Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn linarin từ cúc hoa vàng ( flos chrysanthemi indici)

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ N
•

•

•

VŨ THỊ NGUYỆT MINH

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN LINARIN
TỪ CÚC HOA VÀNG (FLOS CHRYSANTHEMIINDICI)
LUẬN VĂN THẠC SỸ Dược HỌC
•

•

•

•

CHUYÊN NGHÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC & Độc CHẤT
MÃ SỐ

: 607315

Ngưòi hướng dẫn khoa học: TS. Trần Việt Hùng

HÀ NÔI 2010

M

è í e ả m

ổ n

Với lòna kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần
Việt Hùng, người anh trong công việc, người thầy tận tụy đã trực tiếp hướng dẫn,
chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Đốc Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung
Ương, Ban giám hiệu, Phòng quản lý sau đại học và các thầy cô giáo trường Đại
học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học
tập cũng như thực hiện đề tài.
Đặc biệt, tôi cảm ơn các bạn đồng nghiệp Khoa Vật lý đo lường đã giúp đỡ,
san sẻ công việc và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên,
khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập cũns như thực hiện luận văn này.
Luận văn được hoàn thành nhờ sự tài trợ kinh phí của Đề tài cấp Nhà nước
KC.10.16/06-10. Xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Trịnh Văn Lẩu, chủ nhiệm đề tài!
Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2010
DS. Vũ Thị Nguyệt Minh


1.6.1.5. Hồ sơ chất đối chiếu..........................................................................................
1.6.2. Hoạt động thiết lập chất chuẩn tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương...
CHƯƠNG 2. ĐOI TƯỢNG VÀ PHƯỚNG PHÁP NGHIEN c ứ u ........................
2.1. ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u ...............................................................................
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN c ứ u ..........................................................................
2.2.1. Hóa chất- thuốc thử.............................................................................................
2.2.2. Thiết bị- dụng cụ..................................................................................................

2.3. PHƯƠNG PHAP NGHIÊN c ứ u .........................................................................
2.3.1. Định tính nhóm chất và đối tượng nghiên cứu trong dược liệu, sản phẩm
chiết xuất, phân lập và tinh chế..........................................................................
2.3.1.1. Định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học.................................................
2.3.1.2. Định tính linarin bằng sắc kỷ lớp mỏng (TLC)..............................................
2.3.1.3. Định tính bằng sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC).......................................
2.3.1.4. Định tính bằng sắc kỷ khối phổ (LC MS)........................................................
2.3.1.5. Định lượng nhóm chất và đổi tượng nghiên cứu trong dược liệu, sản phẩm
chiết xuất, phân lập và tỉnh chế.........................................................................
2.3.2. Chiết xuất, phân lập và tinh chế.......................................................................
2.3.2.1. Chiết xuẩtflavonoid..........................................................................................
2.5.2.2. Phần lập.............................................................................................................
2.3.2.3. Tinh chế.............................................. ..............................................................
2.3.3. Xây
dưng
bô
dữ liêu
nhân
dang
chất...............................................................
w
•
o
•
•
•
• o
2.3.4. Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn...............
2.3.4.1. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và các chỉ tiêu chất lượng..........................
2.3.4.2. Ouy trình thiết lập và phân tích đánh giả chất chuẩn....................................

2.3.4.3. Đánh giá chất lượng chuẩn thông qua liên phòng thí nghiệm............. .........
2.3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................
CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u ....................................................................
3.1. KIỀM TRA CHÁT LƯỢNG DƯỢC LIỆU THEO DĐVNIV..........................
3.2. ĐỊNH TÍNH NHÓM CHÁT VÀ ĐÓI TỨỢNG NGHIÊN c ứ u .......................
3.2.1. Định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học....................................................
3.2.2. Định tính linarin bàng phương pháp sắc ký lóp mỏng (TLC).......................
3.2.3. Định tính và định lượng ỉinarin trong dược liệu bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)............................................................................
3.3. XAY DựNG QUY TRÌNH CHIÉT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHÉ.....
3.3.1. Xây dựng quy trình chiết xuất...........................................................................
3.3.1.1. Khảo sát xây dựng quy trình chiết xuất...........................................................
3.3.1.2. Đánh giá độ ổn định của quy trình chiết xuất................................................
3.3.1.3. Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ Cúc hoa vàng...........................
3.3.2. Xây dựng quy trình phân lập...........................................................................

27
27
30
30
30
30
30
32
32
32
32
32
32
33

34
34
34
34
34
35
35
37
38
38
40
40
41
41
42
43
45
45
45
47
48
50


ì

3.3.2.1. Nghiên cứu lựa chọn hệ dung môi pha động.................................................. 50
3.3.2.2. Ouv trình phân lập............................................................................................ 51
3.3.2.3. Đánh giá độ ổn định của quy trình phân lập.................................................. 54
3.3.3. Xây dựng quy trình tinh chế................................ ............................................. 55

33.3.1. Khảo sát xây dựng quy trình tinh chế linarin................................................ 55
3.3.3.2. Ouy trình tinh chế........ .............................. ....................................................... 56
3.3.3.3. Khảo sát độ ổn định của quy trình tình chế.................................................... 58
3.4. B ộ D ử LIỆU NHẬN DẠNG LINARIN............................................................... 58
3.4.1. Đặc điểm hình thái.............................................................................. ............... 58
3.4.2. Đo điểm chảy........................................................................................................ 58
3.4.3. Đo phổ (UV- VIS)................................................................................................ 59
3.4.4. Đo phổ hồng ngoại (IR)....................................................................................... 59
3.4.5. Đo phổ khối lượng (MS)...................................................................................... 60
3.4.6. Đo phổ cộng hưỏng từ hạt nhân (NMR)............................................................ 61
3.5. THIỂT LẬP CHÁT CHUẨN........................................ ....................................... 62
3.5.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích............................................. 62
3.5.1.1. Xây dựng phương pháp phân tích.................................................................... 62
3.5.1.2. Thẩm định phương pháp phân tích.................................................................. 64
3.5.2. Tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất chuẩn................................................... 68
3.5.3. Áp dụng tiêu chuẩn chất hrọng và phưottg pháp phân tích đã được thẩm
đinh
để xác đinh
chất lương
liêu
làm chất chuẩn................................. 68
•
•
•
o nguyên
o
•
3.5.3.1. Định tính........................................................................................................... 68
3.5.3.2. Điểm chảy.......................................................................................................... 68
3.5.3.3. Tạp chất liên quan............................................................................................. 69

3.5.3.4. Định lượng.................................................................................................... ......... 70
3.5.4. Đóng gói và đánh giá đồng nhất l ô .................................................................. 72
3.5.5. Đánh giá chất lượng chuẩn thông qua liên phòng thử nghiệm (PTN) và
xác định giá trị ấn định......................................................................................... 72
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................................ 75
4.1. Tính mới và hiệu quả kinh tế................................................................................. 75
4.2. Nghiên cửu chiết xuất, phân lập và tinh chế linarin từ Cúc hoa vàng............. 75
4.3. Xây dựng bộ dữ liệu phân tích, nhận dạng chất................................................. 76
4.4. Thiết lập linarin làm chất chuẩn quốc gia............................................................ 76
KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ............. ......................................................................... 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


ANOVA

:

CĐC
COA

:
:

COSY

:

CRS

:

DĐVN
DEPT

:
:

EI

:

ESI

:

FAB

:

FT-IR

:

GPC

:

HMBC

:

HPLC

:

HSQC

:

IR
KH&CN
LOD

:
:
:
:

LOQ

:

MS

:

NICPBP

:

Analysis o f variance
Phân tích phương sai
Chất đổi chiểu (ĐC: đổi chiếu)
Certificate o f analysis
Phiếu kiểm nghiệm
Chemical Shift Correlation spectrometry
Liên hệ dịch chuyển hóa học
Chemical refeưence Standard
Chất chuẩn đổi chiểu hỏa học
Dược điển Việt Nam
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
Chuyển đổi phân cực biến dạng (phổ)
Electron Impact
Va chạm điện tử
Electro Spray Ionisation
lon hóa bang phun điện tử
Fast atom bombardment
Bắn phá nguyên thử nhanh
Fourier Transform Infrared Spectrophotometry
Hồng ngoại biến đổi Fourier
Gel Permeation Chromatography
Sắc ký thấm qua gel (đồng nghĩa với SEC)
Heteronuclear Multiple Bond Coherence
Liên hệ đa liên kết dị nhân
High Performance Liquid Chromatogarphy,
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Heteronuclear Singular Quantum Coherence
Liên hệ đơn lượng tử dị nhân
Infra-red

Hồng ngoại
Khoa học và công nghệ
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
Limit of quantitation
Giới hạn định lượng
Mass Spectrometry
Phổ khối lượng, gọi tắt là phổ khối
National Institute for Control of Pharmaceuticals and


NMR
PTN
SEC
SKĐ
SKLM
SPPL
S/N
TB
TLC
USP
UV-VIS
Viện KNT.T.Ư
WHO

Biological Products
Viện Kiểm nghiệm Dược phẩm và Sinh phẩm Trung Quốc
Nuclear Magnetic Resonance
Cộng hưởns từ hạt nhân
Phòng thí nghiệm

Size eclusion chromatography
Sắc ký rây (sàng lọc) phân tử (đồng nghĩa với GPC)
Sắc ký đồ
Sắc ký lớp mỏng
Sản phẩm phân lập
Signal to noise ration
Tỷ số đáp ứng (tín hiệu) chia cho nhiễu
Trung bình
Sắc ký lóp mỏng
The United States Pharmacopoeia
Dược điển Mỹ
Ultraviolet - Visible
Tử ngoại - khả kiếm
Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương
World Health Organization


Trang
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số hãns cung cấp chất chuẩn linarin......................................................
Bảng 2.1. Tóm tắt các chỉ tiêu và phương pháp thử của chất chuẩn..............................
Bảng 2.2. Quy tẩc làm ừòn sổ.........................................................................................
Bảng 3.1. Kết quả định tính flavonoid trong dược liệu.................................................
Bảng 3.2. Kết quả định lượng linarin trong Cúc hoa vàng............................................
Bảng 3.3. Kết quả chiết xuất flavonoid toàn phần bằng ethanol 70%, 90% và 100%...
Bảng 3.4. Kết quả chiết xuất flavonoid toàn phần bằng methanol 70%, 90% và 100%
Bảng 3.5. Kết quả định lượng linarin trong flavonoid toàn phần.................................
Bảng 3.6. Kẻt quả khảo sát độ lặp lại của quy trình chiểt xuất.....................................
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình phân lập.......................................
Bảng 3.8. Độ tan của linarin trong methanol ở nhiệt độ phòng và ờ 60°c....................

Bảng 3.9. Hiệu suất và hàm lượng linarin ữong sản phẩm sau 1 lần kết tinh................
Bảng 3.10. Hiệu suất và hàm lượng linarin trong sản phẩm sau 3 lần kết tinh..............
Bảng 3.11. Điểm chảy cùa linarin sau khi tinh chế........................................................
Bảng 3.12. Kết quả đo phổ tử ngoại khả kiến (UV - V IS)...........................................
Bảng 3.13. Kết quả đo phổ hồng ngoại (IR) cùa linarin................................................
Bảng 3.14. Kểt quả đo phổ khối lượng (ESI MS) của linarin........................................
Bảng 3.15. Khảo sát pha động và thành phần pha động.................................................
Bảng 3.16. Kết quả xác định khoảng tuyển tính.............................................................
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thong....................................................
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ chụm của phương pháp..............................................
Bảng 3.19. Kết quả xác định độ đúng............................................................................
Bảng 3.20. Kết quả xác định LOD cho phép định lượng..............................................
Bảng 3.21. Tóm tẳt các chi tiêu và phương pháp thử của chất đối chiểu......................
Bảng 3.22. Kêt quả phân tích tạp trong mẫu thử linarin.................................................
Bảng 3.23. Điều kiện sắc ký...........................................................................................
Bảng 3.24. Kết quả định lượng linarin nguyên liệu thiết lập chuẩn..............................
Bảng 3.25. Kết quả đánh giá độ đồng nhất lô...................................................................
Bảng 3.26. Các thông số của hệ sắc ký..........................................................................
Bảng 3.27. Kết quả xác định hàm lượng........................................................................
Bảng 3.28. Kết quả đánh giả theo ANOVA...................................................................
Bảng 4.1. Số liệu thẩm định phương pháp HPLC của linarin........................................
Bảng 4.2. Các chỉ tiêu đã đánh giá..................................................................................

10
35
39
41
44
45
46

47
48
55
55
56
58
58
59
60
61
62
64
65
65
66

67
68

69
71
71
72
72
73
73
77
77

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cẩu trúc phân tử linarin.................................................................................
Hình 1.2. Cúc hoa vàng.................................................................................................
Hình 1.3. Một phần cẩu trúc của pha tĩnh Sephadex® LH20.........................................
Hình 1.4. Phân biệt sẳc ký phân tích, sẳc ký bán điều chế và điều chế........................
Hình 1.5. Sơ đồ máy HPLC............................................................................................
Hình 1.6. Mô hình mô tả quy trình công tác thiết lập lập chuẩn khu vực ASEAN.......
Hình 1.7. Hình ảnh một số chất chuẩn đổi chiếu hỏa học chuẩn khu vực Asean..........
Hình 1.8. Mô hình thiết lập chất đối chiếu tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương...
Hình 2.1. Một số thiết bị sử dụng ừong nghiên cứu.....................................................
Hình 3.1. Cúc hoa vàng Chrysanthemum indicum L. (1) và Chrysanthemum sp.(2)...
Hình 3.2. Một sổ đặc điểm bột Cúc hoa vàng CH] (a) và CH2 (b )...............................
Hình 3.3. Sắc ký đồ của vết linarin chuẩn và mẫu thử CH2........... ...............................
Hình 3.4. sẳc ký đồ HPLC của mẫu Cúc hoa vàng (1 ) và mẫu đối chiếu linarin (2)...
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình chiết xuất ílavonoid toàn phần từ Cúc hoa vàng..................
Hình 3.6. Sắc ký đồ của flavonoid toàn phần (T) và chẩt đổi chiếu linarin (ĐC)
trong hệ dung môi Cloroform - methanol - nước (5:1:0,1)...........................
Hình 3.7. Sơ đồ quy trình phân lập linarin từ flavonoid toàn phần..............................
Hình 3.8. SKĐ của SPPL (T) và linarin chuẩn (C) trong hệ 1 (a), hệ 2 (b), hệ 3(c )....
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình tinh chế linarin....................................................................
Hình 3.10. Phổ tử ngoại khả kiến (ƯV - VIS), ghi từ 200 - 900 nm của mẫu thử
linarin (methanol, 0,01 mg/ml).....................................................................
Hình 3.11. Phổ hồng ngoại (IR) của mẫu thử linarin, 2.000 - 400 cm’1.......................
Hình 3.12. Phổ khối (ESI MS) của linarin.....................................................................
Hình 3.13. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (]H-NMR,13C-NMR) của mẫu thử linarin....
Hình 3.14. Sắc ký đồ (pha động sổ 3) và phổ DAD của dung dịch đổi chiếu linarin....
Hình 3.15. SKĐ xác định tạp trong mẫu thừ linarin......................................................
Hình 3.16. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn linarin (a) và dung dịch thử linarin (b )..........
Hình 3.17. Sản phấm chất chuẩn tại Viện KNT.T.Ư.....................................................

Hình 3.18. Đóng ổng chuẩn trong buồng Glove - Box, Viện KNT.T.Ư.......................
Hình 3.19. Tủ bảo quản chẩt chuẩn tại Viện KNT.T.Ư.................................................

4
6

14
15
16
28
28
29
31
40
40
42
44
49
50
53
54
57
59
60
61
61
63
70
71
74

74
74


ĐẶT VẮN ĐÈ
•

Từ cổ xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ làm thuốc phòng và chữa bệnh. Cùng
với sự phát triển kinh tể - xã hội, mô hĩnh bệnh tật cũng thay đổi theo, ngày càng
xuất hiện nhiều loại bệnh lạ. Việc kết họp hài hòa hai nền y học cổ truyền và y học
hiện đại là xu thế tất yếu của thời đại nhàm giải quyết những khỏ khăn của y học.
Trong những năm gần đây, xu hướng quay trở lại sử dụng các sản phẩm có nguồn
Sốc thảo mộc để phòns và điều trị bệnh trở nên thịnh hành trên thế giới. Mặt khác,
hiện nay tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc được coi là cơ sở quan trọng để sàng lọc
và tìm ra thuốc mới, nhẩt là ở các nước tiên tiến như Mỹ, Pháp...V iệc sàng lọc tác
dụng sinh học từ các họp chất thiên nhiên dựa vào kinh nshiệm cộng đồng để tìm ra
thuốc mới được đánh giá có hiệu quả và tiết kiệm hơn so với việc tổng họp hóa học.
Đến năm 1985 đã cỏ khoảng 3.500 cẩu trúc hóa học mới cỏ nguồn gốc tự nhiên
được phát hiện, 2.618 chất trong số đó từ thực vật bậc cao, 512 chất từ thực vật bậc
thẩp và 372 chất từ các nguồn khác [26]. Có 119 chẩt tinh khiết được chiết tách từ
khoảng 90 loài thực vật bậc cao được sử dụng làm thuổc trên toàn thế giới. Ở Việt
Nam, cho tới nay, đã cỏ nhiều sách tập họp các công trình nghiên cứu về dược liệu
cũng như những kinh nghiệm phòng và chữa bệnh ữong nhân dân ta như “Nhữi7g
cây thuổc và vị thuốc Việt Nam” của tác giả Đỗ Tất Lợi; uTừ điển cây thuốc” của
tác giả Võ Văn Chi; “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” của tập thể các
tác giả Viện Dược liệu. Trong những dược liệu được sử dụng, có nhiều dược liệu đã
được xây dựng tiêu chuẩn và đưa vào Dược điển Việt Nam (DĐVN)...
Flavonoid là nhóm chất lớn trong dược liệu có tác dụng chổng oxy hóa và gổc tự do
rất mạnh. Linarin là một ílavonoid có trong Cúc hoa vàng, một số nghiên cứu trên
thế giới đã chứng minh linarin cỏ tác dụng điều hòa huyết áp, ức chế sự phát triển

của tế bào ung thư tiền liệt tuyến khi kểt họp với acid chlorogenic [31]’ [39l Ở Việt
Nam, Cúc hoa vàng là vị thuốc quen thuộc trong y học cổ truyền, có vị ngọt, hơi
đắng, tỉnh bình hơi mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải cảm, tán phong thấp, giáng
hỏa, giải độc, làm sáng mắt [6]’ [10]’ [12J’ [15l Dược điển Việt Nam IV có hẳn một
chuyên luận riêng về Cúc hoa vàng, tuy nhiên lại không đề cập đến thành phần


linarin [9]; Trong khi đó, Dược điển Trung Quổc lại quy định hàm lượng linarin
trong Cúc hoa vàng không dưới 0,8% [37].
Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ tư (DĐVN IV, 2009) có 314 chuyên luận
dược liệu và thuốc có nguồn gốc dược liệu; trons đó có hơn 80 chuyên luận cần sử
dụng chất chuẩn chiết ra từ dược liệu như Hoàng kỳ (astragaloside IV), Chi tử
(jasnimoidin), Đại hoàng (emodin), c ổ t toái bổ (naringin)... Do đó việc chiết xuẩt,
phân lập và tinh chế các chất đặc trưng từ dược liệu làm chất chuẩn phục vụ kiểm
nghiệm dược liệu trở nên hết sức cần thiết đổi với công tác kiểm tra giám sát chất
lượng thuốc. Để giải quyết vẩn đề cấp thiết đó, tron? phạm vi đề tài cấp Nhà nước
KC.10.16/06-10, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cửu thiết lập chất chuẩn
ỉinarin từ Cúc hoa vàng (Flos Chrysanthemi indici)”. Để đạt được mục tiêu chiết
xuất, phân lập, tinh chế linarin tò Cúc hoa vans đạt độ tinh khiết làm chất chuẩn và
thiết lập được chất chuẩn linarin, nội dung nghiên cứu cụ thể của đề tài bao gồm:
- Khảo sát và lựa chọn được quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế linarin tò Cúc
hoa vàng.
- Xây dựng bộ dữ liệu phân tích cấu trúc, nhận dạng và đánh siá độ tinh khiểt của
linarin.
- Thiểt lập chẩt chuẩn linarin đạt độ tinh khiết tối thiểu 95 % phục vụ công tác kiểm
nghiệm dược liệu.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. XU THẾ PHÁT TRIỀN THUỔC CÓ NGUÒN GỐC THIÊN NHIÊN

Trên thế gió i: Trong vòng hai thập kỷ lại đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản
phẩm thuổc và thực phẩm chức năng có nguồn gổc thực vật (thảo dược) để phòng
và trị bệnh trở nên thịnh hành trên thế giới. Hướng tân dược hóa thuốc đông dược
đã và đang phát triển mạnh ở nhiều nước có nền công nghiệp dược phẩm tiên tiến
như Mỹ, Pháp, Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ và Trung Quốc. Tại Trung Quốc giai
đoạn 1979-1990 có 42 chế phẩm thuốc mới từ cây thuốc được đưa ra thị trường,
trong đó 11 chể phẩm chữa bệnh tim mạch, 5 chế phẩm chữa ung thư và 6 chế phẩm
chữa các bệnh đường tiêu hóa[42]. Từ năm 1990 đến nay, là giai đoạn phát triển rất
mạnh đổi với sản xuất của các thuốc đông dược và thuốc có nsuồn gốc dược liệu,
với hàng trăm chế phẩm mới ra đời. Có thể nêu một sổ ví dụ điển hình về sử dụns
hoạt chất chiết tò dược liệu (dược chất tinh khiểt, tinh chất hoặc cao chuẩn hóa có
hàm lượng chính xác hoạt chất) làm thuốc trong những năm gần đây trên thế giới:
*

Flavonoid trong cao Bạch quả chuẩn hóa (Standardized Ginkgo Extracts) có chứa 3
hoạt chất: Kaempferol, Isorhamnetin, Quercetin, là thành phần chính của biệt dược
TANAKAN (1990) (Viện Bào chế và Tổng họp các sản phẩm tự nhiên IPSEN, Cộng
hòa Pháp, VIDAL 1994, tr. 1411)[46] được sử dụng làm thuốc tăng tuần hoàn não rất
hiệu quả. Hiện nay, cỏ rất nhiều sản phẩm tương tự TANAKAN đang lưu hành trên
thị trường. Hesperidin, một hoạt chất thuộc nhóm flavonoid có trong Trần bì, Cot
toái bỗ. .. có tác dụng điều hòa và bảo vệ thành mạch, có trong biệt dược DAPLON
(1990)

(Yjện g ậ 0 ckl Servier, Cộng hòa Pháp, VIDAL 1994, tr.378) [46] và các biệt

dược CẺPẺVIT K, ACTI 5 AMP BUV, CIRKAN, CYCLO 3 FORT, DILPAVAN,
FRAGIPREL và VẺNYL (VIDAL 1994) [46]. Naringin chiết ra từ vỏ bưởi là hoạt
chất của biệt dược CYCLOREN (1985) (Viện Bào chế Regepharm, Cộng hòa Pháp,
VIDAL 1994, tr. 369) t46:i. Silymarin chiết ra từ Cúc gai {Silybum marianum) có tác
dụng bảo vệ tế bào gan hiện được nhiều Cône ty dược phẩm trên thế giới sản xuất.

Ở Việt Nam : Những năm thập niên 60 - 70 thế kỷ trước, trong thời kỳ kháng chiến
chống Mỹ cứu nước, đã có những đề tài nghiên cứu chiết xuất berberin từ cây Vàng


đẳng dùng làm kháng sinh, quinin từ cây Canh ki na chữa sốt rét. Sau đó đã có
những nehiên cứu chiết nhiều họp chất alcaloid tò dược liệu làm thuốc như: atropin
tò cây Belladon có tác dụng ức chế thần kinh phó giao cảm làm thuốc giảm đau và
siãn cơ trơn, scopolamin từ Cà độc dược với tác dụng tương tự, strychnin từ hạt Mõ
tiền có tác dụng kích thích thần kinh trung ương, rutin từ hoa Hòe làm tăng tính
thấm và làm bền thành mạch ...w . Tuy nhiên phải đến những năm thập niên 90 thể
kỷ trước trở lại đây, cùng với sự phát triển trên thế giới của các thuốc có nguồn gốc
từ dược liệu, đã có nhiều đề tài nghiên cứu chiết xuất dược chất tò dược liệu và kết
quả của các đề tài này là sự ra đời của nhiều dược phẩm tương ứng trên thị trường.
Cho tới tháng 5/2010, nước ta có khoảng 1.100 số đăng ký thuổc từ dược liệu trong
khoảng 10.000 số đăng ký. Đỏ là chưa kể các sản phẩm từ dược liệu đang lưu hành
dưới dạng thực phẩm chức nãng.
1.2. TỎNG QUAN VÈ ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN

cứu

1.2.1. Linarin

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử linarin
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: 7-((6-0-(6-Deoxy-alpha-L-mannopyranosyl)beta-D-glucopyranosyl)oxy)-5-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-benzopyran-4-on.
Tên khác: Acacetin-beta-rutinoside; linarisenin-glucoside; 5,7-dihydroxy-4'methoxyflavone-D-glucosido-L-rhamnoside; buddleoflavonoloside; 5,7-Dihydroxy4'-methoxyflavone,8CI,7-0-Rutinoside; Acaciin; Linaric acid; Buddleoside.


Linarin là một flavonoid, thuộc nhóm flavon, là bột vô định hĩnh, màu trăng ngà,
[ứ]D26-100° (0,07g trong 10 ml apid acetic đặc); [ứ]D24-87° (0,05g trong pyridin);
Thực tế không tan trong nước và các dung môi thông thường, tan trong nitrobenzen,

phenol, anilin, pyridin, methanol nóng, acid và base đặc.
Linarin có tác dụng giảm đau, hạ sổt và chổng viêm. Tác dụng giảm đau, hạ sốt
tương tự như paracetamol. Tuy nhiên, linarin dùng ở liều 100 mg/kg có tác dụng tổt
hơn paracetamol ở liều 200 m ẹ/ke [33]. Nshiên cứu cho thấy linarin cỏ tác dụng
chổng viêm mạnh hơn pectolinarin và indomethacin nhưng tác dụng giảm đau lại
kém pectolinarin [31]’ [33]. Trong nghiên cứu tác dụng của linarin trên đại thực bào
của chuột

cho thấy linarin có thể ức chế sự sản sinh hai loại cytokine là IL-1 và

TNF-a, (cytokine là sản phẩm phóns thích của đại thực bào). IL-1 có tác dụng hoạt
hóa tể bào nội mô mạch máu, hoạt hóa các tế bào lympho, gây tổn thương tổ chức
tại chỗ tạo điều kiện cho các tế bào thực hiện miễn dịch đi vào các vùng này. TNF-a
có tác dụng hoạt hóa tể bào nội mô mạch máu và tăng tính thẩm thành mạch. Hiệu
ứng này làm tăng các IgG, bổ thể và các tể bào đi vào tổ chức gây viêm cục bộ.
TNF-a còn có tác dụng toàn thân như gây sổt, huy độn 2 các chất chuyển hóa và gây
sổc. Linarin có thể ngăn chặn sự sản sinh TNF-a bời đại thực bào ở liều nào phụ
thuộc từng người, tuy nhiên, với TL-1 không bị ảnh hưởng nhiều.
Linarin còn có tác dụng kìm hãm sự sản xuất nitơ (II) oxyd (NO). Sự sản xuất NO
với một lượng lớn gây ra eiãn mạch và hạ huyết áp ở sốt nhiếm trùng. Linarin được
phát hiện là có thể ngăn cản việc sản xuất NO trong lipopolysaccharid. Linarin
siổng như một thuổc mới hữu hiệu để điều trị nội độc tố và chứng viêm do sản xuất
dư thừa NO [43]-[49].
Một số nghiên cứu cho thấy linarin cỏ tác dụng điều hòa huyết áp [31]. Ngoài ra,
linarin cỏ tác dụng ức chể sự phát triển của tế bào ung thư tiền liệt tuyến khi kết họp
với acid chloroeenic [39].


1.2.2. Cúc hoa vàng
1.2.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố

Hình 1.2. Cúc hoa vàng
Tên khoa học: Chrysanthemum indicum L., họ Cúc (Asteraceae)
Tên khác: Kim cúc, dã cúc, cam cúc, khổ ý, biooc kim (Tày).
Cây thảo, sống hàng năm, hay sống dai, cao khoảng lm. Thân mọc thẳng, nhẵn, có
khía dọc, phân cành ở ngọn. Lá mọc so le, chia làm nhiều thùy, mép có răng cưa
nhọn, không đều, mặt trên màu lục đen sẫm, mặt dưới nhạt, cuống lá ngắn, có tai ở
gốc. Cụm hoa hình đẩu, thường gọi là “hoa” mặc dù đó chỉ là nhiều lá hoa nhỏ tụ
họp lại ở nách lá hay đỉnh cành, đường kính 1 - l,5cm, cuống dài 2 - 5cm; hoa ở
ngoài hình lưỡi nhỏ, màu vàng, xếp hai vòng; hoa ở giữa hình ống, tràng dài 2 mm,
không có mào lông; tràng hoa hình ống ngắn hơn tràng hoa hình lưỡi, có thùy tam
giác nhọn màu vàng. Quả bế, có mào lông. Mùa hoa, quả tháng 10-12 cho đến tháng
5 n ă m sa u [6]’[7]’[10]’[12]’[15].


Cúc hoa vàng có nsuồn gốc ở 'vùng Đông Á: Ở Trung Quổc, Triều Tiên, Nhật Bản,
Việt Nam, Lào, Thái Lan, Ẩn Độ; từ lâu được trồng làm cây cảnh và làm thuốc ở
Trung Quốc, Nhật Bản. Ở Việt Nam cũng vậy, Cúc hoa vàng được dùng làm thuốc
từ rất sớm và được trồng nhiều ở các làna Nghĩa Trai (Hưng Yên), Nhật Tân (Hà
Nội), Tể Tiêu (Hà Tây), v.v...
L2.2.2. Thành phần hóa học
Cúc hoa vàng có chứa tinh dầu, carotenoid, các acid amin, vitamin A, flavonoid và
một sổ loại sesquiterpen [15].
- Tinh dầu: a- pinen, [3- pinen, sabinen, mycren, cineol, chrysanthenon, bomeol,
chrysanthetriol, linalyl acetat, eermacren D, nerolidol, y- cadinen,a- selinen,
caryophyllen, mourolol.
- Carotenoid: chrysanthemoxanthin
- Sesquiterpen: arteglasin A, yejuhua lacton, handelin, chrysetunon, cumambrin A,
angeloylajadin, tuncfulin.
- Flavonoid: linarin, luteolin-7-O-beta-D-glucopyranosid, acacetin-7-0-Ị3-Dgalactopyranosid, chrysanthemin. Chrysanthemin là sắc tổ của hoa C 2iH 2oOn. Khi

thủy phân sẽ được glucose và cyanidin Ci 5H n 0 6.
- Thành phần khác: indicumenon, |3- sitosterol, a- amyrin, friedelin, sesamin,
adenin, cholin, stachydrin và vitamin A.
Trong đó, Dược điển Trung Quốc quy định hàm lượng linarin trong Cúc hoa vàng
không dưới 0 , 8 % t37l
1.2.2.3. Tác dụng và công dụng
Theo Y học cổ truyền, Cúc hoa vàng có vị ngọt, hơi đắng, tính bình hơi mát, có tác
dụng thanh nhiệt, giải cảm, tán phong thấp, giáng hỏa, giải độc [15J, nên thường
được dùng để chữa: phong cảm lạnh, cúm, viêm não, viêm mủ da, viêm vú, chóng
mặt, nhức đầu, cao huyết áp, đau mắt đỏ, chảy nhiều nước mắt, viêm gan. kiết lỵ.
Dùng ngoài chữa trị đinh nhọt, rắn cắn, chấn thương bầm dập [15l Ở Ẩn Độ, Cúc
hoa vàng được coi như có tác dụng làm dễ tiêu và nhuận tràng


Cúc hoa vàng có nhiều tác dụng- dược lý như tác dụng chống viêm thực nghiệm trên
chuột cống trắng, chổng oxy hóa, chổng gốc tự do, kháng khuẩn, hạ huyết ảp và có
hoạt tính gây phản vệ fl5]’ [20]’ [44]. Dịch chiết của Cúc hoa vàng có khả năng chổng
viêm, ức chế miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào, đồng thời còn có hoạt tính của
bạch cầu đơn nhân làm sáng m ắ t[20].
Chrysanthemum indicum cỏ khả năng ức chể quá trình peroxy hóa lipid và có thể
tác dụng này liên quan với chức năng bảo vệ san của Chrysanthemum indicum f29].
Ngoài ra, trong 12 thảo dược Trung Quốc dùng để điều trị bệnh gút, dịch chiết
methanol của Cúc hoa vàng có hoạt tính ức chế xanthin oxidase mạnh thứ hai. Như
vậy, tác dụng điều trị bệnh gút phần nào là do hoạt tính ức chế xanthin oxidase [32l
Hai Flavanon glycoside mới ((2S)- & (2R)-eriodictyol-7-0-fí-Dglucopyranosidurronic) trong Cúc hoa vàng có hoạt tính ức chế aldose reductase ở
thủy tinh thể chuột nhắt trắng [35].
Tinh dầu cất từ nụ Cúc hoa vàng, đã được thử trên các chủng vi khuẩn Diplococcus
pneumoniae,

Streptococcus

haemolyticus,

Streptococcus

faecalis,

Bacillus

pyocyaneus, E.coli, Klebsiella pneumoniae. Kết quả cho thấy tinh dầu này có tác
dụng kháng khuẩn khá m ạn h [I5}.
Cúc hoa vàng có tác dụng hạ huyết áp trên động vật thí nghiệm (chó), cũng như có
tác dụng tốt đối với bệnh nhân cao huyết áp. Hoạt tính của Cúc hoa vàng làm hạ
huyết áp có thể là hiệu quả của tác dụng ức chế phản xạ vận mạch có nguồn gốc
trung tâm và tác dụng ức chế adrenalin. Lưu lượng tim và sự dẫn truyền thần kinh ở
hạch không bị ảnh hưởng. Cao lỏng của Cúc hoa vàng gây hạ huyết áp ở thỏ, nhưng
không có tác dụng làm tăng độ bền mao mạch của thỏ [15].
Phân đoạn ethylacetat (từ dịch chiết methanol) có tác dụng ức chế sản xuất nitơ
oxyd (NO) trong đại thực bào bị hoạt hỏa bởi lipopolysaccharid [49J.
Chrysanthemum indicum sây dị ứng tiếp xúc trên chuột lang f24]’ [40l có thể do sự có
mặt của các họp chất terpenic [38l Arteglasin A cỏ trong Cúc hoa vàng có hoạt tính
gây phản vệ trên da chuột lang và gây viêm da dị ứng tiếp xúc ở n g ư ờ i[15].


Cúc hoa vàng là một dược liệu quý với nhiều tác dụng chưa được nghiên cứu đầy
đủ, thiết lập chất chuẩn linarin góp phần kiểm nghiệm vị dược liệu quí này.
1.3. THIÉT LẬP CHÁT CHUẨN TỪ DƯỢC LIỆU
Bất cứ quốc gia nào cũng đều phải thiểt lập và sản xuất các chất chuẩn đổi chiếu
hóa học ở mửc quốc gia giúp cho công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc và
nguyên liệu làm thuốc. Mỗi khi chiết xuất, tinh chế một chất nào đó từ dược liệu để

làm thuổc thì cần phải thiết lập chất chuẩn đối chiếu hóa học (gọi tắt là chất chuẩn)
từ chính chất đó. Trong những năm gần đây, có một sổ chuẩn hóa học là những
dược chất đặc trưng từ dược liệu đạt mức độ tinh khiết nhất định đã được sản xuất
trên thế giới. Dược điển Mỹ 30 (2007) [45] đã bổ sung một sổ chất chuẩn đổi chiếu
hóa học như quercetin USP CRS (USP 30, tr.64), rutỉn USP CRS (USP 30, tr.64),
silybin USP CRS (ƯSP 30, tr.64)... Viện Kiểm nghiệm Dược phẩm và Sinh phẩm
Trung Quốc (NICBPB), Viện Kiểm nghiệm thuốc Hàn Quốc và Viện Kiểm nghiệm
thuốc Nhật Bản đã thiết lập được nhiều chất chuẩn đổi chiếu hóa học chiết ra từ
dược liệu dùng cho kiểm nghiệm dược liệu, thuốc có nguồn gốc dược liệu và thuổc
đông dược. Chất chuẩn quốc gia chiết ra từ dược liệu được coi là tài sản quốc gia,
quy trình thiết lập chất chuẩn qùốc gia thường được bảo hộ và giữ bí mật. Chính vì
vậy, những chất chuẩn này ở các nước rất ít khi bán ra ngoài, nểu có bán thì phải
xỉn ý kiến nhà chức trách. Viện Kiểm nghiệm Dược phẩm và Sinh phẩm Trung
Quốc chủ trương không bán chất chuẩn chiết từ dược liệu mà chỉ trao đổi chuẩn với
Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương Việt Nam.
Hiện tại, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương (Viện KNT.T.Ư) đã có bộ chất
chuẩn phục vụ kiểm tra và giám sát chất lượng thuốc với khoảng 500 chẩt bao gồm
chuẩn quốc tế, chuẩn khu vực và chuẩn phòng thí nghiệm trong đó chuẩn do Viện
KNT.T.Ư nghiên cứu thiết lập là 180 chất (110 chất chuẩn quốc eia và 70 chất
chuẩn phòng thí nghiệm), chủ yểu là các hóa dược. Một vài chuẩn chiết từ dược liệu
có thể tiếp cận mua được, nhưng thường bán với giá rẩt đắt. Chất chuẩn càng tinh
khiết thì giá càng đắt. Có thể nhận thấy nếu Viện KNT.T.Ư không chủ động được


nauồn chẩt chuẩn, đặc biệt là chất chuẩn chiết từ dược liệu thì ngành Dược sẽ gặp
nhiều khó khăn :
- Không kiểm nghiệm được chất lượng dược liệu một cách đầy đủ và toàn diện;
- Không kiểm tra giám sát chất lượng các dạng bào chế có nguồn gốc từ dược liệu
đang lưu hành trên thị trường một cách đầy đủ;
- Không tiêu chuẩn hóa được các thuổc sản xuẩt trong nước bào chế từ dược liệu

hoặc từ dược chất chiết ra từ dược liệu về mặt hàm lượng dược chẩt, do đó không
giúp được ngành dược bào chế ra các thuốc có chất lượng cao phục vụ nhu cầu
phòng và chữa bệnh.
Từ những lý do trên cho thấy ngành Dược đứng trước nhiệm vụ cấp bách phải chủ
động nguồn chất chuẩn và xây dựng được Quỹ chất chuẩn quốc gia trong đó có các
chất chuẩn chiết ra tò dược liệu nhằm đáp ứng kịp thời công tác đảm bảo chất lượng
thuốc, phục vụ bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe nhân dân.
Ở Việt Nam, cho tới nay, chưa cỏ nơi nào sản xuất linarin để làm chất chuẩn. Một
số hãns cung cấp linarin, chào hàng qua internet theo bảng 1 . 1 .
Bảng 1.1. Một số hãng cung cấp linarin- chất đối chiếu phòng thí nghiệm
TT
1.

2.

3<5.

Tên hãng

Liên hệ

A Meryer Chemical
Technology Shanghai
Company
Shanghai GuansZan
Chemical Technology Co.,
Ltd
Apin Chemicals Ltd.
(UK)

Tel: +86-(0)21-61259100
FAX: +86-(0)21-61259102
Web: www.meryer.com
Tel: 021-50426528 50426030
FAX: 021-50426273
Web: www.shanshai211anszan.com
Tel: +44 1235 832515
FAX: +44 1235 832000
Web: www.apmchemicals.com
Tel: +49 9402 9336 0
FAX: +49 9402 9336 13
Web:
Tel: 1 888 463 6346
FAX: (908) 359-1179
Web: www.indofmechemical.com
Tel: +33 962096793
FAX: +33 434863170
Web: www.leancare.co.uk
Tel: 81 75 251 1723
FAX: 81 75 251 1762
Web: www.nacalai.co.jp
Tel: 410 908 9675
FAX: 240 235 4288
Web: www.smovainc.com

4.

Chemos GmBH
(Germany)

5.

INDOFINE Chemical
Company, Inc. (USA)

6.

Leancare Ltd. (UK)

7.

Nacalai Tesque,
Inc. (Japan)

8.

Sinova Inc. (USA)

Giả

Ghi chú

Không có săn,
phải đặt hàng
980 NDT/
lọ 20mg

Không có săn,
phài đặt hàng
Không có săn,

phải đặt hàng
Không có săn,
phải đặt hàng

200 Euro/
lọ 20 mg

Không có sẵn,
phâi đặt hàng
Không có sẵn,
phải đặt hàng
Không có săn,
phải đặt hàng
Không có săn,
phải đặt hàng


1.4. PHƯƠNG PHÁP CHIỂT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHÉ CÁC CHẮT
ĐẶC TRƯNG TỪ DƯỢC LIỆU
1.4.1. Chiết xuất
Chiết xuất dược liệu có vai trò quan trọng, trước hết là lấy được các chất có trong
dược liệu dưới dạng tinh khiết hay hỗn họp toàn phần phục vụ cho mục đích nghiên
cứu hoặc điều trị. Dược liệu dùng để chiết xuẩt có thể là những bộ phận của động
vật, thực vật, khoáng vật hoặc vi sinh vật, ừong đó dược liệu là thực vật được sử
dụng nhiều nhất. Nguyên liệu thực vật dùng để chiết xuất có thể là một bộ phận của
cây (hoa, quả, hạt, thân, rễ, lả, vỏ..) hoặc toàn cây. Quá trình chiết xuẩt dược liệu
chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tổ thuộc về thành phần, cẩu tạo của dược liệu (màng
tế bào dược liệu, chẩt nguyên sinh, các tạp chất...), dune môi (độ phân cực, độ
nhớt, sức cans bề mặt của dung m ôi...), kỹ thuật và điều kiện chiết xuất (nhiệt độ
chiết, thời gian chiểt, độ mịn của dược liệu..). Có nhiều phương pháp chiểt xuẩt

dược liệu. Các phương pháp được phân loại dựa vào các yểu tổ khác nhau:
- Dựa vào nhiệt độ: Chiểt nóng và chiết nguội (ở nhiệt độ thường);
- Dựa vào chế độ làm việc: Chiết eiản đoạn, chiết bán liên tục và chiết liên tục;
- Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha: Chiết ngược dòng, chiết xuôi
dòng và chiết chéo dòng;
- Dựa vào áp suất làm việc: Áp suất làm việc (áp suẩt khí quyển), áp suất giảm và
áp suẩt cao (làm việc có áp lực);
- Dựa vào trạng thái làm việc của hai pha: Phương pháp ngâm, ngẩm kiệt
- Dựa vào nhữna biện pháp kỹ thuật đặc biệt có thể làm rút ngắn thời gian chiết:
siêu âm, phương phảp tạo dòng xoáy và phương pháp mạch nhịp.. .v.v
Chiết xu ấ t nhỏm flavonoid: Chưa có một phương pháp chung nào để chiết xuất các
flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi hữu
cơ. Các flavonoid aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực, các flavanoid
glycosid dễ tan trong các dung môi phân cực. Thông thường để chiết các/lavonoid
glycosid, người ta loại các chất thân dầu bàng ether dầu hoả, n- hexan, sau đó chiểt
bằng nước nóng, methanol và ethanol ở các nồng độ khác nhau hay hồn hợp
cloroform - ethanol, c ồ n ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần
lớn các fla vonoid [3]. Dịch chiết sau khi được làm đậm đặc ờ nhiệt độ thấp dưới chân
không (40 - 70°C); được loại tiếp các chất tan trong dầu bằng cách lắc tiếp với dung


môi hữu cơ. Trong chiết xuất ờ quy mô công nghiệp, muốn tránh dùng nhiều dung
môi hữu cơ, thườn 2 trong giai đoạn đầu, dược liệu được chiết bàng nước hoặc cồn
thẩp độ, như vậy cũng hạn chế bót các tạp chất tan trong dầu.
1.4.2. Phân lập
Phân lập là quá trình tách riêng một chất ra khỏi hồn họp. c ỏ nhiều phương pháp để
phân lập như: Phương pháp trao đổi ion, phương pháp sắc ký cột, sẳc ký lóp mỏng
điều chể, sắc ký lỏng điều chế/bán điều chế.. .hoặc tiến hành phân lập bằng:
- Các quá trình hoá lý: dựa vào tỉnh tan trone dune môi, độ chảy, độ sôi của chất
cần phân lập, khả năng thẩm thấu, khả năng phân bố của chất trong môi trường.

- Bằng các phản ứng hoá học: Tách riêng chất ra khỏi hỗn hợp bàng phản ứng hoá
học đặc biệt sau đó thực hiện phản ứng chuyển thành chat ban đầu.
Nói chung, phương pháp phân lập phổ biển nhất vẫn là sử dụng sắc ký cột. Có thể
dừng một sổ kiểu sắc ký cột với một sổ cơ chế như sắc ký pha thuận trên silica eel,
pha đảo trên chất nhồi Cg, C]g... hoặc sắc ký rây phân tử (Size exclusion
chromatography. SEC) trên Sephadex®.
Phương pháp phân lập bằng sắc kỷ cột
Nguyên tắc: Dựa tiên nguyên tắc các thành phần trong hỗn họp có độ hấp phụ khác
nhau trên chất hấp phụ đã nạp trong cột. Chất hấp phụ thường dùng là oxyd nhôm,
silica gel dùng cho sắc ký cột, bột cellulose... Ở phần trên của cột sẽ tập trung chất
bị hấp phụ mạnh nhất, còn ở phần dưới của cột tập trung chất kém hấp phụ nhất khi
dùng một dung môi hay một hệ dung môi để rửa giải cảc thành phần đã hấp phụ
trong cột.
Xác định các thông sổ của cột: Tùy theo mục đích phải tách sạch hay chỉ phân loại
thành nhóm mà chọn các thông sổ cột khác nhau như tỷ lệ giữa khối lượng chất hấp
phụ và chẩt cần tách; kích thước cột; kích cỡ hạt hấp p h ụ ... vì các dịch chiết từ thực
vật thường cỏ thành phần phức tạp, khác nhau nhiều về tính chất lý, hóa, độ phân
cực, độ hấp phụ,...
Nhồi cột: Có hai cách nhồi cột: Nhồi ướt và nhồi khô
s Nhồi ướt: Cân chất hấp phụ vào một cốc có dung tích thích họp, đổ dung môi
vào, khuấy đều tay để đuổi hết bọt khí và làm chất hẩp phụ phân tán đều trong


dung môi, đổ từ từ vào cột và phải đảm bảo cột luôn được ngâm trong dung môi
vì nếu để khô hay nứt cột thì khả năng tách sẽ kém nhiều.
■/ Nhồi khô: Cân chất hấp phụ vào một cốc có dung tích thích họp, đổ từ từ vào
cột, sau đó, tiến hành chuyển dung môi vài lần qua cột để nén chặt chất hẩp phụ,
đảm bào độ đồng đều, tránh hiện tượng vỏn cục hay tạo thành bọt khí.
Đưa chất lên cột: Nếu chẩt ban đầu ở dạng rắn hay keo thì phải hòa tan trong một
lượng dung môi vừa đủ; sau đó trộn đều với một lượng chất hấp phụ (lượng chất

hấp phụ không quá 3 lần so với lượng chất) và để bay hơi hết dung môi thành bột
khô tơi. Nếu dạng chất ban đầu là chất lỏng chỉ việc trộn chất hấp phụ vào và để cho
khô. Khi đưa chất lên cột, nên để lượng dung môi trên cột sao cho chỉ vừa đủ ngập
lượng chất dính chất hẩp phụ cho vào.
Chạy cột: Lựa chọn và thay đổi dung môi chạy cột họp lý để đảm bảo các chất phân
tách tốt mà thời gian chạy qua cột không quá dài. Neu chỉ dùng một dung môi trong
suốt quá trình chạy sắc ký, tuy có thể tách sạch nhưng mất nhiều thời gian, hơn nữa
những phân đoạn cùng bị hấp phụ mạnh sẽ không di chuyển được hoặc di chuyển
chậm.
Phân lập bằng sẳc kỷ loại theo kích cỡ và việc sử dụng Sephadex® ^
Sắc ký cột loại theo kích cỡ hiện nay được sử dụng phổ biến nhất trong phân lập
chất ở quy mô phòng thí nghiệm, sắc ký cột phân loại theo kích cỡ (size exclusion
chromatography- SEC) còn được biết đến với tên là sắc ký rây phân tử (molecular
sieve chromatography), sắc ký thấm qua gel (gel permeation chromatography) hay
sắc ký lọc qua gel (gel filtration chromatography). SEC dựa trên sự khác nhau về
kích cỡ của các tiểu phân để tách riêng chúng ra bằng cách sử dụns các chất có kích
thước lỗ xổp xác định làm pha cố định. Các phân tử có kích thước nhỏ hơn sẽ đi sâu
vào trong khối xổp và bị giữ lại lâu hơn trước khi ra khỏi cột. Trong khi đó, các
phân tử có kích thước lớn hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn.
Sắc ký gel bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1950 nhưng gần 10 năm sau, chất lọc
sel dùng làm pha cổ định mới ra đời với tên là Sephadex®. Đây là pha rắn dùng để
lọc các họp chất có trọng lượng phân tử lớn tan trong nước,

về

sau một số chất gel


polystyren có tính kỵ nước ra đời dùng để lọc các hợp chẩt phân tử lớn tan trong
dung môi hữu cơ. Sephadex® là tên thương mại của một loại gel có các dây nổi

dextran, được sử dụng nhiều trong sắc ký lọc sel. Sephadex® LH-20 được tạo ra
bàng cách hydroxypropyl hoá các hạt dextran để tạo các cầu liên kết hình thành nên
một mạng lưới polysaccharid. Mạng lưới này trương nở trong nước hoặc trong các
dung môi hữu cơ. Tuỳ thuộc vào dung môi được sử dụng, Sephadex® LH-20 thể
hiện cả tính ưa nước và kỵ nước và cỏ thể đạt được độ chọn lọc sắc ký cần thiết cho
những ứng dụng nhất định. Khi sử dụng Sephadex® LH-20 trong quá trình phân lập
và tinh chế, để thu được phân đoạn của một nhóm hoạt chất, thể tích mẫu đưa lên
cột cỏ thể lên đến 30% tổng thể tích cột [22l

Hình 1.3. Một phần cấu trúc của pha tĩnh Sephadex® LH20
1.4.3. Tinh chế
Thông thường sau khi phân lập, độ tinh khiết của chất thường đạt được trên 80%.
Quá trình tinh chể nhằm tăng độ tinh khiết, loại tiếp các tạp chất hoặc phần chất
phân lập kèm theo, chưa thể hoặc không thể loại hết trong điều kiện phân lập. Các
phương pháp tinh chế có thể thực hiện:
- Đơn giản nhất là áp dụng tính tan và kết tinh sử dụng các dung môi ở điều kiện
nóng để hòa tan chọn lọc tạp và loại bỏ tạp bằng cách lọc lấy chất; hoặc có thể
hòa tan chất, lọc loại bỏ tạp ít tan, sau đó kết tinh lại chat. Kỹ thuật này cũng là
kỹ thuật cơ bản và thường được áp dụng;


-

Lặp lại quá trình sắc ký cột giổng như giai đoạn phân lập. lựa chọn phân đoạn
tinh khiết hơn hoặc thay đổi dung môi rửa giải hoặc tỷ lệ thành phần của dung
môi rửa giải;

-

Tiến hành sắc ký cột như giai đoạn phân lập, nhưng thay đổi kiểu sắc ký, ví dụ

như eiai đoạn phân lập sử dụng sắc ký hấp phụ pha thuận trên silica gel, giai
đoạn tinh chế sử dụng sắc ký phân bổ pha đảo trên C 8 , C18 hoặc sử dụng sắc ký
thẩm qua sel.

-

Tiến hành phươns pháp sắc ký hệ thống sắc ký bán điều chế/điều chế tự động và
cột bán điều chế/điều chế loại hiệu năng cao chuyên dụng. Kỹ thuật này hiện
chưa thật phổ biến do đầu tư trang thiết bị đắt tiền.

Phân lập và tinh chế bằng sắc kỷ điều chế/bản điều chế
Sắc ký điều chế, khác với sắc ký phân tích, được sử dụng để tách một lượng chất
nhất định ra khỏi hỗn họp. sắc ký điều chế không liên quan nhiều đến lượng mẫu
lớn hay cột lớn (mặc dù các cột sắc ký rẩt lớn thưòng được sử dụng trona sắc ký
điều chể). Tuy nhiên, kỹ thuật này liên quan đến việc tách riêng và thu hồi các thành
phần. Tùy thuộc vào mục đích và yêu cầu sử dụng, đường kính cột sắc ký điều chế
cỏ thể từ vài mm đến vài chục' mm với thể tích pha độns từ vài mililít đến hàng
chục lít. Khi ứng dụng sắc ký điều chể, với thể tích mẫu không quá 2% thể tích cột
điều chế thì cho kết quả tốt nhất.

A nalytical

Preparative

Semi -p re p a ratìve

Loading < 540 m g
O p tic a l P u rity: > 9 9 .9 9 6
R ecovery:
9 8 .5 %

C o lle ctio n :

150 m g X
O p tic a l Purity: > 9 9 . 9 %
Recovery:
Co lle ctio n :

7 4 .9 mg

Lo-bding: 1 5 0 m g

I soproterenol

6 0 0 m m I , D.
2 0 m m I . D.

(

1 0 0 0 m m I.D.
2 5 0 m m I . D.

)

FI

Col l ecti on: 266 g/cyc I

_

Col l ect i on: 2 7 0 g/ c yc

10
C o lu m n size:

C o lu m n s ir e i

C o lu m n size:!

2 5 0 X 4. 6 m m I. D.

25 o X 20 m m I. D .

1 0 0 0 X 6 0 0 m L D.

Hình 1.4. Phân biệt sắc ký phân tích, sắc ký bán điều chế và điều chế

1
I


1.5. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VÀ NHẬN DẠNG CHẢT
1.5.1. Định tính, định lượng hoạt chất bằng săc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.5.1.1. Khải niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao - High Performance Liquid Chromatography (HPLC) là
phương pháp phổ biến nhất hiện nay được sử dụng để định tính và định lượng trong
phân tích kiểm nghiệm. Ra đời từ năm 1967 - 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến
từ phương pháp sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp
chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chat ran
đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang
rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bàng liên kết hoá học với các nhóm hữu

cơ, dựa trên cơ chể hẩp phụ, phân bổ, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ.
L5.1.2. H ệ thống H PLC
Máy HPLC gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt trên sơ đồ hình 1.5.

(5)
D etector

(6)

1. Bình chứa dung môi
pha động

co^L

2. Bơm cao áp

P rim er
Puinp and
dam per

3. Bộ phận tiêm mâu
4. Cột HPLC (pha tĩnh)

A n a ly tic a l

colum n

(4)

5. Detector

6. Máy ghi tin hiệu

Hình 1.5. Sơ đồ máy HPLC
a) Cột HPLC (pha tĩnh): Cột thường được làm bằng thép không gỉ, có chiều dài và
đường kính trong (ộ) khác nhau. Phần lớn quá tìn h phân tách được thực hiện ở
nhiệt độ phòng, nhưng cột có thể được làm nóng nhàm thu được hiệu quả cao hon.
Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá

60°c vì khả năng phân huỷ

của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể xảy ra.
Sau đây là một số pha tĩnh điển hình:


- Sỉlcogel trung tính: Dùng để tách các chẩt không phân cực và ít phân cực. Trên bề
mặt hoạt động của nó có chứa các nhỏm OH phân cực ưa nước. Ví dụ: Lichrosorb
Si 40, Si 60, Si 100; Hypersil; M- partisil; Micropack - S i . ..
Pha động dùns cho loại này là những chất không phân cực hay ít phân cực, thường
là các dung môi hữu cơ đơn hay hỗn hợp của vài dung môi hữu cơ không tan trong
nước như: Benzen, toluen, cloroform, hexan, ethyl a ceta t. . .
- Silicagel đã alkyl hoả: Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các
chất phân cực có khả năng tạo cặp ion. Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị
alkyl hoá tức là đã được gắn với mạch carbon thẳng (C 8 , C18) hay các carbon vòng
(phenyl) vì thể nó không còn phân cực hay rất ít phân cực. Ví dụ: Hypersil ODS,
lichrosorb RP18, - RP 8 , C 8 corasil, phenyl - co rasil. . .
Pha động dùng cho loại này là các chất hữu cơ phân cực như methanol, acetonitril,
nước hoặc hon hợp của chủng.
- Silicagel đã được sulfonic, nitro hoả hay amin hoả: Dùng đế tách các chất có cẩu
tạo ion như các kim loại và họp chất của chủng hay các chất khi tan trong pha động
thì phân ly thành ion như các acid hay base. Ví dụ: Lichrosorb - NH2; Lichrosorb CN; Nucleosil - 5NH2; P artisil: SAX; Micropack; Hyperasil APS.

b)

Pha động

Dung môi dùng để chuẩn bị pha động thường không được chứa các chất làm ổn
định và phải trong suốt ở vùng bước sóng phát hiện, nếu như sử dụng detector tử
ngoại. Điều chỉnh pH, trong trường họp cần thiết, thực hiện với thành phần nước
của pha động mà không điều chỉnh với hỗn hợp.
Pha động có thể chứa những thành phần khác, ví dụ như một ion trái dấu đổi với sắc
ký tạo cặp ion hoặc một chất chọn lọc đối quang trong trường hợp sắc ký sử dụng
pha tĩnh bất đổi, chất đệm pH để ổn định pH, chất tạo phức để tạo ra sự rửa giải
chọn lọc, chất điện li...
Các loại dung môi thích họp cho tòng loại pha tĩnh dùng phổ biển đã được nêu ở
phần chọn pha tĩnh.

TRƯỜNG ĐH DƯỢC HÀ

NỘI

T H Ư VIỆN
I N gày......... íh án g ......... 'năm 20 . . . . . .
I S ố ĐKCB:...................................