới, bệnh
nhân T08 có 14 biến thể, trên các gen: KIAA1109, OR52E8, NFRKB,
WHSC1L1, FLG, INSRR, IL17RC, MUC5B, BCL9L, ENO2, GGA2,
SMTNL2, MUC16, BTAF1.
3.1.8. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T09
3.1.8.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh
nhân T09

18

Hình 3.7. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T09
Sau các bước chọn lọc, kết quả phân tích ở bệnh nhân T09 thu
được 22 biến thể trên 19 gen đã biết liên quan đến bệnh tự kỷ:
ANKRD11, ARX, ATRX, AVPR1A, CHD7, CNTNAP5, DOCK4, EHMT1,
FOXP1, KCNQ5, KLHL3, MED12, MET, NRXN1, OPHN1, RBFOX1,
SMC1A, SOX5, CACNA1G. Mối tương quan giữa các gen này với các
gen liên quan đến các biểu hiện đặc trưng của bệnh nhân tự kỷ cũng
được phân tích.
Kết quả cho thấy, trong số 19 gen đưa vào phân tích, gen MET,
CACNA1G và AVPR1A tham gia ở cả 3 biểu hiện. AVPR1A được đánh
giá là gen quan trọng trong sự hình thành các biểu hiện tương tác xã hội,
hành vi, giao tiếp. MET có vai trò quan trọng trong biểu hiện hành vi.
Các gen này được đánh dấu màu xanh ở hình tròn đại diện (Hình
3.7).Các mối tương tác trong các gen này đều có chỉ số tin cậy trên 0,6.
3.1.8.1. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T09
Ở bệnh nhân T09, số biến thể được tìm thấy trong các gen mới
sau các bước chọn lọc là 12 biến thể, bao gồm 11 gen CNTN5,
PDE4DIP, KDM3B, ABCA1, CTBP2, MUC5B, TRPM7, CCBE1,
MUC16, ZNF208, PGC


19
3.2. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SANGER KIỂM CHỨNG CÁC BIẾN THỂ MỚI TRÊN CÁC GEN
TIỀM NĂNG
3.2.1. Gen RYR3
Kết quả WES từ 7 bệnh nhân cho thấy, 2 bệnh nhân T06 và T07

mang 2 biến thể mới trên mỗi gen RYR2 ( bệnh nhân T07) và RYR3
(bệnh nhân T06). Như đã trình bày ở phần tổng quan tài liệu, các nghiên
cứu trên thế giới cho thấy rằng trong một số trường hợp tự kỷ có thể là
do sự bất thường nội cân bằng Ca 2+ trong quá trình phát triển thần kinh
(Krey and Dolmetsch 2007). Ngoài ra, RYR3 đã được chứng minh có
vai trò trong giải phóng ion Ca 2+ của kênh canxi cũng như đóng vai trò
quan trọng trong việc điều tiết Ca2+ nội bào trong tế bào thần kinh (Fill
and Copello 2002; Lu et al, 2012; Schmunk et al, 2015). Bên cạnh đó,
RYRs còn nằm trên nhiễm sắc thể 15q14-q14 khu vực nhạy cảm với
bệnh tự kỷ (Sorrentino et al, 1993).
Kết quả giải trình tự Sanger biến thể trên gen RYR3 ở bệnh nhân
T06 (Hình 3.8) cho thấy bệnh nhân mang hai biến thể thay thế dạng dị
hợp tử. Bệnh nhân thừa hưởng biến thể p.L111P từ bố và biến thể
p.R3048C từ mẹ. Biến thể đầu tiên (p.L111P) xảy ra trong exon 4, trong
đó T được thay thế bằng C ở vị trí 332 trong cDNA, dẫn đến việc thay
thế Leu (L) bởi Pro (P) tại vị trí 111 trên protein RYR3. Biến thể thứ hai
(p.R3048C) đã được quan sát thấy trên exon 65, trong đó C đã được
thay thế bởi T ở vị trí 9142, dẫn đến sự thay đổi của một amino acid ở vị
trí 3048, nơi Arg (R) được thay thế bởi Cys (C) trên protein RYR3.
Ngoài ra, biến thể p.L111P còn nằm trên vùng domain MIR1 của
protein RYR3. MIR1 nằm tại vị trí amino acid 100 đến 150. Domain
MIR được biết đến là vùng chức năng quan trọng của RYRs. Cả 2 biến
thể đều nằm trên vùng bảo thủ của RYR3 cho thấy mức độ quan trọng
của vị trí độ biến.


20

Hình 3.8. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger
phát hiện biến thể p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys trên gen RYR3 ở

bệnh nhân T06
3.2.2.Gen RYR2

Hình 3.9. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger
phát hiện biến thể p.Arg801Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07
Tương tự như gen RYR3, RYR2 có vai trò trong giải phóng ion
Ca2+ của kênh canxi cũng như đóng vai trò quan trọng trong việc điều
tiết Ca2+ nội bào trong tế bào thần kinh (Fill and Copello 2002; Lu AT. et


21
al, 2012; Schmunk G. et al. 2015). Jihane Soueid và cộng sự đã tìm
những biến thể trùng lặp trên gen RYR2 ở bệnh nhân tự kỷ Lebanese cho
thấy sự liên quan đáng kể của gen này đến bệnh tự kỷ (Jihane Soueid et
al, 2016).

Hình 3.10. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger
phát hiện biến thể p.Tyr819Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07
Các nghiên cứu cho thấy vai trò quan trọng của RYR2 trong việc
kiểm soát cân bằng nồng độ ion Ca2+ nội mô, và liên quan đến những
vấn đề về stress, nhận thức. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp
Sanger cho thấy, bệnh nhân T07 mang một biến thể dị hợp tại vị trí
c.2401 C>T, gây biến đổi trên protein tại vị trí 801, amino acid Arg bị
biến đổi thành Cys. Biến thể này được di truyền từ người mẹ không
mang bệnh. Biến thể xảy ra làm xuất hiện một liên kết Hydro giữa
amino acid Cys801 và Leu803. Biến thể thứ 2 là tại vị trí c.2456A thành
G, gây biến đổi amino acid Tyr thành Cys trên protein tại vị trí 819. Đây
là một biến thể mới phát sinh, không di truyền từ bố hoặc mẹ. Mô hình
mô phỏng cấu trúc không gian của biến thể này cho thấy, khi biến thể
xảy ra, sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc bậc 1 của protein, làm xuất

hiện 1 cầu nối Hydro giữa Cys801 và Leu803.
3.2.3. Gen MUC16


22
Kết quả WES cho thấy tần suất xuất hiện biến thể trên gen
MUC16 ở các bệnh nhân tự kỷ trong nghiên cứu này là khá nhiều. 6/7
bệnh nhân mang các biến thể trên gen MUC16 (Bảng 3.3).Các biến thể
này ở các bệnh nhân và gia đình được kiểm chứng lại bằng phương pháp
giải trình tự Sanger. Trong nội dung tóm tắt này, chỉ kết quả giải trình tự
bằng phương pháp Sanger ở các bệnh nhân được trình bày. Kết quả giải
trình tự cho thấy, các biến thể đều là những biến thể dị hợp tử mới phát
sinh, không di truyền từ bố mẹ (Hình 3.11).

Bảng 3.3. Tổng hợp các biến thể trên gen MUC16 ở các bệnh nhân
tự kỷ
STT
1

Bệnh
nhân
T02

2

HGVS.c

HGVS.p

c.6670G>T

p.Ala2224Ser

c.40707G>C

p.Trp13569Cys

3

T03

c.39687T>A

p.Asp13229Glu

4

T06

c.39511C>T

p.Leu13171Phe

c.38605G>A

p.Glu12869Lys

5
6

T07

c.39499G>C

p.Val13167Met

7

T08

c.40707G>C

p.Trp13569Cys

8

T09

c.6670G>T

p.Ala2224Ser


23

Hình 3.11. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger
phát hiện các biến thể trên gen MUC16 ở các bệnh nhân tự kỷ
3.2.4. SNP rs7725785 trên gen HTR4
rs7725785 được phát hiện trong 4/7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.
Tuy con số này còn nhỏ, chưa có ý nghĩa thống kê, nhưng kết quả này

cũng góp phần làm sáng tỏ hơn nữa vai trò của rs7725785 trong di
truyền bệnh tự kỷ nói chung và bệnh tự kỷ ở Việt Nam nói riêng.


24
Hình 3.12. Biến thể c.507+53G>T trên gen HTR4 ở BN T01,
T07, T08, T09
3.3. CÁC GEN NHẠY CẢM VỚI ASD CÓ LIÊN QUAN ĐẾN
KÊNH ION

Hình 3. 13. Các họ kênh ion và các gen liên quan
Gần đây, phương pháp giải trình tự genome, exome đã được áp
dụng nhiều trong nghiên cứu sự liên kết đa hình của các biến thể trên
các gen nhạy cảm với ASD và liên quan đến các kênh canxi, natri và
kali. Từ kết quả WES, chúng tôi thống kê được các biến thể trên các gen
phụ trách các kênh vẩn chuyển ion Ca 2+, Na+, K+ (hình 3.13). Có thể
thấy rằng, các gen chứa biến thể thuộc nhóm gen tham gia vận chuyển
ion Ca2+ nhiều nhất. Từ đó cho thấy, vai trò quan trọng của kênh vận
chuyển ion Ca2+ đối với bệnh tự kỷ.
CHƯƠNG IV
BÀN LUẬN KẾT QUẢ
4.1. CÁC GEN NHẠY CẢM VỚI ASD CÓ LIÊN QUAN ĐẾN
KÊNH ION
Dẫn truyền tín hiệu thần kinh hầu như là tất cả các khía cạnh của
sự phát triển não bộ. Để hiểu rõ hơn về các rối loạn ASD, các nhà khoa
học đang tìm kiếm các gen bệnh tự kỷ liên kết điều tiết hoạt động thần
kinh. Một số các gen mã hóa các kênh ion mà kích hoạt chuỗi dẫn


25

truyền tín hiệu của tế bào thần kinh. Các biến thể trong các gen liên
quan đến các kênh ion có thể ảnh hưởng đến sự tồn tại, sự khác biệt, di
cư, phát triển tự nhiên, và sự hình thành khớp thần kinh tế bào thần kinh.
Tế bào thần kinh mã hóa thông tin thông qua các tín hiệu có nguồn gốc
từ các kênh ion. Khi một tế bào thần kinh nhận được tín hiệu từ tế bào
thần kinh khác thông qua các khớp thần kinh, tùy thuộc vào các loại
kênh ion dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh sẽ trở thành tích cực
hay tiêu cực. Các đột biến trong các gen nhạy cảm với ASD có liên qua
đến các kênh ion canxi (Ca2+), natri (Na+), kali (K+) thường tăng cường
kích thích não bộ. Những biến đổi trong các gen liên quan đến kênh ion
có khả năng ảnh hưởng đến vô số các chức năng não bộ (Naisbitt S,
Kim E et al. 1999; Boeckers TM, Bockmann J et al. 2002). Kênh ion
thậm chí có thể cung cấp một liên kết giữa di truyền và môi trường bởi
vì các yếu tố môi trường như thủy ngân là tín hiệu tăng canxi. Vai trò
rộng lớn của các kênh ion có thể giúp giải thích tại sao các bệnh nhân
ASD thường kèm theo biến chứng thần kinh khác như vấn đề giấc ngủ
và bệnh động kinh.
4.2. CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN BỆNH ĐẶC TRƯNG
CỦA ASD
Bộ kit TruSight Autism của hãng Illumina được nghiên cứu và phát
triển để phát hiện các biến thể trên 101 gen đã được chứng minh có liên
quan đến bệnh tự kỷ. Trong khuôn khổ luận án này, danh sách 101 được sử
dụng để sàng lọc các biến thể từ kết quả giải trình toàn bộ vùng mã hóa.
Bảng 4.1. Tổng kết các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở 07 bệnh nhân
TT

Gen

1
2

3
4
5
6
7
8
9
10

CASK
ANKRD11
ATRX
AUTS2
AVPR1A
CACNA1C
CACNA1D
CACNA1E
CACNA1F
CACNA1G

T01
x

T02
x

T03

Bệnh nhân
T06

T07
x
x
x
x
x

T08

T09
x
x
x

x
x
x
x
x

3
2
2
2
1
1
1
1
1
1