Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC
•

•

B ộ Y TÉ

Dược HÀ NỘI

-------if if—

•

•

LÊ THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẩ N
ACID CHLOROGENIC TỪ KIM NGÂN HOA
PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA
CHẤT LƯỢNG THUố C

LUẬN
VĂN THẠC
s ĩ DƯỢC
HỌC
•
•
•
•

Chuyên ngành : Kiểm nghiệm thuốc - độc chất
Mã số
: 60 73 15

Nguòi huóng dẫn khoa học: 1. TS. Đoàn Cao Son
2. TS. Trần Hồng Anh

óH
HÀ NỘI - 2010

bSl


LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn
Cao Son và TS. Trần Hồng Anh, những người thầy đã tận tình, trực tiếp hướng dẫn
tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS. Trần Việt Hùng - Khoa Vật lý đo
lường, ThS. Lục Thị Vân - Khoa Kiểm nghiệm các dạng bào chế, ThS. Nguyễn
Tuấn Anh - Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung
ương, đã nhiệt tình quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng quản lý sau Đại học, các
thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà nội, các bạn đồng nghiệp của khoa Kiêm
nghiệm các dạng bào chế, khoa Kiểm nghiệm Đông dược, khoa Vật lý đo lường Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương, các cán bộ của Trung tâm Dược điên Dược thư Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên, giúp đỡ, san sẻ công việc
và góp ý kiến cho tôi hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên,
khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện luận văn này.

Ds. LÊ THỊ THU HIỀN


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
CÁC KÝ HIỆU,
♦ 7 CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN
•
VĂN
DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN
DANH MỤC
• CÁC HÌNH VẼ,7ĐỒ THỊ• TRONG LUẬN
• VĂN
ĐẶT VẤN ĐÈ................................................................................................

1

CHƯƠNG 1 - TỒNG QUAN......................................................................

3

1.1. Chất chuẩn và sử dụng chất chuẩn.....................................................

3

1.1.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học...........................................................

3

1.1.2. Các thông tin về chuẩn acid chỉorogenic.........................................

3

1.2. Tống quan ve acid chlorogenic và dược liệu Kim ngân hoa.........

3

1.2.1. Tổng quan về acid chỉorogenic..........................................................

3

1.2.2. Tồng quan về dược liệu Kim ngân hoa...........................................

6

1.3. Một số qui trình phân lập và tinh chế acid chlorogenic đã được
nghiên cứu......................................................................................................

8

1.4. Phương pháp phân lập và tinh chế bằng sắc ký cột........................

9

1.4.1. Phương pháp sắc kỷ cột silica gel.....................................................

9

1.4.2. Sắc ký loại trù' theo kích cỡ và ứng dụng trong tỉnh chế acid

chlorogenic.....................................................................................................

12

1.5. Phưong pháp định tính, định luọng và xác định cấu trúc phân
t ủ ............................................................................................................................

15

1.5.1. Định tính và xác định độ tình khiết bằng điểm chảy - M P ...........

15

1.5.2. Định tính bằng phố hồng ngoại - I R ...............................................

16


1.5.3.Định tính, định lượng họp chất đặc trưng trong dược liệu, các
sản phẩm của quá trìnlí chiết xuất, phân lập và tinh chế từ dược liệu
bằng sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC)....................................................

16

1.5.4.

21

Phương pháp xác định cấu trúc plíân tủ'..................................

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ..............................................................

24

2.1. Nguyên liệu.............................................................................................

24

2.2. Phương tiện nghiên cứu.......................................................................

24

2.2.1. Thiết bị, dụng cụ..................................................................................

24

2.2.2. Hoá chất, dung môi............................................................................

25

2.3. Nội dung nghiên cứu.............................................................................. 26
2.4. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................

26

2.4.1. Kiếm nghiệm dược liệu Kim ngân hoa dùng đế nghiên cứu.........

26

2.4.2. Phương pháp chiết xuất acid chỉorogenic từ dược liệu Kim ngân
hoa...................................................................................................................

27

2.4.3. Phăn lập và tinh chế acid chỉorogenic bằng phương pháp sắc kỷ
cột.....................................................................................................................

27

2.4.4. Các phương pháp định tính, định lượng và xác định cấu trúc
acid chỉorogenỉc.............................................................................................

27

CHƯƠNG 3 - THỤC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ...................................... 31
3.1. Kiếm nghiệm dưọc liệu Kim ngân hoa..............................................

31

3.1.1. Định tỉnh dược liệu Kim ngân hoa...................................................

31

3.1.2. Địnlt tính, địnlĩ lượng acid chíorogenic trong dược liệu Kim
ngân hoa..........................................................................................................

33

3.2. Chiết xuất acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa...............

35


3.2.1. Lựa chọn dung môi chiết và phương pháp chiết.............................

35

3.2.2. Tiến hành chiết xuất...........................................................................

35

3.2.3. Định tính acid chỉorogenic trong cao đặc và cắn C1 bằng
phương pháp TLC..........................................................................................

36

3.2.4. Định lượng acid chỉorogenic trong cắn C1......................................

38

3.3.Qui trình phân lập acid chlorogenic bằng sắc ký cột silica
g e l....................................................................................................................

40

3.3.1. Kỹ thuật phân lập.................................................................................

40

3.3.2. Kết quả phân lập acid cỉtỉorogenic bằng sắc kỷ cột silica gel........

41

3.4.

Tinh chế acid chlorogenic bằng sắc ký cột Sephadex...............

45

3.4.1. Kỹ thuật tinh chế..................................................................................

45

3.4.2. Kết quả tinh chế acid chỉorogenic bằng sắc kỷ cột Sephadex
G15...................................................................................................................

46

3.4.3. Kết quả tỉnh chế acid chỉorogenic bằng sắc kỷ cột Sephadex
GIO...................................................................................................................

49

3.5. Định tính, xác định cấu trúc, định lưọìig và xác định tạp chất
liên quan của acid chlorogenic tinh chế được..........................................

53

3.5.1. Đặc điểm hình thái............................................................................. . 53

3.5.2. Đo nhiêí
tính và xác đinh
đô• tinh khiết......
• đô
• nóng
o chảy để đinh
•
•

53

3.5.3. Đinh tỉnh acid chỉorogetiic bằng phương pháp sắc kỷ lớp
mỏng.............................................................................................................

54

3.5.4. Định tính acid chlorogenic bằng phương plĩáp đo pho hồng
ngoại...............................................................................................................

55

3.5.5. Định tính acid chlorogenỉc tinh chế được bằng phương pháp
H P L C .............................................................................................................

56


3.5.6. Xác định cẩu trúc của acid chlorogenỉc tinh chế được..................

58

3.5.7. Định lượng acid chlorogenỉc tinlĩ chế được bằng phương plĩáp
HPLC...............................................................................................................

62

3.5.8. Xác định tạp chất liên quan của acid chỉorogenic tinh chế được..

66

3.6. Thẩm định phưoìig pháp HPLC đã sử dụng đế định lượng acid
chlorogenic tinh chế được............................................................................

68

3.6.1. Xác định tính đặc lĩiệu.......................................................................

69

3.6.2. Khoảng tuyến tính.............................................................................

70

3.6.3. Độ lặp lại..............................................................................................

71

3.6.4. Độ đúng................................................................................................

71

3.6.5. Xác định LOD......................................................................................

73

3.6.6. Xác định LOQ......................................................................................

74

3.7. Xây dựng tiêu chuẩn dự thảo cho chất chuẩn phòng thí nghiệm... 74
3.8. Sử dụng acid chlorogenic tinh chế đưọc làm chất chuẩn PTN để
định tính, định lưọng acid chlorogenic trong mẫu dưọc liệu Kim
ngân hoa.........................................................................................................

77

3.8.1. Định tính acid chlorogenỉc trongdược liệu Kim ngân h o a ............

77

3.8.2. Định lượng acid chỉorogenỉc trong dược liệu Kimngân hoa........

80

3.8.3. Xác định độ ấm dược liệu...................................................................

82

CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN VÈ KÉT QƯẢ..............................................

83

KỂT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................

86

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................

88

PHỤ LỤC


CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
13c NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13
Cacbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

'H NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

'H-'H c o s y

'H -’H Chemical Shift Coưelation Spectroscopy

2D-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Two - Dimensional NMR

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

ESI-MS

Phổ khối lượng phun điện tử
Electron Spray Ionization Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC

Heteronuclear Singular Quantum Coherence

IR

Infrared
Phổ hong ngoại

TLC

Thin layer chromatography
Sac ký lóp mỏng

HPLC

High performance liquid chromatography
Sác ký lỏng hiệu năng cao

HSPL

Hệ số pha loãng

MS

Mass spectrum

PA

Pure analysis

ISO

International organization for standardization

IEC

International electrotechnical commision

c

Chuẩn

I

T

Thử

C+T

Chuẩn + Thử

DĐVN III

Dược điển Việt Nam III

RSD

Relative Standard deviation

SD

Standard deviation

TB

Trung bình

uv

Ultraviolet

VIS

Visible


Bảng 1.1. Hàm lượng acid chlorogenic trong một số loại cây

5

Bảng 1.2. Hàm lượng acid chlorogenic phân bố trong một số bộ phận
của cây Kim ngân.

7

Bảng 1.3. Khả năng tách lọc của một số loại gel Sephadex

13

Bảng 3.4. Kết quả định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Kim
ngân hoa đem nghiên cứu

34

Bảng 3.5. Kết quả chiết xuất các mẻ dược liệu

36

Bảng 3.6. Giá trị Rj và màu sắc các vết sắc ký của cao đặc và căn C1

37

Bảng 3.7. Hàm lượng acid chlorogenic trong can C1 thu được sau giai
đoạn chiết xuất

38

Bảng 3.8. Khối lượng cắn Si thu được sau giai đoạn phân lập cắn C1
qua cột silica gel

42

Bảng 3.9. Hàm lượng acid chlorogenic trong cắn Si thu được sau giai
đoạn phân lập can Cl qua cột silica gel

43

Bảng 3.10. Khối lượng cắn Sel thu được sau khi tinh chế can Si qua
cột Sephadex G I5

48

Bảng 3.11. Ket quả định lượng acid chlorogenic trong cắn Sel thu
được sau giai đoạn tinh chế cắn Si qua cột Sephadex GI 5

49

Bảng 3.12. Khối lượng cắn Se2 thu được sau khi tinh chế can Sel qua
cột Sephadex GIO

51

Bảng 3.13. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của acid chlorogenic tinh
chế được

53


Bảng 3.14. Kêt quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của sản phâm
tinh chế được

60

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát tính thích họp của hệ thống sắc ký khi
định lượng acid chlorogenic tinh chế được

64

Bảng 3.16. Kết quả định lượng acid chlorogenic tinh chế được theo
chuẩn 1

65

Bảng 3.17. Kết quả định lượng acid chlorogenic tinh chế được theo
chuẩn 2

66

Bảng 3.18. Kết quả xác định hàm lượng tạp chất liên quan của acid
chlorogenic tinh chế được

68

Bảng 3.19. Kết quả xác định khoảng tuyến tính

70

Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ lặp lại

71

Bảng 3.21. Kết quả xác định độ đúng

72

Bảng 3.22. Kết quả xác định LOD cho phép định lượng

73

Bảng 3.23. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của dịch chiết dược
liệu Kim ngân hoa

78

Bảng 3.24. Kết quả định lượng acid chlorogenic trong mẫu dược liệu
Kim ngân hoa

82


Hình 1.1. Câu trúc hoá học của acid chlorogenic

4

Hình 1.2. Cây Kim ngân

6

Hình 1.3. Cấu tạo phân tử Sephadex

13

Hình 2.4. Dược liệu Kim ngân hoa (Flos Lonicerae japonicae)

24

Hình 3.5. Đặc điểm bột dược liệu Kim ngân hoa

32

Hình 3.6. Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn acid chlorogenic vàdịch
chiết dược liệu Kim ngân hoa

34

Hình 3.7.Sắc ký đồ của các dung dịch chuấn, cao đặc và cắn Cl.

38

Hình 3.8. Sơ đồ chiết xuất acid chlorogenic từ Kim ngân hoa

39

Hình 3.9. SKĐ định tính acid chlorogenic trong giai đoạn phân lập
cắn Cl qua cột silica gel

41

Hình 3.10. Sơ đồ quy trình phân lập acid chlorogenic

44

Hình 3.1 la, 3.1 lb. SKĐ định tính acid chlorogenic trong giai đoạn
tinh chế cắn Si qua cột Sephadex G I5.

47

Hình 3.12a, 3.12b. SKĐ định tính acid chlorogenic trong giai đoạn
tinh chế cắn Sel qua cột Sephadex GIO.

50

Hình 3.13. Sơ đồ quy trình tinh chế acid chlorogenic

52

Hình 3.14. Sắc ký đồ định tính acid chlorogenic tinh chế được.

54

Hình 3.15. Phổ hồng ngoại của acid chlorogenic tinh chê được

55

Hình 3.16. Phổ hồnơ ngoại của acid chlorogenic chuấn

55

Hình 3.17. Sắc ký đồ dunơ dịch chuẩn và thử khi định lưọng acid
chlorogenic tinh chế được
Hình 3.18. Kết quả chồng phổ UV-VIS của acid chlorogenic trong

56


mẫu chuân và mâu thử khi định lượng acid chlorogenic tinh chê

57

được.
Hình 3.19. Kết quả xác định độ tinh khiết của pic acid chlorogenic

58

khi định lượng acid chlorogenic tinh chế được
Hình 3.20. cấu trúc hoá học (A) và các tương tác COSY, HMBC

62

chính của sản phâm đem đo
Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu trắng - xác định tạp chất liên quan của

67

acid chlorogenic tinh chế được
Hình 3.22. sắc ký đồ mẫu thử - xác định tạp chất liên quan của acid

67

chlorogenic tinh chế được

69

Hình 3.23. sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu chuấn - Khảo sát độ đặc hiệu

69

Hình 3.24. sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu thử - Khảo sát độ đặc hiệu
Hình 3.25. Đồ thị biếu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng

70

độ acid chlorogenic
Hình 3.26: Giới hạn phát hiện của phương pháp định lượng acid

73

chlorogenic
Hình 3.27. sắc ký đồ của dung dịch chuẩn acid chlorogenic và dịch

79

chiết dược liệu Kim ngân hoa
Hình 3.28. sắc ký đồ mẫu chuan và mẫu thử-định lượng acid
chlorogenic trong mẫu dược liệu Kim ngân hoa

80


ĐẶT VẤN ĐỀ

Chữa bệnh bằng thuốc y học cổ truyền là một phương pháp có từ lâu đời ở
nước ta và cho đến nay nó vẫn giữ một vai trò quan trọng trong nên y học nước
nhà. Những năm gần đây, các nước trên thế giới có khuynh hướng đây mạnh
việc sử dụng thuốc đông y kết hợp với thuốc tây y trong điều trị một sô bệnh
mãn tính. Ở Việt nam, thị trường thuốc đông dược và dược liệu làm thuốc trở
nên rất đa dạng về chủng loại và phong phú về nguồn gốc. Công tác kiêm tra
chất lượng thuốc đặc biệt là thuốc đông dược và dược liệu làm thuốc là một
nhiệm vụ cấp thiết và quan trọng góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Tuy
nhiên, công việc kiếm nghiệm thuốc và dược liệu gặp nhiều khó khăn do thiếu
chât chuân.
Với mong muốn cung cấp thêm chất chuấn phục vụ kiếm nghiệm dược
liệu, đề tài cấp nhà nước KC.10.16/06-10 đã thực hiện mục tiêu chiết 10 hợp
chất đặc trưng từ dược liệu làm chất chuấn phục vụ kiếm nghiệm dược liệu.
Acid chlorogenic là một trong số các chất chuấn hiện tại trong nước chưa
thiết lập được, phải mua của nước ngoài, giá cả đắt và không chủ động. Chúng
tôi đã tiến hành nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic,
một hoạt chất có trong vị dược liệu dễ tìm ở Việt Nam là Kim ngân hoa.
Trong phạm vi của đề tài này, mục đích chúng tôi đặt ra là sản xuất được
acid chlorogenic có độ tinh khiết cao từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên sẵn có đế
làm chất chuấn dùng trong kiêm nghiệm thuốc và dược liệu dùng làm thuốc.

Muc tiêu nghiên cửu của đẻ tài
- Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic từ
dược liệu Kim ngân hoa đạt độ tinh khiết > 95,0%.
- Điều chế được acid chlorogenic đạt tiêu chuấn làm chất đối chiếu trong
kiếm nghiệm thuốc và dược liệu.


Nôi dung nghiên cửu cu thế của đề tải:
• Nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic từ
dược liệu Kim ngân hoa.
• Định tính, định lượng, xác định cấu trúc acid chlorogenic tinh chế được
• Thẩm định phương pháp HPLC sử dụng để định lượng acid chlorogenic
tinh chế được.
• Sử dụng acid chlorogenic đã tinh chế được làm chất chuân phòng thí
nghiệm để định tính, định lượng acid chlorogenic trong vị dược liệu Kim
ngân hoa.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Chất chuẩn và sử dụng chất chuẩn
1.1.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học
Theo WHO, chất chuẩn đối chiếu hóa học (chemical reference Standard,
viết tắt CRS) là bất kỳ nguyên liệu đã được xác định tính chất (định tính) và độ
tinh khiết/hoạt lực. Một chuẩn đổi chiếu chính thức phải có mặt trong danh mục
chính thức của dược đien Châu Âu (EP), hay dược điên Mỹ (USP) hoặc danh
mục của Tổ chức y tế thế giới (WHO). Có thế thiết lập một chuấn đối chiếu cơ
sở thông qua so sánh tính chất và độ tinh khiết/ hoạt lực với một chuan đối chiếu
chính thức hoặc xác định độ tinh khiết tuyệt đối bằng các kỹ thuật khác. Việc
chấp nhận mức độ tinh khiết cao hơn hay thấp hơn đối với một chuấn đối chiếu
tùy theo mục đích sử dụng (dùng đê định tính, dùng đê định lượng) và bản chât

phương pháp định lượng [15].
1.1.2. Các thông tin về chuấn acid chlorogenic
Cho tới nay, chưa có nơi nào ở Việt Nam sản xuất acid chlorogenic đế
làm chất chuẩn. Mặt khác, việc tìm mua chất chuẩn acid chlorogenic từ các hãng
nước ngoài khó khăn và không chủ động. Do đó có nhu cầu cao về chất chuấn
acid chlorogenic được sản xuất trong nước.
1.2. Tống quan về acid chlorogenic và dược liệu Kim ngân hoa
1.2.1. Tổng quan về acid chỉorogenic
Công thức phân tử : Ci6Hl80 9
Trọng lượng phân tử: 354,31
Tên khoa học theo hệ thống IƯPAC: 3/?-[[3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-OXO-2propenyl]oxy]-l£,4/?,5/?-trihydroxy-cyclohexanecarboxylic acid.
Tên khác: 3-0-Caffeoylquinic acid.
Acid chlorogenic là một hợp chat phenolic tự nhiên, được phân lập từ lá, hoa và
quả của một số loại cây hai lá mầm (như hoa Kim ngân, hạt Cà phê, lá Việt


quất,...)- về mặt cấu trúc nó là một ester của acid cafeic với nhóm 3-hydroxyl
của acid quinic [13], [16], [30].

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của acid chỉorogenic
Acid chlorogenic có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, tan được trong nước
và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd,
dimethylformamid,... Khả năng hòa tan của nó trong các dung môi trên là
khoảng 25 mg/ml.
Nhiệt độ nóng chảy: 209 - 210°c [16].
Acid chlorogenic là một chất khá bền vững, điều kiện bảo quản tốt nhất là ở 4°c
[16].
Hoạt chất này lâu nay được biết đến như là một chất có tác dụng chống oxy hoá,
chổng viêm, ức chế sự phát triến của khối u ; chổng sự đột biến gen của tế bào;
tiêu diệt chất gây ung thư, làm chậm quá trình giải phóng glucose vào tuần hoàn

sau bữa ăn; có tác dụng chống virus, kháng khuân và chống nấm đi kèm độc tính
ở mức độ thấp [3], [26]. Acid chlorogenic được ứng dụng dùng trong dược
phẩm (ngăn bệnh đái tháo đường typ 2, bệnh tim mạch. .

được thương mại hoá

dưới tên Sveltol (tại Anh và Na uy). Là một thành phần thêm vào thực phấm
(như cà phê, kẹo cao su) đê thúc đây quá trình giảm cân và dùng trong mỹ phâm
đê làm đẹp [17], [26], ơ 'Trung Quốc, sản phâm dược phâm có chứa acid
chlorogenic ở mức độ tinh khiết khác nhau từ 20 - 98% và được sử dụng rộng
rãi như là một sản phấm bảo vệ sức khoẻ [26].
Acid chlorogenic đã được nhiều Dược đien sử dụng làm chất đối chiếu hoá học
để định tính và định lượng đảm bảo chất lượng các dược liệu có chứa hoạt chất


này. Ví dụ: trong Dược điển Anh 2009 có 20 chuyên luận, Dược điển Mỹ 31 có
14 chuyên luận, Dược điển Trung Quốc 2005 có 18 chuyên luận sử dụng acid
chlorogenic làm chất đối chiếu hoá học.
Tài liệu [18] đã đưa ra kết quả khảo sát hàm lượng acid chlorogenic trong một
số loại cây trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Hàm lượng acid chlorogenic trong một sổ loại cây
Cây

Acid chlorogenic
(% theo nguyên liệu khô)

Lá việt quất

3,8

Lá cây bách xù

2,4

Lá thuốc lá Virgina

1,4

Lá cây táo gai

0,6

Hoa kim ngân

6,0

Quả kim ngân

5,0

Táo xanh

0,5

Trong số các loại cây này, hoa Kim ngân là nguồn nguyên liệu dễ tìm ở
Việt Nam, có thể được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu chiết xuất acid
chlorogenic. Do đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thêm những tài liệu có
liên quan tới cây Kim ngân hoa.

1.2.2. Tổng quan về dược liệu Kim ngân hoa
Cây Kim ngân
{Lonicera japonica Thunb.)
Kim ngân hoa
(Flos Lonicerae japonicae)
Họ cơm cháy (Caprifoliaceae)

Hình 1.2. Cây Kim ngân

Cây Kim ngân có nguồn gốc Đông Á, phân bố ở Trung Quốc, Nhật Bản,
Triều Tiên và Việt Nam. Ớ Việt Nam, Kim ngân phân bố chủ yếu ở các tỉnh
vùng núi và trung du phía bắc, nơi có khí hậu mát, đất trồng thoát nước tốt như
ở Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Tây... Kim ngân thích nghi
với nhiêu điều kiện khí hậu và đât đai khác nhau, có thê trồng được ở cả miên
núi, trung du và đồng bằng. Ớ nơi mát mẻ, cây sinh trưởng nhanh, còn ở những
vùng nóng cây phát triên chậm. Gân đây, cây được trông ở một sô gia đình, vừa
làm cảnh vừa lấy hoa làm thuốc [3],
Cây Kim ngân, đặc biệt là hoa Kim ngân là một dược liệu được dùng
làm thuôc từ bao đời nay ở Trung Quôc và Việt Nam [26], Bộ phận dùng của
cây Kim ngân là hoa sắp nở (lẫn một sổ hoa đã nở), thân và cành đã phơi khô.
Mùa hoa nở là tháng 3 đến tháng 5. Thu hái hoa khi hoa sap nở vào mùa hè rồi
sây khô. Hoa mẫu 5 mọc thành xim 2 hoa ở kẽ lá. Hoa thơm khi mới nơ có màu
trăng, vê sau chuyên thành màu vàng. Vì trên cây cùng có cả hoa trăng và hoa
vàng nên mới gọi là Kim ngân. Tràng hoa cánh hợp dài 2 - 3 cm chia làm 2 môi
dài không đều nhau, một môi rộng lại chia thành 4 thuỳ nhỏ. Năm nhị đính ở
họng tràng, mọc thò ra ngoài.


Tác dụng dược lý của Kim ngân hoa:
- Tác dụng kháng khuân

- Tác dụng trên chuyến hoá chất béo
- Tác dụng trên đường huyết
- Tác dụng chống choáng phản vệ
Kim ngân hoa có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát trùng. Nó được sử
dụng trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, mày đay,
viêm mũi dị ứng, hạ sốt, chữa cảm cúm, chữa sởi, chữa viêm phối, làm dễ tiêu,
trị lỵ, hoa phơi khô dùng lợi tiếu. Nước sắc hoa Kim ngân còn có tác dụng cải
thiện chuyển hóa chất béo trong bệnh nhân tăng lipid máu, sau khiuống thuốc,
các esters trong huyết thanh giảm. Nước cất nụ hoa Kim ngân (Kim ngân hoa
lệ) được dùng tiêm đe điều trị bệnh nhiễm khuấn [3], [7].
Thành phần hóa học gồm : các flavonoids, tinh dầu, các saponins và đặc
biệt có chứa một hàm lượng acid chlorogenic đáng chú ý được phân bố trong
các bộ phận của cây như bảng 1.2 [3]. Theo các nghiên cứu từ trước và những
nghiên cứu mới nhất gần đây, acid chlorogenic là một hợp chất chính giàu hoạt
tính sinh học có trong hoa Kim ngân [26].
Bảng 1.2. Hàm lượng acid chỉorogenic phân bố trong một số bộ phận
của cây Kim ngân.
Bộ phận

Rễ

Thân

Lá

Hoa

(%) a.chlorogenic

1,4

0,9

2,6

6,0

Có thể thấy rằng trong hoa có chứa acid chlorogenic cao hơn so với các bộ phận
khác trong cây Kim ngân. Vì vậy chúng tôi chọn hoa làm nguyên liệu cho việc
nghiên cứu qui trình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic.


Các thử nghiệm chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu
Kim ngân hoa được mô tả trong phần thực nghiệm và kết quả.
1.3. Một số qui trình phân lập và tinh chế acid chlorogenic đã được nghiên
cứu
Bởi tác dụng đáng chú ý của acid chlorogenic và nhu cầu sử dụng hoạt
chất này ngày càng cao, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã được thực hiện nhăm
tìm ra phương pháp tối ưu nhất đe phân lập và tinh chế acid chlorogenic. Một số
quy trình phân lập và tinh chế acid chlorogenic đã được công bố như dưới đây.
Theo K. Gorter, Liebig Ann (1908), K. Freudenberg (1920), cũng như w .
Pluml và w. Keiholz, đã mô tả các qui trình sản xuất acid chlorogenic, bước đầu
tiên trong tất cả các qui trình trên, acid chlorogenic trong dịch chiết cây lại được
tách ra bằng cách tạo phức kali-caffein-chlorogenat, rồi được tinh chế bằng
nhiều phương pháp, ví dụ như kết tinh lại trong ethanol/ nước hoặc kết tủa bàng
chì acetat. Tách cafein ra khỏi phức đã được tinh chế bằng cách chiết dung dịch
trong nước với chloroform. Acid chlorogenic được tủa lại bằng cách thêm acid
sulphuric, và tinh chế bằng cách kết tinh lại trong nước [18].

u.

Fiedler (1954) đã mô tả một qui trình kết hợp giữa phương pháp của K.

Freudenberg và phương pháp của w . Pluml và w . Keiholz. Dịch chiết dược liệu
có chứa acid chlorogenic được cô đặc lại và kết tủa bằng bari acetat. Sau đó dịch
lọc được trung hoà bang acid sulphuric, bari thừa sẽ được loại bỏ ở giai đoạn
này. Acid chlorogenic được tách ra từ dịch lọc trung tính bằng phương pháp tạo
phức với chì acetat, rửa phức bằng nước nóng và thêm hydrogen sulphid, đế tủ
lạnh 2-3 ns,ày, phức kali-caffein-chloroRenat được tách ra. Caffein được loại ra
khỏi phức bang chloroform, và acid chlorogenic thu được băng cách acid hoá
nhẹ [18].
Một qui trình khác (1970) đã tách acid chlorogenic bằng cột acid silicic
với dung môi rửa giải chloroform - butanol theo tỷ lệ gradient [18].


Năm 1978, Dower 44, Amberlite IRA 410 hoặc Amberlite IRA 47 được
sử dụng để tách acid chlorogenic ra từ dịch chiết nước hạt cà phê xanh [18],
[19].
Theo tài liệu [28], acid chlorogenic trong dịch chiết cây có thể được hấp
phụ bởi HPD-850 resin, sau đó phản hấp phụ bang ethanol 95%, nhưng chỉ tiến
hành ở qui mô nhỏ.
Rõ ràng là những qui trình đã biết thực hiện rất khó khăn, dẫn đến giá
thành của sản phẩm acid chlorogenic thương mại hóa bị đây lên rất cao.
Vì vậy mục tiêu đặt ra cho các nhà sản xuất là nghiên cứu và phát trien
một qui trình sản xuất đơn giản, ít giai đoạn và ít tốn kém đế phân lập và sản
xuất acid chlorogenic dạng tự do hoặc muối, có chất lượng đạt yêu cầu, không
lẫn tạp chất có độc tính hóa học không mong muốn, từ nguyên liệu rẻ tiền và dễ
kiểm.
Tài liệu [18] đã đưa ra một qui trình tinh chế và sản xuất acid chlorogenic
hiệu quả, trong đó acid chlorogenic tự do hoặc dạng muối được tách ra từ dịch

chiết nước của các cây phù hợp bằng sắc ký lọc qua gel bởi một rây phân tử có
các lỗ xốp được tạo thành nhờ sự biến đôi của polysaccharide cụ thê là dextran.
Loại gel này được thương mại hóa dưới tên Sephadex [18].
1.4. Phương pháp phân lập và tinh chế bằng sắc ký cột[13]
Hiện nay phương pháp phân lập một chất từ nhóm chất hoặc từ hỗn hợp, sắc ký
cột là phổ biến nhất. Có thể dùng một số kiểu sắc ký cột với một sổ cơ chế như:
sắc ký pha thuận trên silica gel, pha đảo trên chât nhôi Cg, Cig... hoặc săc ký rây
phân tử (Size exclusion chromatoiiraphv, SEC) trên Sephadex.
1.4.1. Phương pháp sắc kỷ cột silica gel
Nguyên tắc:
Một mẫu thử được nạp lên trên đầu cột chứa chất hấp phụ. Cột chứa chất hấp
phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh. Khi dung môi pha động di chuyên dọc theo
cột sẽ rửa giải các thành phần của mẫu thử ra khỏi cột theo thứ tự độ phân cực


tăng dần. Các chất có độ phân cực thấp hơn được dung môi pha động rửa giải ra
trước, tiếp theo các chất có độ phân cực tăng dần được rửa giải ra. Kiêm soát
hoạt chất rửa giải ra bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích
họp.
Xác định các thông sổ của cột
Tùy theo mục đích phải tách sạch hay chỉ phân loại thành nhóm mà chọn các
thông số cột khác nhau. Với cột đầu chủ yếu đê phân tách thành các nhóm, tỷ lệ
giữa khối lượng silica gel và chất cần tách

( m Sj| jca g C| / m t h ã t )

chỉ cần từ 8-10 là đủ.

Quan trọng là với lượng silica-gel cho trước, phải chọn được cột có kích thước
thích họp, nếu chọn cột dài thì dù đủ khả năng tách tốt nhưng thời gian tách lại

ỉâu. Thực tế một cột có kích thước h/d (chiều dài/đường kính) từ 10-15 là phù
hợp.
Nhôi cột
Có hai cách nhồi cột: Nhồi ướt và nhồi khô
Nhồi ưót: Cân silica-gel cho vào một cốc miệng rộng có dung tích thích họp, đố
dung môi vào, khuấy đều tay để đuổi hết bọt khí và làm silica-gel phân tán đều
trong dung môi. Giai đoạn này ảnh hưởng lớn đến khả năng tách của cột sau này
vì nếu có bọt khí hoặc silica-gel bị vón cục thì sự phân tách sẽ kém nhiêu. Cột
được kẹp vào giá ở vị trí thăng đứng, đáy cột được lót một lớp bông xôp. Đô từ
từ silica gel đã được trộn đều với dung môi vào cột. Chú ý bố sung dung môi
vào cốc nếu thấy silica-gel khô, khó chảy, khi bố sung phải khuấy đều liên tục.
Sau khi silica-gel đã được đưa vào cột, phải đảm bảo cột luôn được ngâm trong
dung môi vì nêu đê khô hay nứt cột thì khả năng tách sẽ kém nhiêu.
Nhồi khô: Cân silica-gel vào một côc có dung tích thích họp, đô từ từ silicagel,
sau khi đã đô hết silica-gel vào cột thì tiến hành rót dung môi vài lân qua cột đê
nén chặt silica-gel, đảm bảo độ đồng đều, tránh hiện tượng vón cục hay tạo
thành bọt khí.
Đưa chất lên cột sắc kỷ


Thông thường người ta hòa tan một lượng chất thô đem chạy cột trong một
lượng tối thiểu dung môi pha động/rửa giải, rồi đưa lên cột bằng pipet pasteur.
Bơm nhẹ nhàng dung dịch này vòng quanh đường kính cột thủy tinh, sao cho
dung dịch chảy xuống thấm đều vào pha tĩnh mà không tạo bọt khí và làm xáo
trộn bề mặt tiếp xúc giữa pha tĩnh với dung môi pha động. Có thê rắc một lóp
cát sạch dày 1-2 cm lên bề mặt phía trên pha tĩnh để bảo vệ bề mặt pha tĩnh khi
rót dung môi pha động lên cột.
Trong trường họp chất thô đem chạy cột rất ít tan trong dung môi rửa giải,
phương pháp dùng silica gel hấp phụ chất trước khi đưa lên cột được áp dụng.
Chất thô được hòa tan trong một lượng dung môi pha động vừa đủ đến tan hoàn

toàn. Thêm một lượng silica gel khoảng gấp ba lần lượng cân chất thô vào dung
dịch trên, trộn đều rồi làm bay hơi dung môi bằng cất quay trong chân không tới
khô thu được bột silica gel khô tơi đã hấp phụ chất thô sẵn sàng đe đưa lên cột
sac ký.
Trong cả hai trường hợp, trước khi đưa chất thô dạng dung dịch hay dạng được
hấp phụ vào silica gel cần duy trì mức dung môi trên cột chỉ vừa đủ đế không
pha loãng thêm dung dịch chất thô (trường hợp 1) và ngấm hết lượng silica gel
hấp phụ chất thô đưa lên cột (trường hợp 2).
Chạy cột
Lựa chọn và thay đối dung môi chạy cột hợp lý đe đảm bảo các chất phân tách
tốt mà thời gian chạy qua cột không quá dài. Đe tách các chất hữu cơ bằng
silica-gel, dung môi bắt đầu chạy thường kém phân cực, sau đó thường nâng dần
độ phân cực của dung môi cho phù họp vói từns, phân đoạn hỗn hợp, bởi vì mỗi
hỗn họp khi đem chạy cột sẽ bị tách thành các phân đoạn khác nhau đôi với từng
chất, những chất di chuyến nhanh hơn là những chất bị hấp phụ kém hơn và ứng
với những dung môi ít phân cực.
Neu chỉ dùng một dung môi trong suốt quá trình chạy sắc ký, khoảng cách giữa
các phân đoạn đầu và cuối càng xa, tuy có the tách sạch nhưng mất nhiều thời


gian do phải chờ giữa hai giai đoạn, hơn nữa những phân đoạn cùng bị hấp phụ
mạnh sẽ không di chuyển được hoặc di chuyến chậm. Vì vậy, với mỗi đoạn ta
tăng dần độ phân cực của dung môi nghĩa là giảm dần độ hấp phụ của silica-gel,
các phân đoạn sẽ di chuyển liên tục vẫn đảm bảo phân tách tốt.
1.4.2.

Sắc ký loại trù' theo kích cỡ và ứng dụng trong tinh cìĩế acid

chỉorogenic
Sắc ký loại trừ theo kích cỡ (size exclusion chromatography - SEC) còn

được biết đến với tên là sắc ký rây phân tử (molecular sieve chromatography).
Có 2 loại SEC là sắc ký thẩm thấu qua gel (gel permeation chromatography) và
sắc ký lọc qua gel (gel filtration chromatography). SEC dựa trên sự khác nhau
về kích cỡ của các tiểu phân đế tách riêng chúng ra bằng cách sử dụng các chất
có kích thước lỗ xốp xác định làm pha cố định. Quá trình tách các chất dựa vào
kích thước phân tử, có thê phân thành các nhóm:
- Phân tử có kích thước lớn hơn kích thước cực đại của lỗ xốp trong pha
tĩnh, sẽ chỉ nằm ở khe hạt, không xâm nhập vào các lỗ xốp được và nhanh chóng
theo pha động thoát ra ngoài trước.
- Các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước lồ xốp có thể xâm nhập
vào các lỗ xốp của hạt, bị lưu giữ tạm thời trong các lỗ xốp này, sau đó mới di
chuyển dần dần theo pha động và thoát ra sau.
Quá trình bị “bẫy vào xoang - bị lun giữ - thoát ra khỏi xoang” này xảy ra
liên tục suốt chiều dài của cột, kết quả là các cấu tử nhỏ thoát ra khỏi cột chậm
hơn các cấu tử lớn. Đoạn đường di chuyến, thời gian lưu của các cấu tử lớn và
bé sẽ càng khác biệt nêu chiêu dài cột càng, lớn [2],
Sắc ký gel bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1950 nhung gân 10 năm sau
chất lọc gel làm pha cố định mới ra đời với tên Sephadex. Đây là pha rắn dùng
để lọc các họp chất có trọng lượng phân tử lớn tan trong nước, cấ u trúc hoá học
của Sephadex gồm các chuỗi dextran liên kết với nhau bang glycerin (hình 1.3).


chuỗi
dextran

o - CH

CH, - CH - CH2
I
I

OH
OH
Hình 1.3. Cấu tạo phân tử Sepỉtadex
Có nhiều loại gel với các cỡ lỗ xốp khác nhau, dùng đe tách các phân tử thuộc
các dải cỡ khác nhau, ví dụ như ở bảng 1.3 [2].
Bảng 1.3. Khả năng tách lọc của môt số loai geỉ Sepltadex
STT

Gel Sephadex

Tách các phân tử cỡ

1

GIO

PTL tới 700

2

GI 5

PTLtó-i 1500

3

G25

PTL 1 0 0 -5 0 0 0

4

G50

PTL 5 0 0 - 10000

5

G200

PTL 5000 - 800000