NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ VÙNG MÃ HÓA (EXOME)

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ
Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM
BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ
VÙNG MÃ HÓA (EXOME)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2019


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ
Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM
BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ
VÙNG MÃ HÓA (EXOME)

Chuyên ngành:
Mã số:

Hóa sinh học

9 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Huy Hoàng
Viện Nghiên cứu hệ gen
2. GS.TS. Phan Văn Chi
Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội - 2019


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn
Huy Hoàng và GS.TS Phan Văn Chi đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ, ủng hộ và tham gia nhiệt tình của các
cán bộ, đồng nghiệp của phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen,
các bác sĩ tại khoa Tâm bệnh, Bệnh viện Nhi Trung Ương,.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, phòng Quản lý tổng hợp, ThS. Bùi
Hải Hà, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về
mọi mặt, hỗ trợ tôi thực hiện các thủ tục cần thiết để tôi có thể hoàn thành chương
trình học tập và nghiên cứu của nghiên cứu sinh.
Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và người thân đã ở bên tôi
chăm sóc, động viên, giúp tôi yên tâm học tập và nghiên cứu.
Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài thuộc các hướng KHCN ưu
tiên cấp Viện Hàn lâm KHCNVN “Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở
bệnh nhân tự kỷ Việt Nam” VAST02.02/15-16. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ

quý báu của Viện Hàn lâm KHCNVN.

Tác giả luận án

Nguyễn Thu Hiền

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác
với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả luận án

Nguyễn Thu Hiền

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................. vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. x
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
1.1.

Bệnh tự kỷ ......................................................................................................... 4

1.1.1.

Giới thiệu bệnh tự kỷ ......................................................................................... 4

1.1.2.

Thực trạng bệnh tự kỷ ........................................................................................ 5

1.2.

Phân biệt, chẩn đoán hội chứng tự kỷ ............................................................ 9

1.2.1.

Hội chứng Asperger ......................................................................................... 10

1.2.2.

Hội chứng Rett ................................................................................................. 11

1.2.3.

Rối loạn tan rã thời thơ ấu ................................................................................ 12

1.2.4.

Rối loạn phát triển lan toả không xác định ...................................................... 12

1.2.5.

Phương pháp chẩn đoán và điều trị .................................................................. 12

1.3.

Các yếu tố di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ........................................... 15

1.3.1.

Các hội chứng di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ .......................................... 15

1.3.2.

Những yếu tố gây bệnh ở cấp độ di truyền học ............................................... 17

1.4.

Các tiến bộ nghiên cứu về di truyền của rối lo n phổ tự kỷ bằng giải
tr nh tự gen thế hệ mới .................................................................................. 23

1.4.1.

Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới ........................................................ 23

iii


1.4.2.

Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa trong nghiên cứu di truyền bệnh tự
kỷ ...................................................................................................................... 26

1.4.3.

Giải trình tự toàn bộ hệ gen trong nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ................ 32

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 33
2.1.

Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................... 33

2.2.

Hóa chất và trang thiết bị .............................................................................. 33

2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 35

2.3.1.

Tách chiết DNA tổng số................................................................................... 35

2.3.2.

Tạo thư viện DNA ............................................................................................ 36

2.3.3.

Giải trình tự gen bằng máy Illumina ................................................................ 38

2.3.4.

Tiền xử lý số liệu và phân tích dữ liệu ............................................................. 38

2.3.5.

Nhân gen bằng kĩ thuật PCR ............................................................................ 43

2.3.6.

Giải trình tự gen tự động trên máy Sanger....................................................... 43

2.3.7.

Phân tích các gen trong mối tương tác ............................................................. 44

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................. 46
3.1.

Tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 46

3.2.

Giải tr nh tự toàn bộ vùng mã hóa ............................................................... 47

3.2.1.

Kết quả tạo thư viện DNA ............................................................................... 47

3.2.2.

Kết quả giải trình tự gen trên máy Illumina ..................................................... 47

3.3.

Xác định biến thể di truyền ở bệnh nhân tự kỷ .......................................... 51

3.3.1.

Xác định và chú giải biến thể ........................................................................... 51

3.3.2.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T01 ................................................................. 53

3.3.3.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T02 ................................................................. 56

iv

3.3.4.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T03 ................................................................. 62

3.3.5.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T06 ................................................................. 65

3.3.6.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T07 ................................................................. 73

3.3.7.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T08 ................................................................. 79

3.3.8.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T09 ................................................................. 83

3.4.

Các gen nh y cảm với ASD có liên quan đến kênh ion .............................. 86

3.5.

SNP RS7725785 trên gen HTR4.................................................................... 88

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ ....................................................................... 89
4.1.

Xác định và chú giải biến thể ........................................................................ 89

4.2.

Các gen liên quan đến biểu hiện bệnh đặc trƣng của ASD ........................ 91

4.3.

Các gen nh y cảm với ASD có liên quan đến kênh ion .............................. 97

4.4.

Gen RYR2, RYR3 .......................................................................................... 101

4.5.

Gen MUC16 .................................................................................................. 103

4.6.

Đa h nh rs7725785 trên gen HTR4 ............................................................. 106

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 110
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN .......................................................................................... 112
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH .......................................................... 113
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 120

v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết
tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ADI-R:

The Autism Diagnostic Interview - Bảng phỏng vấn chẩn đoán
Revised
tự kỷ có điều chỉnh

ADOS

The Autism Diagnostic Observation Bảng quan sát chẩn đoán tự
Schedule
kỷ

ASD

Autism Spectrum Disorders

Rối loạn phổ tự kỷ

BWA

Burrows - Wheeler Alignment Tool

Công
cụ
gióng
Burrows-Wheeler

CARS

Childhood Autism Rating Scale

Thang chẩn đoán tự kỷ tuổi
ấu thơ

CDC

Centers For Disease Control

Trung tâm kiểm soát dịch
bệnh

CHAT

Check - list for Autism in Toddlers

Bảng kiểm tra sàng lọc tự kỷ
ở trẻ nhỏ chập chững biết đi

CNVs

Copy number variants

Biến thể đa hình số lượng
bản sao

Cowden syndrome

Hội chứng Cowden

CS

hàng

DBC-P

Developmental Behavior Checklist for Bảng câu hỏi phát triển hành
Parent
vi cho bố mẹ

dbSNP

The Single Nucleotide Polymorphism Ngân hàng dữ liệu đa hình
Database
đơn nucleotide

DSM

Cẩm nang chẩn đoán và
Diagnostic and Statistical Manual of
thống kê về chứng rối loạn

Mental Disorder
tâm thần

FXS

Fragile X

Hội chứng X dễ gãy

Gilliam Autism Rating Scale

Thang đánh
Gilliam

GARS

vi

giá

tự

kỷ


GATK

Genome Analysis Toolkit

Công cụ phân tích hệ gen

HDAC1

Histone deacetylase 1.

Dữ liệu đột biến gen người

ICD

International Classification of Diseases

Phân loại quốc tế về bệnh tật

IGV

Integrated Genomics Viewer

Công cụ xem hệ gen hợp
nhất

Intellectual disability

Khuyết tật trí tuệ

ID

M-CHAT Modifier Check-list Autism in Toddlers
MECP2
NCBI
NHGRI

Chromatin architecture genes
National Center
Information

for

Bảng sàng lọc tự kỷ ở trẻ nhỏ
chập chững biết đi có sửa đổi
Các gen cấu trúc chromatin

Biotechnology Trung tâm thông tin Công
nghệ sinh học

National Human Genome Research Viện Nghiên cứu quốc gia về
Institute
gen người

NGS

Next Generation Sequencing

Giải trình tự thế hệ mới

PDDNOS

Pervasive Developmental Disorder Not Rối loạn phát triển lan tỏa
Otherwise Specified
không xác định

PDD

Pervasive developmental disorders

Rối loạn phát triển lan tỏa

PLADOS

The Pre - linguistic Autism Diagnostic Bảng quan sát chẩn đoán tự
Observation Schedule
kỷ dành cho trẻ chưa biết nói

SAM

Sequence Alignment / Map

Sắp xếp/gióng hàng trình tự

SBL

sequencing by ligation

Giải trình tự bằng ghép nối

SBS

sequencing by synthesis

Giải trình tự bằng tổng hợp

Tuberous Sclerosis

Bệnh xơ cứng não củ

WES

Whole exome sequencing

Giải trình tự toàn bộ hệ gen
mã hóa

WGS

Whole Genome Sequencing

Giải trình tự toàn bộ hệ gen

TS

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.

Thông tin các mẫu bệnh nhân và gia đình nghiên cứu............

33

Bảng 2.2.

Trình tự đoạn oligonuleotide....................................................

34

Bảng 3.1.

Chất lượng DNA tổng số..........................................................

46

Bảng 3.2.

Bảng thông tin chất lượng đọc của các mẫu giải trình tự.........

49

Bảng 3.3.

Kết quả gióng hàng của các mẫu giải trình tự với hệ gen
tham chiếu................................................................................

50

Bảng 3. 4.

Kết quả xác định và chú giải biến thể......................................

51

Bảng 3.5.

Số lượng biến thể sau các bước lọc của 07 bệnh nhân.............

52

Bảng 3.6.

Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T01...................................................................................

53

Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân
T01............................................................................................

55

Bảng 3.7.
Bảng 3.8.

Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T02..................................................................................

Bảng 3.9.

Thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân
T02...........................................................................................

59

Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T03...................................................................................

62

Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân
T03...........................................................................................

64

Bảng 3.10.
Bảng 3.11.

56

Bảng 3.12.

Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T06..................................................................................

67

Bảng 3.13.

Bảng thống kê biến thể của bệnh nhân T06.............................

68

Bảng 3.14.

Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T07...................................................................................

74

Bảng 3.15.

Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân
T07............................................................................................

viii

76


Bảng 3.16.

Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T08...................................................................................

Bảng 3.17.

Bảng thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân
T08............................................................................................

82

Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T09..................................................................................

83

Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân
T09...........................................................................................

85

Tổng kết các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở 07 bệnh
nhân..........................................................................................

91

Một số đa hình liên quan đến ASD được công bố trên thế
giới

109

Bảng 3.18.
Bảng 3.19.
Bảng 4.1.
Bảng 4.2.

ix

80


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.

Tỷ lệ bệnh tự kỷ ở một số nước phát triển trên thế giới..........

6

Hình 1.2.

Tỷ lệ tự kỷ ở Việt Nam so với các nước trong khu vực Châu
Á.............................................................................................

8

Hình 1.3.

Tình hình bệnh tự kỷ ở Việt Nam...........................................

9

Hình 1.4.

Lịch sử nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ từ năm 1975 đến
năm 2015

25

Hình 2.1.

Sơ đồ nghiên cứu.....................................................................

36

Hình 2.2.

Quy trình tạo thư viện DNA...................................................

37

Hình 2.3.

Sơ đồ phân tích dữ liệu giải trình bằng các phần mềm tin
sinh chuyên sâu......................................................................

39

Hình 3.1.

Kết quả tách DNA tổng số từ mẫu máu toàn phần................

46

Hình 3.2.

Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện DNA...........................

47

Hình 3.3.

Hình ảnh minh họa file kiểm định chất lượng.......................

48

Hình 3.4.

Chất lượng dữ liệu của FastQ của các mẫu.............................

49

Hình 3.5.

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T01.............................

54

Hình 3.6.

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T02............................

57

Hình 3.7.

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T02...........................................................................................

61

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến

thể
p.Trp13569Cys
ở
bệnh
nhân
T02..........................................................................................

61

Hình 3.9.

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T03............................

63

Hình 3.10.

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Val2430Ala trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T03...........................................................................................

65

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T06............................

67

Hình 3.8.

Hình 3.11.

x


Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Leu13171Phe trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T06..........................................................................................

69

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Glu12869Lys trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T06..........................................................................................

69

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger cho phát
hiện biến thể p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys trên gen RYR3
ở bệnh nhân T06.....................................................................

71

Mô hình mô phỏng cấu trúc 3D của đột biến p.L111P và
p.R3048C ở bệnh nhân T06....................................................

71

Hình 3.16.

Vị trí 5 domain đầu tiên của protein RYR3............................

72

Hình 3.17.

Trình tự amino acid của RYR3 ở các loài khác nhau.............

73

Hình 3.18.

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T07............................

75

Hình 3.19.

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Val13167Met trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T07..........................................................................................

76

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Arg801Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân
T07..........................................................................................

77

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện

biến thể p.Tyr819Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân
T07..........................................................................................

77

Mô hình mô phỏng cấu trúc đột biến p.Arg801Cys và
p.Tyr819Cys ở bệnh nhân T07...............................................

78

Hình 3.23

Trình tự amino acid của RYR2 ở các loài khác nhau.............

79

Hình 3.24.

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T08............................

81

Hình 3.25.

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Trp13569Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân
T08..........................................................................................

82

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T09...........................

84

Hình 3.12.

Hình 3.13.

Hình 3.14

Hình 3.15.

Hình 3.20.

Hình 3.21.

Hình 3.22.

Hình 3.26.

xi


Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T09...........................................................................................

85

Hình 3.28.

Các họ kênh ion và các gen liên quan.....................................

87

Hình 3.29.

Đa hình c.507+53G>T trên gen HTR4 ở BN T01, T07, T08,
T09...........................................................................................

88

Vai trò của gen HTR4..............................................................

107

Hình 3.27.

Hình 4. 1

xii


1
MỞ ĐẦU
Tự kỷ (ASD) thuộc một nhóm các rối loạn một rối loạn phát triển, không đồng
nhất về mặt di truyền. Bệnh nhân tự kỷ thường có biểu hiện khiếm khuyết về tương
tác xã hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và
hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Một số bệnh thường thấy đi kèm với
ASD bao gồm rối loạn lo âu, rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa và các phản ứng bất

thường gây kích thích cảm giác. Ước tính mới nhất cho thấy rằng ASD ảnh hưởng
đến khoảng 1 trong 59 trẻ em dưới 8 tuổi và tỷ lệ mắc bệnh ở bé trai chiếm ưu thế
so với bé gái.
Bệnh được cho là có nguy cơ di truyền do ảnh hưởng đồng thời bởi nhiều biến
thể gen khác nhau. Trong những nghiên cứu ở các cặp song sinh, sự đồng nhất kiểu
hình của ASD ở những cặp song sinh cùng trứng chiếm 70-90%, trong khi tỉ lệ này
ở những cặp song sinh khác trứng chỉ 0-30%. Các nghiên cứu cho thấy rằng, anh
chị em trong cùng một gia đình có một bệnh nhân mắc bệnh thì nguy cơ mắc bệnh
trong gia đình lên tới 25%, cao hơn nhiều so với nguy cơ mắc bệnh của dân số nói
chung. Trong số những rối loạn tâm thần và thần kinh có tính di truyền, tự kỷ chiếm
tỷ lệ cao lên tới 40-80%. Sự tương tác yếu tố môi trường với yếu tố di truyền gây ra
những thay đổi bất thường trong sự phát triển tế bào thần kinh, phát triển trí não.
Trong nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ, đã có nhiều phương pháp được áp
dụng như FISH, Microarrya, aCGH. Tuy nhiên, đối với con người, trí tuệ là một
tính trạng cực kỳ phức tạp do nhiều gen quy định. Vì vậy, nghiên cứu ảnh hưởng
của thay đổi các gen liên quan đến trí tuệ, dẫn đến thiểu năng trí tuệ cũng như tự kỷ
cần được tiến hành ở toàn bộ hệ gen, nhất là vùng mã hóa (exome). Đây là hai
phương pháp nghiên cứu đã và đang đạt được nhiều bước tiến nhảy vọt trong
nghiên cứu di truyền bệnh này. Giải trình tự vùng mã hóa - Whole exome
sequencing (WES) là một ứng dụng của công nghệ giải trình tự thế hệ mới để xác
định các biến thể trên tất cả các vùng mã hóa trong hệ gen. Hàng chục nghìn biến
thể gen có thể được xác định trên exome trong nhiều bệnh phức tạp như: tim mạch,


2
thần kinh,... WES đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu lâm sàng vài năm
gần đây. Do đó, WES đang được coi là hướng đi đúng đắn để nghiên cứu di truyền
bệnh tự kỷ.
Tại Việt Nam, bệnh tự kỷ cũng có xu hướng tăng nhanh và cũng chưa có
phương pháp chữa trị triệt để, mà chỉ có các phương pháp hỗ trợ, cải thiện tình hình

bệnh. Đặc biệt, tại Việt Nam, các nghiên cứu di truyền bệnh còn rất hạn chế. Xuất
phát từ những thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số
bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng phƣơng pháp giải tr nh tự toàn bộ vùng mã
hóa (exome)” được thực hiện nhằm góp phần phát hiện và làm sáng tỏ nguyên nhân
gây bệnh tự kỷ ở người Việt Nam. Nghiên cứu này sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu
di truyền học giải thích được cơ chế gây bệnh và các bác sĩ lâm sàng có thêm hướng
điều trị bệnh hiệu quả, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống.
Mục tiêu của đề tài
1. Giải trình tự và phân tích toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở một số bệnh nhân
tự kỷ Việt Nam.
2. Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở một
số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu:
1. Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ.
2. Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân và gia đình.
3. Giải trình tự toàn bộ exome của một số bệnh nhân tự kỷ tự Việt Nam.
4. Phân tích số liệu tìm các biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số
người Việt Nam.
Những đóng góp mới của luận án:
1. Đưa ra số liệu các biến thể mới ở 07 người bệnh tự kỷ Việt Nam.
2. Xác định 02 biến thể mới (p.L111P và p.R3048C) trên gen RYR3 ở 01 bệnh
nhân.
3. Xác định 02 biến thể mới (p.R801C và p.W819C) trên gen RYR2 ở 01 bệnh
nhân.


3
4.

Xác định 06 biến thể mới trên gen MUC16 (p.A2224S; p.W13569C;

p.Val13167Met; p.L13171F; p.E12869K; p.D13229E) ở 06 bệnh nhân.

5. Xác định đa hình rs7725785c.507+53G>T trên gen HTR4 ở 04 bệnh nhân.


4
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH TỰ KỶ

1.1.1. Giới thiệu bệnh tự kỷ
Tự kỷ là một dạng rối loạn trong Rối Loạn Phát Triển Lan Toả (Rối Loạn Phổ
Tự Kỷ). Bệnh khởi phát sớm trong 3 năm đầu tiên của cuộc đời. Tự kỷ tác động đến
sự phát triển của trẻ trong 3 lĩnh vực chính đó là: tương tác xã hội, ngôn ngữ và
hành vi. Tự kỷ hay rối loạn phổ tự kỷ là một nhóm các hội chứng không đồng nhất
về mặt di truyền.
Bệnh nhân tự kỷ biểu hiện ra ngoài bằng những khiếm khuyết về tương tác xã
hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động
mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Hiện tượng này bao gồm nhiều biểu hiện khác
nhau, ví dụ như người bệnh hay có hành động quay cổ tay, quay đầu hay có những
hành động có tính bắt buộc như xếp đồ chơi, búp bê, ô tô thành một hàng ngang
hoặc dọc. Nguy hiểm nhất chính là bệnh nhân hay tự làm mình bị thương như: lấy
tay chọc lên mắt, cấu lên da, tự đánh vào tay và đầu. Một dấu hiệu nữa là trẻ mắc
bệnh thường có khả năng đi lại chậm hơn nhiều so với trẻ khác, phải mất 2-3 năm
tuổi mới đi lại bình thường được. Khả năng giao tiếp bằng mắt của trẻ không tốt và
bệnh nhân thường có thái độ hờ hững với mọi thứ xung quanh.
Ngoài những triệu chứng lâm sàng cổ điển cụ thể, khoảng 31% bệnh nhân bị
khuyết tật trí tuệ, 20-25% có triệu chứng co giật (Canitano, 2007; Liu and Takumi ,
2014; Srivastava and Schwartz, 2014). Một số bệnh thường thấy đi kèm với ASD
bao gồm rối loạn lo âu (White et al, 2009), rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa

(Valicenti-McDermott et al, 2006) và các phản ứng bất thường gây kích thích cảm
giác (Rogers et al, 2003). Các triệu chứng chính của ASD thường xuất hiện sớm,
khoảng 6 tháng tuổi và thể hiện rõ khoảng năm 2-3 tuổi. Bệnh gặp phổ biến ở bé
trai nhiều hơn bé gái, với tỷ lệ khoảng 4:1 (Baio et al, 2018). Bệnh tự kỷ là bệnh có
cơ sở di truyền rất phức tạp do sự tương tác của nhiều gen. Sự tương tác của gen với


5
môi trường hay những yếu tố ngoại cảnh khác không làm biến đổi DNA nhưng ảnh
hưởng đến biểu hiện gen. Cơ sở di truyền của bệnh được đề xuất có liên quan đến
sự ảnh hưởng kết hợp của các biến thể khác nhau (Inoue et al, 2015). Trong những
nghiên cứu ở những cặp song sinh, sự đồng nhất kiểu hình của ASD ở những cặp
song sinh cùng trứng chiếm 70-90%, trong khi tỉ lệ này ở những cặp song sinh khác
trứng chỉ 0-30% (Rosenberg et al, 2009; Ronald and Hoekstra, 2014). Các nghiên
cứu cho thấy rằng, anh chị em trong cùng một gia đình có một bệnh nhân mắc bệnh
thì các thành viên còn lại có nguy cơ mắc cao hơn so với dân số nói chung khoảng
25%. Trong những rối loạn tâm thần và thần kinh có tính di truyền, tự kỷ chiếm tỷ
lệ cao lên tới 40-80% (Chahrour et al, 2012). Có nhiều cách giải thích khác nhau về
sự tăng tỷ lệ trẻ mắc bệnh tự kỷ trên thế giới hàng năm. Gần đây, một số nhà khoa
học cho rằng các bà mẹ mang thai đã tiếp xúc với ô nhiễm hóa chất, đặc biệt là kim
loại và thuốc trừ sâu, sự tiếp xúc này làm biến đổi sự phát triển cấu trúc não của trẻ
dẫn đến bị bệnh tự kỷ. Yếu tố môi trường cũng có những tương tác với yếu tố di
truyền và gây ra những thay đổi bất thường trong sự phát triển tế bào thần kinh và
phát triển trí não (Elif et al, 2016).
1.1.2. Thực tr ng bệnh tự kỷ
1.1.2.1.Thực trạng bệnh tự kỷ trên thế giới
Những nghiên cứu từ trước năm 1985 về tỷ lệ mắc bệnh tự kỷ cho thấy có
khoảng 5 trường hợp trong số 1000 trẻ em. Từ những năm 1980, số ca mắc bệnh
được chẩn đoán tăng lên với tốc độ nhanh chóng. Kết quả này một phần là do
những tiến bộ của y học trong chẩn đoán và một phần là do chính phủ cũng đã đầu

tư nhiều hơn vào lĩnh vực y tế đặc biệt là những bệnh liên quan đến thần kinh
(Blumberg, 2007).
Các đánh giá thống kê cho thấy tỉ lệ mắc ASD trên thế giới ở các nước khác
nhau là khác nhau. Năm 2006, theo thống kê của Williams và cộng sự, tỷ lệ ASD
trên toàn cầu là 20/10.000 (Williams et al, 2006). Đến năm 2012, Elsabbagh và
nhóm nghiên cứu của mình đã báo cáo tỷ lệ mắc ASD trên thế giới là 62/10.000, tức
là cứ 160 trẻ thì có 1 trẻ mắc bệnh (Elsabbagh et al, 2012).


6

Hình 1.1 Tỷ lệ bệnh tự kỷ ở một số nƣớc phát triển trên thế giới
(Nguồn: Trung tâm kiểm soát và Phòng chống bệnh - CDC, 2015)

Tỷ lệ bệnh năm 2015 theo thống kê của Baxter và cộng sự đã có sự gia tăng
đáng kể, ước tính khoảng 7,6/1000, tức là trong 132 người thí có 1 người mắc ASD
(Baxter et al, 2015). Trung tâm Kiểm soát và Phòng chống bệnh (CDC) ở Mỹ đã
đưa ra tỷ lệ trẻ mắc những rối loạn thần kinh trên toàn cầu năm 2014 là 1% (CDC,
2014). Hiện nay, có hơn 3,5 triệu người Mỹ mắc bệnh tự kỷ, ước tính 1/68 trẻ em
được chẩn đoán mắc bệnh (CDC, 2014). Như vậy, tỷ lệ tự kỷ ở trẻ em ở Hoa Kỳ
tăng 119,4% so với năm 2000 (1/150) đến năm 2010 (1/68) (CDC, 2014) (Hình
1.1). Vì thế, tự kỷ được đánh giá là chứng khuyết tật có tỷ lệ phát triển nhanh nhất
(CDC, 2008). Điều này dễ dàng được giải thích bởi lối sống ngày càng thực dụng
tại Mỹ. Bên cạnh Mỹ, Anh cũng là một nước có tỷ lệ tự kỷ ở mức cao (xấp xỉ 1%)
(Brugha et al, 2011). Ngoài Anh và Mỹ có tỷ lệ mắc tự kỷ cao, bệnh cũng có mặt ở
nhiều quốc gia trên thế giới. Do tỷ lệ trẻ tự kỷ gia tăng nhanh chóng đang đặt ra
những vấn đề lớn đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Tại Mỹ, tự kỷ được xếp vào
danh mục 13 dạng khuyết tật bẩm sinh và vấn đề trẻ tự kỷ đã được khẳng định là
một trong những ưu tiên hàng đầu trong chính sách y tế của nước này.
Tại một số nước ở châu Á hiện nay như Hàn Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Trung

Quốc, vấn đề tự kỷ cũng đã được các nhà khoa học và xã hội đặc biệt quan tâm.


7
Trước năm 1980, bệnh tự kỷ không được công nhận tại Trung Quốc, ước tính tỷ lệ
tự kỷ là 11,8 / 10.000 người, trong khi tỷ lệ hiện mắc của bệnh tự kỷ là 26,6 /
10.000 người. Ở Nhật Bản, gần đây ước tính tỷ lệ tự kỷ là 13/10.000 người. Điều
này cho thấy chứng tự kỷ là phổ biến ở châu Á hơn nhiều so với những thống kê
trên thế giới trước đây (Sun and Allison, 2010; Sun et al, 2013). Thang đo hành vi
tự kỷ Clancy (CABS), Danh mục kiểm tra hành vi tự kỷ (ABC) và Danh sách Kiểm
tra cho Tự kỷ ở trẻ vị thành niên (CHAT) thường được sử dụng làm công cụ chẩn
đoán ở Trung Quốc (Sun et al, 2013). Tại châu Á, 2 tác giả Sun và Allison đã tiến
hành một cuộc khảo sát tại sáu nước, loại trừ các nước Nam Á, cho thấy tỷ lệ hiện
mắc ASD từ năm 1980 đến nay là 14,8/10.000 (Sun and Allison, 2010). Tuy nhiên,
nhận thức về ASD ở khu vực này còn thiếu đầy đủ, thậm chí không chính xác gây
nên hệ lụy trong đời sống xã hội và các vấn đề hỗ trợ. Nhìn chung, Mỹ là quốc gia
duy nhất trên thế giới có sự đánh giá, thống kê và báo cáo tình hình tự kỷ ở trong
nước. Tuy vậy, với mức độ tăng nhanh của bệnh, các số liệu của Mỹ cũng cần được
cập nhật thường xuyên hơn.
Theo thống kê, tỷ lệ bệnh ở các nước phát triển có sự chênh lệch khá lớn. Điều
này có thể giải thích bởi các nguyên nhân sau: Thứ nhất, các quốc gia không tích
cực theo dõi hoặc không công khai số liệu của họ. Thứ hai, không có một tiêu chuẩn
thống nhất để đánh giá chứng tự kỷ. Hoặc nếu có, thì vấn đề nguồn lực để thực hiện
việc này cũng là vấn đề đáng lo ngại.
1.1.2.2. Thực trạng bệnh tự kỷ tại Việt Nam
Thuật ngữ ―Tự kỷ‖ được sử dụng ở Việt Nam vào cuối năm 1990 và đầu
những năm 2000, ca bệnh đầu tiên được ghi nhận vào năm 1997-1998. Từ đó đến
nay số trẻ được chẩn đoán và điều trị chứng tự kỷ tại các cơ sở y tế công lập và cả
tư lập ngày càng tăng, năm sau cao hơn năm trước. Theo báo cáo của khoa tâm thần
bệnh viện Nhi Trung ương, số trẻ mắc tự kỷ được chẩn đoán trong các năm 2008,

2010, 2011 lần lượt là 450, 1792, 1968 (Quách Thúy Minh, 2011; Khoa tâm thần,
2012; Vu SH et al, 2014; Vu SH et al, 2017)


8
Theo thống kê của một số tổ chức nước ngoài, tỷ lệ bệnh tự kỷ ở Việt Nam là
75,1 tính trên 100.000 người () (Hình
1.2). Tuy nhiên con số này còn chưa phản ánh chính xác thực tế vì số liệu bệnh
nhân tự kỷ tại Việt Nam chưa được cập nhật đầy đủ và thường xuyên. Và điều đáng
nói là sự nhận thức về bệnh của người dân Việt Nam còn chưa cao, đặc biệt là ở
những vùng nông thôn. Do đó, số cha mẹ đưa con đến bệnh viện chẩn đoán bệnh
còn chưa đầy đủ.
Tại thành phố Hồ Chí Minh, năm 2000 chỉ có 2 trẻ đến Bệnh viện Nhi đồng 1
khám và điều trị chứng tự kỷ, thì năm 2008 số trẻ đến khám là 324, tăng hơn 160
lần. Song những năm gần đây, số lượt trẻ đến khám tại Khoa Tâm thần (Bệnh viện
Nhi Trung ương) được chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ hay có dấu hiệu tự kỷ ngày
càng gia tăng (Đậu Tuấn Nam and Vũ Hải Vân, 2015).

Hình 1.2 Tỷ lệ tự kỷ ở Việt Nam so với các nƣớc trong khu vực Châu Á
(Nguồn: />
Theo báo cáo của bệnh viện Nhi Trung ương, số trẻ đến khám muộn và được
chẩn đoán mắc bệnh tự kỷ vẫn còn tỷ lệ rất cao (43,86% trên 36 tháng tuổi). Số liệu
thống kê của Khoa Tâm bệnh (Bệnh viện Nhi Trung ương) cũng cho thấy, có sự
chênh lệch đáng kể giữa tỷ lệ mắc bệnh ở bé trai và bé gái (bé trai nhiều hơn 4-6 lần


9
so với bé gái), ở thành thị mắc bệnh nhiều hơn ở nông thôn. Thông tin này phần nào
cho thấy, vấn đề nhận thức của người dân về bệnh rất quan trọng trong việc phát
hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh sớm.

Theo thống kê của Bệnh viện Nhi trung ương ghi nhận năm 2007 có khoảng
405 trường hợp thì đến năm 2015 đã ghi nhận có khoảng 200.000 trường hợp (Hình
1.3). Điều này cho thấy, tình hình trẻ mắc bệnh tự kỷ ngày càng tăng gây gánh nặng
và thách thức không nhỏ cho gia đình và xã hội. Đặc biệt, khi những người tự kỷ
trưởng thành sẽ làm thế nào để hoà nhập xã hội và làm cách nào để hạn chế mức độ
gia tăng cũng như có phương án điều trị cho những người đã mắc bệnh.

Hình 1.3 T nh h nh bệnh tự kỷ ở Việt Nam
(Nguồn: Bệnh viện Nhi trung ương, 2015)
1.2. PHÂN BIỆT CHẨN ĐOÁN HỘI CHỨNG TỰ KỶ

Tự kỷ là một trong năm rối loạn phát triển lan tỏa (PDD). Hội chứng này là do
sự bất thường của não bộ, xuất hiện sớm trong những năm đầu đời của trẻ em. Với
những biểu hiện đặc trưng ở các lĩnh vực: kém tương tác xã hội, bất thường về ngôn
ngữ, giao tiếp và hành vi.
Có rất nhiều cách phân loại khác nhau, cũng như mức độ khác nhau của bệnh
tự kỷ:


10
- Tự kỷ mức độ nhẹ: là trẻ có thể giao tiếp bằng mắt tương đối bình thường,
giao tiếp với người ngoài hạn chế, học được các hoạt động đơn giản, kỹ năng chơi
và nói được tương đối bình thường.
- Tự kỷ mức độ trung bình: là trẻ có thể giao tiếp bằng mắt, giao tiếp với
người ngoài hạn chế và nói được nhưng hạn chế.
- Tự kỷ mức độ nặng: là trẻ không giao tiếp bằng mắt, không giao tiếp và
không nói được.
Trước đây thuật ngữ ―tự kỷ‖ không thấy xuất hiện trong y khoa, nhưng đến
năm 1943 một nhà tâm thần học người Áo tên là Leo Kanner đã mô tả một nhóm 11
trẻ có những biểu hiện phát triển không bình thường như: có những khiếm khuyết

về tương tác xã hội, khiếm khuyết trong quá trình phát triển ngôn ngữ, có những
hành vi kỳ lạ lặp đi lặp lại nhiều lần, khởi phát sớm trước 3 tuổi và khái niệm ―tự
kỷ‖ được ra đời từ đó.
Ngày nay, người ta dùng thuật ngữ ―Rối loạn phát triển lan tỏa‖ hoặc ―Rối
loạn phổ tự kỷ‖ để mô tả các trẻ em có các rối loạn phát triển trên 3 lĩnh vực chính
là: tương tác xã hội, rối loạn ngôn ngữ và hành vi. Rối loạn phát triển lan tỏa gồm
có 5 rối loạn chính: hội chứng Asperger, hội chứng rối loạn tan rã tuổi ấu thơ, hội
chứng Rett, hội chứng rối loạn lan tỏa không xác định và hội chứng tự kỷ.
1.2.1. Hội chứng Asperger
Hội chứng Asperger được đặt theo tên của bác sĩ nhi khoa người Áo Hans
Asperger vào năm 1944 khi ông mô tả nhóm trẻ em trong nghiên cứu của mình với
những biểu hiện: thiếu giao tiếp, kém hiểu biết về những cảm xúc của người khác
và thể chất yếu. Ngày nay, hội chứng Asperger được đặc trưng bởi sự tách biệt về
mặt xã hội và các hành vi kỳ cục khi trẻ khi còn nhỏ. Có những khiếm khuyết trong
tương tác xã hội và giao tiếp không lời. Thể hiện một số hành vi đơn điệu, định
hình, lặp lại; Khó khăn trong tiếp thu và lĩnh hội hành vi phi ngôn ngữ như vẻ mặt,
tư thế, tiếp xúc mắt, điệu bộ; Yếu kém trong việc hiểu và thể hiện cảm xúc
(Hamilton, 2000). Mặc dù tuân theo các qui tắc ngữ pháp, nhưng cách nói của trẻ
nghe có vẻ lập dị do sự bất thường ở âm điệu và các khuôn mẫu lặp đi lặp lại. Sự


11
vụng về có thể dễ nhận thấy ở cách phát âm rõ ràng và các hành vi vận động thô.
Mặc dù các dấu hiệu bất thường xuất hiện sớm từ trước năm 2 tuổi, nhưng lại kéo
dài đến hết cuộc đời (Baskin et al, 2006; McPartland, 2006). Trẻ bị Asperger
thường có trí nhớ rất tốt, có trí tuệ trung bình hoặc trên trung bình. Trẻ có khả năng,
sở thích về kĩ thuật và toán học. Hội chứng Asperger khác tự kỷ là không chậm
hoặc trì trệ trong phát triển trí tuệ, ngôn ngữ và nhận thức. Ước tính hiện năm 2015
số lượng bệnh nhân mắc Asperger lên đến 37,2 triệu người trên toàn cầu
(Collaborators, 2016) và con số này vẫn đang ngày càng tăng lên.

1.2.2. Hội chứng Rett
Hội chứng này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1966 bởi một bác sĩ nhi ở
Vienna, Andreas Rett. Tuy nhiên, các bài viết của bác sĩ này bằng tiếng Đức nên
bệnh không được công nhận rộng rãi (Percy, 2014). Đến năm năm 1983, Bengt
Hagberg- một bác sĩ nhi khoa người Thụy Điển xuất bản một bài báo tiếng Anh mô
tả bệnh này và đặt tên bệnh là Rett. Đột biến gây ra bệnh này được công bố lần đầu
tiên vào năm 1999 bởi bác sĩ người Mỹ Li-băng, Huda Zoghbi (Amir et al, 1999).
Hiện nay, bệnh này ảnh hưởng đến khoảng 1 trong 8.500 phụ nữ.
Không như tự kỷ xuất hiện ở bé trai nhiều gấp bốn lần bé gái, rối loạn Rett chỉ
ảnh hưởng đến bé gái. Các bé trai mắc hội chứng này sẽ chết trước sinh. Các dấu
hiệu của bệnh thường thấy rõ rệt sau 6 đến 18 tháng. Các triệu chứng bao gồm các
vấn đề về ngôn ngữ, phối hợp và các chuyển động lặp đi lặp lại. Các biến chứng có
thể bao gồm động kinh, chứng vẹo cột sống, và các vấn đề về giấc ngủ. Tuy nhiên,
những người bị ảnh hưởng có thể bị ảnh hưởng ở mức độ khác nhau (Percy, 2014).
Trẻ bị mất những kỹ năng tinh tế của bàn tay mà trước đây trẻ đã đạt được, thay vào
đó là những vận động định hình, lặp đi lặp lại; trẻ bị mất tương tác xã hội, các động
tác phối hợp cơ thể đơn điệu và suy giảm nghiêm trọng tính mục đích, mất phối hợp
trong đi đứng và cử động thân thể, ngôn ngữ tiếp thu và thể hiện giảm sút nghiêm
trọng kết hợp với chậm phát triển tâm thần (Hamilton, 2000). Như vậy, điểm giống
nhau giữa hội chứng tự kỷ và hội chứng Rett là đều có những suy giảm về giao tiếp,
ngôn ngữ, quan hệ xã hội, hành vi và chậm phát triển tâm thần. Tuy nhiên, sự khác