BÀI GIẢNG KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN VÀ TẠO DÒNG TẾ BÀO

EPC

MCF7

MSC

BÀI 4. KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN VÀ TẠO DÒNG TẾ BÀO
10/9/17

TS. Vũ Bích Ngọc


+

Mục tiêu
! 

Hiểu khái niệm –mục đích cấy chuyền tế bào và một số kỹ
thuật có liên quan

! 

Nắm được một số phương pháp tạo dòng tế bào

! 

Biết được một số ứng dụng của dòng tế bào trong lĩnh vực y
sinh học

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+

Nội dung

Tạo
dòng tế
bào

Nhắc lại

Kỹ thuật
cấy
chuyền
TS. Vũ Bích Ngọc -

Các
ứng
dụng
10/9/17


+
THU NHẬN MẪU MÔ

CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

Cắt nhỏ

(mảnh nhỏ
để nuôi)

Tách tế bào
bằng cơ học
(nghiền, ép)

Nuôi mẫu mô
sơ cấp

NUÔI SƠ
CẤP

Thu nhận tế
bào mới

Cấy chuyền

Thu mảnh
DÒNG TẾ
mô
thứ
cấp
BÀO
TS. Vũ Bích Ngọc -

Tách tế bào
bằng enzym
(ủ…)

Trypsin lạnh

Tái huyền
phù

Trypsin ấm

Collagenase

Ly tâm

10/9/17


+
Nuôi sơ cấp
Nuôi mô

Thu nhận
cơ quan
Cắt
nhỏ
Thành
tế bào
đơn

Cấy
chuyền

Cấy chuyền

TS. Vũ Bích Ngọc -

Nuôi sơ cấp

Cell line

10/9/17


+

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


Tách rời tế bào

+

Tách bằng tác
nhân khác
(EDTA, cơ học)

Trypsin

Tách bằng
enzym

Collagenase

Papain

Elastas

Trypsin ấm

Trypsin lạnh
TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+

Tách rời tế bào

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+

Tách bằng enzyme

Trypsin:

Chymotrypsin

Collagenase

•  pH6-9, tối ưu 8-9
•  Nồng độ dùng:
0,01%-0,5%
•  Ca2+ được xem như
chất bảo vệ Trypsin
•  Bị kìm hãm bởi FBS
hoặc Di-IsopropylFluorophosphat(DF
P)
•  Không đặc hiệu cho
loại protein: Cắt liên
kết –COOH của
lysin/arginin và –
NH2 " có thể gây
hư hai cho tế bào

•  pH 7-9, thích
hợp 8-9
•  Cắt liên kết
peptide tạo bởi
–COOH acid
amin thơm với
–NH2
•  Tính đặc hiệu
kém hơn
trypsin
•  Bị ức chế bởi
DFB

• 

•  Hoạt động •  pH
•  Phân
tốt: pH7-8,
4,5-8,
huỷ
< 450C
5
elastin
•  Cắt liên kết •  Bị kìm •  Sử dụng
peptide
hãm
kết hợp
dạng polybởi
với
L prolin;
chất
enzyme
gồm 4 loại
oxy
khác
đặc trưng
hoá
tắt từng
loại mô
chuyên
biệt# ít
làm hư hại
tế bào

TS. Vũ Bích Ngọc -
MỘT
SỐ ENZYME PHÂN CẮT THƯỜNG DÙNG

Papain

Elastase

10/9/17


+
Tế bào không bám dính

Tế bào bám dính

Cụm tế bào nuôi sơ cấp

Sau nuôi sơ cấp, tế
bào bám vào bề
mặt đĩa nuôi

Tế bào tách khỏi bề
mặt đĩa nuôi,
chuyển qua các đĩa
nuôi khác

3

1. Huyền phù
để tách rời
cụm tế bào
thành tế bào
đơn

Sau 1 thời gian, tế bào
tăng sinh, bao phủ đầy
bề mặt đĩa nuôi

Thêm enzym
(trypsin,
collagenase…)

1

2

Sau cấy chuyền, tế bào tiếp tục tăng sinh

TS. Vũ Bích Ngọc -

Puck và Marcus (1955)

2. Pha loãng
mật độ tế bào,
chuyển sang
các đĩa nuôi
mới
3. Tế bào đơn với

mật độ thưa
trong đĩa nuôi
mới
10/9/17


+

Quy trình cấy chuyền tế bào bám dính
Thu môi trường cũ vào ống falcon vô trùng

Rửa tế bào 3 lần bằng PBS

Bổ sung trypsin/EDTA 0,25%, tráng đều bề mặt đĩa
nuôi

Ủ trong tủ ấm từ 2-5 phút

quan sát dưới kính hiển vi để đảm bảo các tế bào đã
co tròn và tách khỏi bề mặt đĩa nuôi
chuyển Flask và tủ thao tác, dùng pipette huyền phù
đều để đảm bảo tế bào tách thành tế bào đơn
TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+

Quy trình cấy chuyền tế bào bám dính (tt)

Hút toàn bộ huyền phù tế bào, chuyển vào ống falcon chứa
môi trường cũ

Ly tâm ống ở tốc độ 2500 RPM trong 5 phút

Loại bỏ dịch, thu cụm tế bào ở đáy ống falcon

Bổ sung môi tường mới với lượng gấp 3 lần môi trường cũ

huyền phù đều và chia đều cho 3 flask mới

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+

Lưu ý
! 

Hạn chế tối đa thời gian tiếp xúc của enzyme phân tách với tế
bào

! 

Chọn nồng độ tối thiểu enzyme phân tách tuỳ loại tế bào

! 

Sử dụng các chất ức chế hoạt tính enzym ngay sau khi phân
tách (FBS, protease inhibitor)

! 

Cấy chuyền khi mật độ tế bào bao phủ 70-80% bề mặt đĩa nuôi

! 

Hầu hết tế bào bám dính sau 3-4 giờ

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


TẠO
DÒNG
TẾ
BÀO
+

KHÁI NIỆM- ĐẶC TÍNH

TS. Vũ Bích Ngọc -

MỘT SỐ PHƯƠNG
PHÁP

XÂY DỰNG ĐƯỜNG

CONG TĂNG TRƯỞNG
VÀ ĐO SỰ PHÁT TRIỂN

10/9/17


+

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+

Tăng sinh

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17
(Regenerative Medicine,
2006

+

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+

Tiêu chí lựa chọn dòng tế bào cho
thí nghiệm
! 

Loài

! 

Đặc điểm chức năng

! 

Hữu hạn hay liên tục

! 

Bình thường hay chuyển dạng

! 

Điều kiện và đặc tính tăng trưởng

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+
! 

Cùng kiểu gen,
hình thái

! 

quần thể tế bào
như nhau ở đặc
điểm quan tâm.

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


Douglas C. McFarland
Methods in Cell Science 22: 63–66 (2000).

+

Mô

Phân tách
Tế bào đơn
Nuôi sơ cấp

Pha loãng tới hạn

Vòng nhẫn

Tách tế bào tự động

Clone phát triển

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+
Chuỗi pha Loãng lần 1

Giếng tế bào gốc

TS. Vũ Bích Ngọc -

Chuỗi pha Loãng lần 2

10/9/17

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+

TS. Vũ Bích Ngọc -

10/9/17


+

TS. Vũ Bích Ngọc -

Nhuộm crystal violet

10/9/17